Summary
A imagem viva da excitose lisosômica em células micropatteradas permite uma quantificação espacial desse processo. A normalização da morfologia usando micropatterns é uma excelente ferramenta para descobrir regras gerais sobre a distribuição espacial dos processos celulares.
Abstract
Imagem ao vivo da pHluorin marcada como fator solúvel N-ethylmaleimida-fator anexo Proteína de apego REceptor (v-SNARE) Proteína de membrana associada à vesícula 7 (VAMP7) por microscopia de fluorescência de reflexão interna total (TIRFM) é uma maneira simples de explorar a secreção do compartimento lysosomal. Aproveitando a cultura celular em superfícies micropatteradas para normalizar a forma celular, uma variedade de ferramentas estatísticas foram empregadas para realizar uma análise espacial de padrões secretos. Usando a função K de Ripley e um teste estatístico baseado na distância do vizinho mais próximo (NND), confirmamos que a secreção de lysososomes não é um processo aleatório, mas mostra agrupamento significativo. Note-se que nossa análise revelou que os eventos de exocitose também estão agrupados em áreas de não adesão, indicando que as moléculas de adesão não são as únicas estruturas que podem induzir pontos quentes secretos na membrana plasmática. Ainda assim, descobrimos que a adesão celular aumenta o agrupamento. Além das áreas adesivas e não adesivas precisamente definidas, a geometria circular desses micropatterns permite o uso de coordenadas polares, simplificando as análises. Utilizamos a Estimativa de Densidade do Kernel (KDE) e a função de distribuição cumulativa em coordenadas polares de eventos de exocitose para identificar áreas enriquecidas de exocitose. Em células de micropattern em forma de anel, o agrupamento ocorreu na borda entre as áreas adesivas e não adesivas. Nossa análise ilustra como ferramentas estatísticas podem ser empregadas para investigar distribuições espaciais de diversos processos biológicos.
Introduction
Exocitose é um processo celular universal no qual uma vesícula se funde com a membrana plasmática e libera seu conteúdo. A vesícula pode se fundir totalmente com a membrana plasmática (fusão total) ou criar um poro de fusão que permanece aberto durante um tempo limitado (beijo-e-corrida)1. Por exemplo, proteínas recém-sintetizadas são liberadas no meio extracelular a partir de vesículas provenientes do complexo golgi. Este caminho biossintético, anterograde é primordial, especialmente em organismos multicelulares, para segregar peptídeos de sinalização (por exemplo, hormônios, neurotransmissores) e componentes de matriz extracelular (por exemplo, colágeno), bem como para traficar proteínas transmembranas para a membrana plasmática. Além disso, secreções podem ocorrer a partir de diferentes endossóis: 1) reciclagem de endósmosos a fim de reutilizar proteínas transmembranas; 2) corpos multivesiculares (MVBs) para liberação de exosóis; e 3) lysososomes para a liberação de enzimas proteolíticas. A secreção endossomal tem se mostrado importante para o crescimento de neurite, formação de pseudopodia, reparação da membrana plasmática e sinalização dependente de ATP2.
Para estudar a exocitese no nível de célula única, várias técnicas foram empregadas. Patch-clamp permite a detecção de eventos de exocitose única com uma alta resolução temporal em uma grande variedade de células vivas3. No entanto, este método não fornece informações sobre a localização de eventos de exocistose, nem de qual compartimento ocorre. A microscopia eletrônica permite a visualização direta de eventos exocióticos com alta resolução espacial, e em combinação com o imunolabeling fornece informações sobre a especificidade dos compartimentos e moléculas envolvidas. Uma desvantagem dessa abordagem é a falta de informação sobre a dinâmica do processo, bem como sua incapacidade de realizar estudos de alto rendimento. A microscopia leve, como a microscopia de fluorescência de reflexão interna total (TIRFM), que explora o campo evanescente para iluminar fluoroforos nas proximidades do deslizamento de cobertura (100 nm), proporciona boa resolução temporal e espacial para estudar eventos de exocistose. No entanto, este método só é compatível com células aderentes e só pode ser aplicado na parte ventral/inferior das células.
Note-se que a membrana plasmática revela heterogeneidade significativa baseada em complexos adesivos que estão presentes apenas em áreas restritas. Essa heterogeneidade restringe, por exemplo, a absorção de diferentes ligantes4. Da mesma forma, foi recentemente relatado que a secreção do complexo golgi está concentrada em "pontos quentes" na membrana plasmática5. Além disso, sabe-se que certas cargas são secretadas através da exocistose focal associada à adesão6. Assim, deve-se prestar atenção especial à questão de saber se os eventos de exocitose são distribuídos aleatoriamente no espaço, ou se estão concentrados em áreas específicas da membrana plasmática. Várias ferramentas estatísticas baseadas na função K de Ripley foram propostas para explorar essas questões7,,8,,9. Nossa abordagem combina essas ferramentas com micropatterning para controlar a forma celular e heterogeneidade da membrana plasmática. Além de fornecer um meio de distinguir entre áreas adesivas e não adesivas, essa técnica também permite a comparação entre diferentes células e condições e aumenta o poder das análises estatísticas.
Aqui utilizamos uma variedade de ferramentas estatísticas para estudar a distribuição espacial de eventos de excitose a partir do compartimento lisosômico monitorado por imagens de células vivas TIRFM de VAMP7-pHLuorin em células hTert-RPE1 em forma de anel. Foi confirmado que a secreção de lysososomes não é um processo aleatório8,,9 e que eventos de exocitose exibem agrupamento. Note-se que os eventos de exocitose também estão agrupados em áreas não adesivas, indicando que as moléculas de adesão não são as únicas estruturas que podem induzir pontos quentes secretos na membrana plasmática. No entanto, a adesão celular melhorou o agrupamento. Consistentemente, nossa análise identificou áreas enriquecidas de exocitose que estavam localizadas na fronteira entre as áreas adesivas e não adesivas.
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Protocol
1. Preparação de células micropatteradas
- Transfecção de células
- Um dia antes da transfecção, as células semente 2,5 x 106 hTERT-RPE1 em um poço de uma placa de 12 poços (2 x 2 cm) em 1 mL de média.
- No dia da transfecção, prepare a mistura de transfecção com plasmídeo vamp7-pHluorin (100 μL de tampão, 0,8 μg de DNA, 3 μL de mistura de transfecção). Incubar por 10 minutos.
NOTA: VAMP7 é um v-SNARE lysosômico, fundido com uma tag pHluorin luminal. A sonda pHluorin é saciada por pH baixo, mas durante os prótons de exocitose são liberados e pHluorin começa a emitir um sinal10,11. - Adicione a mistura de transfecção às células em seu meio.
- Mude o meio 4h depois de adicionar a mistura de transfecção nas células.
- Use as células para experimentos durante as próximas 24-48 h.
- Preparação de micropatteria (método de fotolitografia)
- Lave as tampas (25 mm de diâmetro) no etanol e deixe-as secas por 5 minutos.
- Ative as tampas por iluminação sob UV profundo por 5 minutos.
- Crie uma câmara úmida umidificando completamente uma toalha de papel na qual um filme de parafina é colocado. Adicione gotas (30 μL para cobertura de 22 mm) da solução Poly-L-Lysine-graft-Polyethylene Glycol (PLL-g-PEG) (0,1 mg/mL, 10 mM HEPES, pH = 7,4) e coloque tampas com a superfície ativada sobre eles. Feche a câmara úmida com uma tampa superior e incubar tampas por 1h.
- Lavar tampas 2x em PBS e 1x em água destilada e deixá-los secar.
- Lave a máscara de quartzo com água destilada e depois com etanol ou propanol. Seque a máscara com fluxo de ar filtrado.
NOTA: O fotomasmak de quartzo é revestido de um lado com cromo antirreflexo que contém furos na forma de micropatterns. Uma máscara fotográfica contendo micropatters em forma de anel de 37 μm é usada neste protocolo. Quando o UV profundo é iluminado na máscara fotográfica, a luz só pode passar por esses buracos12. - Exponha a máscara (lado revestido de cromado) a UV profundo por 5 minutos para limpar a superfície.
- Adicione pequenas gotas de água (10 μL para um deslizamento de cobertura de 20 mm) no lado cromado da máscara fotográfica. Coloque o deslizamento de cobertura com seu lado tratado de PLL-g-PEG na queda e seque a água extra. Certifique-se de que não se formem bolhas de ar entre a máscara e as tampas.
NOTA: A força capilar da água imobilizará as tampas. - Exponha a máscara fotográfica a UV profundo por 5 minutos com o lado não cromado para cima (as tampas são anexadas na superfície inferior).
NOTA: A luz só pode passar pelos orifícios e modificar a superfície tratada com PLL-g-PEG de manchas abaixo da máscara fotográfica. - Remova as tampas da máscara fotográfica adicionando água em excesso.
NOTA: As manchas devem flutuar rapidamente. - Incubar as tampas em uma solução de proteínas de matriz extracelular (50 μg/mL de fibronectina, 5 μg/mL de fibrinog fluorescente diluído em água) em filme de parafina em uma câmara úmida (como na etapa 1.2.3) por 1 h sob um capô de fluxo laminar para evitar contaminação.
NOTA: O experimento pode ser pausado neste momento armazenando as tampas em PBS a 4 °C.
- Semeadura celular em superfícies micropatteradas
- Use um suporte de deslizamento magnético que se encaixe no tamanho das tampas micropatteradas para montar as tampas. No dia da aquisição, aqueça o suporte de deslizamento de tampas a 37 °C para evitar choque térmico para as células durante as etapas subsequentes.
- Prepare o meio padrão suplementando o meio DMEM/F12 com HEPES de 20 mM e 2% de penicilina/estreptomicina.
- Coloque as tampas no suporte com o lado micropatterado para cima e adicione o meio de padrão assim que a mancha estiver na base do suporte. Adicione o selo e imobilize com o dispositivo magnético. Encha o suporte do deslizamento com o meio de padrão e feche-o com a tampa de vidro.
NOTA: Seja rápido, para não permitir que a tampa seque. Não lave o suporte de tampa com etanol entre os experimentos, pois o selo pode reter um pouco de etanol, que pode reagir com PLL-g-PEG e resultar em estresse celular. Lave o suporte do deslizamento apenas com água com sabão. Além disso, a articulação pode ser incubada no meio padrão a 37 °C por 1 h para diluir o produto residual. - Colete células hTERT-RPE1 transfectadas por trippsinização (0,5 mL para uma placa de 12 poços) e adicione 1 mL de 10% de meio FBS DMEM/F12.
- Adicione 0,5 x 106 células hTERT-RPE1 transfecidas ao suporte do deslizamento de tampas e o recue. Incubar por 10 minutos na incubadora.
- Lave o suporte de tampa 5x com meio padrão para remover células não-naturais e FBS residuais adicionando o meio padrão com uma pipeta e aspirando o meio com outra pipeta para criar um fluxo de lavagem. Mantenha sempre um pequeno volume de padrão médio no suporte de deslizamento de tampa para evitar a secagem das células na tampa micropatterada, o que levará à morte celular.
- Incubar na incubadora por 3h para permitir a propagação completa das células.
2. Aquisição de dados de exocitose
- Imagens de eventos de exocitose
- Coloque o suporte de deslizamento de tampas sob um TIRM. O sinal deve ser detectado por uma câmera sensível configurada com o melhor formato de imagem disponível.
NOTA: Neste experimento, um objetivo de lente de 100x e uma câmera EMCCD com região de detecção de 512 x 512 pixels foi usado dando origem a um tamanho de pixel de 160 nm. - Procure por uma célula expressando VAMP7-pHluorin que está totalmente espalhada(Figura 1A).
NOTA: As células que expressam VAMP7 são claramente identificáveis, porque exibem um sinal verde. - Altere o ângulo do laser até que um ângulo TIRF que permita a visualização dos eventos de exocitose VAMP7-pHluorin seja alcançado. Realize uma aquisição de 5 min em uma frequência compatível com a taxa de exocitose e escala de tempo (tipicamente 3 Hz, Figura 1D) usando o software de microscópio.
NOTA: as células hTERT-RPE1 têm uma taxa de sigilo lysomal de cerca de 0,3 Hz em micropatterns. Exoctose lysosômica tem uma duração típica de 1 s. Caracteriza-se por uma intensidade máxima seguida de uma decadência exponencial. A difusão da sonda deve ser evidente neste momento(Figura 1B, C). - Para cada célula, também realize uma aquisição do micropattern utilizando o software de microscópio (Figura 1A).
- Coloque o suporte de deslizamento de tampas sob um TIRM. O sinal deve ser detectado por uma câmera sensível configurada com o melhor formato de imagem disponível.
- Aquisição de coordenadas de exócitose
- Abra o filme adquirido com ImageJ/FIJI. Usar arquivo | Importação | Sequência de imagem. Encontre eventos de exocistose de olho. Um evento de exocistose é caracterizado pelo aparecimento de um sinal brilhante que se espalha para fora(Figura 1).
- Use a ferramenta de ponto para marcar o centro do evento exociótico. Use Analyze | Medida para medir as coordenadas X e Y, bem como a coordenada temporal (número de fatia). Realize estas medidas para todos os eventos de exocistose do filme.
- Salvar os resultados (Resultados | Arquivo | Salve Como). Prepare um arquivo de texto para cada célula analisada chamada "Resultados(cell_name).txt" que contém a fatia, coordenadas X e coordenadas Y para todos os eventos de exocistose nessa ordem.
O arquivo de texto deve ser assim:
Raio de diâmetro de ID X Y Feret
RPE1_WT_Cell1 167 136 230 115
RPE1_WT_Cell2 164 160 230 115
NOTA: Tenha cuidado para substituir todas as círgulas por pontos. - Meça o centro e o diâmetro de cada célula usando a "Ferramenta Oval". Encaixe um círculo perfeito (não use um oval) e use "Medida" para obter as coordenadas X e Y e o diâmetro de Feret. Salve a identidade de cada célula (ID), as coordenadas X e Y, o diâmetro de Feret e o raio (diâmetro/2) em um arquivo de texto chamado "Parâmetro Esférico.txt".
O arquivo de texto deve ser assim:
Raio de diâmetro de ID X Y Feret
RPE1_WT_Cell1 167 136 230 115
RPE1_WT_Cell2 164 160 230 115
NOTA: Tenha cuidado para substituir todas as círgulas por pontos. - Meça a espessura do anel de micropattern (comprimento de adesão) com a ferramenta reta e salve o ID celular, o raio celular (do arquivo: "Parâmetro esférico.txt") e o comprimento de adesão em um arquivo de texto chamado "Padrão parâmetro.txt". Calcule o comprimento de adesão normalizado dividindo o comprimento de adesão por raio celular.
NOTA: Tenha cuidado para substituir todas as comísas por pontos.
O arquivo deve ficar assim:
Comprimento de adesão do raio de célula iD Comprimento de adesão normalizado Comprimento de adesão
RPE1_WT_Cell1 115 34 0.295652174
RPE1_WT_Cell2 115 35 0,304347826
3. Análise espacial unicelular
- Pacote e instalação de R
NOTA: O pacote R para esta análise aproveita o pacote Spatstat13 para calcular a densidade bidimensional (2D) e a função K de Ripley. O código é de código aberto e usa arquivos de texto que foram descritos anteriormente.- Baixar e instalar R a partir de https://www.r-project.org/ (versão 3.5.2 foi utilizado nesta análise).
- Baixe o pacote (e o conjunto de dados de demonstração) de: https://github.com/GoudTeam/JoVE-paper
- Instale o pacote no R Studio usando "Ferramentas" usando "Pacotes de instalação". Selecione "Arquivo de arquivo de pacote (.zip; .tar.gz)" para a categoria " Instalarde:" e escolha o arquivo do pacote. Pressione "Instalar".
- Carregue o pacote com a função "biblioteca ("ExocytosisSpatialAnalysis")" escrevendo este comando em estúdio R e pressionando "Enter".
- Execute o pacote com a função "ESA()" escrevendo este comando no estúdio R e pressionando "Enter".
NOTA: Uma interface de usuário será aberta. - Selecione o diretório para o conjunto de dados (arquivos.txt) e um diretório para plots de saída.
NOTA: Os parâmetros da análise (ver texto abaixo) podem ser alterados através de uma interface de usuário. - Este script iniciará e executará automaticamente a análise. Ele fornece arquivos .pdf de parcelas correspondentes e arquivos .txt contendo resultados numéricos.
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Representative Results
As características esposteis dos eventos de exocitose foram analisadas a partir de lysososomes visualizados por VAMP7-pHluorin10,11 em células hTert-RPE1. as células hTert-RPE1 são células não transformadas que adotam bem a micropatterning e têm sido amplamente utilizadas em estudos anteriores baseados em micropattern4,14. VAMP7 é um v-SNARE15 lisosômico que foi marcado com o pHluorin super eclíptico em seu N-terminus e está localizado no lúmen do lysosome. Dentro da célula, a sonda de pHLuorin foi saciada pelo pH baixo do lysosome, mas durante a exocitose pHluorin começou a emitir um sinal porque o pH aumentou devido à liberação de prótons. O VAMP7-pHluorin foi monitorado por imagens de células vivas TIRFM em micropatterns em forma de anel(Figura 1A–B). O sinal de phluorina exibiu um pico durante a exocitose que representou a liberação rápida de prótons liossômicos seguidos de decadência exponencial, representando a difusão 2D da sonda na membrana plasmática(Figura 1C). as células hTERT-RPE1 apresentaram uma importante atividade de secreção liossômica com uma taxa média de excitose de 0,28 Hz(Figura 1D). No entanto, observou-se alta heterogeneidade na taxa de exocitose entre as células (desvio padrão de 0,15 Hz), indicando que houve forte variabilidade célula-celular na secreção dos lysosomos.
Análise espacial de célula única para investigar se excitose de lisesomos é aleatória
Foi possível visualizar a distribuição 2D da exocitose pelo KDE, como anteriormente realizada para compartimentos endomembranos14, o que poderia revelar diferenças nas densidades locais(Figura 2B). Essa abordagem é pertinente para a visualização da distribuição média de uma população de células, mas menos informativa em células únicas devido ao número limitado de eventos detectados (dezenas versus os milhares obtidos pela análise populacional) e alta variabilidade célula-celular. Por exemplo, essa abordagem não nos permitiu avaliar se a distribuição de eventos de excitose seguiu um comportamento de aleatoriedade espacial completa (RSE) (ou seja, correspondeu a uma distribuição de ponto uniforme em uma região observada para uma única célula). Um padrão de pontos segue um comportamento de RSE quando as duas hipóteses a seguir são verdadeiras: 1) a localização de cada ponto é independente da dos outros pontos; e 2) a probabilidade de encontrar um ponto em uma sub-região depende apenas da razão entre a área desta sub-região e a área total. Existem três possíveis desvios de RSE: 1) agrupamento (ou seja, agregação); 2) dispersão (ou seja, ordenando com distância constante); ou 3) uma mistura de agrupamento e dispersão(Figura 2C). A função K de Ripley foi usada para responder a essa pergunta como nas análises anteriores7,8,9 ( Figura2D). A função K de Ripley é próxima de πr² (sendo d a distância normalizada de um evento) no caso de RSE, mas superior (respiratória inferior) a πr² no caso de agrupamento (dispersão respiratória). Ao subtrair πr² da função K de Ripley, a curva teórica da RSE deve estar em 0. Simulações de casos de RSE foram realizadas utilizando o mesmo número de pontos que os eventos de exocistose observados para avaliar a bondade de ajuste para a caixa de RSE (envelope cinza em torno da curva teórica). A função K transformada de Ripley aplicada aos dados experimentais exibia valores positivos fora do envelope, indicando clustering(Figura 2D).
Para investigar se o agrupamento de eventos de exocitose foi devido à adesão celular conforme relatado anteriormente6,realizou-se uma análise semelhante em dados exclusivamente da área celular não adesiva no centro (Figura 2A, área adesiva na área de centro celular cinza, não adesivo em branco). Note-se que os eventos de exocitose na área não adesiva também foram agrupados (Figura 2E),indicando que as moléculas de adesão não eram as únicas estruturas que induziram pontos quentes secretos nas membranas plasmáticas.
Como a função K de Ripley é uma estatística descritiva que não fornece um valor P, um teste estatístico foi criado comparando eventos de exocitose celular com simulações de RSE. Utilizou-se o método NND(i) de distância do vizinho mais próximo. NDD é definido como a distância euclidiana mínima entre um ponto i e todos os outros pontos. A média de NND(i) de todos os eventos exocióticos de uma célula foi calculada e comparada com a RSE obtida com um alto número de simulações de Monte Carlo(Figura 2F). Verificou-se que a NND média da célula única analisada na Figura 2F foi inferior à média da distribuição simulada do caso da RSE, indicando vizinhos mais próximos em média e, portanto, agrupamento. No caso de dispersão, esperava-se um maior valor para a média do NND(Figura 2C). Esta comparação permitiu o cálculo de um valor P para cada célula. O valor P representa a porcentagem de simulações que apresentaram um NND mais extremo (de forma dupla). Para ser preciso, o valor P imparcial foi computado como (k+1)/(N+1) sendo N o número total de simulações de Monte-Carlo (10.000), e k o número dessas simulações que foi mais extremo do que o medido observado16. O histograma de todos os valores P foi traçado para a área celular total(Figura 2G) e a área celular não adesiva(Figura 2I). Se H0: "Exocistose é um processo de RSE" era verdadeira, era esperada uma distribuição uniforme dos valores P. Se H0 era falso, um pico de baixo valor P era esperado. Realizando um teste kolmogorov-smirnov nos histogramas de valor P, obteve-se um valor P inferior a 0,001, mostrando um desvio significativo da RSE em ambos os casos (Figuras 2G e 2I). Além disso, um coeficiente de agrupamento de 0,955 para a área celular total e 1.000 para a área celular não adesiva indicou que a excitose lysomal era um processo agrupado independente da adesão celular. O coeficiente de agrupamento representa a porcentagem de células mais próximas de um comportamento de agrupamento do que dispersão. Este resultado foi consistente com a função K de Ripley.
Para avaliar o papel da adesão celular no agrupamento, comparamos a NND média na área não adesiva com a da área geral para cada célula individual(Figura 2H). Como o NND médio era inversamente proporcional à densidade da superfície, normalizamos o NND médio da área não adesiva utilizando homothety. A média significativamente maior de eventos de excitose na área não adesiva indicou menos agrupamento(Figura 2H). Assim, embora a secreção de aglomerados de lysososomes em áreas não adesivas, a adesão celular parecia melhorar o agrupamento.
Análise espacial de eventos de excitose usando coordenadas polares
A geometria circular do micropattern em forma de anel permitiu o uso das coordenadas polares comuns, que simplificaram as análises, como encontrado anteriormente17. Cada evento de exocistose poderia, assim, ser descrito por um módulo (distância da origem, aqui o centro do plano inferior da célula) e um ângulo (de acordo com um eixo arbitrário fixo). Além disso, o módulo pode ser normalizado dividindo-o pelo raio da célula. O histograma dos eventos de excitose foi traçado de acordo com o módulo para uma célula representativa (Figura 3A). Isso revelou um pico ao redor da fronteira entre as áreas adesivas/não adesivas. Também foi observada uma grande variabilidade entre as células. Portanto, reunimos n = 22 células para obter uma distribuição média de eventos de exocitose. No entanto, para dar o mesmo peso estatístico a cada célula, o mesmo número de eventos de cada célula foi selecionado aleatoriamente. Esta seleção aleatória não alterou os padrões globais vistos. Para obter uma distribuição média contínua das distribuições individuais de células únicas, utilizou-se um KDE(Figura 3B). No entanto, como o módulo normalizado é entre 0 e 1, as condições de borda tinham que ser levadas em consideração. Um kernel beta que muda de forma ao lado das bordas foi usado18. Uma banda de erro foi computada com uma estratégia bootstrap. A distribuição média observada foi comparada a uma distribuição hipotética de RSE que mostrou mais eventos em um módulo mais elevado, pois a área aumentou com um módulo mais elevado. Como a integral de uma densidade de probabilidade deve ser uma, a distribuição da RSE foi de 2r (com o raio normalizado, sem unidades). Uma faixa de confiança foi computada em torno da curva teórica usando um grande número de simulações de CSR Monte Carlo (5.000 cada). Foram traçados percentis1 e99 da distribuição do módulo dessas simulações. Verificou-se que a distribuição média dos eventos de excitose desviou-se do hipotético a 0,7rno máximo,o que corresponde ao início da área adesiva da célula.
Procuramos testar se a distribuição observada do módulo era diferente da teórica. Como as distribuições médias, como neste caso, não podem ser testadas com precisão por um teste de bondade de ajuste (por exemplo, Kolmogorov-Smirnov) foi empregado um método alternativo proposto por Pecot et al. Este método mede a diferença entre a variação entre uma população e a variação dentro de uma população, e assim permite testes independentes para cada coordenada (ou seja, módulo e ângulo)17. Este teste foi utilizado para comparar nossos dados com dados simulados representando eventos de exocistose de RSE (o mesmo número de eventos de células e excitose como os dados observados), e encontrou uma diferença estatisticamente significativa nas variações (p < 0,001 com o teste Wilcoxon-Mann-Whitney, n = 22 células), indicando que a distribuição média observada de exocitose não era CSR. No entanto, quando duas simulações de RSE (com 5.000 simulações cada) foram comparadas, descobrimos que o histograma de valor P não mostrava uma distribuição uniforme, mas exibia um pico próximo a 1, indicando que este teste provavelmente não tinha sensibilidade.
Como a estimativa do KDE depende de uma escolha não trivial da largura de banda do kernel e é sensível aos efeitos de borda, a função de distribuição cumulativa também foi calculada, o que supera os problemas inerentes à estimativa do KDE(Figura 3D). Esta função é definida entre 0 e 1 e não contém parâmetros ou vieses arbitrários (por exemplo, vieses de borda). As faixas de erro e confiança foram computadas da mesma forma que para a distribuição do módulo. A função de distribuição cumulativa confirmou que os eventos de exocistose não seguiram uma distribuição de RSE, mas foram superconcentrados em moduli em torno de 0,7rno máximo. Essa análise nos permitiu identificar áreas celulares onde ocorreu o agrupamento. Uma pergunta interessante que este resultado levanta é se a superconcentração a 0,7rno máximo foi devido à presença de áreas adesivas/não adesivas do micropattern em forma de anel ou um efeito das áreas de secreção periférica/central das células.
Como a distribuição média dos eventos de exocistose desviou-se do caso da RSE em áreas não adesivas, também nos perguntamos onde a densidade da exocitose era mais alta. As densidades superficiais da exocistose nas áreas de adesão e não adesão foram computadas e comparadas. Verificou-se que a densidade da superfície era menor na área de adesão do que na área de não adesão por uma análise emparelhada(Figura 3C). Isso pode ser explicado pela forte diminuição da exocostose na periferia celular (0,85 – 1rno máximo, Figura 3B).
Figura 1. Exocitosis de lisosomos em células hTert-RPE1: (A) Micropattern em forma de anel (vermelho) e células adesivas hTert-RPE1 transfeinadas com VAMP7-pHluorin (verde) imagens por TIRFM. A seta mostra um evento de exocitose. Barras de escala = 10 μm. (B) Cândógrafo dos eventos de exocistose. Setas mostram eventos de exocitose. Barra de escala = 2 μm, barra de escala no tempo = 5 s. (C) Perfil de intensidade normalizado de excitose lysosômica de 22 células. Cada ponto é uma média de pelo menos 1.530 eventos de exocistose. Os dados são apresentados ± SEM. (D) Taxa de exocitose das 22 células. O desvio padrão médio +/- é plotado em vermelho. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Análise espacial dos eventos de excisotose lysomal. (A) Dispersar o enredo dos eventos de exocistose durante a aquisição de 5 min. Cada ponto representa um evento de exocistose. A área adesiva é mostrada em cinza. (B) Estimativa de densidade do kernel 2D (KDE) de parcela de dispersão de A. A cor representa a densidade local dos eventos de exocistose. (C) Representação esquemática de possíveis padrões de ponto. Os quatro casos, Aleatoriedade Espacial Completa (RSE), Agrupamento, Dispersão e Misto são mostrados, e várias distâncias vizinhas mais próximas (NND) são traçadas (linhas tracejadas) para mostrar como o NND médio diminuiu no agrupamento e aumentou com a dispersão. (D) Análise de uma célula representativa usando a função K de Ripley. A linha vermelha é igual a "função K de Ripley - πr²" para eventos de RSE, o envelope cinza representa a bondade estimada de ajuste das simulações de Monte Carlo com o mesmo número de pontos que eventos de exocitose(N evento = 81). A linha sólida preta é igual a "função K de Ripley – πr²" para eventos de exocisose observados(N evento = 81). Seu desvio positivo da curva vermelha para fora do envelope cinza indica agrupamento de eventos de exocistose. A função K de Ripley foi normalizada para ter um valor máximo de 1. (E) Análise da área não adesiva da mesma célula usando a função K de Ripley como em D. O desvio positivo da curva vermelha fora do envelope cinza indica um agrupamento de eventos de exocitose na área não adesiva. (F) Comparação da distribuição média de NND a partir de uma célula representativa (linha vermelha) com o KDE da RSE obtido a partir de simulações de Monte Carlo (curva azul). O valor P foi calculado como o percentual de valores simulados mais extremos do que o valor observado. (G) Valor de P histograma obtido a partir do teste NND como em F para n = 26 células. O pico de baixos valores P significa que a hipótese nula "exocistose segue RSE" foi rejeitada com um teste de Kolmogorov-Smirnov, indicando que a excitose lysômica não era RSE. (H) Box-plot de NND médio de eventos de exocistose em áreas não adesivas (branco) e áreas células totais (cinza). Os dois pontos de dados da mesma célula são unidos por uma linha. A média de NND foi maior na área não adesiva, p < 0,001 com um teste de Wilcoxon emparelhado (n = 25 células), indicando significativamente menos agrupamento na área não adesiva. (I) O mesmo que G para a área não adesiva para n = 26 células. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Análise espacial de eventos de excitose lysomal agrupados: (A) Histograma dos eventos de exocistose de uma célula representativa durante uma aquisição de 5 min com n = 161 eventos de excitose em função do módulo normalizado; 0 representa o centro celular e 1 a periferia celular. A área adesiva da célula é mostrada em cinza e corresponde a moduli de 0,65-1 para as células mostradas. Há um pico no início da área adesiva em torno de moduli entre 0,6 e 0,7. (B) KDE dos eventos de exocitose em função do módulo normalizado para n = 22 células com 56 eventos em cada célula; 0 representa o centro celular e 1 a periferia celular. A área adesiva média é mostrada em cinza e corresponde, em média, a moduli de 0,61-1. A curva azul tracejada é a curva teórica esperada no caso da RSE. Esta curva teórica é acompanhada por um envelope que representa os percentis de 1º a 99º da RSE obtidos através da simulação de Monte Carlo. A curva KDE dos dados observados está em vermelho e acompanhada por uma faixa de erro gerada pelo bootstrapping. A área adesiva está em cinza +/- SEM. (C) Análise emparelhada das densidades superficiais em áreas de adesão e não adesão. A densidade superficial da excitose foi calculada como o número de eventos por área normalizada e por segundo. Aqui, *p < 0,05 de um t-teste de aluno emparelhado (n = 22 células). A normalidade foi testada anteriormente por um teste de Shapiro-Wilk. (D) Função de distribuição cumulativa dos dados em simulações B (linha vermelha) e de Monte Carlo CSR (linha azul pontilhada). Envelopes foram gerados como em B. Note que a linha vermelha se desvia da RSE teórica em torno de 0,7rno máximo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Monitoramos eventos de exocitose do compartimento lisosômico por tirfm imagem celular viva de VAMP7-pHluorin em células normalizadas em forma de anel e realizamos uma análise estatística rigorosa dos parâmetros espaciais dos eventos de excitose. Empregando a função K da Ripley transformada e um teste estatístico baseado na distância mais próxima do vizinho, confirmamos que a secreção de lysososomes não é um processo aleatório8,,9. Ambas as análises estatísticas mostraram convincentemente que os eventos de exocitose exibem agrupamento (Figuras 2D e 2G). Aplicando ferramentas semelhantes à área celular não adesiva, descobrimos que os eventos de exocitosis também estão agrupados em áreas não adesivas (Figuras 2E e 2I). Assim, moléculas de adesão que foram relatadas anteriormente para permitir o agrupamento6 não são as únicas estruturas que podem induzir pontos quentes secretos na membrana plasmática. No entanto, a adesão celular aumentou o agrupamento: a distância média do vizinho entre os eventos de exocitose foi significativamente maior em áreas não adesivas(Figura 2H). Consistentemente, nossa análise baseada na estimativa da densidade do kernel e na função de distribuição cumulativa identificou áreas enriquecidas de exocitose que estavam localizadas na fronteira entre as áreas adesivas e não adesivas em células de micropattern em forma de anel. Mais trabalho é necessário para determinar os mecanismos moleculares subjacentes ao agrupamento, como a adesão ou um direcionamento específico de lysosome para esta região. Curiosamente, observamos alta heterogeneidade na taxa de exocitose entre as células hTERT-RPE1 (desvio padrão de 0,15 Hz para taxa média de exocitose de 0,28 Hz, Figura 1D), indicando que a secreção de lysososomes tem alta variação intercelular. Portanto, as análises de subpopulação devem ser consideradas em trabalhos futuros. Seria particularmente interessante investigar se essa variação reflete a diversidade de compartimentos lysosômicos, diferenças nas cargas ou dependência de máquinas de exocitose.
Esses resultados ilustram como ferramentas estatísticas podem ser empregadas para investigar parâmetros espaciais de diversos processos biológicos. Além disso, os micropatterns facilitam o estudo do efeito da adesão celular de forma imparcial com a ajuda de diferentes geometrias de micropattern (por exemplo, em forma de anel versus diskshaped). Em particular, o uso de formas redondas facilita as análises porque as coordenadas polares podem ser empregadas. Como as ferramentas estatísticas exigem que uma certa quantidade de dados seja significativa, foram utilizadas células com mais de 30 eventos para nossa análise. No entanto, existe a possibilidade de que células com 30 ou menos eventos sejam significativas. Assim, células amostrais com 30 ou menos eventos poderiam ser realizadas a fim de obter eventos suficientes para análise para determinar se esse é o caso. Da mesma forma, é difícil estimar quantas células devem ser analisadas, especialmente se houver forte variação intercelular. Uma maneira de contornar isso é selecionar aleatoriamente o mesmo número de eventos de cada célula, a fim de dar o mesmo peso estatístico a cada célula ao junção deles. No entanto, recomendamos que análises em menos de 15 células sejam feitas com precaução. Como as distribuições médias das células agrupadas não podem ser testadas com precisão por testes de bondade de ajuste (por exemplo, Kolmogorov-Smirnov) utilizamos uma estatística de teste proposta por Pecot et al. que mede a diferença nas variações das populações17. Embora este teste nos permitiu encontrar uma diferença estatisticamente significativa nas variações nas distribuições médias, suspeitamos que este teste tem baixa sensibilidade porque o histograma de valor P não era plano (ou seja, mostrou distribuição uniforme) ao comparar diferentes simulações de RSE para valores p próximos a 1. Portanto, este procedimento estatístico pode precisar ser melhorado.
Uma desvantagem em nossas análises é a detecção manual de eventos de exocistose, o que reduz drasticamente a velocidade da análise. Limitações na detecção automática são muitas vezes devido à forte heterogeneidade no parâmetro único e simples que está sendo analisado (por exemplo, intensidade de eventos de exocitese). Redes neurais podem ser potencialmente poderosas para detecção automática, porque podem ser treinadas para reconhecer muitos recursos.
A análise aqui apresentada pode ser aplicada a outros processos dinâmicos observados pela TIRFM, como secreção de outros compartimentos e distribuição da membrana microdomína ou apresentação de antígeno. Análises semelhantes também podem ser aplicadas em células fixas para estudar a distribuição espacial de proteínas. Esperamos que nosso trabalho aumente o interesse crescente pela análise de distribuição espacial na biologia celular.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Reconhecemos muito Thierry Galli (Centro de Psiquiatria e Neurociências, INSERM) por fornecer o plasmídeo VAMP7-pHluorin. Agradecemos a Tarn Duong por conselhos sobre análise estatística e membros do laboratório goud por discussões frutíferas. Os autores reconhecem muito as Instalações de Imagem celular e tecidual (PICT-IBiSA @Burg, PICT-EM @Burg e PICT-IBiSA @Pasteur) e Nikon Imaging Center, Institut Curie (Paris), membro da Infraestrutura Nacional de Pesquisa Francesa France-BioImaging (ANR10-INBS-04). A H.L. foi apoiada pela Associação pour la Recherche sur le Cancer (ARC) e a P.M. recebeu financiamento do programa de pesquisa e inovação Horizon 2020 da União Europeia sob o acordo de subvenção de Marie Skłodowska-Curie nº 666003. Este trabalho foi apoiado por subvenções da INFECT-ERA (ANR-14-IFEC-0002-04), do Labex CelTisPhyBio (ANR-10-LBX-0038) e Idex Paris Sciences et Lettres (ANR-10-IDEX-0001-02 PSL), bem como o Centre National de la Recherche Scientifique e Institut Curie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chamlide Magnetic Chamber | Chamlide | ||
| DMEM/F12 | Gibco | 21041-025 | |
| Fibrinogen | Molecular Probes, Invitrogen | F35200 | |
| Fibronectin bovine plasma | Sigma | F1141 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-056 | |
| hTert RPE1 cell line | https://www.atcc.org | ||
| ImageJ | http://rsbweb.nih.gov/ij/ | n/a | Authored by W. Rasband, NIH/NIMH |
| JetPRIME Transfection reagent | Polyplus | 114-07 | |
| Penicilin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Photomask | Delta Mask | ||
| PLL-g-PEG solution | Surface Solutions | PLL(20)-g[3.5]- PEG(2) | |
| R Software | https://www.r-project.org/ | n/a | |
| Trypsin (TrypLE Express 1X) | Gibco | 12605-010 | |
| UV ozone oven | Jelight Company Inc | 342-220 | |
| VAMP7-pHFluorin plasmid | n/a | n/a | Paper reference :http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Role+of+HRB+in+clathrin-dependent+endocytosis. J Biol Chem. 2008 Dec 5;283(49):34365-73. doi: 10.1074/jbc.M804587200. Role of HRB in clathrin-dependent endocytosis. Chaineau M, Danglot L, Proux-Gillardeaux V, Galli T. |
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