Summary
Levende avbildning av lysosomal eksokytose på mikropatterned celler tillater en romlig kvantifisering av denne prosessen. Morfologi normalisering ved hjelp av mikropapirer er et fremragende verktøy for å avdekke generelle regler om romlig distribusjon av cellulære prosesser.
Abstract
Levende avbildning av pHluorin merket Løselig N-etylaleimide-sensitive-faktor Vedlegg protein REceptor (v-SNARE) Vesicle-assosiert membran protein 7 (VAMP7) av total intern refleksjon fluorescens mikroskopi (TIRFM) er en enkel måte å utforske sekresjon fra lysosomale rommet. Ved å dra nytte av cellekultur på mikromønstrede overflater for å normalisere celleformen, ble en rekke statistiske verktøy brukt til å utføre en romlig analyse av sekretoriske mønstre. Ved hjelp av Ripleys K-funksjon og en statistisk test basert på nærmeste naboavstand (NND), bekreftet vi at sekresjon fra lysosomer ikke er en tilfeldig prosess, men viser betydelig klynger. Av notatet viste vår analyse at eksocytosehendelser også er gruppert i ikke-adhesjonsområder, noe som indikerer at vedheftmolekyler ikke er de eneste strukturene som kan indusere sekretoriske hot spots på plasmamembranen. Likevel fant vi ut at celleadhesjon forbedrer klynger. I tillegg til nøyaktig definerte klebende og ikke-adhemmende områder, tillater den sirkulære geometrien til disse mikropapirene bruk av polare koordinater, noe som forenkler analyser. Vi brukte Kernel Density Estimering (KDE) og den kumulative fordelingsfunksjonen på polare koordinater av eksocytosehendelser for å identifisere berikede områder av eksocytose. I ringformede mikropatternceller oppstod klynger på grensen mellom klebemiddelet og ikke-adhesive områder. Vår analyse illustrerer hvordan statistiske verktøy kan brukes til å undersøke romlige fordelinger av ulike biologiske prosesser.
Introduction
Exocytosis er en universell cellulær prosess der en vesikkel smelter sammen med plasmamembranen og frigjør innholdet. Vesikkelen kan enten smelte helt sammen med plasmamembranen (full fusjon) eller skape en fusjonspor som holder åpent i en begrenset periode (kyss-og-løp)1. For eksempel frigjøres nylig syntetiserte proteiner i det ekstracellulære mediet fra vesikler som kommer fra Golgi-komplekset. Denne biosyntetiske, anterograde banen er primordial, spesielt i flercellede organismer, å skille ut signalering peptider (f.eks hormoner, nevrotransmittere) og ekstracellulære matrisekomponenter (f.eks kollagen), samt trafikktransmembranproteiner til plasmamembranen. I tillegg kan sekreter forekomme fra forskjellige endosomer: 1) resirkulering endosomer for å gjenbruke transmembrane proteiner; 2) multivesikulære organer (MVB) for å frigjøre eksosomer; og 3) lysosomer for frigjøring av proteolytiske enzymer. Endosomal sekresjon har vist seg å være viktig for neuritt utvekst, pseudopodia dannelse, plasma membran reparasjon, og ATP-avhengig signalering2.
For å studere eksocytose på enkeltcellenivå, har flere teknikker blitt brukt. Patch-clamp gjør det mulig å oppdage enkelt exocytosis hendelser med høy temporal oppløsning i et bredt utvalg av levende celler3. Denne metoden gir imidlertid ikke informasjon om lokalisering av exocytosehendelser, heller ikke fra hvilket rom det oppstår. Elektronmikroskopi tillater direkte visualisering av eksokytiske hendelser med høy romlig oppløsning, og i kombinasjon med immunolabeling gir informasjon om spesifisiteten til rommene og molekylene som er involvert. En ulempe med denne tilnærmingen er mangelen på informasjon om dynamikken i prosessen, samt dens manglende evne til å utføre høy gjennomstrømningsstudier. Lett mikroskopi tilnærminger som total intern refleksjon fluorescens mikroskopi (TIRFM), som utnytter evanescent feltet for å belyse fluoroforer i nærheten av coverslip (100 nm), gir god timelig og romlig oppløsning for å studere exocytosis hendelser. Denne metoden er imidlertid bare kompatibel med tiltalende celler og kan bare brukes på ventral / dårligere del av celler.
Merk at plasmamembranen avslører betydelig heterogenitet basert på klebende komplekser som bare finnes i begrensede områder. Denne heterogeniteten begrenser for eksempel opptaket av forskjellige ligande4. Tilsvarende har det nylig blitt rapportert at sekresjon fra Golgi-komplekset er konsentrert på "hot spots" i plasmamembranen5. Videre er det kjent at visse laster utskilles gjennom fokal-vedheft-assosiert exocytosis6. Dermed bør spesiell oppmerksomhet rettes mot spørsmålet om eksocytosehendelser fordeles tilfeldig i rommet, eller om de er konsentrert på bestemte områder av plasmamembranen. Flere statistiske verktøy basert på Ripleys K-funksjon har blitt foreslått å utforske dissespørsmålene 7,8,9. Vår tilnærming kombinerer disse verktøyene med mikropattering for å kontrollere celleform og plasmamembran heterogenitet. I tillegg til å gi et middel til å skille mellom lim og ikke-adhemmende områder, tillater denne teknikken også sammenligning på tvers av forskjellige celler og forhold og øker kraften i statistiske analyser.
Her bruker vi en rekke statistiske verktøy for å studere romlig fordeling av eksocytosehendelser fra det lysosomale rommet overvåket av TIRFM levende celleavbildning av VAMP7-pHluorin i ringformede mikropattern-normaliserte hTert-RPE1-celler. Det ble bekreftet at sekresjon fra lysosomer ikke er en tilfeldigprosess 8,9 og at exocytosis hendelser viser klynger. Merk at exocytosis hendelser også er gruppert i ikke-adhesive områder, noe som indikerer at vedheftmolekyler ikke er de eneste strukturene som kan indusere sekretoriske hot spots på plasmamembranen. Likevel forbedret celleadhesjon klynger. Konsekvent identifiserte vår analyse berikede områder av eksocytose som lå ved grensen mellom klebemiddel og ikke-adhesive områder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Tilberedning av mikropatterned celler
- Transfection av celler
- En dag før transfection, frø 2,5 x 106 hTERT-RPE1 celler i en brønn av en 12 brønnplate (2 x 2 cm) i 1 ml medium.
- På transfectiondagen, forberede transfection blandingen med VAMP7-pHluorin plasmid (100 μL buffer, 0,8 μg DNA, 3 μL transfection blanding). Inkuber i 10 min.
MERK: VAMP7 er en lysosomal v-SNARE, smeltet sammen med en luminal pHluorin-kode. pHluorin-sonden slukkes av lav pH, men under eksocytoseprotoner frigjøres og pHluorin begynner å sende ut et signal10,11. - Tilsett transfection blandingen til cellene i deres medium.
- Bytt medium 4 timer etter at du har lagt til transfeksjonsblandingen på cellene.
- Bruk cellene til eksperimenter i løpet av de neste 24–48 h.
- Mikropapirpreparat (fotolitografimetode)
- Vask dekkglassene (25 mm diameter) i etanol og la dem tørke i 5 min.
- Aktiver dekkslepper ved belysning under dyp UV i 5 min.
- Lag et fuktig kammer ved å grundig fukte et papirhåndkle som en parafinfilm er plassert på. Tilsett dråper (30 μL for 22 mm dekklips) poly-l-lysin-graft-polyetylenglykol (PLL-g-PEG) oppløsning (0,1 mg/ml, 10 mM HEPES, pH = 7,4) og plasser dekkslepper med aktivert overflate på dem. Lukk det fuktige kammeret med en topp og inkuber dekkslepper i 1 t.
- Vask dekkglass 2x i PBS og 1x i destillert vann og la dem tørke.
- Vask kvartsfotomasken med destillert vann og deretter med etanol eller propanol. Tørk fotomasken med filtrert luftstrøm.
MERK: Kvartsfotomasken er belagt på den ene siden med antireflekterende krom som inneholder hull i form av mikropapirer. En fotomaske som inneholder ringformede mikropapirer på 37 μm brukes i denne protokollen. Når dyp UV skinner på fotomasken, kan lyset bare passere gjennom disse hullene12. - Utsett fotomasken (forkrommet side) for dyp UV i 5 min for å rengjøre overflaten.
- Tilsett små vanndråper (10 μL for en 20 mm dekkslips) på den krombelagte siden av fotomasken. Plasser dekkslippen med sin PLL-g-PEG-behandlede side på dråpen og tørk det ekstra vannet. Pass på at det ikke dannes luftbobler mellom masken og dekkglassene.
MERK: Vannets kapillære kraft immobiliserer dekkglassene. - Utsett fotomasken for dyp UV i 5 minutter med den ikke-krombelagte siden opp (dekkslipsene er festet på underoverflaten).
MERK: Lyset kan bare passere gjennom hullene og modifisere den PLL-g-PEG-behandlede overflaten av dekkslepper under fotomasken. - Fjern dekkglassene fra fotomasken ved å tilsette overflødig vann.
MERK: Dekkglassene skal raskt flyte av. - Inkuber dekksleppene i en løsning av ekstracellulære matriseproteiner (50 μg/ml fibronectin, 5 μg/ml fluorescerende fibrinogen fortynnet i vann) på parafinfilm i et fuktig kammer (som i trinn 1.2.3) i 1 time under en laminær strømningshette for å unngå kontaminering.
MERK: Eksperimentet kan settes på pause på dette tidspunktet ved å lagre dekkglassene i PBS ved 4 °C.
- Cellesåing på mikropatternede overflater
- Bruk en magnetisk dekkslipsholder som passer til størrelsen på de mikropatternede dekkslipsene til å montere dekkglassene. På oppkjøpsdagen varmer du dekkslipsholderen til 37 °C for å unngå termisk støt for cellene under påfølgende trinn.
- Forbered mønstermediet ved å supplere DMEM/F12 medium med 20 mM HEPES og 2 % av penicillin/streptomycin.
- Plasser dekkglassene i holderen med mikromønstret side opp og tilsett mønstermedium så snart dekkslippen er på holderbasen. Tilsett forseglingen og immobiliser med den magnetiske enheten. Fyll dekkslipholderen med mønstermediet og lukk den med glasslokket.
MERK: Vær rask, for ikke å la dekkglasset tørke. Ikke vask dekkslipholderen med etanol mellom eksperimenter, fordi forseglingen kan beholde litt etanol, noe som kan reagere med PLL-g-PEG og føre til cellestress. Vask dekkslipholderen kun med såpevann. Videre kan leddet inkuberes i mønstermediet ved 37 °C i 1 time for å fortynne restprodukt. - Samle transfected hTERT-RPE1 celler ved trypsinisering (0,5 ml for en 12 brønnplate) og tilsett 1 ml 10% FBS DMEM / F12 medium.
- Legg til 0,5 x 106 trans infiserte hTERT-RPE1-celler i dekkslipholderen og reclose den. Inkuber i 10 min i inkubatoren.
- Vask dekkslepeholderen 5x med mønstermedium for å fjerne ikke-festede celler og gjenværende FBS ved å legge til mønstermediet med en pipette og aspirere mediet med en annen pipette for å skape en vaskestrøm. Ha alltid et lite volum mønstermedium i dekkslipholderen for å unngå tørking av cellene på mikromønstret dekkslipp, noe som vil føre til celledød.
- Inkuber i inkubatoren i 3 timer for å tillate full cellespredning.
2. Innhenting av exocytose data
- Avbildning av eksocytosehendelser
- Plasser dekkglassholderen under en TIRM. Signalet må oppdages av et følsomt kamera satt opp med det beste bildeformatet som er tilgjengelig.
MERK: I dette eksperimentet ble det brukt et objektivmål på 100 x objektiv og et EMCCD-kamera med 512 x 512 pikslers deteksjonsområde, noe som ga opphav til en pikselstørrelse på 160 nm. - Søk etter en celle som uttrykker VAMP7-pHluorin som er fullstendig spredt (figur 1A).
MERK: Celler som uttrykker VAMP7 er tydelig identifiserbare, fordi de viser et grønt signal. - Endre vinkelen på laseren til en TIRF vinkel som tillater visualisering av VAMP7-pHluorin exocytosis hendelser er nådd. Utfør et 5 min oppkjøp med en frekvens som er kompatibel med eksokytosehastigheten og tidsskalaen (vanligvis 3 Hz, figur 1D) ved hjelp av mikroskopprogramvaren.
MERK: hTERT-RPE1-celler har en lysosomal sekretorisk hastighet på rundt 0,3 Hz på mikropatterner. Lysosomal eksocytose har en typisk varighet på 1 s. Det er preget av en toppintensitet etterfulgt av en eksponentiell forfall. Sondens diffusjon skal være tydelig på dette tidspunktet (figur 1B, C). - For hver celle, også utføre et oppkjøp av mikropapir ved hjelp av mikroskop programvare (Figur 1A).
- Plasser dekkglassholderen under en TIRM. Signalet må oppdages av et følsomt kamera satt opp med det beste bildeformatet som er tilgjengelig.
- Oppkjøp av exocytose koordinater
- Åpne den kjøpte filmen med ImageJ/FIJI. Bruk fil | Importere | Bildesekvens. Finn exocytosis hendelser for øye. En eksocytosehendelse er preget av utseendet på et lyst signal som sprer seg utover (figur 1).
- Bruk poengverktøyet til å markere midten av den eksokytiske hendelsen. Bruk Analyser | Mål for å måle X- og Y-koordinater, samt den timelige koordinaten (skivenummer). Utfør disse målingene for alle exocytosis hendelser i filmen.
- Lagre resultatene (Resultater | Fil | Lagre som). Klargjør en tekstfil for hver analyserte celle med navnet "Resultater(cell_name).txt" som inneholder stykke, X-koordinater og Y-koordinater for alle exocytosehendelser i den rekkefølgen.
Tekstfilen skal se slik ut:
ID X Y Ferets diameter Radius
RPE1_WT_Cell1 167 136 230 115
RPE1_WT_Cell2 164 160 230 115
MERK: Vær forsiktig med å erstatte alle komma med punkter. - Mål midten og diameteren på hver celle ved hjelp av "Oval Tool". Monter en perfekt sirkel (ikke bruk en oval) og bruk "Mål" for å oppnå X- og Y-koordinatene og Ferets diameter. Lagre hver celles identitet (ID), X- og Y-koordinater, Ferets diameter og radius (diameter/2) i en tekstfil med navnet "Sfærisk parameter.txt".
Tekstfilen skal se slik ut:
ID X Y Ferets diameter Radius
RPE1_WT_Cell1 167 136 230 115
RPE1_WT_Cell2 164 160 230 115
MERK: Vær forsiktig med å erstatte alle komma med punkter. - Mål tykkelsen på mikromønstreringen (vedheftslengde) med det rette verktøyet og lagre celle-IDen, celleradiusen (fra filen: "Sfærisk parameter.txt"), og vedheftslengde i en tekstfil med navnet "Mønsterparameter.txt". Beregn den normaliserte vedheftslengden ved å dele vedheftslengden med celleradius.
MERK: Vær forsiktig så du erstatter alle kommaene med punkter.
Filen skal se slik ut:
ID-celleradius vedheftslengde Normalisert vedheftslengde
RPE1_WT_Cell1 115 34 0,295652174
RPE1_WT_Cell2 115 35 0,304347826
3. Enkeltcelles romlig analyse
- R pakke og installasjon
MERK: R-pakken for denne analysen drar nytte av Spatstat-pakken13 for å beregne den todimensjonale (2D) tettheten og Ripleys K-funksjon. Koden er åpen kildekode og bruker tekstfiler som tidligere er beskrevet.- Last ned og installer R fra https://www.r-project.org/ (versjon 3.5.2 ble brukt i denne analysen).
- Last ned pakken (og demodatasettet) fra: https://github.com/GoudTeam/JoVE-paper
- Installer pakken på R Studio ved hjelp av "Verktøy" ved hjelpav " Installer pakker". Velg "Pakkearkivfil (.zip; .tar.gz)" for kategorien "Installer fra:" og velg pakkefilen. Trykk på "Installer".
- Last pakken med funksjonen "bibliotek("ExocytosisSpatialAnalysis")" ved å skrive denne kommandoen i R studio og trykke "Enter".
- Kjør pakken med funksjonen "ESA() " ved åskrive denne kommandoen i R studio og trykke "Enter".
MERK: Et brukergrensesnitt åpnes. - Velg katalogen for datasettet (TXT-filer) og en katalog for utdataplott.
MERK: Parametere for analysen (se tekst nedenfor) kan endres via et brukergrensesnitt. - Dette skriptet starter og utfører analysen automatisk. Det gir PDF-filer av tilsvarende plott og TXT-filer som inneholder numeriske resultater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De spatiotemporale egenskapene til exocytose hendelser ble analysert fra lysosomer visualisert av VAMP7-pHluorin10,11 i hTert-RPE1 celler. hTert-RPE1-celler er ikke-overførte celler som vedtar godt til mikropattering og har blitt mye brukt i tidligere mikropatternbasertestudier 4,14. VAMP7 er en lysosomal v-SNARE15 som ble merket med super ekliptisk pHluorin ved n-terminus og ligger i lumen av lysosomet. Inne i cellen ble pHluorin-sonden slukket av lysosomets lave pH, men under eksocytose pHluorin begynte å avgi et signal fordi pH-en økte på grunn av protonutgivelse. VAMP7-pHluorin ble overvåket av TIRFM live celleavbildning på ringformede mikropatter (figur 1A–B). pHluorinsignalet viste en topp under eksocytose som representerte rask frigjøring av lysosomale protoner etterfulgt av eksponentiell forfall, som representerer 2D-diffusjonen av sonden ved plasmamembranen (figur 1C). hTERT-RPE1-celler presenterte en viktig lysosomal sekresjonsaktivitet med en gjennomsnittlig eksokytosehastighet på 0,28 Hz (figur 1D). Imidlertid ble høy heterogenitet observert i eksocytosehastigheten på tvers av celler (standardavvik på 0,15 Hz), noe som indikerer at det var sterk celle-til-celle variabilitet i sekresjon fra lysosomene.
Encellet romlig analyse for å undersøke om eksocytose av lysosomer er tilfeldig
Det var mulig å visualisere 2D-fordelingen av eksocytose av KDE, som tidligere utført for endomembranøse rom14, noe som kan avsløre forskjeller i lokale tettheter (figur 2B). Denne tilnærmingen er relevant for visualisering av gjennomsnittlig fordeling av en cellepopulasjon, men mindre informativ i enkeltceller på grunn av det begrensede antallet hendelser som oppdages (titalls versus flere tusen oppnådd ved populasjonsbasert analyse) og høy celle-til-celle-variabilitet. Denne tilnærmingen tillot for eksempel oss ikke å vurdere om fordelingen av eksocytosehendelser fulgte en fullstendig romlig randomness (CSR) oppførsel (det vil si tilsvarte en jevn punktfordeling i et observert område for en enkelt celle). Et poengmønster følger en CSR-virkemåte når de to følgende hypotesene er sanne: 1) hvert punkts plassering er uavhengig av de andre punktene; og 2) sannsynligheten for å finne et punkt i en underregion er bare avhengig av forholdet mellom dette underregionens område og det totale området. Det er tre mulige avvik fra CSR: 1) klynger (det vil si aggregering); 2) dispersjon (det vil vil at du bestiller med konstant avstand); eller 3) en blanding av klynger og dispersjon (figur 2C). Ripleys K-funksjon ble brukt til å svare på dette spørsmålet som i tidligereanalyser 7,8,9 ( Figur2D). Ripleys K-funksjon er nær πr² (med d som normalisert avstand fra en hendelse) i tilfelle csr, men overlegen (respiratorisk dårligere) til πr² i tilfelle klynger (respiratorisk dispersjon). Ved å trekke πr² fra Ripleys K-funksjon, bør den teoretiske CSR-kurven være på 0. Simuleringer av CSR-tilfeller ble utført ved hjelp av samme antall punkter som de observerte exocytose-hendelsene for å vurdere godheten til CSR-saken (grå konvolutt rundt den teoretiske kurven). Den transformerte Ripleys K-funksjon som ble brukt på de eksperimentelle dataene viste positive verdier utenfor konvolutten, noe som indikerer klynger (figur 2D).
For å undersøke om klynger av eksocytosehendelser skyldtes celleadhesjon som tidligererapportert 6,utførte vi en lignende analyse på data fra utelukkende det ikke-adhemmende celleområdet i midten (Figur 2A, klebeområde i grått, ikke-adhesivt cellesenterområde i hvitt). Merk at exocytosis hendelser i nonadhesive området ble også gruppert (Figur 2E), noe som indikerer at vedheftmolekyler ikke var de eneste strukturene som induserte sekretoriske hot spots på plasmamembraner.
Fordi Ripleys K-funksjon er en beskrivende statistikk som ikke gir en P-verdi, ble en statistisk test satt opp ved å sammenligne cellulære exocytosehendelser med CSR-simuleringer. Den nærmeste naboavstand NND(i) metoden ble brukt. NDD er definert som den minimale euklidiske avstanden mellom et punkt i og alle andre punkter. Gjennomsnittlig NND(i) fra alle eksokytiske hendelser i en celle ble beregnet og sammenlignet med CSR oppnådd med et høyt antall Monte Carlo-simuleringer (figur 2F). Vi fant at den gjennomsnittlige NND av en celle analysert i figur 2F var lavere enn gjennomsnittet av den simulerte fordelingen av CSR-saken, noe som indikerer nærmere naboer i gjennomsnitt og dermed klynger. Ved spredning var det forventet en høyere verdi for gjennomsnittlig NND (figur 2C). Denne sammenligningen tillot beregning av en P-verdi for hver celle. P-verdien representerer prosentandelen av simuleringer som viste en mer ekstrem NND (på en tosidig måte). For å være presis, ble den objektive P-verdien beregnet som (k +1) / (N + 1) med N som det totale antall Monte-Carlo-simuleringer (10.000), og k antall av disse simuleringene som var mer ekstreme enn den observerte målmiddel16. Histogrammet av alle P-verdier ble plottet for det totale celleområdet (figur 2G) og det ikke-adhesive celleområdet (figur 2I). Hvis H0: "Exocytosis er en CSR-prosess" var sant, var det forventet en jevn fordeling av P-verdier. Hvis H0 var falsk, var det forventet en topp med lav P-verdi. Utføre en Kolmogorov-Smirnov test på P verdi histogrammer, en P verdi dårligere enn 0,001 ble oppnådd, viser en betydelig avvik fra CSR i begge tilfeller (Figur 2G og 2I). Videre indikerte en klyngekoeffisient på 0,955 for det totale celleområdet og 1.000 for det ikke-adhemmende celleområdet at lysosomal eksokytose var en gruppert prosess uavhengig av celleadhesjon. Klyngekoeffisienten representerer prosentandelen av celler som var nærmere en klyngevirkemåte enn spredning. Dette resultatet var i samsvar med Ripleys K-funksjon.
For å evaluere rollen som celleadhesjon i klynger, sammenlignet vi gjennomsnittlig NND i ikke-adhemmende området med det i det totale området for hver enkelt celle (figur 2H). Fordi den gjennomsnittlige NND var omvendt proporsjonal med overflatetettheten, normaliserte vi den gjennomsnittlige NND av det ikke-adhemmende området ved hjelp av homotety. Den betydelig større gjennomsnittlige NND av exocytosis hendelser i nonadhesive området indikert mindre klynger (Figur 2H). Dermed, selv om sekresjon fra lysosomer klynger i ikke-adheesive områder, celle vedheft syntes å forbedre klynger.
Romlig analyse av eksocytosehendelser ved hjelp av polare koordinater
Den sirkulære geometrien til det ringformede mikropapiret tillot bruk av de vanlige polarkoordinatene, noe som forenklet analyser, som tidligere funnet17. Hver eksocytose hendelse kan dermed beskrives av en modulus (avstand fra opprinnelsen, her midten av den nedre planet av cellen) og en vinkel (i henhold til en fast vilkårlig akse). I tillegg kan modulen normaliseres ved å dele den med radiusen til cellen. Histogrammet av exocytosis hendelser ble plottet i henhold til modulus for en representativ celle (Figur 3A). Dette avslørte en topp rundt grensen mellom de selvklebende / ikke-adhemmende områdene. En stor variasjon mellom celler ble også observert. Derfor samlet vi n = 22 celler for å oppnå en gjennomsnittlig fordeling av eksocytosehendelser. Men for å gi samme statistiske vekt til hver celle, ble samme antall hendelser fra hver celle tilfeldig valgt. Dette tilfeldige valget endret ikke de generelle mønstrene sett. For å oppnå en kontinuerlig gjennomsnittlig fordeling av de enkelte fordelingene av enkeltceller, ble det brukt en KDE (figur 3B). Men fordi den normaliserte modulen er mellom 0 og 1, måtte kantforhold tas i betraktning. En betakjerne som endrer form ved siden av kantene ble brukt18. Et feilbånd ble beregnet med en bootstrap strategi. Den observerte gjennomsnittlige fordelingen ble sammenlignet med en hypotetisk CSR-fordeling som viste flere hendelser ved en høyere modulus, fordi området økte med en høyere modulus. Fordi integralen i en sannsynlighetstetthet skulle være én, var CSR-fordelingen 2r (med er den normaliserte radiusen, uten enheter). Et konfidensbånd ble beregnet rundt den teoretiske kurven ved hjelp av et stort antall CSR Monte Carlo-simuleringer (5000 hver). De 1st og 99th persentiler av modulus distribusjon fra disse simuleringene ble plottet. Vi fant at den gjennomsnittlige fordelingen av eksocytosehendelser avviket fra den hypotetiske ved 0,7rmaks, noe som tilsvarer begynnelsen av klebeområdet i cellen.
Vi forsøkte å teste om den observerte fordelingen av modulen var forskjellig fra den teoretiske. Fordi gjennomsnittlige distribusjoner, som i dette tilfellet, ikke kan nøyaktig testes av en godhet-of-fit test (f.eks Kolmogorov-Smirnov) en alternativ metode foreslått av Pecot et al. ble ansatt. Denne metoden måler forskjellen mellom variasjonen på tvers av en befolkning og variasjonen i en befolkning, og tillater dermed uavhengig testing for hver koordinat (det vil vil vil at modulus og vinkel)17. Denne testen ble brukt til å sammenligne våre data med simulerte data som representerer CSR exocytosis hendelser (samme antall celler og exocytose hendelser som de observerte dataene), og fant en statistisk signifikant forskjell i variasjonene (p < 0,001 med Wilcoxon-Mann-Whitney test, n = 22 celler), noe som indikerer at den observerte gjennomsnittlige exocytose distribusjon ikke var CSR. Men når to CSR-simuleringer (med 5000 simuleringer hver) ble sammenlignet, fant vi ut at P-verdien histogrammet ikke viste en jevn fordeling, men viste en topp nær 1, noe som indikerer at denne testen sannsynligvis manglet følsomhet.
Fordi KDE-estimeringen er avhengig av et ikke-trivielt valg av kjernebåndbredde og er følsom for kanteffekter, ble den kumulative distribusjonsfunksjonen også beregnet, noe som overvinner problemene som ligger i KDE-estimering (figur 3D). Denne funksjonen er definert mellom 0 og 1 og inneholder ingen vilkårlige parametere eller skjevheter (f.eks. kantbias). Feil- og konfidensbånd ble beregnet på samme måte som for modulfordelingen. Den kumulative fordelingsfunksjonen bekreftet at exocytosis hendelser ikke fulgte en CSR-distribusjon, men ble overkonsentrert ved moduli rundt 0,7rmaks. Denne analysen tillot oss dermed å identifisere cellulære områder der klynger skjedde. Et interessant spørsmål som dette resultatet reiser er om overkonsentrasjonen på 0,7rmaks var på grunn av tilstedeværelsen av klebende / nonadhesive områder av det ringformede mikromønstret eller en effekt av perifer / sentral sekresjonsområder av celler.
Som den gjennomsnittlige fordelingen av exocytosis hendelser avviket fra CSR tilfelle i nonadhesive samt selvklebende områder, vi lurte også på hvor exocytosis tetthet var høyest. Overflaten tettheter av eksocytose i vedheft og nonadhesion områder ble beregnet og sammenlignet. Vi fant at overflatetettheten var lavere i vedheftsområdet enn i ikke-adhesion-området ved hjelp av en paret analyse (figur 3C). Dette kan forklares med den sterke reduksjonen av eksocytose i celle periferien (0,85 – 1rmaks, figur 3B).
Figur 1. Exocytosis fra lysosomer i hTert-RPE1 celler: (A) Ringformet mikrokrem (rød) og lim hTert-RPE1 celle transfected med VAMP7-pHluorin (grønn) avbildet av TIRFM. Pilen viser en exocytosis hendelse. Vektstenger = 10 μm. (B) Kymograph av exocytosis hendelser. Piler viser exocytosis hendelser. Vektlinje = 2 μm, skalerbar i tide = 5 s. (C) Normalisert intensitetsprofil av lysosomal eksocytose fra 22 celler. Hvert punkt er i gjennomsnitt minst 1530 exocytose hendelser. Data presenteres ± SEM. (D) Exocytosis rate av de 22 cellene. Gjennomsnittlig +/- standardavvik tegnes inn i rødt. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2. Romlig analyse av lysosomale eksocytosehendelser. (A) Scatter plott av exocytosis hendelser under 5 min oppkjøp. Hver prikk representerer en exocytose hendelse. Klebeområdet er vist i grått. (B) 2D kjerne tetthet estimering (KDE) av scatter plot av A. Fargen representerer den lokale tettheten av exocytose hendelser. (C) Skjematisk representasjon av mulige punktmønstre. De fire tilfellene, Complete Spatial Randomness (CSR), Clustering, Dispersion og Mixed vises, og flere nærmeste naboavstander (NND) plottes (stiplede linjer) for å vise hvordan gjennomsnittlig NND reduserte i klynger og økes med spredning. (D)Analyse av en representativ celle ved hjelp av Ripleys K-funksjon. Den røde stiplede linjen er lik "Ripley's K-funksjon - πr²" for CSR-hendelser, den grå konvolutten representerer den estimerte godhet-of-fit fra Monte Carlo simuleringer med samme antall poeng som exocytosis hendelser (Nhendelse = 81). Den svarte faste linjen tilsvarer "Ripleys K-funksjon – πr²" for observerte eksocytosehendelser(N-hendelse = 81). Den positive avviket fra den røde kurven ut fra den grå konvolutten indikerer klynge av eksocytosehendelser. Ripleys K-funksjon ble normalisert til å ha en maksimumsverdi på 1. (E) Analyse av ikke-adhemmende området av samme celle ved hjelp av Ripleys K-funksjon som i D. Det positive avviket fra den røde kurven utenfor den grå konvolutten indikerer en klynge av exocytosis hendelser i ikke-adhemmende området. (F) Sammenligning av gjennomsnittlig NND-distribusjon fra en representativ celle (rød linje) med KDE av CSR hentet fra Monte Carlo-simuleringer (blå kurve). P-verdien ble beregnet som prosentandelen av simulerte verdier som var mer ekstreme enn verdien som ble observert. (G) P verdi histogrammet hentet fra NND testen som i F for n = 26 celler. Toppen ved lave P-verdier betyr at nullhypotesen "exocytosis follows CSR" ble avvist med en Kolmogorov-Smirnov-test, noe som indikerer at lysosomal eksokytose ikke var CSR. (H) Box-plot av gjennomsnittlig NND fra exocytosis hendelser i ikke-adhemmende områder (hvit) og totale celleområder (grå). De to datapunktene fra samme celle er forbundet med en linje. Gjennomsnittlig NND var større i ikke-adhemmende område, p < 0,001 med en paret Wilcoxon-test (n = 25 celler), noe som indikerer betydelig mindre klynger i det ikke-adhemmende området. (I)Samme som G for nonadhesive området for n = 26 celler. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3. Romlig analyse av samlede lysosomale eksocytosehendelser: (A) Histogram av eksocytosehendelsene i en representativ celle under et 5 min oppkjøp med n = 161 exocytosis hendelser som en funksjon av normalisert modulus; 0 representerer cellesenteret og 1 celle periferien. Den selvklebende delen av cellen er vist i grått og tilsvarer moduli fra 0,65-1 for cellene som vises. Det er en topp i begynnelsen av klebeområdet rundt moduli mellom 0,6 og 0,7. (B) KDE av exocytosis hendelser som en funksjon av normalisert modulus for n = 22 celler med 56 hendelser i hver celle; 0 representerer cellesenteret og 1 celle periferien. Det gjennomsnittlige klebemiddelområdet er vist i grått og tilsvarer i gjennomsnitt til moduli fra 0,61-1. Den stiplede blå kurven er den teoretiske kurven som forventes i tilfelle av CSR. Denne teoretiske kurven er ledsaget av en konvolutt som representerer 1-99th persentiler av CSR oppnådd ved hjelp av Monte Carlo simulering. KDE-kurven fra de observerte dataene er i rødt og ledsaget av et feilbånd generert av bootstrapping. Klebeområdet er i grått +/- SEM. (C) Paret analyse av overflatetetthetene i vedhefts- og ikke-vedheftsområder. Eksocytose overflatetettheten ble beregnet som antall hendelser per normalisert område og per sekund. Her, *p < 0,05 fra en paret student t-test (n = 22 celler). Normaliteten ble tidligere testet av en Shapiro-Wilk-test. (D) Kumulativ fordelingsfunksjon for dataene i B (rød linje) og fra Monte Carlo CSR-simuleringer (stiplet blå linje). Konvolutter ble generert som i B. Legg merke til at den røde linjen avviker fra den teoretiske CSR på rundt 0,7rmaks. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi overvåket eksocytosehendelser fra det lysosomale rommet ved TIRFM levende celleavbildning av VAMP7-pHluorin i ringformede mikropattern-normaliserte celler og utførte en streng statistisk analyse av de romlige parametrene for exocytosehendelser. Ved hjelp av den forvandlede Ripleys K-funksjon og en statistisk test basert på nærmeste naboavstand, bekreftet vi at sekresjon fra lysosomer ikke er en tilfeldigprosess 8,9. Begge statistiske analyser viste overbevisende at exocytosis hendelser viser klynger (Figur 2D og 2G). Ved hjelp av lignende verktøy til det ikke-adhemmende celleområdet, fant vi at exocytosis hendelser også er gruppert i ikke-adhemmende områder (Figur 2E og 2I). Dermed er vedheftmolekyler som tidligere har blitt rapportert å tillateklynger 6 ikke de eneste strukturene som kan indusere sekretoriske hot spots på plasmamembranen. Imidlertid ble celleadhesjon forbedret klynger: den gjennomsnittlige nærmeste naboavstanden mellom exocytose hendelser var betydelig større i ikke-adhesive områder (figur 2H). Konsekvent identifiserte vår analyse basert på kjernetetthetsestimering og den kumulative fordelingsfunksjonen berikede områder av eksocytose som lå på grensen mellom klebende og ikke-adhesive områder i ringformede mikropatternceller. Mer arbeid er nødvendig for å bestemme de molekylære mekanismene som ligger til grunn for klynger, for eksempel vedheft eller en bestemt målretting av lysosomet til denne regionen. Interessant, observerte vi høy heterogenitet i eksocytosehastigheten på tvers av hTERT-RPE1-celler (standardavvik på 0,15 Hz for gjennomsnittlig eksocytoserate på 0,28 Hz, figur 1D), noe som indikerer at sekresjon fra lysosomer har høy intercellulær variasjon. Derfor bør underbefolkningsanalyser vurderes i fremtidig arbeid. Det ville være spesielt interessant å undersøke om denne variasjonen gjenspeiler mangfoldet av lysosomale rom, forskjeller i last, eller avhengighet av exocytosis maskineri.
Disse resultatene illustrerer hvordan statistiske verktøy kan brukes til å undersøke romlige parametere for ulike biologiske prosesser. Videre letter mikromønstre studien av effekten av celleadhesjon på en objektiv måte ved hjelp av forskjellige mikromønstrede geometrier (f.eks ringformet versus diskshaped). Spesielt legger bruk av runde former til rette for analyser fordi polare koordinater kan brukes. Fordi statistiske verktøy krever at en viss mengde data er meningsfulle, ble celler med mer enn 30 hendelser brukt til vår analyse. Det er imidlertid en mulighet for at celler med 30 eller færre hendelser er meningsfulle. Dermed kan prøvetakingsceller med 30 eller færre hendelser utføres for å oppnå tilstrekkelige hendelser for analyse for å avgjøre om dette er tilfelle. På samme måte er det vanskelig å anslå hvor mange celler som skal analyseres, spesielt hvis det er sterk intercellulær variasjon. En måte å omgå dette på er å tilfeldig velge samme antall hendelser fra hver celle for å gi samme statistiske vekt til hver celle når du har samlet dem. Vi anbefaler imidlertid at analyser på færre enn 15 celler gjøres med forsiktighetsregler. Siden gjennomsnittlige fordelinger av samlede celler ikke kan testes nøyaktig av godhet-of-fit tester (f.eks Kolmogorov-Smirnov) vi ansatt en test statistikk foreslått av Pecot et al. som måler forskjellen i variasjoner avpopulasjoner 17. Selv om denne testen tillot oss å finne en statistisk signifikant forskjell i variasjonene i de gjennomsnittlige distribusjonene, mistenker vi at denne testen har lav følsomhet fordi P-verdien histogrammet ikke var flatt (det vil si viste jevn fordeling) når vi sammenligner forskjellige CSR-simuleringer for p-verdier nær 1. Derfor kan denne statistiske prosedyren måtte forbedres.
En ulempe med våre analyser er manuell påvisning av exocytose hendelser, noe som drastisk reduserer hastigheten på analysen. Begrensninger i automatisk deteksjon skyldes ofte sterk heterogenitet i den unike og enkle parameteren som analyseres (f.eks. intensiteten av eksocytosehendelser). Nevrale nettverk kan være potensielt kraftige for automatisk deteksjon, fordi de kan trenes til å gjenkjenne mange funksjoner.
Analysen som presenteres her kan brukes på andre dynamiske prosesser observert av TIRFM, for eksempel sekresjon fra andre rom og fordelingen av membranmikrodomenet eller antigenpresentasjonen. Lignende analyser kan også brukes på faste celler for å studere romlig fordeling av proteiner. Vi håper at vårt arbeid vil øke den økende interessen for romlig distribusjonsanalyse i cellebiologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi anerkjenner Thierry Galli (Senter for psykiatri og nevrovitenskap, INSERM) for å gi VAMP7-pHluorin plasmid. Vi takker Tarn Duong for råd om statistisk analyse og medlemmer av GOUD-laboratoriet for fruktbare diskusjoner. Forfatterne anerkjenner i stor grad Cell and Tissue Imaging Facility (PICT-IBiSA @Burg, PICT-EM @Burg og PICT-IBiSA @Pasteur) og Nikon Imaging Center, Institut Curie (Paris), medlem av den franske nasjonale forskningsinfrastrukturen France-BioImaging (ANR10-INBS-04). H.L. ble støttet av Association pour la Recherche sur le Cancer (ARC) og P.M. mottok støtte fra EUs Horizon 2020 forsknings- og innovasjonsprogram under Marie Skłodowska-Curie tilskuddsavtale no 666003. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra INFECT-ERA (ANR-14-IFEC-0002-04), Labex CelTisPhyBio (ANR-10-LBX-0038) og Idex Paris Sciences et Lettres (ANR-10-IDEX-0001-02 PSL), samt Centre National de la Recherche Scientifique og Institut Curie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chamlide Magnetic Chamber | Chamlide | ||
| DMEM/F12 | Gibco | 21041-025 | |
| Fibrinogen | Molecular Probes, Invitrogen | F35200 | |
| Fibronectin bovine plasma | Sigma | F1141 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-056 | |
| hTert RPE1 cell line | https://www.atcc.org | ||
| ImageJ | http://rsbweb.nih.gov/ij/ | n/a | Authored by W. Rasband, NIH/NIMH |
| JetPRIME Transfection reagent | Polyplus | 114-07 | |
| Penicilin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Photomask | Delta Mask | ||
| PLL-g-PEG solution | Surface Solutions | PLL(20)-g[3.5]- PEG(2) | |
| R Software | https://www.r-project.org/ | n/a | |
| Trypsin (TrypLE Express 1X) | Gibco | 12605-010 | |
| UV ozone oven | Jelight Company Inc | 342-220 | |
| VAMP7-pHFluorin plasmid | n/a | n/a | Paper reference :http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Role+of+HRB+in+clathrin-dependent+endocytosis. J Biol Chem. 2008 Dec 5;283(49):34365-73. doi: 10.1074/jbc.M804587200. Role of HRB in clathrin-dependent endocytosis. Chaineau M, Danglot L, Proux-Gillardeaux V, Galli T. |
References
- Wu, L. -G., Hamid, E., Shin, W., Chiang, H. -C. Exocytosis and endocytosis: modes, functions, and coupling mechanisms. Annual Review of Physiology. 76, 301-331 (2014).
- Samie, M. A., Xu, H. Lysosomal exocytosis and lipid storage disorders. Journal of Lipid Research. 55, 995-1009 (2014).
- Neher, E., Marty, A. Discrete changes of cell membrane capacitance observed under conditions of enhanced secretion in bovine adrenal chromaffin cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79, 6712-6716 (1982).
- Grossier, J. P., Xouri, G., Goud, B., Schauer, K. Cell adhesion defines the topology of endocytosis and signalling. The EMBO Journal. 33, 35-45 (2014).
- Fourriere, L., et al. RAB6 and microtubules restrict protein secretion to focal adhesions. Journal of Cell Biology. 218, 2215-2231 (2019).
- Wang, Y., McNiven, M. A. Invasive matrix degradation at focal adhesions occurs via protease recruitment by a FAK-p130Cas complex. Journal of Cell Biology. 196, 375-385 (2012).
- Lagache, T., Lang, G., Sauvonnet, N., Olivo-Marin, J. C. Analysis of the spatial organization of molecules with robust statistics. PLoS One. 12, 80914 (2013).
- Yuan, T., Lu, J., Zhang, J., Zhang, Y., Chen, L. Spatiotemporal Detection and Analysis of Exocytosis Reveal Fusion "Hotspots" Organized by the Cytoskeleton in Endocrine Cells. Biophysical Journal. 108, 251-260 (2015).
- Urbina, F. L., Gomez, S. M., Gupton, S. L. Spatiotemporal organization of exocytosis emerges during neuronal shape change. Journal of Cell Biology. 217, 1113-1128 (2018).
- Martinez-Arca, S., Alberts, P., Zahraoui, A., Louvard, D., Galli, T. Role of Tetanus Neurotoxin Insensitive Vesicle-Associated Membrane Protein (Ti-Vamp) in Vesicular Transport Mediating Neurite Outgrowth. Journal of Cell Biology. 149, 889-900 (2000).
- Alberts, P., et al. Cdc42 and Actin Control Polarized Expression of TI-VAMP Vesicles to Neuronal Growth Cones and Their Fusion with the Plasma Membrane. Molecular Biology of Cell. 17, 1194-1203 (2006).
- Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Théry, M., Piel, M. Simple and rapid process for single cell micro-patterning. Lab on a Chip. 9, 1640-1642 (2009).
- Baddeley, A., Rubak, E., Turner, R. Spatial point Patterns: Methodology and Applications with R. , CRC Press. Indianapolis, IN. (2015).
- Schauer, K., et al. Probabilistic density maps to study global endomembrane organization. Nature Methods. 7, 560-566 (2010).
- Advani, R. J., et al. Seven Novel Mammalian SNARE Proteins Localize to Distinct Membrane Compartments. Journal of Biological Chemistry. 273, 10317-10324 (1998).
- North, B. V., Curtis, D., Sham, P. C. A Note on the Calculation of Empirical P Values from Monte Carlo Procedures. American Journal of Human Genetics. 71, 439-441 (2002).
- Pecot, T., Zengzhen, L., Boulanger, J., Salamero, J., Kervrann, C. A quantitative approach for analyzing the spatio-temporal distribution of 3D intracellular events in fluorescence microscopy. eLife. 7, 32311 (2018).
- Chen, S. X. Beta kernel estimators for density functions. Computational Statistics & Data Analysis. 31, 131-145 (1999).
