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Biology

माइक्रोपैटर्न्ड कोशिकाओं में सेलुलर एक्सोसाइटोसिस के स्पैटीियोटेम्परल पैरामीटर की मात्रा निर्धारित करना

Published: September 16, 2020 doi: 10.3791/60801
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 4, 1,2,3
1Unité Mixte de Recherche 144 CNRS, Molecular Mechanisms of Intracellular Transport group, Institut Curie, 75005 Paris, France, 2PSL Research University, Paris, France, 3Sorbonne Université, Paris, France, 4INRIA, Université Paris-Sud, PSL

Summary

माइक्रोपैटर्न्ड कोशिकाओं पर लिसोसोमल एक्सोसाइटोसिस की लाइव इमेजिंग इस प्रक्रिया के स्थानिक मात्राकरण की अनुमति देती है। माइक्रोपैटर्न का उपयोग करके आकृति विज्ञान सामान्यीकरण सेलुलर प्रक्रियाओं के स्थानिक वितरण के बारे में सामान्य नियमों को उजागर करने के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण है।

Abstract

कुल आंतरिक प्रतिबिंब फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी (टीआईआरएफएम) द्वारा कूपिन टैग किए गए घुलनशील एन-एथिलमलेइमाइड-सेंसिटिव-फैक्टर अटैचमेंट प्रोटीन आरईपीसेप्टर (वी-SNARE) वेसिकल-संबद्ध झिल्ली प्रोटीन 7 (VAMP7) की लाइव इमेजिंग लिसोसोमल डिब्बे से स्राव का पता लगाने का एक सीधा तरीका है। कोशिका आकार को सामान्य बनाने के लिए माइक्रोपैटर्न्ड सतहों पर सेल संस्कृति का लाभ उठाते हुए, विभिन्न प्रकार के सांख्यिकीय उपकरणों को गुप्त पैटर्न का स्थानिक विश्लेषण करने के लिए नियोजित किया गया था। रिप्ले के कश्मीर फ़ंक्शन और निकटतम पड़ोसी दूरी (एनएनडी) के आधार पर एक सांख्यिकीय परीक्षण का उपयोग करके, हमने पुष्टि की कि लाइसोसोम्स से स्राव एक यादृच्छिक प्रक्रिया नहीं है बल्कि महत्वपूर्ण क्लस्टरिंग दिखाता है। ध्यान दें, हमारे विश्लेषण से पता चला है कि एक्सोसाइटोसिस की घटनाओं को गैर-चिपकने वाले क्षेत्रों में भी संकुलित किया जाता है, यह दर्शाता है कि आसंजन अणु केवल संरचनाएं नहीं हैं जो प्लाज्मा झिल्ली पर गुप्त गर्म स्थानों को प्रेरित कर सकती हैं। फिर भी, हमने पाया कि सेल आसंजन क्लस्टरिंग को बढ़ाता है। ठीक परिभाषित चिपकने वाले और गैर चिपकने वाले क्षेत्रों के अलावा, इन माइक्रोपैटर्न की परिपत्र ज्यामिति ध्रुवीय निर्देशांक के उपयोग की अनुमति देती है, विश्लेषण को सरल बनाती है। हमने कर्नेल घनत्व अनुमान (केडीई) और एक्सोसाइटोसिस घटनाओं के ध्रुवीय समन्वय पर संचयी वितरण समारोह का उपयोग एक्सोसाइटोसिस के समृद्ध क्षेत्रों की पहचान करने के लिए किया। रिंग के आकार की माइक्रोपैटर्न कोशिकाओं में, चिपकने वाले और गैर चिपकने वाले क्षेत्रों के बीच सीमा पर क्लस्टरिंग हुई। हमारा विश्लेषण दिखाता है कि विविध जैविक प्रक्रियाओं के स्थानिक वितरण की जांच करने के लिए सांख्यिकीय उपकरणों को कैसे नियोजित किया जा सकता है।

Introduction

एक्सोसाइटोसिस एक सार्वभौमिक सेलुलर प्रक्रिया है जिसमें एक वेसिकल प्लाज्मा झिल्ली के साथ फ़्यूज़ करता है और इसकी सामग्री जारी करता है। वेसिकल या तो प्लाज्मा झिल्ली (पूर्ण संलयन) के साथ पूरी तरह से फ्यूज कर सकता है या एक संलयन ताकना बना सकता है जो सीमित समय (चुंबन और रन) 1 केदौरानखुला रहता है। उदाहरण के लिए, नए संश्लेषित प्रोटीन गोलगी परिसर से आने वाले वेसिकल्स से बाह्य माध्यम में जारी किए जाते हैं। यह बायोसिंथेटिक, एंटेरोग्रेड मार्ग मौलिक है, विशेष रूप से बहुकोशिकीय जीवों में, सिग्नलिंग पेप्टाइड्स (जैसे, हार्मोन, न्यूरोट्रांसमीटर) और एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स घटकों (जैसे, कोलेजन) को स्रावित करने के साथ-साथ प्लाज्मा झिल्ली में ट्रांसमेम्ब्रान प्रोटीन के लिए भी। इसके अतिरिक्त, स्राव विभिन्न एंडोसोम्स से हो सकता है: 1) ट्रांसमेम्ब्रान प्रोटीन का पुन: उपयोग करने के लिए एंडोसोम्स को रीसाइक्लिंग; 2) मल्टीवेस्कुलर निकाय (एमवीबी) एक्सोसोम्स जारी करने के लिए; और 3) प्रोटियोलिटिक एंजाइमों की रिहाई के लिए लाइसोसोम्स। एंडोसोमल स्राव को न्यूराइट आउटग्रोथ, स्यूडोपोडिया गठन, प्लाज्मा झिल्ली की मरम्मत और एटीपी-निर्भर सिग्नलिंग2के लिए महत्वपूर्ण दिखाया गया है।

एकल कोशिका स्तर पर एक्सोसाइटोसिस का अध्ययन करने के लिए, कई तकनीकों को नियोजित किया गया है। पैच-क्लैंप जीवित कोशिकाओं की एक विस्तृत विविधता में उच्च लौकिक संकल्प के साथ एकल एक्सोसाइटोसिस घटनाओं का पता लगाने के लिए अनुमति देता है3। हालांकि, यह विधि एक्सोसाइटोसिस घटनाओं के स्थानीयकरण के बारे में जानकारी प्रदान नहीं करती है, न ही यह किस डिब्बे से होती है। इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी उच्च स्थानिक संकल्प के साथ एक्सोसाइटिक घटनाओं के प्रत्यक्ष दृश्य की अनुमति देता है, और इम्यूनोलाबेलिंग के संयोजन में शामिल डिब्बों और अणुओं की विशिष्टता के बारे में जानकारी प्रदान करता है। इस दृष्टिकोण का एक नुकसान प्रक्रिया की गतिशीलता के बारे में जानकारी की कमी है, साथ ही उच्च थ्रूपुट अध्ययन करने में असमर्थता भी है। कुल आंतरिक प्रतिबिंब फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी (टीआईआरएफएम) जैसे हल्के माइक्रोस्कोपी दृष्टिकोण, जो कवरस्लिप (100 एनएम) के आसपास फ्लोरोफोरस को रोशन करने के लिए इवानसेंट क्षेत्र का शोषण करते हैं, एक्सोसाइटोसिस घटनाओं का अध्ययन करने के लिए अच्छा लौकिक और स्थानिक संकल्प प्रदान करता है। हालांकि, यह विधि केवल अनुयायी कोशिकाओं के साथ संगत है और केवल कोशिकाओं के वेंट्रल/अवर भाग पर लागू की जा सकती है।

ध्यान दें, प्लाज्मा झिल्ली चिपकने वाले परिसरों के आधार पर महत्वपूर्ण विषमता का पता चलता है जो केवल प्रतिबंधित क्षेत्रों में मौजूद हैं। उदाहरण के लिए, यह विषमता विभिन्न लिगामेंट्स4के तेज को प्रतिबंधित करती है। इसी तरह, हाल ही में यह सूचित किया गया है कि गोलगी परिसर से स्राव प्लाज्मा झिल्ली5में "हॉट स्पॉट" पर केंद्रित है। इसके अलावा, यह ज्ञात है कि फोकल-आसंजन से जुड़े एक्सोसाइटोसिस6के माध्यम से कुछ कार्गो स्रावित होते हैं। इस प्रकार, इस सवाल पर विशेष ध्यान दिया जाना चाहिए कि क्या एक्सोसाइटोसिस की घटनाओं को अंतरिक्ष में बेतरतीब ढंग से वितरित किया जाता है, या क्या वे प्लाज्मा झिल्ली के विशिष्ट क्षेत्रों पर केंद्रित हैं। रिप्ले के फ़ंक्शन पर आधारित कई सांख्यिकीय उपकरण इन प्रश्नों को तलाशने का प्रस्ताव किया गया है7,8,9. हमारा दृष्टिकोण सेल आकार और प्लाज्मा झिल्ली विषमता को नियंत्रित करने के लिए माइक्रोपैटर्निंग के साथ इन उपकरणों को जोड़ती है। चिपकने वाले और गैर चिपकने वाले क्षेत्रों के बीच अंतर करने का साधन प्रदान करने के अलावा, यह तकनीक विभिन्न कोशिकाओं और स्थितियों में तुलना की अनुमति देती है और सांख्यिकीय विश्लेषणों की शक्ति को बढ़ाती है।

यहां हम रिंग-आकार के माइक्रोपैटर्न-सामान्यीकृत एचटर्ट-आरपीई1 कोशिकाओं में VAMP7-pHluorin के TIRFM लाइव सेल इमेजिंग द्वारा निगरानी किए गए लिसोसोमल डिब्बे से एक्सोसाइटोसिस घटनाओं के स्थानिक वितरण का अध्ययन करने के लिए विभिन्न सांख्यिकीय उपकरणों को नियोजित करते हैं। यह पुष्टि की गई थी कि लाइसोसोम्स से स्राव एक यादृच्छिक प्रक्रिया नहीं है8,,9 और यह एक्सोसाइटोसिस घटनाएं क्लस्टरिंग प्रदर्शित करती हैं। ध्यान दें, हमने पाया कि एक्सोसाइटोसिस की घटनाओं को गैर चिपकने वाले क्षेत्रों में भी संकुलित किया जाता है, यह दर्शाता है कि आसंजन अणु एकमात्र संरचनाएं नहीं हैं जो प्लाज्मा झिल्ली पर गुप्त गर्म स्थानों को प्रेरित कर सकती हैं। फिर भी, सेल आसंजन ने क्लस्टरिंग को बढ़ाया। लगातार, हमारे विश्लेषण ने एक्सोसाइटोसिस के समृद्ध क्षेत्रों की पहचान की जो चिपकने वाले और असाध्य क्षेत्रों के बीच सीमा पर स्थित थे।

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Protocol

1. माइक्रोपैटर्न्ड कोशिकाओं की तैयारी

  1. कोशिकाओं का ट्रांसफेक्शन
    1. ट्रांसफेक्शन से एक दिन पहले, बीज 2.5 x 106 एचटीईआरटी-आरपीई1 कोशिकाओं को माध्यम के 1 एमएल में 12 अच्छी प्लेट (2 x 2 सेमी) के एक कुएं में।
    2. ट्रांसफैक्शन के दिन, वाष्प 7-पीएचलूरिन प्लाज्मिड (बफर के 100 माइक्रोन, डीएनए के 0.8 माइक्रोग्राम, ट्रांसफैक्शन मिश्रण के 3 माइक्रोन) के साथ ट्रांसफैक्शन मिश्रण तैयार करें। 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट ।
      नोट: VAMP7 एक lysosomal v-SNARE है, जो एक चमकदार pHluorin टैग के साथ जुड़ा हुआ है। पीएचलूरिन जांच कम पीएच द्वारा बुझाई जाती है, लेकिन एक्सोसाइटोसिस प्रोटॉन जारी किए जाते हैं और पीएचलूरिन एक संकेत10,,11उत्सर्जित करना शुरू कर देता है।
    3. अपने माध्यम में कोशिकाओं के लिए ट्रांसफेक्शन मिश्रण जोड़ें।
    4. कोशिकाओं पर ट्रांसफैक्शन मिक्स जोड़ने के बाद मीडियम 4 एच बदलें।
    5. अगले 24-48 घंटे के दौरान प्रयोगों के लिए कोशिकाओं का उपयोग करें।
  2. माइक्रोपैटर्न तैयारी (फोटोलिथोग्राफी विधि)
    1. इथेनॉल में कवरस्लिप (25 मिमी व्यास) धोएं और उन्हें 5 मिनट तक सूखने दें।
    2. 5 मिनट के लिए गहरी यूवी के तहत रोशनी से कवरस्लिप को सक्रिय करें।
    3. एक पेपर तौलिया को अच्छी तरह से आर्द्र बनाकर एक आर्द्र कक्ष बनाएं जिस पर पैराफिन फिल्म रखी गई है। पॉली-एल-लिसिन-ग्राफ्ट-पॉलीथीन ग्लाइकोल (पीएलएल-जी-खूंटी) समाधान (0.1 मिलीग्राम/एमएल, 10 एमएम एचईपीई, पीएच = 7.4) की बूंदें (22 मिमी कवरस्लिप के लिए 30 माइक्रोल) जोड़ें और उन पर सक्रिय सतह के साथ कवर्लिक रखें। 1 घंटे के लिए एक शीर्ष और इनक्यूबेट कवर्लिप्स के साथ आर्द्र कक्ष को बंद करें।
    4. पीबीएस में 2x और आसुत पानी में 1x को धोएं और उन्हें सूखने दें।
    5. क्वार्ट्ज फोटोमास्क को आसुत पानी से धोएं और फिर इथेनॉल या प्रोपनॉल से धोएं। फ़िल्टर किए गए एयरफ्लो के साथ फोटोमास्क को सुखाएं।
      नोट: क्वार्ट्ज फोटोमास्क को एंटीरिफ्लेक्टिव क्रोम के साथ एक तरफ लेपित किया जाता है जिसमें माइक्रोपैटर्न के रूप में छेद होते हैं। इस प्रोटोकॉल में 37 माइक्रोन के रिंग के आकार के माइक्रोपैटर्न युक्त फोटोमास्क का उपयोग किया जाता है। जब फोटोमास्क पर गहरी यूवी चमकती है, तो प्रकाश केवल इनछेदों 12से गुजर सकता है।
    6. सतह को साफ करने के लिए 5 मिनट के लिए डीप यूवी के लिए फोटोमास्क (क्रोम-लेपित साइड) का पर्दाफाश करें।
    7. फोटोमास्क के क्रोम-लेपित पक्ष पर छोटी पानी की बूंदें (20 मिमी कवरलिप के लिए 10 माइक्रोन) जोड़ें। कवरलिप को उनके पीएलएल-जी-खूंटी-उपचारित पक्ष के साथ बूंद पर रखें और अतिरिक्त पानी को सुखाएं। सुनिश्चित करें कि मास्क और कवर्लिप्स के बीच कोई हवा के बुलबुले नहीं बनाते हैं।
      नोट: पानी का केशिका बल कवरस्लिप को स्थिर करेगा।
    8. फोटोमास्क को गैर-क्रोम-लेपित साइड अप (कवरस्लिप निचली सतह पर संलग्न हैं) के साथ 5 मिनट के लिए डीप यूवी में बेनकाब करें।
      नोट: प्रकाश केवल छेद के माध्यम से पारित कर सकते है और फोटोमास्क के नीचे कवरस्लिप की PLL-जी-खूंटी इलाज सतह को संशोधित ।
    9. अतिरिक्त पानी डालकर फोटोमास्क से कवरस्लिप निकालें।
      नोट: कवरस्लिप को जल्दी से तैरना चाहिए।
    10. एक आर्द्र कक्ष में पैराफिन फिल्म पर एक्स्ट्रासेलुलर मैट्रिक्स प्रोटीन (50 माइक्रोग्राम/एमएलए ऑफ फाइब्रोनेक्टिन, 5μg/ml पानी में पतला) के समाधान में कवरस्लिप को एक आर्द्र कक्ष में पैराफिन फिल्म पर (कदम 1.2.3 के रूप में) एक लैमिनर प्रवाह हुड के नीचे 1 एच के लिए संदूषण से बचने के लिए।
      नोट: प्रयोग को पीबीएस में कवरस्लिप को 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित करके इस बिंदु पर रोका जा सकता है।
  3. माइक्रोपैटर्न्ड सतहों पर सेल सीडिंग
    1. एक चुंबकीय कवरस्लिप धारक का उपयोग करें जो कवरस्लिप को माउंट करने के लिए माइक्रोपैटर्न्ड कवर्लिप्स के आकार को फिट बैठता है। अधिग्रहण के दिन, बाद के चरणों के दौरान कोशिकाओं के लिए थर्मल शॉक से बचने के लिए कवरस्लिप धारक को 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।
    2. 20 एमएम एचईपीई और 2% पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ डीएमईएम/एफ12 मीडियम को सप्लीमेंट करके पैटर्न मीडियम तैयार करें ।
    3. कवरस्लिप को माइक्रोपैटर्न्ड साइड अप के साथ होल्डर में रखें और जैसे ही कवरस्लिप होल्डर बेस पर हो, पैटर्न मीडियम डालें । सील जोड़ें और चुंबकीय डिवाइस के साथ स्थिर। कवरस्लिप धारक को पैटर्न माध्यम से भरें और इसे ग्लास ढक्कन के साथ बंद करें।
      नोट: जल्दी हो, कवरस्लिप सूखने की अनुमति नहीं है । प्रयोगों के बीच इथेनॉल के साथ कवरस्लिप धारक को न धोएं, क्योंकि सील कुछ इथेनॉल को बनाए रख सकती है, जो पीएलएल-जी-खूंटी के साथ प्रतिक्रिया कर सकती है और परिणामस्वरूप सेल तनाव हो सकता है। कवरस्लिप धारक को केवल साबुन के पानी से धोएं। इसके अलावा, अवशिष्ट उत्पाद को पतला करने के लिए संयुक्त को 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पैटर्न माध्यम में इनक्यूबेटेड किया जा सकता है।
    4. ट्राइपसिनाइजेशन (एक 12 वेल प्लेट के लिए 0.5 एमएल) द्वारा संक्रमित एचटीआरटी-आरपीई1 कोशिकाओं को एकत्र करें और 10% एफबीएस डीएमईएम/एफ 12 माध्यम के 1 एमएल जोड़ें।
    5. कवरस्लिप धारक को 0.5 x10 6 संक्रमित एचटीआरटी-आरपीई1 कोशिकाओं को जोड़ें और इसे फिर से बंद करें। इनक्यूबेटर में 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
    6. एक पिपेट के साथ पैटर्न माध्यम जोड़कर और एक धोने के प्रवाह को बनाने के लिए एक और पिपेट के साथ माध्यम को एस्पिर करने के लिए गैर संलग्न कोशिकाओं और अवशिष्ट एफबीएस को हटाने के लिए पैटर्न माध्यम के साथ कवरस्लिप धारक 5x धोएं। माइक्रोपैटर्न्ड कवरस्लिप पर कोशिकाओं के सूखने से बचने के लिए कवरस्लिप होल्डर में पैटर्न मीडियम की एक छोटी मात्रा हमेशा रखें, जिससे सेल डेथ हो जाएगी।
    7. पूर्ण कोशिका को फैलाने की अनुमति देने के लिए 3 घंटे के लिए इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट।

2. एक्सोसाइटोसिस डेटा का अधिग्रहण

  1. एक्सोसाइटोसिस घटनाओं की इमेजिंग
    1. एक टीआईआरएम के तहत कवरस्लिप धारक रखें। सिग्नल का पता सबसे अच्छा इमेजिंग प्रारूप उपलब्ध के साथ स्थापित एक संवेदनशील कैमरे से किया जाना है।
      नोट: इस प्रयोग में, 100x लेंस उद्देश्य और 512 x 512 पिक्सेल डिटेक्शन क्षेत्र के साथ एक EMCCD कैमरा 160 एनएम के पिक्सेल आकार को जन्म देने का उपयोग किया गया था।
    2. VAMP7-pHluorin व्यक्त करने वाले सेल की खोज करते हैं जो पूरी तरह से फैल गया है(चित्रा 1A)।
      नोट: VAMP7 व्यक्त करने वाली कोशिकाएं स्पष्ट रूप से पहचाने जाने योग्य हैं, क्योंकि वे हरी झंडी प्रदर्शित करते हैं।
    3. एक TIRF कोण है कि VAMP7-pHluorin एक्सोसाइटोसिस घटनाओं के दृश्य तक पहुंच गया है की अनुमति देता है जब तक लेजर के कोण बदलें । माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर का उपयोग करके एक्सोसाइटोसिस दर और समय पैमाने (आमतौर पर 3 हर्ट्ज, चित्रा 1D)के साथ संगत आवृत्ति पर 5 मिनट का अधिग्रहण करें।
      नोट: hTERT-RPE1 कोशिकाओं माइक्रोपैटर्न पर लगभग 0.3 हर्ट्ज की एक lysosomal गुप्त दर है। Lysosomal एक्सोसाइटोसिस की एक विशिष्ट अवधि 1 एस है। यह एक चोटी की तीव्रता की विशेषता है जिसके बाद घातीय क्षय होता है। जांच का प्रसार इस समय स्पष्ट होना चाहिए(चित्र 1 बी, सी)।
    4. प्रत्येक सेल के लिए, माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर(चित्रा 1A)का उपयोग करके माइक्रोपैटर्न का अधिग्रहण भी करें।
  2. एक्सोसाइटोसिस का अधिग्रहण निर्देशांक
    1. इमेजजे/फिजी के साथ अधिग्रहीत फिल्म खोलें । फ़ाइल का उपयोग करें । आयात । इमेज सीक्वेंस। आंखों से एक्सोसाइटोसिस की घटनाओं का पता लगाएं। एक एक्सोसाइटोसिस घटना एक उज्ज्वल संकेत है कि बाहर फैलता है(चित्रा 1)की उपस्थिति की विशेषता है ।
    2. एक्सोसाइटिक घटना के केंद्र को चिह्नित करने के लिए बिंदु उपकरण का उपयोग करें। विश्लेषण का उपयोग करें । एक्स और वाई निर्देशांक को मापने के उपाय, साथ ही लौकिक समन्वय (टुकड़ा संख्या) । फिल्म की सभी एक्सोसाइटोसिस घटनाओं के लिए ये माप करें।
    3. परिणामों को सहेजें (परिणाम । फाइल । के रूप में बचाओ)। "परिणाम (cell_name)txt" नामक प्रत्येक विश्लेषण कोशिका के लिए एक टेक्स्ट फ़ाइल तैयार करें जिसमें स्लाइस, एक्स निर्देशांक और वाई उस क्रम में सभी एक्सोसाइटोसिस घटनाओं के लिए निर्देशांक हैं।

      टेक्स्ट फ़ाइल को इस तरह से देखना चाहिए:
      आईडी एक्स वाई फेरेट का व्यास त्रिज्या
      RPE1_WT_Cell1 167 136 230 115
      RPE1_WT_Cell2 164 160 230 115

      नोट: अंक के साथ सभी अल्पविराम की जगह सावधान रहें ।
    4. "ओवलटूल"का उपयोग करके प्रत्येक कोशिका के केंद्र और व्यास को मापें। एक आदर्श चक्र फिट (एक अंडाकार का उपयोग नहीं करते हैं) और एक्स और वाई निर्देशांक और Feret व्यास प्राप्त करने के लिए"उपाय"का उपयोग करें। "गोलाकार पैरामीटर.txt" नामक एक टेक्स्ट फाइल में प्रत्येक सेल की पहचान (आईडी), एक्स और वाई निर्देशांक, फेरेट का व्यास, और त्रिज्या (व्यास/2) सहेजें।

      टेक्स्ट फ़ाइल को इस तरह से देखना चाहिए:
      आईडी एक्स वाई फेरेट का व्यास त्रिज्या
      RPE1_WT_Cell1 167 136 230 115
      RPE1_WT_Cell2 164 160 230 115

      नोट: अंक के साथ सभी अल्पविराम की जगह सावधान रहें ।
    5. सीधे उपकरण के साथ माइक्रोपैटर्न रिंग (आसंजन लंबाई) की मोटाई को मापें और सेल आईडी, सेल त्रिज्या (फ़ाइल से: "गोलाकार पैरामीटर.txt"), और "पैटर्न पैरामीटर.txt" नामक एक टेक्स्ट फ़ाइल में आसंजन लंबाई को बचाएं। कोशिका त्रिज्या द्वारा आसंजन लंबाई को विभाजित करके सामान्यीकृत आसंजन लंबाई की गणना करें।
      नोट: अंक से सभी अल्पविराम की जगह सावधान रहें ।

      फ़ाइल इस तरह दिखना चाहिए:
      आईडी सेल त्रिज्या आसंजन लंबाई सामान्यीकृत आसंजन लंबाई
      RPE1_WT_Cell1 115 34 0.295652174
      RPE1_WT_Cell2 115 35 0304347826

3. एकल कोशिका स्थानिक विश्लेषण

  1. आर पैकेज और स्थापना
    नोट: इस विश्लेषण के लिए आर पैकेज दो आयामी (2D) घनत्व और रिप्ले के कश्मीर समारोह की गणना करने के लिए स्पैटस्टेट पैकेज13 का लाभ उठाता है। कोड ओपन-सोर्स है और उन टेक्स्ट फाइलों का उपयोग करता है जिन्हें पहले वर्णित किया गया है।
    1. डाउनलोड करें और https://www.r-project.org/ से आर स्थापित करें (संस्करण 3.5.2 इस विश्लेषण में इस्तेमाल किया गया था)।
    2. पैकेज (और डेमो डेटासेट) से डाउनलोड करें: https://github.com/GoudTeam/JoVE-paper
    3. "इंस्टॉल पैकेज" का उपयोग करके"टूल्स"का उपयोग करके आर स्टूडियो परपैकेज स्थापित करें। "पैकेजआर्काइव फाइल (.ज़िप; .tar.gz)श्रेणी के लिए"से स्थापित करें:" और पैकेज फ़ाइल चुनें। प्रेस"स्थापित"।
    4. आर स्टूडियो में इस आदेश को लिखकर और"एंटर"दबाकर"फ़ंक्शन ("लाइब्रेरी ("एक्सोसाइटोसिसस्पेशियललएनालिसिस" केसाथ पैकेज लोड करें।
    5. आर स्टूडियो में इस आदेश को लिखकर और"एंटर"दबाकर फ़ंक्शन"ईएसए()के साथ पैकेज चलाएं।
      नोट: एक यूजर इंटरफेस खुलेगा।
    6. डेटासेट (.txt फ़ाइलें) और आउटपुट प्लॉट के लिए एक निर्देशिका के लिए निर्देशिका का चयन करें।
      नोट: विश्लेषण के मापदंडों (नीचे पाठ देखें) को यूजर इंटरफेस के माध्यम से बदला जा सकता है।
    7. यह स्क्रिप्ट अपने आप शुरू हो जाएगी और विश्लेषण करेगी। यह संबंधित भूखंडों की .pdf फाइलें और संख्यात्मक परिणामों वाली .txt फ़ाइलें प्रदान करता है।

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Representative Results

एक्सोसाइटोसिस घटनाओं की स्थानिक विशेषताओं का विश्लेषण VAMP7-pHluorin10, 11,11 द्वारा hTert-RPE1 कोशिकाओं में कल्पना लाइसोसोम्स से किया गया था। hTert-RPE1 कोशिकाएं गैर-संचार कोशिकाएं हैं जो माइक्रोपैटर्निंग के लिए अच्छी तरह से अपनाती हैं और पिछले माइक्रोपैटर्न-आधारित अध्ययनों में बड़े पैमाने पर उपयोग की गई हैं4,,14। VAMP7 एक लाइसोसोमल वी-SNARE15 है जिसे अपने एन-टर्मिनस में सुपर एक्ट्रेस प्लूरिन के साथ टैग किया गया था और लाइसोसोम के ल्यूमेन में स्थित है। सेल के अंदर, pHluorin जांच लाइसोसोम के कम पीएच द्वारा बुझाया गया था, लेकिन एक्सोसाइटोसिस pHluorin के दौरान एक संकेत उत्सर्जन करने के लिए शुरू कर दिया क्योंकि पीएच प्रोटोन रिलीज के कारण वृद्धि हुई । VAMP7-pHluorin अंगूठी के आकार के माइक्रोपैटर्न(चित्रा 1A-B)पर TIRFM लाइव सेल इमेजिंग द्वारा निगरानी की गई थी ।B पीएचलुरिन सिग्नल ने एक्सोसाइटोसिस के दौरान एक चोटी का प्रदर्शन किया जो lysosomal प्रोटॉन की तेजी से रिहाई का प्रतिनिधित्व करता है जिसके बाद घातीय क्षय होता है, जो प्लाज्मा झिल्ली(चित्रा 1C)पर जांच के 2D प्रसार का प्रतिनिधित्व करता है। hTERT-RPE1 कोशिकाओं ने 0.28 हर्ट्ज(चित्रा 1D)की औसत एक्सोसाइटोसिस दर के साथ एक महत्वपूर्ण lysosomal स्राव गतिविधि प्रस्तुत की। हालांकि, कोशिकाओं (0.15 हर्ट्ज के मानक विचलन) में एक्सोसाइटोसिस दर में उच्च विषमता देखी गई, जो यह दर्शाता है कि लाइसोसोम्स से स्राव में मजबूत सेल-टू-सेल परिवर्तनशीलता थी।

एकल सेल स्थानिक विश्लेषण की जांच करने के लिए कि क्या लाइसोसोम्स का एक्सोसाइटोसिस यादृच्छिक है
केडीई द्वारा एक्सोसाइटोसिस के 2डी वितरण की कल्पना करना संभव था, जैसा कि पहले एंडोमेट्रेब्रास डिब्बों14के लिए किया जाता था, जो स्थानीय घनत्व(चित्रा 2B)में अंतर प्रकट कर सकता था। यह दृष्टिकोण कोशिकाओं की आबादी के औसत वितरण के दृश्य के लिए प्रासंगिक है, लेकिन पता चला घटनाओं की सीमित संख्या के कारण एकल कोशिकाओं में कम जानकारीपूर्ण (दसियों बनाम कई जनसंख्या आधारित विश्लेषण द्वारा प्राप्त हजार) और उच्च सेल-टू-सेल परिवर्तनशीलता। उदाहरण के लिए, इस दृष्टिकोण ने हमें यह मूल्यांकन करने की अनुमति नहीं दी कि क्या एक्सोसाइटोसिस घटनाओं के वितरण ने एक पूर्ण स्थानिक यादृच्छिकता (सीएसआर) व्यवहार (यानी, एक एकल कोशिका के लिए एक अवलोकन क्षेत्र में एक समान बिंदु वितरण से मेल खाती है)। एक अंक पैटर्न सीएसआर व्यवहार का पालन करता है जब दो निम्नलिखित परिकल्पनाएं सच हैं: 1) प्रत्येक बिंदु का स्थान अन्य बिंदुओं से स्वतंत्र है; और 2) एक उपक्षेत्र में एक बिंदु खोजने की संभावना केवल इस उपक्षेत्र के क्षेत्र और कुल क्षेत्र के बीच अनुपात पर निर्भर है। सीएसआर से तीन संभावित विचलन हैं: 1) क्लस्टरिंग (यानी, एकत्रीकरण); 2) फैलाव (यानी, लगातार दूरी के साथ आदेश); या 3) क्लस्टरिंग और फैलाव(चित्रा 2C) कामिश्रण । रिप्ले के फ़ंक्शन का उपयोग इस प्रश्न का उत्तर देने के लिए किया गया था जैसा कि पिछलेविश्लेषणों 7,,8,,9 (चित्रा 2D)में किया गया था। रिप्ले का कश्मीर फ़ंक्शन सीएसआर के मामले में (डी के साथ किसी घटना से सामान्यीकृत दूरी होने के साथ) के करीब है, लेकिन क्लस्टरिंग (श्वसन फैलाव) के मामले में बेहतर (श्वसन अवर) है। रिप्ले के फ़ंक्शन से 100 ² को घटाकर, सैद्धांतिक सीएसआर वक्र 0 पर होना चाहिए। सीएसआर मामलों के सिमुलेशन सीएसआर मामले (सैद्धांतिक वक्र के आसपास ग्रे लिफाफा) के लिए अच्छाई-फिट का आकलन करने के लिए मनाया exocytosis घटनाओं के रूप में अंक की एक ही संख्या का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया । बदल रिप्ले के कार्य प्रायोगिक डेटा पर लागू लिफाफे के बाहर सकारात्मक मूल्यों का प्रदर्शन किया, क्लस्टरिंग(चित्रा 2D)का संकेत है ।

यह जांचने के लिए कि क्या एक्सोसाइटोसिस घटनाओं का क्लस्टरिंग सेल आसंजन के कारण था जैसा कि पहले6रिपोर्ट किया गया था, हमने केंद्र में विशेष रूप से गैर चिपकने वाले सेल क्षेत्र(चित्रा 2 A,सफेद में ग्रे, गैर चिपकने वाला सेल केंद्र क्षेत्र) के डेटा पर एक समान विश्लेषण किया। ध्यान दें, हमने पाया कि गैर चिपकने वाले क्षेत्र में एक्सोसाइटोसिस की घटनाओं को भी क्लस्टर किया गया था(चित्रा 2E),यह दर्शाता है कि आसंजन अणु केवल संरचनाएं नहीं थीं जो प्लाज्मा झिल्ली पर गुप्त हॉट स्पॉट को प्रेरित करती थीं।

क्योंकि रिप्ले का कश्मीर फ़ंक्शन एक वर्णनात्मक आंकड़ा है जो पी मूल्य प्रदान नहीं करता है, सीएसआर सिमुलेशन के साथ सेलुलर एक्सोसाइटोसिस घटनाओं की तुलना में एक सांख्यिकीय परीक्षण स्थापित किया गया था। निकटतम पड़ोसी दूरी NND (i) विधि का उपयोग किया गया था। एनडीडी को एक बिंदु i और अन्य सभी बिंदुओं के बीच न्यूनतम यूक्लिडियन दूरी के रूप में परिभाषित किया गया है। एक सेल की सभी एक्सोसाइटिक घटनाओं से औसत एनएनडी (i) की गणना की गई थी और सीएसआर की तुलना में मोंटे कार्लो सिमुलेशन(चित्रा 2F)की एक उच्च संख्या के साथ प्राप्त किया गया था। हमने पाया कि चित्रा 2F में विश्लेषण किए गए एकल सेल का औसत एनएनडी सीएसआर मामले के नकली वितरण के औसत से कम था, जो औसतन पड़ोसियों को दर्शाता है और इस प्रकार क्लस्टरिंग करता है। फैलाव के मामले में, औसत एनएनडी के लिए एक उच्च मूल्य(चित्रा 2C)की उम्मीद थी। इस तुलना ने प्रत्येक कोशिका के लिए पी मूल्य की गणना की अनुमति दी। पी मूल्य सिमुलेशन के प्रतिशत का प्रतिनिधित्व करता है जिसने अधिक चरम एनएनडी (दो तरफा तरीके से) का प्रदर्शन किया। सटीक होने के लिए, निष्पक्ष पी मूल्य की गणना (k +1)/(N +1) के रूप में की गई थी, जिसमें एन मोंटे कार्लो सिमुलेशन (10,000) की कुल संख्या थी, और कश्मीर इन सिमुलेशन की संख्या जो मनाई गई मापी16की तुलना में अधिक चरम थी। सभी पी मूल्यों के हिस्टोग्राम को कुल सेल क्षेत्र(चित्रा 2जी)और गैर चिपकने वाले सेल क्षेत्र(चित्रा 2I)के लिए प्लॉट किया गया था। यदि एच0:"एक्सोसाइटोसिस एक सीएसआर प्रक्रिया है" सच था, पी मूल्यों का एक समान वितरण की उम्मीद थी। अगर एच0 झूठा था, एक कम पी मूल्य पर एक चोटी की उंमीद थी । पी वैल्यू हिस्टोग्राम पर कोल्मोगोरोव-स्मिरनोव टेस्ट का प्रदर्शन करते हुए, 0.001 से कम पी वैल्यू प्राप्त की गई, जिसमें दोनों मामलों(आंकड़े 2जी और 2I)में सीएसआर से एक महत्वपूर्ण विचलन दिखाया गया। इसके अलावा, कुल सेल क्षेत्र के लिए 0.955 और गैर चिपकने वाले सेल क्षेत्र के लिए 1.000 के क्लस्टरिंग गुणांक ने संकेत दिया कि लिसोसोमल एक्सोसाइटोसिस सेल आसंजन से स्वतंत्र एक क्लस्टर प्रक्रिया थी। क्लस्टरिंग गुणांक कोशिकाओं के प्रतिशत का प्रतिनिधित्व करता है जो फैलाव की तुलना में क्लस्टरिंग व्यवहार के करीब थे। यह परिणाम रिप्ले के कश्मीर समारोह के अनुरूप था।

क्लस्टरिंग में सेल आसंजन की भूमिका का मूल्यांकन करने के लिए, हमने प्रत्येक व्यक्तिगत सेल(चित्रा 2H)के लिए समग्र क्षेत्र में गैर चिपकने वाले क्षेत्र में औसत एनएनडी की तुलना की। क्योंकि औसत एनएनडी सतह घनत्व के विपरीत आनुपातिक था, इसलिए हमने होमोथी का उपयोग करके गैर चिपकने वाले क्षेत्र के औसत एनएनडी को सामान्य बनाया। गैर चिपकने वाले क्षेत्र में एक्सोसाइटोसिस घटनाओं के काफी बड़े औसत एनएनडी ने कम क्लस्टरिंग(चित्रा 2H) कासंकेत दिया। इस प्रकार, हालांकि गैर चिपकने वाले क्षेत्रों में लाइसोसोम्स क्लस्टर से स्राव, सेल आसंजन क्लस्टरिंग को बढ़ाने के लिए लग रहा था।

ध्रुवीय निर्देशांक का उपयोग करके एक्सोसाइटोसिस घटनाओं का स्थानिक विश्लेषण
अंगूठी के आकार के माइक्रोपैटर्न की परिपत्र ज्यामिति ने आम ध्रुवीय निर्देशांकों के उपयोग की अनुमति दी, जिसने विश्लेषण को सरल बनाया, जैसा कि पहले17पाया गया था। प्रत्येक एक्सोसाइटोसिस घटना इस प्रकार एक मॉड्यूलस (मूल से दूरी, यहां सेल के निचले विमान का केंद्र) और एक कोण (एक निश्चित मनमाने धुरी के अनुसार) द्वारा वर्णित किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, मॉड्यूलस को कोशिका के त्रिज्या द्वारा विभाजित करके सामान्यीकृत किया जा सकता है। एक्सोसाइटोसिस घटनाओं के हिस्टोग्राम को एक प्रतिनिधि प्रकोष्ठ(चित्रा 3 ए)के लिए मोडुलस के अनुसार प्लॉट किया गया था। इससे चिपकने वाले/असादने क्षेत्रों के बीच सीमा के चारों ओर एक चोटी का पता चला । कोशिकाओं के बीच एक बड़ी परिवर्तनशीलता भी देखी गई। इसलिए, हमने एक्सोसाइटोसिस घटनाओं का औसत वितरण प्राप्त करने के लिए एन = 22 कोशिकाओं को एकत्र किया। हालांकि, प्रत्येक कोशिका को एक ही सांख्यिकीय वजन देने के लिए, प्रत्येक कोशिका से एक ही संख्या में घटनाओं का चयन बेतरतीब ढंग से किया गया था। इस यादृच्छिक चयन ने समग्र पैटर्न को नहीं बदला। एकल कोशिकाओं के व्यक्तिगत वितरण का निरंतर औसत वितरण प्राप्त करने के लिए, केडीई(चित्रा 3बी)का उपयोग किया गया था। हालांकि, क्योंकि सामान्यीकृत मॉड्यूलस 0 और 1 के बीच है, किनारे की स्थितियों को ध्यान में रखा जाना था। किनारों के बगल में आकार बदलने वाली बीटा गिरी का उपयोग18का उपयोग किया गया था । एक त्रुटि बैंड एक बूटस्ट्रैप रणनीति के साथ गणना की गई थी। मनाया औसत वितरण एक काल्पनिक सीएसआर वितरण है कि एक उच्च मॉड्यूलस पर अधिक घटनाओं को दिखाया की तुलना में था, क्योंकि क्षेत्र में एक उच्च मॉड्यूलस के साथ वृद्धि हुई । क्योंकि संभावना घनत्व का अभिन्न हिस्सा एक होना चाहिए, सीएसआर वितरण 2r था (इकाइयों के बिना सामान्यीकृत त्रिज्या के साथ)। बड़ी संख्या में सीएसआर मोंटे कार्लो सिमुलेशन (प्रत्येक 5,000) का उपयोग करके सैद्धांतिक वक्र के चारों ओर एक आत्मविश्वास बैंड की गणना की गई थी। इन सिमुलेशन से मॉडुलस डिस्ट्रीब्यूशन के1 और99 पर्सेंटाइल प्लॉट किए गए थे। हमने पाया कि एक्सोसाइटोसिस घटनाओं का औसत वितरण 0.7rअधिकतमपर काल्पनिक एक से भटक गया, जो कोशिका के चिपकने वाले क्षेत्र की शुरुआत से मेल खाता है।

हमने यह परीक्षण करने की मांग की कि क्या मॉड्यूलस का मनाया गया वितरण सैद्धांतिक से अलग था । क्योंकि औसत वितरण, जैसा कि इस मामले में, एक अच्छाई-फिट परीक्षण (जैसे, कोल्मोगोरोव-स्मिरनोव) द्वारा पेकॉट एट अल द्वारा प्रस्तावित एक वैकल्पिक विधि द्वारा सटीक रूप से परीक्षण नहीं किया जा सकता था। यह विधि जनसंख्या में भिन्नता और जनसंख्या के अंदर भिन्नता के बीच अंतर को मापता है, और इस प्रकार प्रत्येक समन्वय (यानी, मॉड्यूलस और कोण)17के लिए स्वतंत्र परीक्षण की अनुमति देता है। इस परीक्षण का उपयोग हमारे डेटा की तुलना सीएसआर एक्सोसाइटोसिस घटनाओं (अवलोकन डेटा के रूप में कोशिकाओं और एक्सोसाइटोसिस घटनाओं की समान संख्या) का प्रतिनिधित्व करने वाले नकली डेटा के लिए किया गया था, और विलकॉक्सन-मान-व्हिटनी परीक्षण, एन = 22 कोशिकाओं के साथ विविधताओं (पी एंड एलटी; 0.001) में सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर पाया गया, जो यह दर्शाता है कि मनाया गया औसत एक्सोसाइटोसिस वितरण सीएसआर नहीं था। हालांकि, जब दो सीएसआर सिमुलेशन (प्रत्येक 5,000 सिमुलेशन के साथ) की तुलना की गई, तो हमने पाया कि पी वैल्यू हिस्टोग्राम ने एक समान वितरण नहीं दिखाया, लेकिन 1 के पास एक चोटी का प्रदर्शन किया, यह दर्शाता है कि इस परीक्षण में शायद संवेदनशीलता का अभाव था।

क्योंकि केडीई अनुमान गिरी बैंडविड्थ के एक गैर-तुच्छ विकल्प पर निर्भर करता है और बढ़त के प्रभावों के प्रति संवेदनशील होता है, संचयी वितरण समारोह की भी गणना की गई थी, जो केडीई अनुमान(चित्रा 3 डी)में निहित समस्याओं पर काबू पा जाता है। इस फ़ंक्शन को 0 और 1 के बीच परिभाषित किया गया है और इसमें कोई मनमाना पैरामीटर या पूर्वाग्रह (उदाहरण के लिए, किनारे पूर्वाग्रह) शामिल नहीं है। मॉडुलस वितरण के लिए त्रुटि और आत्मविश्वास बैंड की गणना उसी तरह की गई थी। संचयी वितरण समारोह ने इस बात की पुष्टि की कि एक्सोसाइटोसिस की घटनाओं ने सीएसआर वितरण का पालन नहीं किया, बल्कि 0.7रअधिकतम केआसपास मोडुली पर अधिक विस्तारित किया गया । इस प्रकार इस विश्लेषण ने हमें सेलुलर क्षेत्रों की पहचान करने की अनुमति दी जहां क्लस्टरिंग हुई । एक दिलचस्प सवाल यह है कि इस परिणाम को उठाती है कि क्या 0.7rअधिकतम पर अतिउपसारण अंगूठी के आकार के माइक्रोपैटर्न या कोशिकाओं के परिधीय/केंद्रीय स्राव क्षेत्रों के प्रभाव के चिपकने/गैर चिपकने वाले क्षेत्रों की उपस्थिति के कारण था ।

चूंकि एक्सोसाइटोसिस घटनाओं का औसत वितरण गैर चिपकने वाले और चिपकने वाले क्षेत्रों में सीएसआर मामले से भटक गया, हमने यह भी सोचा कि एक्सोसाइटोसिस घनत्व कहां सबसे अधिक था। आसंजन और गैर-चिपकने वाले क्षेत्रों में एक्सोसाइटोसिस के सतह घनत्व की गणना और तुलना की गई। हमने पाया कि सतह घनत्व एक युग्मित विश्लेषण(चित्रा 3C)द्वारा गैर आसंजन क्षेत्र की तुलना में आसंजन क्षेत्र में कम था । इसे सेल परिधि (0.85 - 1rअधिकतम, चित्रा 3 बी)पर एक्सोसाइटोसिस की मजबूत कमी से समझाया जा सकता है।

Figure 1
चित्रा 1. एचटर्ट-आरपीई1 कोशिकाओं में लाइसोसोम्स से एक्सोसाइटोसिस: (ए)रिंग के आकार का माइक्रोपैटर्न (लाल) और चिपकने वाला एचटरट-आरपीई1 सेल जो टीएमपी 7-प्लूरिन (ग्रीन) से संक्रमित है। तीर एक एक्सोसाइटोसिस घटना को दिखाता है। स्केल बार = 10 माइक्रोन(बी)एक्सोसाइटोसिस घटनाओं का कामोग्राफ। तीर एक्सोसाइटोसिस घटनाओं को दिखाते हैं। स्केल बार = 2 माइक्रोन, स्केल बार समय में = 5 एस (C)22 कोशिकाओं से lysosomal exocytosis की सामान्यीकृत तीव्रता प्रोफ़ाइल। प्रत्येक बिंदु कम से कम 1,530 एक्सोसाइटोसिस घटनाओं का औसत है। डेटा प्रस्तुत कर रहे हैं ± SEM.(D)22 कोशिकाओं की Exocytosis दर. औसत +/-मानक विचलन लाल रंग में प्लॉट किया जाता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2। lysosomal एक्सोसाइटोसिस घटनाओं का स्थानिक विश्लेषण। (A)5 मिनट के अधिग्रहण के दौरान एक्सोसाइटोसिस घटनाओं की स्कैटर प्लॉट। प्रत्येक डॉट एक एक्सोसाइटोसिस घटना का प्रतिनिधित्व करता है। चिपकने वाला क्षेत्र ग्रे में दिखाया गया है। (B)2डी गिरी घनत्व अनुमान (केडीई) एके स्कैटर प्लॉट का । रंग एक्सोसाइटोसिस घटनाओं के स्थानीय घनत्व का प्रतिनिधित्व करता है। (ग)संभावित बिंदु पैटर्न का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। चार मामलों, पूर्ण स्थानिक यादृच्छिकता (सीएसआर), क्लस्टरिंग, फैलाव, और मिश्रित दिखाए जाते हैं, और कई निकटतम पड़ोसी दूरी (एनएनडी) को यह दिखाने के लिए प्लॉट किया जाता है (धराशायी लाइनें) यह दिखाने के लिए कि कैसे औसत एनएनडी क्लस्टरिंग में कमी आई और फैलाव के साथ वृद्धि हुई। (घ)रिप्ले के कार्य का उपयोग करके एक प्रतिनिधि प्रकोष्ठ का विश्लेषण। लाल धराशायी लाइन सीएसआर घटनाओं के लिए "रिप्ले के कश्मीर फ़ंक्शन - 1r²" के बराबर होती है, ग्रे लिफाफा मोंटे कार्लो सिमुलेशन से अनुमानित अच्छाई-फिट का प्रतिनिधित्व करता है, जिसमें एक्सोसाइटोसिस घटनाओं (एनइवेंट = 81) के समान अंक हैं। ब्लैक सॉलिड लाइन मनाया एक्सोसाइटोसिस घटनाओं (एनइवेंट = 81) के लिए "रिप्ले के कश्मीर फ़ंक्शन - 1r²" के बराबर होती है। ग्रे लिफाफे से लाल वक्र से इसका सकारात्मक विचलन एक्सोसाइटोसिस घटनाओं के क्लस्टरिंग को इंगित करता है। रिप्ले के फ़ंक्शन को अधिकतम 1 के अधिकतम मूल्य के लिए सामान्यीकृत किया गया था। (ई) डीमें रिप्ले के कार्य का उपयोग करके उसी कोशिका के असाध्य क्षेत्र का विश्लेषण । ग्रे लिफाफे के बाहर लाल वक्र से सकारात्मक विचलन गैर चिपकने वाले क्षेत्र में एक्सोसाइटोसिस घटनाओं के एक क्लस्टरिंग को इंगित करता है। (F)मोंटे कार्लो सिमुलेशन (ब्लू वक्र) से प्राप्त सीएसआर के केडीई के साथ एक प्रतिनिधि सेल (रेड लाइन) से औसत एनएनडी वितरण की तुलना। पी मूल्य की गणना नकली मूल्यों के प्रतिशत के रूप में की गई थी जो देखे गए मूल्य की तुलना में अधिक चरम थे। (जी)पी वैल्यू हिस्टोग्राम एन = 26 कोशिकाओं के लिए एफ में के रूप में एनएनडी परीक्षण से प्राप्त की गई । कम पी मूल्यों पर चोटी का मतलब है कि शून्य परिकल्पना "एक्सोसाइटोसिस सीएसआर का अनुसरण करती है" कोल्मोगोरोव-स्मिनोव परीक्षण के साथ अस्वीकार कर दिया गया था, यह दर्शाता है कि लाइसोसोमल एक्सोसाइटोसिस सीएसआर नहीं था। (H)नॉन चिपकने वाले क्षेत्रों (सफेद) और कुल सेल क्षेत्रों (ग्रे) में एक्सोसाइटोसिस घटनाओं से औसत एनएनडी का बॉक्स-प्लॉट। एक ही सेल से दो डेटा पॉइंट्स एक लाइन से जुड़े होते हैं । औसत एनएनडी गैर चिपकने वाले क्षेत्र में बड़ा था, पी एंड एलटी; 0.001 एक युग्मित विलकॉक्सन परीक्षण (एन = 25 कोशिकाओं) के साथ, जो गैर चिपकने वाले क्षेत्र में काफी कम क्लस्टरिंग का संकेत देता है। (I)एन = 26 कोशिकाओं के लिए गैर चिपकने वाले क्षेत्र के लिए जी के रूप में ही । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3। पूल्ड lysosomal exocytosis घटनाओं का स्थानिक विश्लेषण: (ए)सामान्यीकृत मॉड्यूलस के एक समारोह के रूप में एन = 161 एक्सोसाइटोसिस घटनाओं के साथ 5 मिनट अधिग्रहण के दौरान एक प्रतिनिधि कोशिका की एक्सोसाइटोसिस घटनाओं का हिस्टोग्राम; 0 सेल सेंटर और 1 सेल परिधि का प्रतिनिधित्व करता है। कोशिका का चिपकने वाला क्षेत्र ग्रे में दिखाया गया है और दिखाए गए कोशिकाओं के लिए 0.65-1 से मोडुली से मेल खाती है। 0.6 और 0.7 के बीच मोडुली के आसपास चिपकने वाले क्षेत्र की शुरुआत में एक चोटी है। (ख)एक्सोसाइटोसिस की केडीई प्रत्येक कोशिका में 56 घटनाओं के साथ एन = 22 कोशिकाओं के लिए सामान्यीकृत मॉड्यूलस के एक समारोह के रूप में घटनाओं; 0 सेल सेंटर और 1 सेल परिधि का प्रतिनिधित्व करता है। औसत चिपकने वाला क्षेत्र ग्रे में दिखाया गया है और 0.61-1 से मोडुली के लिए औसत से मेल खाती है। धराशायी नीला वक्र सीएसआर के मामले में अपेक्षित सैद्धांतिक वक्र है। यह सैद्धांतिक वक्र एक लिफाफे के साथ है जो मोंटे कार्लो सिमुलेशन का उपयोग करके प्राप्त सीएसआर के 1-99 वें शतमक का प्रतिनिधित्व करता है। मनाया डेटा से KDE वक्र लाल रंग में है और एक त्रुटि बैंड बूटस्ट्रैपिंग द्वारा उत्पन्न के साथ है । चिपकने वाला क्षेत्र चिपकने वाले और गैर-चिपकने वाले क्षेत्रों में सतह घनत्व का मिश्रित विश्लेषण ग्रेC+/-एसईएम में है। एक्सोसाइटोसिस सतह घनत्व की गणना सामान्यीकृत क्षेत्र और प्रति सेकंड घटनाओं की संख्या के रूप में की गई थी। यहां, *p< 0.05 एक युग्मित छात्र टी-टेस्ट (एन = 22 कोशिकाओं) से। सामान्यता पहले एक Shapiro-विल्क परीक्षण द्वारा परीक्षण किया गया था । (घ) बी (रेड लाइन) में डेटा का संचयी वितरण कार्य और मोंटे कार्लो सीएसआर सिमुलेशन (बिंदीदार नीली रेखा) से। लिफाफे बीके रूप में उत्पन्न किए गए थे । ध्यान दें कि लाल रेखा सैद्धांतिक सीएसआर से लगभग 0.7र अधिकतम पर भटक जातीहै। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

हमने रिंग-आकार के माइक्रोपैटर्न-सामान्यीकृत कोशिकाओं में VAMP7-pHluorin के TIRFM लाइव सेल इमेजिंग द्वारा लिसोसोमल डिब्बे से एक्सोसोसाइटोसिस घटनाओं की निगरानी की और एक्सोसाइटोसिस घटनाओं के स्थानिक मापदंडों का एक कठोर सांख्यिकीय विश्लेषण किया। बदल रिप्ले के कार्य और निकटतम पड़ोसी दूरी के आधार पर एक सांख्यिकीय परीक्षण को नियोजित करते हुए, हमने पुष्टि की कि लाइसोसोम्स से स्राव एक यादृच्छिक प्रक्रिया नहीं है8,,9। दोनों सांख्यिकीय विश्लेषणों से पता चला है कि एक्सोसाइटोसिस घटनाओं क्लस्टरिंग(आंकड़े 2D और 2G)प्रदर्शित करते हैं । गैर चिपकने वाले सेल क्षेत्र में इसी तरह के उपकरण लागू करते हुए, हमने पाया कि एक्सोसाइटोसिस की घटनाओं को गैर चिपकने वाले क्षेत्रों(आंकड़े 2E और 2I)में भी संकुलित किया जाता है। इस प्रकार, आसंजन अणुओं कि पहले क्लस्टरिंग 6 की अनुमति के लिए सूचित किया गया है केवलसंरचनाएं है कि प्लाज्मा झिल्ली पर गुप्त गर्म धब्बे प्रेरित कर सकते है नहीं कर रहे हैं । हालांकि, सेल आसंजन ने क्लस्टरिंग को बढ़ाया: एक्सोसाइटोसिस घटनाओं के बीच औसत निकटतम पड़ोसी दूरी गैर चिपकने वाले क्षेत्रों(चित्रा 2H)में काफी बड़ी थी। लगातार, गिरी घनत्व अनुमान और संचयी वितरण समारोह के आधार पर हमारे विश्लेषण ने एक्सोसाइटोसिस के समृद्ध क्षेत्रों की पहचान की जो रिंग के आकार के माइक्रोपैटर्न कोशिकाओं में चिपकने वाले और गैर चिपकने वाले क्षेत्रों के बीच सीमा पर स्थित थे। आसंजन या इस क्षेत्र के लिए लाइसोसोम का एक विशिष्ट लक्ष्यीकरण जैसे क्लस्टरिंग अंतर्निहित आणविक तंत्र को निर्धारित करने के लिए अधिक काम आवश्यक है। दिलचस्प बात यह है कि हमने एचआरटी-आरपीई1 कोशिकाओं में एक्सोसाइटोसिस दर में उच्च विषमता देखी (0.28 हर्ट्ज, चित्रा 1Dकी औसत एक्सोसाइटोसिस दर के लिए 0.15 हर्ट्ज का मानक विचलन), यह दर्शाता है कि लाइसोसोम्स से स्राव में उच्च अंतरकोशिकीय भिन्नता है। इसलिए भविष्य के काम में उपजनसंख्या विश्लेषणों पर विचार किया जाना चाहिए। यह जांच करना विशेष रूप से दिलचस्प होगा कि क्या यह भिन्नता lysosomal डिब्बों की विविधता, कार्गो में अंतर, या एक्सोसाइटोसिस मशीनरी पर निर्भरता को दर्शाती है।

ये परिणाम दर्शाते हैं कि विविध जैविक प्रक्रियाओं के स्थानिक मापदंडों की जांच करने के लिए सांख्यिकीय उपकरणों को कैसे नियोजित किया जा सकता है। इसके अलावा, माइक्रोपैटर्न विभिन्न माइक्रोपैटर्न ज्यामिति (जैसे, अंगूठी के आकार बनाम डिस्कशेप्ड) की मदद से निष्पक्ष तरीके से सेल आसंजन के प्रभाव के अध्ययन की सुविधा प्रदान करते हैं। विशेष रूप से, गोल आकृतियों का उपयोग विश्लेषण की सुविधा देता है क्योंकि ध्रुवीय निर्देशांक को नियोजित किया जा सकता है। क्योंकि सांख्यिकीय उपकरणों को सार्थक होने के लिए डेटा की एक निश्चित राशि की आवश्यकता होती है, 30 से अधिक घटनाओं वाली कोशिकाओं का उपयोग हमारे विश्लेषण के लिए किया जाता था। हालांकि, इस बात की संभावना है कि 30 या उससे कम घटनाओं वाली कोशिकाएं सार्थक हों। इस प्रकार, 30 या उससे कम घटनाओं के साथ नमूना कोशिकाओं को विश्लेषण के लिए पर्याप्त घटनाओं को प्राप्त करने के लिए प्रदर्शन किया जा सकता है ताकि यह निर्धारित किया जा सके कि क्या यह मामला है। इसी तरह, यह अनुमान लगाना मुश्किल है कि कितनी कोशिकाओं का विश्लेषण किया जाना चाहिए, खासकर यदि मजबूत अंतरकोशिकीय भिन्नता है। इसे दरकिनार करने का एक तरीका यह है कि प्रत्येक कोशिका से समान संख्या में घटनाओं का चयन करें ताकि प्रत्येक कोशिका को समान सांख्यिकीय वजन दिया जा सके। हालांकि, हम अनुशंसा करते हैं कि 15 से कम कोशिकाओं पर विश्लेषण एहतियात के साथ किया जाए। पूल्ड कोशिकाओं के औसत वितरण के रूप में अच्छाई-फिट परीक्षणों (जैसे, कोल्मोगोरोव-स्मिरनोव) द्वारा सही परीक्षण नहीं किया जा सकता है, हमने पेकॉट एट अल द्वारा प्रस्तावित एक परीक्षण आंकड़ा नियोजित किया है जो17 आबादीकी विविधताओं में अंतर को मापता है। यद्यपि इस परीक्षण ने हमें औसत वितरणों में विविधताओं में सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर खोजने की अनुमति दी, हमें संदेह है कि इस परीक्षण में कम संवेदनशीलता है क्योंकि पी वैल्यू हिस्टोग्राम फ्लैट नहीं था (यानी, समान वितरण दिखाया गया था) जब 1 के करीब पी मूल्यों के लिए विभिन्न सीएसआर सिमुलेशन की तुलना करते थे। इसलिए, इस सांख्यिकीय प्रक्रिया में सुधार की आवश्यकता हो सकती है ।

हमारे विश्लेषणों में एक दोष एक्सोसाइटोसिस घटनाओं का मैनुअल पता लगाना है, जो विश्लेषण की गति को काफी कम कर देता है। स्वचालित पता लगाने में सीमाएं अक्सर विश्लेषण किए जा रहे अद्वितीय और सरल पैरामीटर (उदाहरण के लिए, एक्सोसाइटोसिस घटनाओं की तीव्रता) में मजबूत विषमता के कारण होती हैं। तंत्रिका नेटवर्क स्वचालित पता लगाने के लिए संभावित रूप से शक्तिशाली हो सकते हैं, क्योंकि उन्हें कई सुविधाओं को पहचानने के लिए प्रशिक्षित किया जा सकता है।

यहां प्रस्तुत विश्लेषण को टीआईआरएफएम द्वारा देखी गई अन्य गतिशील प्रक्रियाओं पर लागू किया जा सकता है, जैसे अन्य डिब्बों से स्राव और झिल्ली माइक्रोडोमेन या एंटीजन प्रस्तुति का वितरण। इसी तरह के विश्लेषण भी निश्चित कोशिकाओं के लिए लागू किया जा सकता है ताकि प्रोटीन के स्थानिक वितरण का अध्ययन करने के लिए । हमें उम्मीद है कि हमारा काम सेल बायोलॉजी में स्थानिक वितरण विश्लेषण में बढ़ती रुचि को बढ़ाएगा ।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम VAMP7-pHluorin प्लाज्मिड प्रदान करने के लिए थीयर्रे गैली (मनोरोग और तंत्रिका विज्ञान, INSERM के केंद्र) को बहुत स्वीकार करते हैं। हम सांख्यिकीय विश्लेषण और सार्थक चर्चा के लिए गौड प्रयोगशाला के सदस्यों पर सलाह के लिए Tarn डंग शुक्रिया अदा करते हैं । लेखक सेल और टिशू इमेजिंग सुविधा (PICT-IBiSA @Burg, PICT-EM @Burg और PICT-IBiSA @Pasteur) और निकॉन इमेजिंग सेंटर, इंस्टीटयूट क्यूरी (पेरिस), फ्रांसीसी राष्ट्रीय अनुसंधान बुनियादी ढांचे फ्रांस के सदस्य-BioImaging (ANR10-INBS-04) को बहुत स्वीकार करते हैं । एच.एल. एसोसिएशन द्वारा समर्थित था ला Recherche सुर ले कैंसर (एआरसी) डालना और पी. एम. मैरी Skłodowska-क्यूरी अनुदान समझौते नहीं ६६६००३ के तहत यूरोपीय संघ के क्षितिज २०२० अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम से धन प्राप्त किया । इस काम को संक्रमित-युग (एएनआर-14-आईएफईसी-0002-04), लेटेक्स सेल्टिस फिबायो (एएनआर-10-एलबीएक्स-0038) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।) और इडेक्स पेरिस साइंसेज एट लेट्रेस (एएनआर-10-आईडीईएक्स-0001-02 पीएसएल), साथ ही सेंटर नेशनल डी ला रेचेचे साइंटिफ़िक और इंस्टीटयूट क्यूरी।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chamlide Magnetic Chamber Chamlide
DMEM/F12 Gibco 21041-025
Fibrinogen Molecular Probes, Invitrogen F35200
Fibronectin bovine plasma Sigma F1141
HEPES (1M) Gibco 15630-056
hTert RPE1 cell line https://www.atcc.org
ImageJ http://rsbweb.nih.gov/ij/ n/a Authored by W. Rasband, NIH/NIMH
JetPRIME Transfection reagent Polyplus 114-07
Penicilin/Streptomycin Gibco 15140-122
Photomask Delta Mask
PLL-g-PEG solution Surface Solutions PLL(20)-g[3.5]- PEG(2)
R Software https://www.r-project.org/ n/a
Trypsin (TrypLE Express 1X) Gibco 12605-010
UV ozone oven Jelight Company Inc 342-220
VAMP7-pHFluorin plasmid n/a n/a Paper reference :http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Role+of+HRB+in+clathrin-dependent+endocytosis.
J Biol Chem. 2008 Dec 5;283(49):34365-73. doi: 10.1074/jbc.M804587200.
Role of HRB in clathrin-dependent endocytosis.
Chaineau M, Danglot L, Proux-Gillardeaux V, Galli T.

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References

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जीव विज्ञान अंक 163 माइक्रोपैटर्न लाइसोसोम एक्सोसाइटोसिस टीआईआरएफएम सीएसआर VAMP7
माइक्रोपैटर्न्ड कोशिकाओं में सेलुलर एक्सोसाइटोसिस के स्पैटीियोटेम्परल पैरामीटर की मात्रा निर्धारित करना
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Lachuer, H., Mathur, P., Bleakley,… More

Lachuer, H., Mathur, P., Bleakley, K., Schauer, K. Quantifying Spatiotemporal Parameters of Cellular Exocytosis in Micropatterned Cells. J. Vis. Exp. (163), e60801, doi:10.3791/60801 (2020).

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