Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

כימות פרמטרים Spatiotemporal של אקסוציטוזיס תאי בתאים Micropatterned

Published: September 16, 2020 doi: 10.3791/60801
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 4, 1,2,3
1Unité Mixte de Recherche 144 CNRS, Molecular Mechanisms of Intracellular Transport group, Institut Curie, 75005 Paris, France, 2PSL Research University, Paris, France, 3Sorbonne Université, Paris, France, 4INRIA, Université Paris-Sud, PSL

Summary

הדמיה חיה של אקסוציטוזיס ליזומלי על תאים מיקרו-פטרניים מאפשרת כימות מרחבית של תהליך זה. נורמליזציה מורפולוגית באמצעות מיקרו-פטרנים היא כלי יוצא מן הכלל לחשיפת כללים כלליים לגבי ההפצה המרחבית של תהליכים סלולריים.

Abstract

הדמיה חיה של pHluorin מתויג מסיס N-ethylmaleimide-רגיש-גורם חיבור חלבון REceptor (v-SNARE) Vesicle הקשורים קרום חלבון 7 (VAMP7) על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי השתקפות פנימית מוחלטת (TIRFM) היא דרך פשוטה לחקור הפרשה מהתא lysosomal. ניצול של תרבות התא על משטחים micropatterned כדי לנרמל את צורת התא, מגוון רחב של כלים סטטיסטיים הועסקו כדי לבצע ניתוח מרחבי של דפוסי הפרשה. באמצעות פונקציית K של ריפלי ומבחן סטטיסטי המבוסס על מרחק השכן הקרוב ביותר (NND), אישרנו כי הפרשה מlysosomes אינה תהליך אקראי, אבל מראה קיבוץ באשכולות משמעותי. שימו לב, הניתוח שלנו גילה כי אירועי אקסוציטוזיס מקובצים גם באזורים שאינם הדבקה, המציין כי מולקולות הדבקה אינן המבנים היחידים שיכולים לגרום לנקודות חמות הפרשה על קרום הפלזמה. ובכל זאת, מצאנו שהדבקת תאים משפרת את התקבצות האשכולות. בנוסף לאזורים דביקים ולא דביקים מוגדרים במדויק, הגיאומטריה המעגלית של מיקרו-פטרנים אלה מאפשרת שימוש בקואורדינטות קוטביות, ומפשטת את הניתוחים. השתמשנו הערכת צפיפות ליבה (KDE) ואת פונקציית ההתפלגות המצטברת על קואורדינטות קוטביות של אירועי אקסוציטוזיס כדי לזהות אזורים מועשרים של אקסוציטוזיס. בתאי מיקרו-פטרן בצורת טבעת, התקבצות אירעה בגבול בין האזורים הדביקים לאזורים שאינם דביקים. הניתוח שלנו ממחיש כיצד ניתן להשתמש בכלים סטטיסטיים כדי לחקור הפצות מרחביות של תהליכים ביולוגיים מגוונים.

Introduction

אקסוציטוזיס הוא תהליך תאי אוניברסלי שבו שלוק מתפתל עם קרום הפלזמה ומשחרר את תכולתו. שלבית יכול להתמזג לחלוטין עם קרום פלזמה (היתוך מלא) או ליצור נקבובית היתוך שנשאר פתוח בזמן מוגבל (נשיקה וריצה)1. לדוגמה, חלבונים מסונתזים חדשים משתחררים למדיום החוץ-תאי מהשלוקים שהגיעו ממתחם Golgi. מסלול זה biosynthetic, anterograde הוא קדמוני, במיוחד אורגניזמים רב תאיים, כדי להפריס פפטידים איתות (למשל, הורמונים, נוירוטרנסמיטורים) ורכיבי מטריצה חוץ תאית (למשל, קולגן), כמו גם את התנועה חלבוני טרנסמברנה לממברנה פלזמה. בנוסף, הפרשות יכולות להתרחש אנדוזומים שונים: 1) מיחזור אנדוזומים על מנת לעשות שימוש חוזר חלבונים transmembrane; 2) גופים רב-ווריקולריים (MVBs) לשחרור אקסוזומים; ו-3) ליזומה לשחרור אנזימים פרוטאוליטיים. הפרשה אנדו-פלומטית כבר הראה להיות חשוב עבור גידול נורייט, היווצרות פסאודופודיה, תיקון קרום פלזמה, ואיתות תלוי ATP2.

כדי ללמוד אקסוציטוזיס ברמת תא יחיד, מספר טכניקות הועסקו. מהדק תיקון מאפשר זיהוי של אירועי אקסוציטוזיס יחיד עם רזולוציה זמנית גבוהה במגוון רחב של תאים חיים3. עם זאת, שיטה זו אינה מספקת מידע על התאמה למיקום אחר של אירועי אקסוציטוזיס, ולא מאיזה תא היא מתרחשת. מיקרוסקופאלקטרונים מאפשרת הדמיה ישירה של אירועים אקסוציטיים ברזולוציה מרחבית גבוהה, ובשילוב עם חיסונים מספקת מידע על הספציפיות של התאים והמולקולות המעורבים. חיסרון בגישה זו הוא חוסר המידע על הדינמיקה של התהליך, כמו גם חוסר יכולתו לבצע מחקרים בתפוקה גבוהה. גישות מיקרוסקופיות אור כגון מיקרוסקופ פלואורסצנטי השתקפות פנימית מוחלטת (TIRFM), אשר מנצל את השדה evanescent כדי להאיר פלואורופורים בקרבת כיסוי (100 טנ"מ), מספק רזולוציה זמנית ומרחבית טובה כדי ללמוד אירועי אקסוציטוזיס. עם זאת, שיטה זו תואמת רק לתאים דבקים ותוחל רק על החלק האוורירי/נחות של התאים.

הערה, קרום הפלזמה חושף הטרוגניות משמעותית המבוססת על תסביכי דבק הנוכחיים רק באזורים מוגבלים. הטרוגניות זו מגבילה, למשל, את ספיגת ליגנדיםשונים 4. באופן דומה, לאחרונה דווח כי הפרשה ממתחם Golgi מרוכזת "נקודות חמות" קרום פלזמה5. יתר על כן, ידוע כי מטענים מסוימים מופרשים באמצעות exocytosis הקשורים למוקדהדבקה 6. לכן, תשומת לב מיוחדת צריכה להיות משולמת לשאלה אם אירועי אקסוציטוזיס מופצים באופן אקראי בחלל, או אם הם מרוכזים באזורים מסוימים של קרום הפלזמה. מספר כלים סטטיסטיים המבוססים על פונקציית K של ריפלי הוצעו לחקור אתהשאלות האלה 7,8,9. הגישה שלנו משלבת כלים אלה עם micropatterning כדי לשלוט בצורת התא והטרוגניות קרום פלזמה. בנוסף למתן אמצעי להבחין בין אזורים דביקים ולא דביקים, טכניקה זו גם מאפשרת השוואה בין תאים ותנאים שונים ומגבירה את כוחם של ניתוחים סטטיסטיים.

כאן אנו מעסיקים מגוון של כלים סטטיסטיים כדי ללמוד את ההתפלגות המרחבית של אירועי אקסוציטוזיס מתא lysosomal בפיקוח TIRFM הדמיית תאים חיים של VAMP7-pHluorin בתאי hTert-RPE1 מיקרו-פטורן בצורת טבעת. אושר כי הפרשת ליזומים אינה תהליך אקראי8-,9, ושאירועי אקסוציטוזיס מציגים קיבוץ באשכולות. שימו לב, מצאנו כי אירועי אקסוציטוזיס מקובצים גם באזורים לא דביקים, מה שמצביע על כך שמולקולות הדבקה אינן המבנים היחידים שיכולים לגרום לנקודות חמות של הפרשה בממברנה פלזמה. אף על פי כן, הדבקת תאים אכן שפרו את התקבצות האשכולות. באופן עקבי, הניתוח שלנו זיהה אזורים מועשרים של אקסוציטוזיס שהיו ממוקמים בגבול בין האזורים הדביקים ולא דבקים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת תאים מיקרו-פטרניים

  1. תעבירת תאים
    1. יום אחד לפני transfection, זרע 2.5 x 106 hTERT-RPE1 תאים לתוך באר אחת של 12 צלחת באר (2 x 2 ס"מ) ב 1 מ"ל של בינוני.
    2. ביום של transfection, להכין את תערובת transfection עם VAMP7-pHluorin plasmid (100 μL של חוצץ, 0.8 μg של ה-DNA, 3 μL של תערובת טרנספד). דגירה במשך 10 דקות.
      הערה: VAMP7 הוא v-SNARE lysomal, התמזגו עם תג pHluorin זוהר. הגשושית pHluorin מרווה על ידי pH נמוך, אבל במהלך פרוטונים exocytosis משתחררים pHluorin מתחיל לפלוטאות 10,,11.
    3. מוסיפים את תערובת הטרנס-פעולה לתאים במדיום שלהם.
    4. שנה את 4 השעות הבינוניות לאחר הוספת תערובת הטרנס-פעולה בתאים.
    5. השתמש בתאים לניסויים במהלך 24-48 השעות הבאות.
  2. הכנת מיקרופטרן (שיטת פוטוליתוגרפיה)
    1. שוטפים את כיסויי הכיסוי (קוטר 25 מ"מ) באתנול ולתת להם להתייבש במשך 5 דקות.
    2. הפעל כיסויים על ידי תאורה תחת UV עמוק במשך 5 דקות.
    3. צור תא לח על-ידי לחות יסודית של מגבת נייר שעליה ממוקם סרט פרפין. להוסיף טיפות (30 μL עבור 22 מ"מ coverslip) של פולי-L-לייסין-שתל-פוליאתילן גליקול (PLL-g-PEG) פתרון (0.1 מ"ג / מ"ל, 10 mM HEPES, pH = 7.4) וכיסויי מקום עם המשטח מופעל עליהם. סגור את התא הלח עם החלק העליון ותרגם כיסויי במשך שעה אחת.
    4. לשטוף כיסויים 2x ב PBS ו 1x במים מזוקקים ולתת להם להתייבש.
    5. שוטפים את מסך הפוטו קוורץ במים מזוקקים ולאחר מכן עם אתנול או פרופנול. יבש את מסכה הצילום עם זרימת אוויר מסוננת.
      הערה: פוטו-מסכה קוורץ מצופה בצד אחד עם כרום אנטי-רפלקסיבי המכיל חורים בצורה של מיקרו-פטרנים. בפרוטוקול זה נעשה שימוש במיקרו-פטרנים בצורת טבעת של 37 μm. כאשר UV עמוק הוא נוצץ על מסכה, האור יכול לעבור רק דרך חורים אלה12.
    6. לחשוף את מסכה הצילום (בצד כרום מצופה) UV עמוק במשך 5 דקות כדי לנקות את פני השטח.
    7. הוסף טיפות מים קטנות (10 μL עבור כיסוי 20 מ"מ) בצד מצופה כרום של מסיכה. מניחים את כיסוי הכיסוי עם הצד PLL-g-PEG שטופלו על הטיפה ויבשו את המים הנוספים. ודא כי אין בועות אוויר טופס בין המסכה ואת כיסויי.
      הערה: כוח נימו של המים יהיה לשתק את כיסויי.
    8. לחשוף את מסיכה הצילום UV עמוק במשך 5 דקות עם הצד שאינו מצופה כרום למעלה (כיסויים מחוברים על פני השטח התחתון).
      הערה: האור יכול לעבור רק דרך החורים ולשנות את פני השטח שטופלו ב-PLL-g-PEG של כיסויים מתחת לסיכה.
    9. הסר את הכיסויים מהסיכה על-ידי הוספת עודפי מים.
      הערה: כיסויים אמורים לצוף במהירות.
    10. דגירה כיסויים בתמיסה של חלבוני מטריצה חוץ תאית (50 μg / מ"ל של פיברונקטין, 5 μg / מ"ל של פיברינוגן פלורסנט מדולל במים) על סרט פרפין בתא לח (כמו בשלב 1.2.3) עבור 1 שעה תחת מכסה המנוע זרימה למינאר כדי למנוע זיהום.
      הערה: ניתן להשהות את הניסוי בשלב זה על-ידי אחסון הכיסויים ב- PBS ב- 4 °C.
  3. זריעת תאים על משטחים מיקרו-פטרניים
    1. השתמש במחזיק כיסוי מגנטי שמתאים לגודל של כיסויי מיקרו-פטרונים כדי להרכיב את הכיסויים. ביום הרכישה, לחמם את מחזיק כיסוי ל 37 ° C כדי למנוע הלם תרמי עבור התאים במהלך השלבים הבאים.
    2. הכן את המדיום תבנית על ידי השלמת DMEM / F12 בינוני עם 20 mM HEPES ו 2% של פניצילין / סטרפטומיצין.
    3. המקום מכסה את המחזיק עם הצד micropatterned למעלה ולהוסיף תבנית בינונית ברגע כיסוי הוא על בסיס המחזיק. הוסף את החותם ושתק עם המכשיר המגנטי. ממלאים את מחזיק כיסויי הכיסוי בתבנית בינונית וסוו אותו עם מכסה הזכוכית.
      הערה: היה מהיר, כדי לא לאפשר כיסוי להתייבש. אין לשטוף את מחזיק כיסוי עם אתנול בין ניסויים, כי החותם עשוי לשמור על כמה אתנול, אשר יכול להגיב עם PLL-g-PEG ותוצאה של מתח התא. יש לשטוף את מחזיק כיסוי הכיסוי רק עם מי סבון. יתר על כן, המפרק יכול להיות דגירה במדיום דפוס ב 37 מעלות צלזיוס עבור 1 שעות כדי לדלל את המוצר שיורית.
    4. לאסוף תאי hTERT-RPE1 transfected על ידי trypsinization (0.5 מ"ל עבור לוח אחד 12 גם) ולהוסיף 1 מ"ל של 10% FBS DMEM / F12 בינוני.
    5. הוסף 0.5 x 106 תאים hTERT-RPE1 transfected למחזיק כיסוי ולעקוף אותו מחדש. דגירה במשך 10 דקות באינקובטור.
    6. יש לשטוף את מחזיק כיסוי 5x עם תבנית בינונית כדי להסיר תאים שאינם מחוברים ושאריות FBS על ידי הוספת המדגם תבנית עם פיפטה אחת ושאף את המדיום עם פיפטה אחרת כדי ליצור זרימת כביסה. תמיד לשמור על נפח קטן של דפוס בינוני במחזיק כיסוי כדי למנוע ייבוש של התאים על כיסוי micropatterned, אשר יוביל למוות תא.
    7. דגירה באינקובטור במשך 3 שעות כדי לאפשר התפשטות תאים מלאה.

2. רכישת נתוני אקסוציטוזיס

  1. הדמיה של אירועי אקסוציטוזיס
    1. מחזיק כיסוי מקום מתחת ל-TIRM. יש לזהות את האות על-ידי מצלמה רגישה עם תבנית ההדמיה הטובה ביותר הזמינה.
      הערה: בניסוי זה, מטרת עדשה 100x ומצלמת EMCCD עם 512 x 512 פיקסלים אזור זיהוי שימש להולידה גודל פיקסל של 160 נארם.
    2. חפש תא המביע VAMP7-pHluorin כי הוא מופץ באופן מלא (איור 1A).
      הערה: תאים המביעים VAMP7 ניתנים לזיהוי בבירור, מכיוון שהם מציגים אות ירוק.
    3. שנה את זווית הלייזר עד לזווית TIRF המאפשרת הדמיה של אירועי אקסוציטוזיס VAMP7-pHluorin. בצע רכישה של 5 דקות בתדר התואם לקצב האקסוציטוזיס ולעוות הזמן (בדרך כלל 3 הרץ, איור 1D)באמצעות תוכנת המיקרוסקופ.
      הערה: לתאי hTERT-RPE1 יש קצב הפרשה lysomal של כ- 0.3 הרץ במיקרו-פטרנים. אקסוציטוזיס Lysosomal יש משך אופייני של 1 s. הוא מאופיין בעוצמת שיא ואחריו ריקבון אקספוננציאלי. דיפוזיה של הגשוש צריך להיות ברור בשלב זה(איור 1B, ג).
    4. עבור כל תא, לבצע גם רכישה של micropattern באמצעות תוכנת מיקרוסקופ(איור 1A).
  2. רכישת קואורדינטות אקסוציטוזיס
    1. פתח את הסרט שנרכש עם ImageJ/FIJI. השתמש בקובץ | יבוא | רצף תמונות. מצא אירועי אקסוציטוזיס בעין. אירוע אקסוציטוזיס מאופיין במראה של אות בהיר ההתפשטות כלפי חוץ(איור 1).
    2. השתמש בכלי הנקודה כדי לסמן את מרכז האירוע האקסוצ'ית. השתמש ב'ניתוח' | למדוד כדי למדוד קואורדינטות X ו- Y, כמו גם את קואורדינטת הזמן (מספר פרוסה). בצע מדידות אלה עבור כל אירועי האקסוציטוזיס של הסרט.
    3. שמור את התוצאות (תוצאות | קובץ | שמירה בשם). הכן קובץ טקסט עבור כל תא מנותח בשם "Results(cell_name).txt" המכיל את נקודות הציון של הפרוסה, קואורדינטות X ו- Y עבור כל אירועי האקסוציטוזיס בסדר זה.

      קובץ הטקסט אמור להיראות כך:
      רדיוס קוטר של מזהה X Y Feret
      RPE1_WT_Cell1 167 136 230 115
      RPE1_WT_Cell2 164 160 230 115

      הערה: הקפד להחליף את כל פסיקים בנקודות.
    4. מדוד את המרכז והקטר של כל תא באמצעות "הכלי הסגלגל". התאימו מעגל מושלם (אל תשתמשו בסגלגל) והשתמשו ב "מדידה" כדי להשיג את קואורדינטות X ו-Y וקוטרו של פרט. שמור את זהותו של כל תא (מזהה), קואורדינטות X ו- Y, קוטר ורדיוס של Feret (קוטר/2) בקובץ טקסט בשם "spherical parameter.txt".

      קובץ הטקסט אמור להיראות כך:
      רדיוס קוטר של מזהה X Y Feret
      RPE1_WT_Cell1 167 136 230 115
      RPE1_WT_Cell2 164 160 230 115

      הערה: הקפד להחליף את כל פסיקים בנקודות.
    5. מדוד את עובי טבעת המיקרו-פפטרן (אורך ההדבקה) בעזרת הכלי הישר ושמור את מזהה התא, רדיוס התא (מהקובץ: "פרמטר כדורי.txt") ואורך הדבקה בקובץ טקסט בשם "Pattern parameter.txt". חשב את אורך ההדבקה המנורמל על-ידי חלוקת אורך ההדבקה לפי רדיוס התא.
      הערה: הקפד להחליף את כל פסיקים לפי נקודות.

      הקובץ אמור להיראות כך:
      אורך הדבקת רדיוס תא מזהה אורך הדבקה מנורמל
      RPE1_WT_Cell1 115 34 0.295652174
      RPE1_WT_Cell2 115 35 0.304347826

3. ניתוח מרחבי של תא יחיד

  1. חבילת R והתקנה
    הערה: חבילת R עבור ניתוח זה מנצלת את חבילת Spatstat13 כדי לחשב את הצפיפות הדו-ממדית (2D) ואת פונקציית K של ריפלי. הקוד הוא קוד פתוח ומשתמש בקבצי טקסט שתוארו בעבר.
    1. הורד והתקן R https://www.r-project.org/ (גירסה 3.5.2 שימש בניתוח זה).
    2. הורד את החבילה (ואת ערכת הנתונים הדגמה) מ: https://github.com/GoudTeam/JoVE-paper
    3. התקן את החבילה ב- R Studio באמצעות "כלים" באמצעות "התקנת חבילות". בחר "קובץ ארכיון החבילה ( .zip; .tar.gz)" עבור הקטגוריה "התקן מ:" ובחר את קובץ החבילה. לחץ על "התקן".
    4. טען את החבילה עם הפונקציה "ספריה ("ExocytosisSpatialAnalysis") " על-ידיכתיבת פקודה זו בסטודיו R והקשה על "Enter".
    5. הפעל את החבילה עם הפונקציה "ESA()" על-ידי כתיבת פקודה זו בסטודיו R והקשה על "Enter".
      הערה: ממשק משתמש ייפתח.
    6. בחר את הספריה עבור ערכת הנתונים (קבצי .txt) ובסי ספריה עבור קווי פלט.
      הערה: ניתן לשנות פרמטרים של הניתוח (ראה טקסט להלן) באמצעות ממשק משתמש.
    7. קובץ Script זה יתחיל ויבצע את הניתוח באופן אוטומטי. הוא מספק קבצי .pdf של קוויווים תואמים וקבצי .txt המכילים תוצאות מספריות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

המאפיינים spatiotemporal של אירועי אקסוציטוזיס נותחו lysosomes חזותי על ידי VAMP7-pHluorin10,,11 בתאי hTert-RPE1. hTert-RPE1 תאים הם תאים לא טרנספורמיים לאמץ היטב micropatterning, שימשו בהרחבה במחקרים מבוססימיקרו-פטרן קודמים 4,14. VAMP7 הוא lysomal v-SNARE15 כי היה מתויג עם pHluorin סופר ecliptic ב N-terminus שלה והוא ממוקם בלומן של הליזו. בתוך התא, הגשוש pHluorin היה מרווה על ידי pH נמוך של הליזוזה, אבל במהלך pHluorin exocytosis התחיל לפלוט אות כי ה-pH גדל עקב שחרור פרוטון. VAMP7-pHluorin היה במעקב על ידי TIRFM הדמיית תאים חיים על מיקרו-פטרנים בצורת טבעת (איור 1A–B). אות ה-pHluorin הפגין שיא במהלך אקסוציטוזיס שייצג את השחרור המהיר של פרוטונים ליזומליים ואחריו ריקבון אקספוננציאלי, המייצג את דיפוזיה דו-מיועדית של הגשוש בממברנהפלזמה (איור 1C). תאי hTERT-RPE1 הציגו פעילות הפרשה ליזומלית חשובה עם קצב אקסוציטוזיס ממוצע של 0.28 הרץ(איור 1D). עם זאת, הטרוגניות גבוהה נצפתה בקצב exocytosis על פני תאים (סטיית תקן של 0.15 הרץ), המציין כי הייתה שונות חזקה מתא לתא הפרשת מן הליזוזומים.

ניתוח מרחבי של תא יחיד כדי לחקור אם אקסוציטוזיס של lysosomes הוא אקראי
ניתן היה לדמיין את התפלגות דו-מיתודה של אקסוציטוזיס על ידי KDE, כפי שבוצע בעבר עבור תאים אנדומבראניים14, אשר יכול לחשוף הבדלים צפיפויות מקומיות (איור 2B). גישה זו רלוונטית להדמיה של התפלגות ממוצעת של אוכלוסיית תאים, אך פחות אינפורמטיבית בתאים בודדים בשל המספר המוגבל של אירועים שזוהו (עשרות לעומת כמה אלפים שהושגו על ידי ניתוח מבוסס אוכלוסייה) ושונות גבוהה מתא לתא. לדוגמה, גישה זו לא אפשרה לנו להעריך אם ההתפלגות של אירועי אקסוציטוזיס באה בעקבות התנהגות אקראיות מרחבית מלאה (כלומר, תואמת לחלוקת נקודה אחידה באזור שנצפה עבור תא בודד). תבנית נקודות עוקבת אחר אופן פעולה של CSR כאשר שתי ההשערות הבאות נכונות: 1) המיקום של כל נקודה אינו תלוי במיקום של הנקודות האחרות; ו- 2) ההסתברות למצאת נקודה באזור משנה תלויה רק ביחס בין אזור אזור משנה זה לבין האזור הכולל. קיימות שלוש סטיות אפשריות מ- CSR: 1) קיבוץ באשכולות (כלומר, צבירה); 2) פיזור (כלומר, הזמנה במרחק קבוע); או 3) תערובת של קיבוץ ופיזור(איור 2C). פונקציית K של ריפלי שימשה כדי לענות על שאלה זוכמו בניתוחים קודמים 7,8,9 (איור 2D). פונקציית K של ריפלי קרובה ל-20000 (עם מרחק מנורמל מאירוע) במקרה של CSR, אבל מעולה (נחות נשימתי) במקרה של קיבוץ באשכולות (פיזור נשימתי). על-ידי חיסור ² מפונקציית K של ריפלי, עקומת CSR התיאורטית צריכה להיות ב- 0. הדמיות של מקרי CSR בוצעו באמצעות אותו מספר נקודות כמו אירועי exocytosis שנצפו כדי להעריך את הטוב של התאמה עבור מקרה CSR (מעטפה אפורה סביב העקומה התיאורטית). פונקציית K של ריפלי שהשתנתה הוחלה על הנתונים הניסיוניים הציגה ערכים חיוביים מחוץ למעטפה, המציינת קיבוץ באשכולות (איור 2D).

כדי לחקור אם קיבוץ של אירועי אקסוציטוזיס נבע מהדבקת תאים כפי שדווח בעבר6, ביצענו ניתוח דומה על נתונים באופן בלעדי של אזור התא הלא דביק במרכז(איור 2A, אזור דבק באזור מרכז תא אפור, לא דבק בלבן). שימו לב, מצאנו כי אירועי אקסוציטוזיס באזור הלא דביק התקבצו גם הם(איור 2E),מה שמצביע על כך שמולקולות הדבקה לא היו המבנים היחידים שמצאו נקודות חמות של הפרשה בממברנות פלזמה.

מכיוון שפונקציית K של ריפלי היא סטטיסטיקה תיאורית שאינו מספק ערך P, הוגדרה בדיקה סטטיסטית המשווה אירועי אקסוציטוזיס תאיים לסימולציות CSR. נעשה שימוש בשיטת NND(i) של מרחק השכן הקרוב ביותר. NDD מוגדר כמרחק האוקלידי המינימלי בין נקודה i וכל שאר הנקודות. NND(i) הממוצע מכל האירועים האקסוצ'יים של תא אחד היה מחושב בהשוואה CSR שהושג עם מספר גבוה של סימולציות מונטה קרלו (איור 2F). מצאנו כי NND הממוצע של התא היחיד שנותח איור 2F היה נמוך מהממוצע של התפלגות מדומה של מקרה CSR, המציין שכנים קרובים יותר בממוצע ובכך קיבוץ באשכולות. במקרה של פיזור, היה צפוי ערך גבוה יותר עבור NND הממוצע(איור 2C). השוואה זו אפשרה חישוב של ערך P עבור כל תא. ערך ה-P מייצג את אחוז הסימולציות שהציגו NND קיצוני יותר (באופן דו-צדדי). ליתר דיוק, ערך P לא משוחד חושב כמו (k+1)/(N+1) עם N להיות המספר הכולל של סימולציות מונטה קרלו (10,000), וk את מספר הסימולציות האלה שהיה קיצוני יותר מאשר מדדשנצפה 16. ההיסטוגרמה של כל ערכי ה- P התוותה עבור אזורהתא הכולל (איור 2G)ואזור התא הלא דביק(איור 2I). אם H0: "Exocytosis הוא תהליך CSR" היה נכון, התפלגות אחידה של ערכי P היה צפוי. אם H0 היה שקר, היה צפוי שיא בערך P נמוך. ביצוע מבחן קולמוגורוב-סמירנוב על היסטוגרמה ערך P, ערך P נחות 0.001 הושג, מראה סטייה משמעותית מ CSR בשני המקרים(דמויות 2G ו 2I). יתר על כן, מקדם קיבוץ באשכולות של 0.955 עבור אזור התא הכולל ו 1.000 עבור אזור התא שאינו דבק הצביע על כך אקסוציטוזיס lysomal היה תהליך מקובצת ללא קשר של הדבקת תאים. מקדם קיבוץ האשכולות מייצג את אחוז התאים שהיו קרובים יותר להתנהגות קיבוץ באשכולות מאשר לפיזור. תוצאה זו הייתה עקבית עם פונקציית K של ריפלי.

כדי להעריך את התפקיד של דבק תא באשכולות, השווינו את NND הממוצע באזור שאינו דבק עם זה באזור הכולל עבור כל תאבודד (איור 2H). מכיוון שה-NND הממוצע היה פרופורציונלי הפוך לצפיפות פני השטח, נרמלנו את ה-NND הממוצע של האזור הלא דביק באמצעות הומותטיות. NND הממוצע הגדול באופן משמעותי של אירועי אקסוציטוזיס באזור שאינו דבק הצביע על קיבוץ באשכולות פחות(איור 2H). לכן, למרות הפרשה מאשכולות lysosomes באזורים שאינם דביקים, הדבקת תאים נראה לשפר את קיבוץ באשכולות.

ניתוח מרחבי של אירועי אקסוציטוזיס באמצעות קואורדינטות קוטביות
הגיאומטריה המעגלית של המיקרו-פפטרן בצורת טבעת אפשרה שימוש בקואורדינטות הקוטב הנפוצות, אשר פישטו את הניתוחים, כפישנמצאו בעבר 17. כל אירוע אקסוציטוזיס יכול להיות מתואר על ידי מודולוס (מרחק מהמקור, כאן מרכז המישור התחתון של התא) וזווית (על פי ציר שרירותי קבוע). בנוסף, מודולוס יכול להיות מנורמל על ידי חלוקתו על ידי הרדיוס של התא. ההיסטוגרמה של אירועי אקסוציטוזיס זוהתה על פי המודולוס עבור תא מייצג(איור 3A). זה חשף שיא סביב הגבול בין האזורים דביק / לא דבק. שינוי גדול בין תאים נצפתה גם. לכן, אנו מאגר n = 22 תאים כדי לקבל התפלגות ממוצעת של אירועי אקסוציטוזיס. עם זאת, כדי לתת את אותו משקל סטטיסטי לכל תא, אותו מספר אירועים מכל תא נבחר באופן אקראי. בחירה אקראית זו לא שישנה את התבניות הכוללות שנראו. כדי להשיג התפלגות ממוצעת רציפה של ההפצות הבודדות של תאים בודדים, נעשה שימוש ב- KDE (איור 3B). עם זאת, מכיוון מודולוס מנורמל הוא בין 0 ו 1, תנאי קצה היה צריך להילקח בחשבון. 18 נעשה שימוש ב- 18 ליבתביתא המשנה צורה לצד קצוות. רצועה שגיאה חושבה עם אסטרטגיית מלכודת מגפיים. ההתפלגות הממוצעת שנצפתה הושוותה להתפלגות CSR היפותטית שהראתה יותר אירועים במודולוס גבוה יותר, כי האזור גדל עם מודולוס גבוה יותר. מאחר שתהיה חלק בלתי נפרד מצפיפות ההסתברות, התפלגות CSR היתה 2r (עם הרדיוס המנורמל, ללא יחידות). להקת ביטחון חושבה סביב העקומה התיאורטית באמצעות מספר רב של סימולציות CSR מונטה קרלו (5,000 כל אחד). האחוזונים 1 וה-99של התפלגות המודולוס מהסימולציות האלה היו תכנון.st מצאנו כי ההתפלגות הממוצעת של אירועי אקסוציטוזיס סטתה מההיפותטית ב-0.7rמקסימום, התואמת לתחילת אזור הדבק של התא.

ביקשנו לבדוק אם ההתפלגות הנצפית של המודולוס שונה מהתיאורטית. מכיוון שהתפלגויות ממוצעות, כמו במקרה זה, אינן יכולות להיבדק במדויק על ידי מבחן טוב לב (למשל, קולמוגורוב-סמירנוב) שיטה חלופית שהוצעה על ידי פקוט ואח'. שיטה זו מודדת את ההבדל בין הווריאציה בין אוכלוסייה לבין הווריאציה בתוך אוכלוסייה, ובכך מאפשרת בדיקה עצמאית עבור כל קואורדינטות (כלומר, מודולוסוזווית) 17. בדיקה זו שימשה להשוואת הנתונים שלנו לנתונים מדומים המייצגים אירועי אקסוציטוזיס CSR (אותו מספר תאים ואירועי אקסוציטוזיס כמו הנתונים שנצפו), ומצאה הבדל משמעותי סטטיסטית בווריאציות (p < 0.001 עם מבחן וילקוקסון-מאן-וויטני, n = 22 תאים), מה שמצביע על כך שהתפלגות האקסוציטוזיס הממוצעת שנצפתה לא הייתה CSR. עם זאת, כאשר הושוו שתי סימולציות CSR (עם 5,000 סימולציות כל אחת), מצאנו כי היסטוגרמה ערך P לא הראה התפלגות אחידה, אבל הציג שיא ליד 1, המציין כי בדיקה זו כנראה חסר רגישות.

מכיוון שהערכת KDE מסתמכת על בחירה לא טריוויאלית של רוחב פס ליבה ורגישה לאפקטי קצה, מחשבבו גם פונקציית ההתפלגות המצטברת, אשר מתגברת על הבעיות הטמונות אוונום KDE(איור תלת-מירבי). פונקציה זו מוגדרת בין 0 ל- 1 ואינה מכילה פרמטרים שרירותיים או הטיות (לדוגמה, הטיות קצה). רצועות שגיאה וביטחון חושבו באותו אופן כמו עבור התפלגות מודולוס. פונקציית ההתפלגות המצטברת אישרה כי אירועי exocytosis לא בצע התפלגות CSR אבל היו במיקום יתר במודולי סביב 0.7rמקסימום. ניתוח זה איפשר לנו לזהות אזורים תאיים שבהם אירעו קיבוץ באשכולות. שאלה מעניינת שתוצאה זו מעלה היא אם ריכוז יתר ב 0.7rמקסימום היה בגלל הנוכחות של אזורים דביקים / לא דבקים של micropattern בצורת טבעת או השפעה של אזורי הפרשה היקפית / מרכזית של תאים.

כמו ההפצה הממוצעת של אירועי אקסוציטוזיס סטה ממקרה CSR באזורים שאינם דביקים, כמו גם דבק, תהינו גם איפה צפיפות האקסוציטוזיס הייתה הגבוהה ביותר. צפיפויות פני השטח של אקסוציטוזיס באזורי הדבקה ואי-הדבקה היו מחושבים והושוו. מצאנו כי צפיפות פני השטח הייתה נמוכה יותר באזור ההדבקה מאשר באזור אי ההדבקה על ידי ניתוח מזווג(איור 3C). זה יכול להיות מוסבר על ידי הירידה החזקה של אקסוציטוזיס בפריפריה התא (0.85 – 1rמקסימום, איור 3B).

Figure 1
איור 1. אקסוציטוזיס מליזומים בתאי hTert-RPE1: (A) מיקרו-פיטרן בצורת טבעת (אדום) ותא דבק hTert-RPE1 הנגוע ב-VAMP7-pHluorin (ירוק) בתמונה של TIRFM. החץ מציג אירוע אקסוציטוזיס. סולם ברים = 10 μm. (ב)Kymograph של אירועי אקסוציטוזיס. חצים מראים אירועי אקסוציטוזיס. סרגל קנה מידה = 2 μm, סרגל קנה מידה בזמן = 5 s. (C) פרופיל אינטנסיבי מנורמל של exocytosis lysomal מ 22 תאים. כל נקודה היא ממוצע של לפחות 1,530 אירועי אקסוציטוזיס. הנתונים מוצגים ± SEM. (D) קצב אקסוציטוזיס של 22 התאים. סטיית התקן הממוצעת +/- מתווה באדום. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2. ניתוח מרחבי של אירועי אקסוציטוזיס ליזומליים. (א)חלקת פיזור של אירועי אקסוציטוזיס במהלך רכישה של 5 דקות. כל נקודה מייצגת אירוע אקסוציטוזיס אחד. אזור הדבק מוצג באפור. (ב)הערכת צפיפות ליבה דו-מיוד (KDE) של חלקת פיזור של A. הצבע מייצג את הצפיפות המקומית של אירועי אקסוציטוזיס. (ג)ייצוג סכמטי של דפוסי נקודות אפשריים. ארבעת המקרים, אקראיות מרחבית מלאה (CSR), קיבוץ באשכולות, פיזור ומעורבות מוצגים, ומספר מרחקי שכנים קרובים (NND) מתווים (קווים מקווקווים) כדי להראות כיצד NND הממוצע ירד באשכולות וגדל עם פיזור. (ד)ניתוח של תא מייצג אחד באמצעות פונקציית K של ריפלי. הקו האדום המקווה שווה "פונקציית K של ריפלי - ωr²" עבור אירועי CSR, המעטפה האפורה מייצגת את הטוב-of-fit המשוער מסימולציות מונטה קרלו עם אותו מספר נקודות כמו אירועי אקסוציטוזיס(אירוע N = 81). הקו המוצק השחור שווה ל"פונקציית K של ריפלי – ωr²" עבור אירועי אקסוציטוזיס שנצפו(אירוע N = 81). סטייתו החיובית מהעקומה האדומה מהמעטפה האפורה מצביעה על קיבוץ באשכולות של אירועי אקסוציטוזיס. פונקציית K של ריפלי הייתה מנורמלת יש ערך מרבי של 1. (ה)ניתוח של האזור הלא דביק של אותו תא באמצעות פונקציית K של ריפלי כמו ב- D. סטייה חיובית מהעקומה האדומה מחוץ למעטפה האפורה מצביעה על קיבוץ באשכולות של אירועי אקסוציטוזיס באזור שאינו דביק. (F) השוואה של התפלגות NND הממוצעת מתא נציג אחד (קו אדום) עם KDE של CSR שהושג מסימולציות מונטה קרלו (עקומה כחולה). ערך ה- P חושב כאחוז הערכים המדומים שהיו קיצוניים יותר מהערך שנצפה. (G) היסטוגרמה ערך P התקבל ממבחן NND כמו F עבור n = 26 תאים. השיא בערכי P נמוכים אומר כי השערת null "exocytosis עוקב CSR" נדחה עם מבחן Kolmogorov-סמירנוב, המציין כי אקסוציטוזיס lysomal לא היה CSR. (H) תיבת-חלקה של NND ממוצע מאירועי אקסוציטוזיס באזורים שאינם דביקים (לבן) וסכום אזורי תא (אפור). שתי נקודות הנתונים מאותו תא מצטרפו לשורה. NND הממוצע היה גדול יותר באזור שאינו דבק, p < 0.001 עם בדיקת וילקוקסון מזווג (n = 25 תאים), המציין באופן משמעותי פחות קיבוץ באשכולות באזור שאינו דבק. (I) זהה ל-G עבור האזור הלא דביק עבור n = 26 תאים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3. ניתוח מרחבי של אירועי אקסוציטוזיס lysomal הוסיף: (א)היסטוגרמה של אירועי אקסוציטוזיס של תא נציג אחד במהלך רכישה של 5 דקות עם n = 161 אירועי אקסוציטוזיס כפונקציה של מודולוס מנורמל; 0 מייצג את מרכז התא ו- 1 את הפריפריה של התא. אזור הדבק של התא מוצג באפור ומתאים moduli מ 0.65-1 עבור התאים המוצגים. יש שיא בתחילת אזור הדבק סביב מודולי בין 0.6 ו 0.7. (ב)KDE של אירועי אקסוציטוזיס כפונקציה של מודולוס מנורמל עבור n = 22 תאים עם 56 אירועים בכל תא; 0 מייצג את מרכז התא ו- 1 את הפריפריה של התא. אזור הדבק הממוצע מוצג באפור ומתאים בממוצע למודולי מ-0.61 ל-1. העקומה הכחולה המ מקווצת היא העקומה התיאורטית הצפויה במקרה של CSR. עקומה תיאורטית זו מלווה במעטפה המייצגת את האחוזונים 1-99 של CSR שהושגו באמצעות סימולציית מונטה קרלו. עקומת KDE מהנתונים שנצפו היא באדום ומלווה ברצועה שגיאה שנוצרת על-ידי רצועות מגפיים. אזור ההדבקה הוא באפור +/- SEM. (C) ניתוח מזווג של צפיפויות פני השטח באזורי הדבקה ואי-הדבקה. צפיפות פני השטח אקסוציטוזיס היה מחושב כמספר האירועים לכל אזור מנורמל ולשנייה. כאן, *p < 0.05 ממבחן t של תלמיד מזווג (n = 22 תאים). הנורמליות נבדקה בעבר על ידי בדיקת שפירו-ווילק. (D) פונקציית התפלגות מצטברת של הנתונים ב- B (קו אדום) ומסימולציות CSR מונטה קרלו (קו כחול מנוקד). מעטפות נוצרו כמו ב- B. שים לב כי הקו האדום סוטה מ- CSR התיאורטי בסביבות 0.7rמקסימום. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

עקבנו אחר אירועי אקסוציטוזיס מהתא הליזומלי על ידי TIRFM הדמיית תאים חיים של VAMP7-pHluorin בתאים מיקרו-פטרן בצורת טבעת מנורמל וביצע ניתוח סטטיסטי קפדני של הפרמטרים המרחביים של אירועי אקסוציטוזיס. מתוך שימוש בתפקוד ה-K של ריפלי ומבחן סטטיסטי המבוסס על מרחק השכן הקרוב ביותר, אישרנו כי הפרשה מlysosomes אינהתהליך אקראי 8,9. שני הניתוחים הסטטיסטיים הראו בצורה משכנעת כי אירועי אקסוציטוזיס מציגים קיבוץ באשכולות (דמויות דו-מיוד ו-2G). החלת כלים דומים על אזור התא הלא דביק, מצאנו כי אירועי אקסוציטוזיס מקובצים גם באזורים לאדביקים (דמויות 2E ו- 2I). לכן, מולקולות הדבקה שדווחו בעבר כדי לאפשר קיבוץבאשכולות 6 אינם המבנים היחידים שיכולים לגרום הפרשת נקודות חמות על קרום פלזמה. עם זאת, דבק התא משופר קיבוץ באשכולות: המרחק השכן הקרוב ביותר הממוצע בין אירועי אקסוציטוזיס היה גדול יותר באופן משמעותי באזורים שאינםדביקים (איור 2H). באופן עקבי, הניתוח שלנו המבוסס על הערכת צפיפות הקרנל ופונקציית ההתפלגות המצטברת זיהו אזורים מועשרים של אקסוציטוזיס שהיו ממוקמים בגבול בין האזורים הדביקים ולא דבקים בתאי מיקרו-פטרן בצורת טבעת. צורך בעבודה נוספת כדי לקבוע את המנגנונים המולקולריים הבסיסיים קיבוץ באשכולות, כגון הדבקה או פילוח ספציפי של ליזוזה לאזור זה. מעניין, הבחנו הטרוגניות גבוהה בקצב exocytosis על פני תאי hTERT-RPE1 (סטיית תקן של 0.15 הרץ עבור קצב אקסוציטוזיס ממוצע של 0.28 הרץ, איור 1D),המציין כי הפרשה מlysosomes יש וריאציה בין תאית גבוהה. לכן, יש לקחת בחשבון ניתוחי תת-אוכלוסיה בעבודה עתידית. יהיה מעניין במיוחד לחקור אם וריאציה זו משקפת את המגוון של תאים ליזומליים, הבדלים במטענים, או תלות במכונות אקסוציטוזיס.

תוצאות אלה ממחישות כיצד ניתן להשתמש בכלים סטטיסטיים כדי לחקור פרמטרים מרחביים של תהליכים ביולוגיים מגוונים. יתר על כן, micropatterns להקל על המחקר של ההשפעה של הדבקת תאים באופן משוחד בעזרת גיאומטריות micropattern שונות (למשל, טבעת בצורת לעומת disk עוצב). בפרט, השימוש בצורות עגולות מקל על ניתוחים מכיוון שניתן להשתמש בקואורדינטות קוטביות. מכיוון שכלים סטטיסטיים דורשים כמות מסוימת של נתונים כדי להיות בעלי משמעות, תאים עם יותר מ-30 אירועים שימשו לניתוח שלנו. עם זאת, קיימת אפשרות כי תאים עם 30 או פחות אירועים הם בעלי משמעות. לכן, ניתן לבצע דגימה של תאים עם 30 אירועים או פחות כדי להשיג אירועים מספיקים לניתוח כדי לקבוע אם זה המקרה. באופן דומה, קשה להעריך כמה תאים יש לנתח, במיוחד אם יש וריאציה בין תאית חזקה. דרך אחת לעקוף זאת היא לבחור באופן אקראי את אותו מספר אירועים מכל תא כדי לתת את אותו משקל סטטיסטי לכל תא בעת אוסף אותם. עם זאת, אנו ממליצים כי ניתוחים על פחות מ 15 תאים ליעשה עם אמצעי זהירות. מכיוון שלא ניתן לבחון במדויק התפלגויות ממוצעות של תאים המאגרים על-ידי בדיקות טובות-התאמה (לדוגמה, קולמוגורוב-סמירנוב) העסקנו סטטיסטיקת בדיקה שהוצעה על ידי פקוט ואח' המודדת את ההבדל בווריאציותשל אוכלוסיות 17. למרות שבדיקה זו אפשרה לנו למצוא הבדל משמעותי סטטיסטית בווריאציות בהפצות הממוצעות, אנו חושדים כי לבדיקה זו יש רגישות נמוכה מכיוון שהיסטוגרמה ערך P לא הייתה שטוחה (כלומר, הראתה התפלגות אחידה) בעת השוואת סימולציות CSR שונות עבור ערכי p קרוב ל- 1. לכן, ייתכן שיהיה צורך לשפר הליך סטטיסטי זה.

חיסרון אחד לניתוחים שלנו הוא זיהוי ידני של אירועי אקסוציטוזיס, אשר מפחית באופן דרסטי את מהירות הניתוח. מגבלות בזיהוי אוטומטי נובעות לעתים קרובות מהטרוגניות חזקה בפרמטר הייחודי והפשוט שנותח (לדוגמה, עוצמת אירועי אקסוציטוזיס). רשתות עצביות עלולות להיות חזקות פוטנציאליות לזיהוי אוטומטי, מכיוון שניתן לאמן אותם לזהות תכונות רבות.

הניתוח המוצג כאן יכול להיות מיושם על תהליכים דינמיים אחרים שנצפו על ידי TIRFM, כגון הפרשה מתאיים אחרים ואת ההפצה של microdomain קרום או מצגת אנטיגן. ניתוחים דומים יכולים להיות מיושמים גם על תאים קבועים על מנת ללמוד את ההפצה המרחבית של חלבונים. אנו מקווים שעבודתנו תשפר את ההתעניינות הגוברת בניתוח הפצה מרחבית בביולוגיה של תאים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

לסופרים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

אנו מכירים מאוד תיירי גאלי (המרכז לפסיכיאטריה ומדעי המוח, INSERM) למתן פלסמיד VAMP7-pHluorin. אנו מודים לטארן דואונג על ייעוץ בנושא ניתוח סטטיסטי וחברי מעבדת GOUD לדיונים פוריים. המחברים מכירים מאוד את מתקן הדמיית תאים ורקמות (PICT-IBiSA @Burg, PICT-EM @Burg ו PICT-IBiSA @Pasteur) ואת ניקון הדמיה מרכז, המכון קירי (פריז), חבר תשתית המחקר הלאומי הצרפתי צרפת-BioImaging (ANR10-INBS-04). H.L. נתמך על ידי האגודה לשפוך la Recherche sur le Cancer (ARC) ו P.M. קיבל מימון מתכנית המחקר והחדשנות אופק של האיחוד האירופי 2020 תחת מארי Skłodowska-Curie מענק הסכם מס ' 666003. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מ-INFECT-ERA (ANR-14-IFEC-0002-04), Labex CelTisPhyBio (ANR-10-LBX-0038) ו-Idex Paris Sciences et Lettres (ANR-10-IDEX-0001-02 PSL), כמו גם המרכז הלאומי דה לה רשרש סיינטיפיק ומשקיע קירי.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chamlide Magnetic Chamber Chamlide
DMEM/F12 Gibco 21041-025
Fibrinogen Molecular Probes, Invitrogen F35200
Fibronectin bovine plasma Sigma F1141
HEPES (1M) Gibco 15630-056
hTert RPE1 cell line https://www.atcc.org
ImageJ http://rsbweb.nih.gov/ij/ n/a Authored by W. Rasband, NIH/NIMH
JetPRIME Transfection reagent Polyplus 114-07
Penicilin/Streptomycin Gibco 15140-122
Photomask Delta Mask
PLL-g-PEG solution Surface Solutions PLL(20)-g[3.5]- PEG(2)
R Software https://www.r-project.org/ n/a
Trypsin (TrypLE Express 1X) Gibco 12605-010
UV ozone oven Jelight Company Inc 342-220
VAMP7-pHFluorin plasmid n/a n/a Paper reference :http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Role+of+HRB+in+clathrin-dependent+endocytosis.
J Biol Chem. 2008 Dec 5;283(49):34365-73. doi: 10.1074/jbc.M804587200.
Role of HRB in clathrin-dependent endocytosis.
Chaineau M, Danglot L, Proux-Gillardeaux V, Galli T.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wu, L. -G., Hamid, E., Shin, W., Chiang, H. -C. Exocytosis and endocytosis: modes, functions, and coupling mechanisms. Annual Review of Physiology. 76, 301-331 (2014).
  2. Samie, M. A., Xu, H. Lysosomal exocytosis and lipid storage disorders. Journal of Lipid Research. 55, 995-1009 (2014).
  3. Neher, E., Marty, A. Discrete changes of cell membrane capacitance observed under conditions of enhanced secretion in bovine adrenal chromaffin cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79, 6712-6716 (1982).
  4. Grossier, J. P., Xouri, G., Goud, B., Schauer, K. Cell adhesion defines the topology of endocytosis and signalling. The EMBO Journal. 33, 35-45 (2014).
  5. Fourriere, L., et al. RAB6 and microtubules restrict protein secretion to focal adhesions. Journal of Cell Biology. 218, 2215-2231 (2019).
  6. Wang, Y., McNiven, M. A. Invasive matrix degradation at focal adhesions occurs via protease recruitment by a FAK-p130Cas complex. Journal of Cell Biology. 196, 375-385 (2012).
  7. Lagache, T., Lang, G., Sauvonnet, N., Olivo-Marin, J. C. Analysis of the spatial organization of molecules with robust statistics. PLoS One. 12, 80914 (2013).
  8. Yuan, T., Lu, J., Zhang, J., Zhang, Y., Chen, L. Spatiotemporal Detection and Analysis of Exocytosis Reveal Fusion "Hotspots" Organized by the Cytoskeleton in Endocrine Cells. Biophysical Journal. 108, 251-260 (2015).
  9. Urbina, F. L., Gomez, S. M., Gupton, S. L. Spatiotemporal organization of exocytosis emerges during neuronal shape change. Journal of Cell Biology. 217, 1113-1128 (2018).
  10. Martinez-Arca, S., Alberts, P., Zahraoui, A., Louvard, D., Galli, T. Role of Tetanus Neurotoxin Insensitive Vesicle-Associated Membrane Protein (Ti-Vamp) in Vesicular Transport Mediating Neurite Outgrowth. Journal of Cell Biology. 149, 889-900 (2000).
  11. Alberts, P., et al. Cdc42 and Actin Control Polarized Expression of TI-VAMP Vesicles to Neuronal Growth Cones and Their Fusion with the Plasma Membrane. Molecular Biology of Cell. 17, 1194-1203 (2006).
  12. Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Théry, M., Piel, M. Simple and rapid process for single cell micro-patterning. Lab on a Chip. 9, 1640-1642 (2009).
  13. Baddeley, A., Rubak, E., Turner, R. Spatial point Patterns: Methodology and Applications with R. , CRC Press. Indianapolis, IN. (2015).
  14. Schauer, K., et al. Probabilistic density maps to study global endomembrane organization. Nature Methods. 7, 560-566 (2010).
  15. Advani, R. J., et al. Seven Novel Mammalian SNARE Proteins Localize to Distinct Membrane Compartments. Journal of Biological Chemistry. 273, 10317-10324 (1998).
  16. North, B. V., Curtis, D., Sham, P. C. A Note on the Calculation of Empirical P Values from Monte Carlo Procedures. American Journal of Human Genetics. 71, 439-441 (2002).
  17. Pecot, T., Zengzhen, L., Boulanger, J., Salamero, J., Kervrann, C. A quantitative approach for analyzing the spatio-temporal distribution of 3D intracellular events in fluorescence microscopy. eLife. 7, 32311 (2018).
  18. Chen, S. X. Beta kernel estimators for density functions. Computational Statistics & Data Analysis. 31, 131-145 (1999).

Tags

ביולוגיה גיליון 163 מיקרו-פטרן ליזוזה אקסוציטוזיס TIRFM CSR VAMP7
כימות פרמטרים Spatiotemporal של אקסוציטוזיס תאי בתאים Micropatterned
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lachuer, H., Mathur, P., Bleakley,… More

Lachuer, H., Mathur, P., Bleakley, K., Schauer, K. Quantifying Spatiotemporal Parameters of Cellular Exocytosis in Micropatterned Cells. J. Vis. Exp. (163), e60801, doi:10.3791/60801 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter