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Genetics

जीनोम-स्केल CRISPR/Cas9 जेनेटिक स्क्रीन का उपयोग करसेल सरफेस रिसेप्टर पहचान

Published: June 6, 2020 doi: 10.3791/60803

Summary

यह पांडुलिपि बाह्य रिसेप्टर-लिगामेंट इंटरैक्शन की पहचान करने के लिए जीनोम-स्केल सेल-आधारित स्क्रीनिंग दृष्टिकोण का वर्णन करती है।

Abstract

झिल्ली-एम्बेडेड कोशिका सतह रिसेप्टर्स के बीच सीधी बातचीत द्वारा मध्यस्थता अंतरकोशिकीय संचार बहुकोशिकीय जीवों के सामान्य विकास और कामकाज के लिए महत्वपूर्ण है। इन बातचीत का पता लगाना तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण बना हुआ है, लेकिन । यह पांडुलिपि एक व्यवस्थित जीनोम-स्केल CRISPR/Cas9 नॉकआउट जेनेटिक स्क्रीनिंग दृष्टिकोण का वर्णन करती है जो विशिष्ट सेल सतह मान्यता घटनाओं के लिए आवश्यक सेलुलर रास्तों का पता चलता है । यह परख एक कोशिका आधारित आनुवंशिक स्क्रीन में बातचीत भागीदारों की पहचान करने के लिए शौकीन चावला बाध्यकारी जांच के रूप में एक स्तनधारी प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रणाली में उत्पादित पुनः संयोजन प्रोटीन का उपयोग करता है । इस विधि का उपयोग झिल्ली-एम्बेडेड रिसेप्टर्स के एक्टोडोमेन के अनुरूप पुनः संयोजन बाध्यकारी जांच द्वारा पाए गए कोशिका सतह बातचीत के लिए आवश्यक जीन की पहचान करने के लिए किया जा सकता है। महत्वपूर्ण बात, इस दृष्टिकोण के जीनोम पैमाने प्रकृति को देखते हुए, यह भी न केवल प्रत्यक्ष रिसेप्टर की पहचान करने का लाभ है, लेकिन यह भी सेलुलर घटक है कि सेल की सतह पर रिसेप्टर की प्रस्तुति के लिए आवश्यक हैं, जिससे रिसेप्टर के जीव विज्ञान में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं ।

Introduction

सेल सरफेस रिसेप्टर प्रोटीन द्वारा एक्स्ट्रासेलुलर इंटरैक्शन ऊतक संगठन, मेजबान-रोगजनक मान्यता और प्रतिरक्षा विनियमन जैसे महत्वपूर्ण जैविक प्रक्रियाओं को प्रत्यक्ष करता है। इन बातचीत की जांच व्यापक जैव चिकित्सा समुदाय के लिए ब्याज की है, क्योंकि झिल्ली रिसेप्टर्स व्यवस्थित रूप से वितरित चिकित्सा जैसे मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के कार्रवाई योग्य लक्ष्य हैं। उनके महत्व के बावजूद, इन बातचीत का अध्ययन तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण बना हुआ है । यह मुख्य रूप से इसलिए है क्योंकि झिल्ली-एम्बेडेड रिसेप्टर्स एम्फीपैथिक होते हैं, जिससे उन्हें जैव रासायनिक हेरफेर के लिए जैविक झिल्ली से अलग करना मुश्किल हो जाता है, और उनकी बातचीत कमजोर बातचीत एफिनिटीज (माइक्रोएम-एमएम रेंज मेंकेडीएस)1द्वारा टाइप की जाती है। नतीजतन, आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले कई तरीके प्रोटीन इंटरैक्शन1,,2के इस वर्ग का पता लगाने के लिए अनुपयुक्त हैं।

विशेष रूप से बाह्य रिसेप्टर-लिगामेंट इंटरैक्शन की जांच करने के लिए कई तरीके विकसित किए गए हैं जो उनके अद्वितीय जैव रासायनिक गुणों को ध्यान में रखते हैं3। इनमें से कई दृष्टिकोणों में स्तनधारी या कीट कोशिका आधारित प्रणालियों में घुलनशील पुनः संयोजन प्रोटीन के रूप में रिसेप्टर के पूरे ectodomain को व्यक्त करना शामिल है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि इन प्रोटीनों में पोस्टट्रांसलेशनल संशोधन होते हैं जो संरचनात्मक रूप से महत्वपूर्ण होते हैं, जैसे ग्लाइकान और डिसल्फाइड बांड। कम आत्मीयता बाध्यकारी को दूर करने के लिए, एक्टोडोमेन अक्सर अपनी बाध्यकारी avidity बढ़ाने के लिए ओलिगोमर्माइज्ड होते हैं। शौकीन चावला प्रोटीन एक्टोडोमेन का सफलतापूर्वक उपयोग बाध्यकारी जांच के रूप में किया गया है ताकि प्रत्यक्ष पुनः संयोजन प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन स्क्रीन4,5,,6,7 में इंटरैक्शन पार्टनर्स की पहचान की जासके। जबकि मोटे तौर पर सफल, पुनः संयोजन प्रोटीन आधारित तरीकों की आवश्यकता है कि एक झिल्ली रिसेप्टर के ectodomain एक घुलनशील प्रोटीन के रूप में उत्पादित किया जाना है । इसलिए, यह केवल आम तौर पर प्रोटीन पर लागू होता है जिसमें समीपस्थ बाह्य क्षेत्र (जैसे, एकल-पास प्रकार I, टाइप II, या जीपीआई-लंगर) होता है और आम तौर पर रिसेप्टर परिसरों और झिल्ली प्रोटीन के लिए उपयुक्त नहीं होता है जो झिल्ली को कई बार फैलाते हैं।

अभिव्यक्ति क्लोनिंग तकनीकजिसमें पूरक डीएन (सीडीएनए) की एक पुस्तकालय कोशिकाओं में ट्रांस्रेड होती है और एक लाभ के लिए परीक्षण किया जाता है-बाध्यकारी फेनोटाइप का उपयोग एक्स्ट्रासेलुलर प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन8की पहचान करने के लिए भी किया गया है। हाल के वर्षों में क्लोन और अनुक्रमित सीडीएनए अभिव्यक्ति प्लाज्मिड के बड़े संग्रहों की उपलब्धता ने उन तरीकों की सुविधा प्रदान की है जिनमें सीडीएएन एनकोडिंग9सेल सतह रिसेप्टर्स को 9,10की पहचान करने के लिए पुनर्संयोजन प्रोटीन के बंधन के लिए सेल लाइनों की जांच की जाती है । सीडीएनए अतिअभिव्यक्ति आधारित दृष्टिकोण, पुनर्संयोजन प्रोटीन आधारित तरीकों के विपरीत, प्लाज्मा झिल्ली के संदर्भ में बातचीत की पहचान करने की संभावना बर्दाश्त करते हैं। हालांकि, सीडीएनए अभिव्यक्ति का निर्माण करने की सफलता कोशिकाओं की सही ढंग से मुड़ा हुआ रूप में प्रोटीन को ओवरएक्सप्रेस करने की क्षमता पर निर्भर करती है, लेकिन इसके लिए अक्सर ट्रांसपोर्टरों, चैपरोन और सही ओलिगोमेरिक असेंबली जैसे सेलुलर सहायक कारकों की आवश्यकता होती है। इसलिए एक भी सीडीएनए को स्थानांतरित करना सेल सतह अभिव्यक्ति प्राप्त करने के लिए पर्याप्त नहीं हो सकता है।

सीडीएनए निर्माण या पुनः संयोजन प्रोटीन जांच का उपयोग कर स्क्रीनिंग तकनीक संसाधन-गहन हैं और सीडीएनए या पुनः संयोजन प्रोटीन पुस्तकालयों के बड़े संग्रह की आवश्यकता होती है। विशेष रूप से डिजाइन किए गए बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री-आधारित तरीकों का उपयोग हाल ही में एक्स्ट्रासेलुलर इंटरैक्शन की पहचान करने के लिए किया गया है जिन्हें बड़े पुस्तकालयों की असेंबली की आवश्यकता नहीं है। हालांकि, इन तकनीकों को कोशिका सतह के रासायनिक हेरफेर की आवश्यकता होती है, जो कोशिकाओं की सतह पर मौजूद अणुओं की जैव रासायनिक प्रकृति को बदल सकती है और वर्तमान में केवल ग्लाइकोसिलेटेड प्रोटीन11,,12द्वारा मध्यस्थता की गई बातचीत के लिए लागू होती है। वर्तमान में उपलब्ध तरीकों के बहुमत भी प्रोटीन के बीच बातचीत पर भारी ध्यान केंद्रित करते हुए मोटे तौर पर झिल्ली माइक्रोवातावरण से योगदान की अनदेखी, जैसे ग्लाइकान, लिपिड, और कोलेस्ट्रॉल के रूप में अणुओं सहित ।

CRISPR आधारित दृष्टिकोणों का उपयोग कर अत्यधिक कुशल bialleleic लक्ष्यीकरण के हाल के विकास के एक ही पूल में परिभाषित जीन की कमी कोशिकाओं के जीनोम पैमाने पर पुस्तकालयों सक्षम है कि एक व्यवस्थित और निष्पक्ष तरीके से जांच की जा सकती है विभिन्न संदर्भों में शामिल सेलुलर घटकों की पहचान, सेलुलर सिग्नलिंग प्रक्रियाओं को विच्छेदन करने, दवाओं, विषाक्त पदार्थों और रोगजनकों के प्रतिरोध को प्रदान करने वाले क्षोभ की पहचान और एंटीबॉडी13,,14,,15,,16की विशिष्टता निर्धारित करना शामिल है। यहां, हम एक जीनोम-स्केल CRISPR-आधारित नॉकआउट सेल स्क्रीनिंग परख का वर्णन करते हैं जो वर्तमान जैव रासायनिक दृष्टिकोणों के लिए एक विकल्प प्रदान करता है ताकि एक्स्ट्रासेलुलर रिसेप्टर-लिगाऔर इंटरैक्शन की पहचान की जा सके। आनुवंशिक स्क्रीन द्वारा झिल्ली रिसेप्टर्स द्वारा मध्यस्थता की गई बातचीत की पहचान करने का यह दृष्टिकोण शोधकर्ताओं के लिए विशेष रूप से उपयुक्त है जिनकी व्यक्तिगत लिगांड पर केंद्रित रुचि है क्योंकि यह सीडीएनए या पुनः संयोजन प्रोटीन के बड़े पुस्तकालयों को संकलित करने की आवश्यकता से बचता है।

इस परख में तीन प्रमुख कदम होते हैं: 1) अत्यधिक शौकीन चावला पुनः संयोजन प्रोटीन बाध्यकारी जांच जिसमें ब्याज के रिसेप्टर के बाह्य क्षेत्रों का उत्पादन किया जाता है और फ्लोरेसेंस-आधारित प्रवाह साइटोमेट्री आधारित बाध्यकारी परखों में उपयोग किया जाता है; 2) बाध्यकारी परखों का उपयोग एक सेल लाइन की पहचान करने के लिए किया जाता है जो पुनः संयोजन प्रोटीन जांच के इंटरैक्शन पार्टनर को व्यक्त करता है; 3) कोशिका रेखा का एक Cas9-व्यक्त संस्करण जो ब्याज के प्रोटीन के साथ बातचीत करता है और जीनोम-स्केल CRISPR/Cas9-आधारित नॉकआउट स्क्रीन का प्रदर्शन किया जाता है(चित्रा 1)। इस आनुवंशिक स्क्रीन में, सेल लाइनों के लिए एक पुनः संयोजन प्रोटीन के बाध्यकारी एक औसत दर्जे का फेनोटाइप के रूप में प्रयोग किया जाता है जिसमें नॉकआउट पुस्तकालय के भीतर कोशिकाओं है कि जांच को बांधने की क्षमता खो दिया है फ्लोरेसेंस आधारित सक्रिय सेल छंटाई (FACS) और जीन है कि अनुक्रमण द्वारा पहचाने गए बाध्यकारी फेनोटाइप के नुकसान का कारण का उपयोग कर हल कर रहे हैं । सिद्धांत रूप में, शौकीन चावला जांच बाध्यकारी और इसके सेल सतह प्रदर्शन के लिए आवश्यक उन लोगों के लिए जिंमेदार रिसेप्टर encoding जीन की पहचान कर रहे हैं ।

इस प्रोटोकॉल के पहले चरण में झिल्ली से बंधे रिसेप्टर्स के एक्टोडोमेन का प्रतिनिधित्व करने वाले शौकीन चावला पुनः संयोजन प्रोटीन जांच का उत्पादन शामिल है। इन रिसेप्टर्स को अक्सर अपने बाह्य बाध्यकारी कार्यों को बनाए रखने के लिए जाना जाता है जब उनके एक्टोडोमेन को पुनः संयोजन घुलनशील प्रोटीन के रूप में व्यक्त किया जाता है ब्याज के प्रोटीन के लिए, घुलनशील पुनः संयोजन प्रोटीन किसी भी प्रारूप में किसी भी उपयुक्त यूकेरियोटिक प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रणाली में उत्पादित किया जा सकता है बशर्ते कि इसे बाध्यकारी avidity में वृद्धि के लिए ओलिगोमेराइज्ड किया जा सके, और इसमें ऐसे टैग शामिल हैं जिनका उपयोग फ्लोरेसेंस-आधारित प्रवाह साइटोमेट्री-आधारित बाध्यकारी परखों (जैसे, फ्लैग-टैग, बायोटिन-टैग) में किया जा सकता है। HEK293 प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रणाली का उपयोग कर झिल्ली रिसेप्टर्स के घुलनशील ectodomains के उत्पादन के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल, साथ ही विभिन्न मल्टीमराइजेशन तकनीकों और प्रोटीन अभिव्यक्ति दोनों पेंटामेरिक प्रोटीन और मोनोमेरिक प्रोटीन के उत्पादन के लिए निर्माण पहले1,,17वर्णित किया गया है । यहां प्रोटोकॉल एक फ्लोरोक्रोम (जैसे, फाइकोरिथ्रिन, या पीई) के लिए एक प्रकार का स्ट्रेप्टाविजिन के लिए उन्हें संयुग्मित करके मोनोमेरिक बायोटिनेटेड प्रोटीन से फ्लोरोसेंट शौकीन चावला जांच पैदा करने के लिए कदमों का वर्णन करेगा, जिसका उपयोग सीधे सेल-आधारित बाध्यकारी रूपों में किया जा सकता है और इसका पता लगाने के लिए एक माध्यमिक एंटीबॉडी की आवश्यकता नहीं है। जीनोम-स्केल स्क्रीन प्रदर्शन के लिए सामान्य प्रोटोकॉल पहले ही20,,21वर्णित किए गए हैं, इस प्रकार प्रोटोकॉल मुख्य रूप से मानव V1 ("Yusa") पुस्तकालय18का उपयोग करCRISPR/Cas9 नॉकआउट स्क्रीनिंग सिस्टम का उपयोग करके प्रवाह साइटोमेट्री आधारित पुनः संयोजन प्रोटीन बाध्यकारी स्क्रीन प्रदर्शन की बारीकियों पर ध्यान केंद्रित करता है ।

Protocol

1. बायोटिनेटेड उसके टैग प्रोटीन का उत्पादन और शुद्धिकरण

  1. घुलनशील पुनः संयोजन उसके टैग बायोटिनेटेड प्रोटीन का उत्पादन करने के लिए एक स्तनधारी या कीट कोशिका आधारित प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रणाली का उपयोग करें (तालिका 1में प्लाज्मिड निर्माण देखें)।
    नोट: हेक293 सेल अभिव्यक्ति प्रणाली का उपयोग करके मोनोमेरिक बायोटिन और उसके टैग किए गए प्रोटीन के उत्पादन के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल केर एट अल17द्वारा वर्णित है। HEK293 अभिव्यक्ति प्रणाली का उपयोग कर व्यक्त प्रोटीन ectodomains संस्कृति माध्यम में स्रावित कर रहे हैं ।
  2. 20 मिन के लिए 3,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज्ड द्वारा कोशिकाओं को पैलेट करके घुलनशील प्रोटीन एकत्र करें।
  3. 0.22 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से सुपरनेट को फ़िल्टर करें और 1:1,000 अनुपात में फ़िल्टर किए गए प्रोटीन सुपरनेटेंट में नी2 +-एनटीए अगारोज मोतियों को जोड़ें (यानी, 50% अगारोज स्लरी का 50 फ़ैनिस्ट का 50 माइक्रोन सुपरनेटेंट के 50 मिलील में)। एक घूर्णन मंच पर 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर या कम से कम 4-5 घंटे का इनक्यूबेट।
  4. उसके शुद्धि धोने बफर के 5 mL जोड़कर पॉलीप्रोपाइलीन कॉलम धोलें। सभी बफर रचनाओं के लिए तालिका 2 को देखें।
  5. कॉलम में पूरे बीनड़-प्रोटीन अधिनेत मिश्रण डालें। मोती आधार पर जमा होंगे।
  6. मोतियों को 2x धोएं। प्रोटीन कमजोर पड़ने से बचने के लिए, ध्यान से 5 मिलीस सिरिंज और त्यागने के साथ कॉलम से अवशिष्ट धोने बफर आकर्षित करें।
  7. ध्यान से अपने शुद्धि elution बफर के 300-500 μL सीधे मोतियों के लिए जोड़ें और कम से कम 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट । 1 mL सिरिंज का उपयोग करके तरल को फिर से ध्यान से खींचकर लहूलुहान प्रोटीन एकत्र करें। डिसाल्टिंग कॉलम का उपयोग करके वांछित बफर (जैसे, सामान्य रूप से पीबीएस या एचबीएस) के लिए एल्यूशन बफर का आदान-प्रदान करें। आगे के उपयोग तक सभी प्रोटीन को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

2. एकामेरिक बायोटिनेटेड प्रोटीन की मात्रा और ओलिगोमेराइजेशन

नोट: बाध्यकारी avidity बढ़ाने के लिए, उन्हें बाध्यकारी परख में उपयोग करने से पहले tetrameric स्ट्रेप्टाविडिन-पीई पर बायोटिनीेटेड मोनोमेरिक प्रोटीन ओलिगोमेराइज़ करें। स्ट्रेप्टाविडिन की एक निश्चित एकाग्रता के खिलाफ बायोटिनी मोनोमर की कमजोर पड़ने की श्रृंखला का परीक्षण करके और अनुभवजन्य रूप से न्यूनतम कमजोर पड़ने की स्थापना करके मोनोमेरिक प्रोटीन और टेट्रामिक स्ट्रेप्टाविडिन-पीई के इष्टतम संजुगन अनुपात प्राप्त करें जिस पर कोई अतिरिक्त बायोटिनी मोनोमर का पता नहीं लगाया जा सकता है।

  1. एक 96 अच्छी प्लेट में 1% गोजातीय सीरम एल्बुमिन [बीएसए]) के साथ एक उपयुक्त कमजोर पड़ने वाले बफर (या तो पीबीएस या एचबीएस] का उपयोग करके बायोटिनेटेड प्रोटीन नमूनों के कम से कम आठ धारावाहिक कमजोर हो जाएं। सुनिश्चित करें कि प्रत्येक कमजोर पड़ने की अंतिम मात्रा कम से कम 200 माइक्रोन है।
  2. प्रत्येक कुएं से 100 माइक्रोन निकालकर और एक नई 96 अच्छी प्लेट में स्थानांतरित करके नमूनों की एक डुप्लिकेट प्लेट बनाएं। हमेशा एक नियंत्रण शामिल करें। इस मामले में नियंत्रण टैग-केवल प्रोटीन (यानी, बायोटिनेटेड उसके टैग सीडी 4 डोमेन 3 +4 प्रोटीन) हैं। यह सभी बाध्यकारी परखमें एक नियंत्रण जांच के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा ।
  3. कमजोर पड़ने वाले बफर में 0.1 μg/mL के लिए पतला स्ट्रेप्टाविडिन-पीई।
  4. प्लेटों में से सिर्फ एक पर, पतला स्ट्रेप्टाविडिन-पीई के 100 माइक्रोन जोड़ें। डुप्लीकेट प्लेट एक नियंत्रण के रूप में काम करेगी। वॉल्यूम को बराबर करने के लिए कंट्रोल प्लेट में 100 माइक्रोन ऑफ कमजोर पड़ने वाले बफर डालें।
  5. कमरे के तापमान (आरटी) पर 20 न्यूनतम के लिए इनक्यूबेट। इस दौरान 15 मिन के लिए कमजोर पड़ने वाले बफर के साथ स्ट्रेप्टाविडिन कोटेड प्लेट के कुओं को ब्लॉक कर दें।
  6. दोनों प्लेटों से नमूना की कुल मात्रा को स्ट्रेप्टाविडिन-लेपित प्लेटों के व्यक्तिगत कुओं में स्थानांतरित करें और आरटी में 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  7. प्लेट 3x को वॉश बफर (यानी, या तो पीबीएस या एचबीएस के साथ 0.1% ट्वीन-20, 2% बीएसए) के साथ धोएं। 2 μg/mL माउस विरोधी चूहा Cd4d3 + 4 IgG (OX68) के १०० μL जोड़ें और आरटी में 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट ।
  8. प्लेट 3x को वॉश बफर से धोलें। आरटी में 1 घंटे के लिए 0.2 μg/mL पर एक एंटी-माउस क्षारीय फॉस्फेट कॉन्जुगेट के 100 माइक्रोन जोड़ें।
  9. प्लेट को वॉश बफर और 1x के साथ पतला बफर में धोएं।
  10. डिथेनॉलमाइन बफर में 1 मिलीग्राम/mL पर पी-नाइटोफेनिल फॉस्फेट तैयार करें। प्रत्येक कुएं में 100 माइक्रोन जोड़ें और 15 मिन के लिए इनक्यूबेट करें।
  11. 405 एनएम पर लीन्प्रोस रीडिंग लें। न्यूनतम कमजोर पड़ने का उपयोग करें जिस पर प्लेट पर कोई संकेत नहीं है क्योंकि टेट्रामर(चित्रा 2)बनाने के लिए उपयुक्त कमजोर पड़ने का कारक है।
  12. सभी नमूनों और नियंत्रण के लिए एक 10x टेट्रामर धुंधला समाधान 4 μg/mL स्ट्रेप्टाविडिन-पीई और आरटी में 30 मेंस के लिए उपयुक्त बायोटिनेटेड प्रोटीन कमजोर पड़ने का समाधान करें । स्टोर संयुग्मित प्रोटीन एक प्रकाश संरक्षित ट्यूब में 4 डिग्री सेल्सियस पर जब तक आगे उपयोग करें ।

3. फ्लो साइटोमेट्री आधारित सेल बाध्यकारी परख

  1. अनुयायी कोशिकाओं के लिए, संस्कृति मीडिया को हटा दें और बिना डिवेलंट ेशन के पीबीएस के साथ 1x धोएं। फिर सेल टुकड़ी समाधान (जैसे, EDTA) जोड़ें। कोशिकाओं को 5-10 मिन के लिए अलग करने की अनुमति दें । कोशिकाओं को छोड़ने के लिए फ्लास्क को धीरे से टैप करें।
    नोट: ट्राइप्सिन आधारित उत्पादों का उपयोग करने से बचें क्योंकि वे सेल सतह प्रोटीन को क्लीव कर सकते हैं।
  2. अलग कोशिकाओं को एक ट्यूब में एकत्र करें। निलंबन में बढ़ रही कोशिकाओं के लिए (उदाहरण के लिए, HEK293 कोशिकाओं), सीधे संस्कृति फ्लास्क से कोशिकाओं को एक ट्यूब में इकट्ठा करते हैं।
  3. 5 मिन के लिए 200 x ग्राम पर पैलेट कोशिकाएं। सुपरनेटेंट को हटादें और वॉश बफर (यानी पीबीएस/1% बीएसए) में गोली को फिर से सस्पेंड करें।
  4. एक हीमोसाइटोमीटर का उपयोग कर कोशिकाओं की गणना और २.५ x 105-1x 106 कोशिकाओं/mL करने के लिए एकाग्रता समायोजित करें । अलीकोट एक 96 अच्छी तरह से यू-या वी-तली प्लेट पर तैयार सेल मिश्रण के 100 माइक्रोन। 400 x ग्रामपर 5 मिन के लिए प्लेट स्पिन। एक मल्टीचैनल पिपेट के साथ अधिनेत को हटा दें।
  5. सामान्यीकृत फ्लोरोसेंटी लेबल अत्यधिक शौकीन चावला प्रोटीन जांच और कोशिकाओं के साथ पहले से तैयार प्लेटों में नियंत्रण और 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट के 100 μL जोड़ें । 1 घंटे के लिए बाध्यकारी के बाद, 5 मिन के लिए 400 x ग्राम पर प्लेट स्पिन।
  6. अधिस्थान निकालें और वॉश बफर (यानी, पीबीएस/1% बीएसए) के 200 माइक्रोन जोड़ें। ऊपर और नीचे पाइपिंग करके अच्छी तरह मिलाएं।
  7. 5 मिन के लिए 400 x ग्राम पर सेंट्रलाइज्ड द्वारा कोशिकाओं को गोली मार ें। वॉश स्टेप 1x दोहराएं। दो वॉश के बाद, सुपरनेटेंट को पूरी तरह से हटा दें और पीबीएस के 100 माइक्रोन में सेल पैलेट को फिर से निलंबित करें।
  8. प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा कोशिकाओं का विश्लेषण करें। पीई फ्लोरेसेंस का पता लगाने के लिए पीले-हरे रंग के लेजर (यानी, 561 एनएम) का उपयोग करें।
    1. सबसे पहले उन कोशिकाओं का विश्लेषण करें जिन्हें नियंत्रण जांच से दाग दिया गया है। पीई फ्लोरेसेंस के वितरण के आधार पर, बाध्यकारी आबादी के लिए एक गेट आकर्षित करें ताकि नियंत्रण सेल का 1% से अधिक इस गेट में न गिर जाए।
    2. नमूने का विश्लेषण करें और बाध्यकारी गेट में आने वाली कोशिकाओं के अंश का निर्धारण करें।
      नोट: सेल लाइनें जो उच्च बाध्यकारी आबादी प्रदर्शित करती हैं, आनुवंशिक स्क्रीन के लिए वांछित हैं, क्योंकि उनके पास उच्च सिग्नल-टू-शोर अनुपात है। आदर्श रूप से 80% से अधिक कोशिकाएं इस गेट के भीतर गिरनी चाहिए।

4. हीट लैबेले एपिटोप्स और हेपरन सल्फेट साइडचेन से बाध्यकारी योगदान का निर्धारण

नोट: कई प्रोटीन की गतिविधि हीट लैबाइल है, इसलिए गर्मी उपचार के बाद बाध्यकारी गतिविधि का नुकसान उत्साहजनक है। रिकॉम्बिनेंट प्रोटीन के बाध्यकारी मध्यस्थता में नकारात्मक रूप से आवेशित ग्लाइकोसामिनोग्लिकन, मुख्य रूप से हेपरन सल्फेट (एचएस) से योगदान निर्धारित करने की सलाह दी जाती है। इसका कारण यह है कि एचएस द्वारा यहां वर्णित सेल बाइंडिंग परख में बाध्यकारी अन्य रिसेप्टर्स19पर सहनिर्भर होने के बजाय योजक हो सकता है । इसका मतलब यह है कि मनाया बाध्यकारी पूरी तरह से सेल सतह proteoglycans की एचएस साइड चेन द्वारा मध्यस्थता किया जा सकता है और एक विशिष्ट रिसेप्टर द्वारा नहीं । सेल की सतह पर एचएस के लिए बाध्यकारी जरूरी गैर विशिष्ट नहीं है, बल्कि एक प्रोटीन की एक संपत्ति है, जो एक पूर्ण आनुवंशिक स्क्रीन प्रदर्शन करने से पहले पता करने के लिए उपयोगी है ।

  1. बाध्यकारी परखों में उपयोग करने के लिए गर्मी का इलाज प्रोटीन के नमूने तैयार करें।
    1. सामान्यीकृत लेकिन अनकॉन्जुजेक्ट मोनोमेरिक प्रोटीन को 10 मिन के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करें।
    2. एलिसा द्वारा निर्धारित अपने अनुपचारित समकक्ष के रूप में एक ही संयुग्म अनुपात को संभालने वाले स्ट्रेपेविडिन-पीई को गर्मी-उपचारित प्रोटीन का संजूगेट करें (धारा 2 का उल्लेख करें)।
  2. हेपरिन-अवरुद्ध प्रोटीन के नमूने तैयार करें।
    1. पीबीएस में घुलनशील हेपरिन के आठ 1:3 कमजोर222 मिलीग्राम/mL की शुरुआती एकाग्रता और १०० माइक्रोन की अंतिम मात्रा के साथ तैयार करें ।
    2. कम से कम 30 मिन के लिए हेपरिन कमजोरियों में तैयार बाध्यकारी जांच के इनक्यूबेट 100 μL।
  3. धारा 3 में वर्णित बाध्यकारी परखों में हीट-इलाज प्रोटीन और हेपरिन/प्रोटीन मिश्रण के पूरे 200 माइक्रोन का प्रयोग करें। प्रतिनिधि परिणाम चित्र 3ए, बीमें दिखाए जाते हैं ।

5. सेल लाइनों का चयन S9 व्यक्त

नोट: सेल लाइन है कि ब्याज की जांच बांधसे पहले CRISPR स्क्रीनिंग में इस्तेमाल किया जा सकता है, यह पहले Cas9 nuclease और एक अत्यधिक सक्रिय क्लोनचयनित 19व्यक्त इंजीनियर होना चाहिए ।

  1. Cas9 अभिव्यक्ति के लिए लेंटिवायरल निर्माण का उपयोग करके लेंटिवायरस का उत्पादन करने के लिए निम्नलिखित सामान्य लेंटिवायरस उत्पादन प्रोटोकॉल का उपयोग करें (तालिका 1को देखें)।
    1. डीएमईएम/10% एफबीएस मीडिया में संस्कृति HEK293-FT कोशिकाओं ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2पर । बीज HEK293-FT कोशिकाओं को ट्रांसफेक्शन से 1 दिन पहले इतना है कि वे ट्रांसफेक्शन के दिन ~ 80% अनुकूल हैं।
      नोट: HEK293FT कोशिकाओं शिथिल अनुयायी हैं; इसलिए, जब उनका उपयोग लेंटिवायरस के उत्पादन के लिए किया जाता है, तो पालन बढ़ाने के लिए 0.1% (w/v) जिलेटिन के साथ लेपित संस्कृति फ्लास्क पर उन्हें चढ़ाना पर विचार करें।
    2. सुबह ट्रांसफेक्शन करें। स्थानांतरण वेक्टर, पैकेजिंग मिश्रण, और ट्रांसफेक्शन पुनरुत्थान को पूर्वगरम ट्रांसफेक्शन संगत मीडिया (जैसे, ऑप्टी-एमईएम) में जोड़ें। ट्यूब 10-15x उलटा करमिलाएं। आरटी में 5 मिन के लिए इनक्यूबेट। सटीक मात्रा के लिए टेबल 3 देखें।
    3. निर्माता द्वारा सुझाए गए ट्रांसफेक्शन रिएजेंट जोड़ें। त्वरित भंवर से मिलाएं। आरटी में 30 मिन के लिए इनक्यूबेट ।
    4. बहुत सावधानी से खर्च किए गए माध्यम को एस्पिरेट करें। प्लेट में ट्रांसफेक्शन संगत मीडिया जोड़ें।
    5. ट्रांसफेक्शन रिएजेंट/डीएनए कॉम्प्लेक्स को प्लेट के किनारे पर गिराएं और धीरे-धीरे प्लेट के माध्यम से बहुत धीरे-धीरे घूमता रहा।
    6. 3-5 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट और D10 माध्यम के साथ माध्यम की जगह। रातोंरात इनक्यूबेट।
    7. अगले दिन सुबह, ताजा D10 माध्यम के साथ माध्यम की जगह । रातोंरात इनक्यूबेट।
    8. अगले दिन देर दोपहर में वायरल अलौकिक को इकट्ठा करें। कम प्रोटीन बाध्यकारी के साथ 0.45 माइक्रोन फिल्टर के साथ फ़िल्टर करें। वैकल्पिक रूप से, ताजा D10 माध्यम जोड़ें, रातोंरात इनक्यूबेट करें और अगले दिन अधिनेत को याद करें।
    9. वायरस सुपरनेटेंट केवल कुछ दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर हैं। लंबी अवधि के भंडारण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      नोट: एक अत्यधिक केंद्रित लेंटिवायरल तैयारी उत्पन्न करने के लिए, जो कोशिकाओं को स्थानांतरित करने के लिए मुश्किल के ट्रांसड्यूक्शन के लिए वांछनीय हो सकता है, सुपरनेटेंट को 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात 6,000 x ग्राम पर केंद्रीकरण द्वारा केंद्रित किया जा सकता है। पारदर्शी वायरल गोली को इथेनॉल प्रतिरोधी पेन से चिह्नित करके और अधिनायक को त्यागदें। एकाग्रता में 100x वृद्धि के लिए मूल मात्रा के 1/100 th में गोली को फिर से निलंबित करें।
  2. लेंटिवायरस के साथ कोशिकाओं को पार करें।
    1. प्लेट 1 x 106 कोशिकाओं प्रति अच्छी तरह से एक 6 अच्छी तरह से प्लेट में उपयुक्त संस्कृति मीडिया के 3 mL के साथ । कुछ कोशिकाओं को दूसरों की तुलना में अधिक आसानी से ट्रांसड्यू किया जाता है। कोशिकाओं को स्थानांतरित करने में आसान के लिए (उदाहरण के लिए, एचईसी कोशिकाएं), सीधे कोशिकाओं में लेंटिवायरस जोड़ें। कोशिकाओं को स्थानांतरित करने में मुश्किल के लिए, नीचे वर्णित स्पिनोक्लेशेशन प्रोटोकॉल का पालन करना आवश्यक हो सकता है।
      1. 15 मीटर शंकुई ट्यूब में 2-5 x 106 कोशिकाओं/mL के Aliquot 2 mL ।
      2. लेंटिवायरस को 8 μg/mL हेक्साडिमेथ्रिन ब्रोमाइड के साथ एक साथ जोड़ें और 30 मिन के लिए आरटी में इनक्यूबेट करें ।
      3. 32 डिग्री सेल्सियस पर 800 x ग्राम पर 100 मिन के लिए सेंट्रलाइज। फिर एक ही मीडिया में कोशिकाओं को फिर से निलंबित कर दिया और उचित मीडिया के साथ उपयुक्त संस्कृति फ्लास्क में सेल निलंबन जोड़ें ।
    2. कम से कम 24 घंटे के लिए ट्रांसपोटेशन की अनुमति दें। बाद में वायरस युक्त मीडिया को हटा दें और ताजा माध्यम जोड़ें।
    3. एक और 24 घंटे के बाद, एक है कि उचित एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक है के लिए मीडिया बदल जाते हैं । Cas9 निर्माण चयन के लिए एक ब्लास्टिसाइडिन प्रतिरोध कैसेट शामिल हैं।
      नोट: एक खुराक प्रतिक्रिया किल वक्र प्रदर्शन करके प्रत्येक सेल लाइन के लिए ब्लास्टिसाइडिन की मात्रा को अनुकूलित किया जाना चाहिए। 2.5-50 μg/mL के बीच एक blasticidin एकाग्रता ट्रांसड्यूक्शन के 10 दिनों के भीतर सबसे अनट्रांसड्यूस सेल लाइनों को मारना चाहिए ।
  3. नियंत्रण प्लेट में सभी कोशिकाओं (यानी, गैर-ट्रांसड्यूड कोशिकाओं को जो चयन एंटीबायोटिक दवाओं की एक ही एकाग्रता के साथ इलाज किया गया है) तक चयन करें।

6. उच्च Cas9-गतिविधि क्लोन का चयन

नोट: पॉलीक्लोनल Cas9 सफलतापूर्वक आनुवंशिक स्क्रीन प्रदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है; हालांकि, उच्च Cas9 गतिविधि के साथ एक क्लोन का चयन स्क्रीनिंग परिणाम18में सुधार .

  1. तीन 96 अच्छी तरह से संस्कृति मीडिया से युक्त प्लेटों के कुओं में कमजोर पड़ने या एकल सेल तरह व्यक्तिगत ब्लास्टिसाइडिन प्रतिरोधी कोशिकाओं को सीमित करने का उपयोग करें। क्लोन 2-4 सप्ताह के बीच उभरने लगेंगे। 10-20 क्लोन का चयन करें और 6 अच्छी प्लेटों में विस्तार करें।
  2. परख Cas9 गतिविधि के लिए क्लोन जल्दी का आकलन GFP-BFP (ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन-ब्लू फ्लोरोसेंट प्रोटीन) प्रणाली है, जो एक बहिर्जात जीन नॉकआउट प्रणाली है जिसमें कोशिकाओं को या तो एक gRNA-लक्ष्यीकरण GFP या एक नियंत्रण18के रूप में एक खाली gRNA के साथ GFP व्यक्त निर्माण के साथ ट्रांसड्यू किया जाता है का उपयोग करता है ।
    1. आदेश रिपोर्टर प्लाज्मिड्स: GFP-BFP प्लाज्मिड, नियंत्रण-BFP प्लाज्मिड(तालिका 1)
    2. धारा 5.1 में वर्णित लेंटिवायरस उत्पादन प्रोटोकॉल का उपयोग करके जीएफपी-बीएफपी प्लाज्मिड और नियंत्रण-बीएफपी प्लाज्मिड दोनों के लिए लेंटिवायरस का उत्पादन करें।
    3. प्रत्येक Cas9-व्यक्त सेल लाइन क्लोन को जीएफपी-बीएफपी प्रणाली और नियंत्रण-बीएफपी को अलग से एन्कोडिंग करने वाले लेंटिवायरस के साथ ट्रांसड्यूस करें। धारा 5.2 में प्रोटोकॉल का पालन करें।
    4. ट्रांसड्यूक्शन के 3 दिनों के बाद, फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करके प्रत्येक क्लोन के जीएफपी-बीएफपी फ्लोरेसेंस की जांच करें। जीएफपी और बीएफपी का पता लगाने के लिए क्रमश 488 एनएम लेजर और 405 एनएम लेजर का प्रयोग करें।
    5. बीएफपी के अनुपात की जांच केवल जीएफपी-बीएफपी-डबल पॉजिटिव कोशिकाओं को करके प्रत्येक क्लोन में Cas9 गतिविधि को क्वांटिस्ट करें। उच्च गतिविधि Cas9 कोशिकाओं को आदर्श रूप से होना चाहिए >95% GFP नॉकआउट दक्षता(चित्रा 4)

7. जीनोम चौड़ा CRISPR-Cas9 स्क्रीनिंग नॉकआउट पुस्तकालय की पीढ़ी

  1. मानव V1 पुस्तकालय18का उपयोग कर जीनोम-व्यापी स्क्रीनिंग के लिए, जीनोम-वाइड लाइब्रेरी (टेबल 1को देखें) का आदेश दें और निर्माता के मैनुअल में "लाइब्रेरी प्रतिकृति के लिए प्रोटोकॉल" के तहत प्रदान किए गए प्रोटोकॉल का उपयोग करके बैक्टीरियल चाकू से प्लाज्मिड लाइब्रेरी तैयार करें।
  2. धारा 5.1 में वर्णित लेंटिवायरस उत्पादन प्रोटोकॉल का उपयोग करके मानव जीन के लक्षित व्यवधान के लिए एक लेंटिवायरल लाइब्रेरी एन्कोडिंग जीआरएनए का उत्पादन करने के लिए जीनोम-वाइड लाइब्रेरी प्लाज्मिड तैयारी का उपयोग करें।
    नोट: एक अच्छा अभ्यास लेंटिवायरल तैयारी का एक बैच का उत्पादन करना है जो प्रयोगात्मक स्थिरता में सुधार के लिए ट्रांसड्यूक्शन के लिए अनुकूलित है।
  3. 30% ट्रांसड्यूक्शन प्राप्त करने के लिए प्रत्येक सेल लाइन के लिए आवश्यक मात्रा में वायरस का निर्धारण करने के लिए छोटे पैमाने पर परीक्षण ट्रांसफेक्शन करने के लिए धारा 5.2 में ट्रांसडक्शन प्रोटोकॉल का उपयोग करें। ट्रांसड्यूक्शन दक्षता के लिए प्रॉक्सी के रूप में बीएफपी फ्लोरेसेंस का आकलन करने के लिए फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करें।
  4. HEK293 कोशिकाओं को पार करने के लिए, बस ~ 4 घंटे के लिए सामान्य विकास मीडिया में सुसंस्कृत 30-50 x 106 कोशिकाओं में पूर्व निर्धारित लेंटिवायरल तैयारी जोड़ें। फिर लेंटिवायरस के साथ मीडिया को हटा दें और ताजा विकास मीडिया से बदलें।
  5. अन्य सेल लाइनों के लिए, धारा 5.2.1 में स्पिनोकुलेशन प्रोटोकॉल का उपयोग करें, लेकिन बड़े पैमाने पर, जैसे कि कुल 30-50 x 106 कोशिकाओं को स्थानांतरित किया जाता है। इसके लिए 15 करोड़ शंकुई ट्यूब में 5 x 106 कोशिकाओं/mL के 2 mL को अलीकोट करें और बताए अनुसार आगे बढ़ें ।
  6. अनुयायी सेल लाइनों के लिए, ट्रांसड्यूक्शन के बाद प्यूरोमाइसिन 24 एच जोड़कर ट्रांसड्यूस कोशिकाओं का चयन करें।
    नोट: खुराक प्रतिक्रिया किल वक्र प्रदर्शन करके प्यूओमाइसिन सांद्रता का अनुकूलन करें। आम तौर पर 1-10 μg/mL के बीच सांद्रता 3-5 दिनों के भीतर nontransduced कोशिकाओं को मारना चाहिए । प्यूरोमाइसिन की उच्च सांद्रता का उपयोग करने से बचें क्योंकि इससे उन कोशिकाओं का चयन करने की संभावना बढ़ सकती है जिन्हें एक से अधिक गाइड आरएनए (एसजीआरएनए) द्वारा स्थानांतरित किया गया है।
  7. निलंबन कोशिकाओं के लिए, फसल ट्रांसड्यूड (यानी, बीएफपी पॉजिटिव) कोशिकाएं सेल सॉर्टर का उपयोग करके 3 दिन पोस्टट्रांसड्यूक्शन करती हैं और पुस्तकालयउत्पन्न करती हैं जिनमें कम से कम 10 x 106 कोशिकाएं होती हैं। एक बार BFP का उपयोग कर चयनित, मीडिया में कोशिकाओं को विकसित करने के लिए puromycin की उचित मात्रा के साथ पूरक ।
    नोट: निलंबन सेल लाइनों के लिए केवल puromycin के साथ चयन से बचें, क्योंकि निलंबन सेल संस्कृतियों से मृत कोशिकाओं और मलबे को हटाना मुश्किल है जो सेल छंटाई में हस्तक्षेप कर सकते हैं।
  8. 9-16 दिनों के लिए संस्कृति उत्परिवर्ती पुस्तकालय हर 2-3 दिनों में नियमित मार्ग के साथ पोस्टट्रांसड्यूक्शन।

8. सेल सतह बाध्यकारी के लिए आनुवंशिक स्क्रीनिंग

  1. 5 मिन के लिए 200 x ग्राम पर उत्परिवर्ती सेल पुस्तकालय को गोली दें और पीबीएस में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
  2. कोशिकाओं को प्रत्येक ट्यूब में कम से कम 50 x 106 कोशिकाओं के साथ दो 15 मीटर शंकुट्यूब में विभाजित करें।
  3. 5 मिन के लिए 200 x ग्राम पर एक शंकुई ट्यूब स्पिन, supernatant निकालें, और -20 डिग्री सेल्सियस पर सेल गोली फ्रीज। यह नियंत्रण आबादी है और बाद में कार्रवाई की जाएगी ।
  4. पीबीएस/1% बीएसए के 10 एमसीएल में दूसरी ट्यूब में गोली को फिर से सस्पेंड करें। एक 96 अच्छी तरह से थाली पर एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में कोशिकाओं के 100 μL अलग सेट करें।
  5. शंकु ट्यूब में सेल निलंबन के लिए उपयुक्त प्रीकॉन्जुलेंट प्रोटीन जोड़ें और 96 अच्छी प्लेट में नकारात्मक नियंत्रण प्रोटीन।
  6. कोमल रोटेशन (6 आरपीएम) के साथ बेंचटॉप रोटर पर कम से कम 1 घंटे कम से कम 4 डिग्री सेल्सियस के लिए सेल धुंधला प्रदर्शन करें।
  7. 5 मिन के लिए 200 x ग्राम पर कोशिकाओं को गोली, supernatant हटा दें। दो वॉश चरण करें, फिर पीबीएस के 5 एमएल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
  8. कोशिकाओं को तनाव हालांकि सेल समूहों को हटाने के लिए एक 30 माइक्रोन सेल छलनी। एक प्रवाह सॉर्टर का उपयोग कर विश्लेषण करें।
  9. बीएफपी +/पीई-कोशिकाओं के लिए गेट करने के लिए नकारात्मक नियंत्रण नमूने का उपयोग करें ।
  10. नमूना छांटें और बीएफपी +/पीई-कोशिकाओं को एकत्र करें । सॉर्ट गेट्स प्रोटीन के लिए कोशिकाओं की बाध्यकारी पर निर्भर करेगा लेकिन आम तौर पर पीई नकारात्मक नमूनों का 1-5% एकत्र किया जाता है । सप्लीमेंट्री फिगर 1में छंटाई गेट का उदाहरण दिया गया है .
  11. चयनित गेट से 500,000-1,000,000 कोशिकाओं को लीजिए। कोशिकाओं की कम संख्या को देखते हुए, नुकसान को कम करने के लिए 1.5 mL केंद्रीकरण ट्यूब में नमूनों को इकट्ठा करने पर विचार करें।
  12. 5 मिनट के लिए 500 x ग्राम पर अपकेंद्री द्वारा हल कोशिकाओं को गोली मार। ध्यान से अतिशयोक्ति को हटा दें और त्यागें। 6 महीने तक के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर गोली स्टोर करना संभव है।

9. जीनोमिक डीएनए निष्कर्षण और gRNA संवर्धन के लिए पहली पीसीआर

  1. उच्च जटिलता नियंत्रण आबादी से जीनोमिक डीएनए निकालें।
    1. यदि नियंत्रण आबादी -20 डिग्री सेल्सियस पर जम गई थी, तो शंकुन ट्यूब को बाहर निकालें और पीबीएस जोड़ें। गोली गल ने के लिए बर्फ पर रखें।
    2. 50 x 106 कोशिकाओं से जीनोमिक डीएनए निकालने के लिए निर्माता की सिफारिशों का उपयोग करके एक वाणिज्यिक किट (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करें। डीएनए एकाग्रता को 1 मिलीग्राम/mL में समायोजित करें।
    3. प्रत्येक नमूने के लिए, डीएनए के 72 μg के अनुरूप पीसीआर के लिए एक मास्टर मिश्रण स्थापित करें। अलीकोट एक 96 अच्छी तरह से पीसीआर प्लेट के 36 कुओं में प्रति अच्छी तरह से 50 μL। आवश्यक प्राइमर दृश्यतालिका 4में सूचीबद्ध हैं। तालिका 5 और 6में गाइड का उपयोग करें ।
    4. पीसीआर के 5 माइक्रोन को 2% (w/v) अगारोज जेल पर 6-12 प्रतिनिधि नमूनों से हल करें। ~ 250 बीपी पर एक स्पष्ट बैंड मनाया जाना चाहिए। यदि बैंड बेहोश हैं, तो अतिरिक्त 2-3 चक्रों के लिए पीसीआर को दोहराएं।
    5. प्रत्येक कुएं (कुल 180 माइक्रोन) से पीसीआर उत्पादों के 5 माइक्रोन एकत्र करने के लिए एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करें और उन्हें एक जलाशय में एक वाणिज्यिक किट से बाध्यकारी बफर के 900 माइक्रोन के साथ पूल करें (सामग्री की तालिकादेखें)।
    6. एक वाणिज्यिक पीसीआर शुद्धिकरण किट का उपयोग कर पीसीआर उत्पादों को शुद्ध करें। एक वाणिज्यिक किट से एल्यूटियन बफर के 50 μL में एल्यूट डीएनए (सामग्री की तालिकादेखें) और डीएनए एकाग्रता को मापने।
  2. बाध्यकारी फेनोटाइप के नुकसान के लिए हल किए गए नमूनों के बड़ी संख्या में स्वतंत्र क्लोन से बने होने की संभावना नहीं है । इसलिए 72 माइक्रोन डीएनए के साथ पीसीआर करना जरूरी नहीं है। एक उपयुक्त वाणिज्यिक किट का उपयोग कर डीएनए अलग (सामग्री की तालिकादेखें) । 100 एनजी/μL डीएनए के साथ पहले वर्णित प्रोटोकॉल (धारा 9.1.3) का उपयोग कर3-4 पीसीआर प्रतिक्रियाओं की स्थापना करें। यदि हल किए गए सेल की संख्या जीनोमिक डीएनए तैयारी के बजाय 100,000 उपयोग कोशिका ओं की संख्या से कम है।
    1. अलीकोट लगभग 10,000 कोशिकाओं/अच्छी तरह से एक 96 अच्छी तरह से पीसीआर प्लेट में.
    2. प्लेट में कोशिकाओं को गोली और ध्यान से अतिशयोक्ति के अधिकांश हटा दें। गोली दिखाई नहीं देगी।
    3. प्रत्येक कुएं में 25 माइक्रोन पानी डालें और 10 मिन के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों को गर्म करें।
    4. 1 घंटे के लिए प्रत्येक कुएं में 2 मिलीग्राम/एमएल के 5 माइक्रोन जोड़ें और 56 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। इसके बाद प्रोटीन के को निष्क्रिय करने के लिए 10 मिन के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर सैंपल गर्म करें।
    5. प्रति पीसीआर रिएक्शन के हिसाब से सेल लाइसेट मिश्रण के 10 माइक्रोन का इस्तेमाल करें। लाइसेट्स का उपयोग 24 घंटे के भीतर किया जाना चाहिए।

10. इंडेक्स बारकोडिंग और सीक्वेंसिंग के लिए पीसीआर का दूसरा दौर

  1. पहले राउंड पीसीआर से 40 पीजी/माइक्रोन तक के उत्पादों को पतला करें।
  2. प्रति नमूना एक पीसीआर स्थापित करें (टेबल 7 और 8में प्रदान किए गए गाइड का उपयोग करें)। एक उच्च निष्ठा बहुलक का उपयोग sgRNA प्रवर्धन के दौरान बहुलक द्वारा शुरू की त्रुटियों को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है ।
  3. 2% (w/v) अगारोज जेल पर पीसीआर उत्पादों के 5 μL का समाधान करें। ~ 330 बीपीएस पर एक स्पष्ट बैंड मनाया जाना चाहिए।
  4. पीसीआर उत्पादों को पुनः निलंबित मोतियों के 31.5 माइक्रोन (0.7 x कुल मात्रा) जोड़कर पैरामैग्नेटिक मोतियों का उपयोग करने वाले पीसीआर उत्पादों को शुद्ध करें, अच्छी तरह से मिलाएं, और आरटी में 5 मिन के लिए इनक्यूबेटिंग करें।
  5. ट्यूब को 3 मिन के लिए चुंबकीय रैक पर रखें। मोती को प्लेट के किनारे पर कब्जा कर लिया जाना चाहिए और समाधान स्पष्ट होना चाहिए। ध्यान से हटा एंकरिंग करें और फेंक दें।
  6. ट्यूब में 80% हौसले से तैयार इथेनॉल के 150 माइक्रोन जोड़ें। 30 एस के लिए इनक्यूबेट, और फिर ध्यान से हटाने और अतिशयोक्ति त्यागें।
  7. 13.6 चरण दोहराएं, इस बार 180 माइक्रोन के साथ। फिर हवा 5 मिन के लिए मोती सूखी।
  8. चुंबक से ट्यूब निकालें। मोतियों से बाँझ ईबी बफर के 35 μL में एल्यूट डीएनए लक्ष्य। 3 मिन के लिए इनक्यूबेट, फिर ट्यूब को 3 मिन के लिए चुंबकीय रैक में वापस डाल दें।
  9. एक साफ ट्यूब के लिए eluted पीसीआर उत्पादों युक्त supernatant के लगभग 30 μL हस्तांतरण ।
  10. अगली पीढ़ी के अनुक्रममंच पर नमूनों का अनुक्रम करें। HumanV1 gRNA पुस्तकालय के लिए, 19 बीपी अनुक्रम के लिए तालिका 4 में सूचीबद्ध कस्टम प्राइमर का उपयोग करें ।

11. रिसेप्टर और संबंधित रास्तों की पहचान करने के लिए बायोइन्फॉर्मेटिक्स विश्लेषण

  1. MAGeCK के गिनती समारोह का उपयोग कर संदर्भ पुस्तकालय के लिए हल और अक्रमित आबादी से नक्शा दृश्यों । समारोह में रॉ काउंट फाइल(सप्लीमेंट्री टेबल 1)निकलेगी ।
    नोट: MAGeCK की स्थापना और MAGeCK के भीतर विभिन्न कार्यों के उपयोग पर विस्तृत निर्देश वांग एट अल20द्वारा पहले से प्रकाशित प्रोटोकॉल में वर्णित हैं ।
  2. स्क्रीन में इस्तेमाल होने वाले कंट्रोल लाइब्रेरी के टेक्निकल स्टैंडर्ड की जांच करें।
    1. मीडियन कच्चे मामलों को सामान्य करें और प्लाज्मिड में गिनती के अनुभवजन्य संचयी संचयी घनत्व समारोह भूखंड की साजिश रचने के लिए आर21 या समकक्ष सॉफ्टवेयर में ggplot2 पैकेज का उपयोग करें और अनसॉर्ट किए गए नमूनों को नियंत्रित करें(चित्रा 5ए)।
    2. "नियंत्रण" के रूप में प्लाज्मिड आबादी से गिनती का उपयोग कर MAGeCK के परीक्षण समारोह चलाएं और "परीक्षण" नमूने के रूप में अनसॉर्ट किए गए नियंत्रण नमूनों से मायने रखता है। समारोह में जीन सारांश फाइल(सप्लीमेंट्री टेबल 1)निकलेगी ।
    3. जीन सारांश फ़ाइल खोलें और पहले वर्गीकृत आवश्यक और गैर जरूरी जीन22 (चित्रा 5बी)के लिए लॉग-फोल्ड-परिवर्तन(neg.lfc कॉलम) का वितरण आकर्षित करें।
    4. काफी समाप्त जीन(neg.fdr & 0.05) का चयन करें और आर(चित्रा 5सी)में समृद्ध23 पैकेज या किसी भी समकक्ष मार्ग संवर्धन पैकेज का उपयोग करमार्ग संवर्धन विश्लेषण करते हैं ।
  3. डिफ़ॉल्ट सेटिंग के साथ MAGeCK के परीक्षण समारोह चलाएं। बिना किसी नियंत्रण के नमूने से कच्चे मामलों को"नियंत्रण"के रूप में उपयोग करें और विश्लेषण करते समय"उपचार"के रूप में हल किए गए नमूने से गिना जाता है।
  4. MAGeCK द्वारा उत्पन्न जीन सारांश फ़ाइल खोलें और आरोही क्रम में पीओएस रैंक कॉलम रैंक करें। हिट की पहचान के लिए एफडीआर (पीओएस.एफडीआर कॉलम) और एलटी; 0.05 को कटऑफ के रूप में उपयोग करें। रिसेप्टर आमतौर पर उच्च स्थान पर है, अक्सर पहली स्थिति में।
  5. आर या एक समकक्ष सॉफ्टवेयर(चित्रा 5डी)में सकारात्मक चयन(pos.score)के लिए मजबूत रैंकिंग-एल्गोरिदम (आरआरए) स्कोर प्लॉट करें।
  6. जीन हिट का चयन करें और समृद्ध मार्गों की पहचान करने के लिए आर में समृद्ध पैकेज या किसी भी समकक्ष मार्ग संवर्धन पैकेज का उपयोग करके मार्ग संवर्धन विश्लेषण करें।

Representative Results

एनसीआई-एसएनयू-1 और एचके 293 कोशिकाओं में क्रमशः प्रदर्शन किए गए मानव टीएनएफएसएफ9 और पी फाल्सीपेरम आरएच5 के बाध्यकारी साझेदार की पहचान के लिए दो प्रतिनिधि जीनोम-स्केल नॉकआउट स्क्रीन से अनुक्रमण डेटा प्रदान किए जाते हैं(अनुपूरक तालिका 1)। RH5 का बाध्यकारी व्यवहार हेपरन सल्फेट और इसके ज्ञात रिसेप्टर बीएसजी24 (चित्रा 3सी)दोनों से प्रभावित था, जबकि TNFRSF9 विशेष रूप से अपने ज्ञात रिसेप्टर TNFSF9 से बंधा हुआ था और घुलनशील हेपरिन के साथ प्रीइनक्यूबेशन पर बाध्यकारी नहीं खोता था। चित्रा 3बी में प्रोटीन 3 TNFRSF9 का प्रतिनिधित्व करता है ।

दोनों सेल लाइनों के लिए, 3 दिनों (9, 14, और 16 दिनों के बाद) के बाद नियंत्रण उत्परिवर्ती पुस्तकालय में जीआरएनए का वितरण भी प्रदान किया जाता है(अनुपूरक तालिका 1)। GRNA वितरण से पता चला है कि पुस्तकालय जटिलता प्रयोग के दौरान बनाए रखा गया था(चित्र5ए)। TNFSF9 के लिए लिगलैंड की पहचान के लिए आनुवंशिक स्क्रीन 14 दिन posttransduction पर किया गया था, जबकि RH5 के लिए दिन 9 posttransduction प्रदर्शन किया गया था । आवश्यक जीन22 (चित्रा 5बी)के संदर्भ सेट के लिए वितरण की तुलना में गैर जरूरी जीन के संदर्भ सेट को लक्षित करने वाले जीआरएनए के देखे गए गुना-परिवर्तनों के वितरण की जांच करके स्क्रीन की तकनीकी गुणवत्ता का आकलन किया गया था । इसके अलावा, मार्ग स्तर संवर्धन से यह भी पता चला है कि अपेक्षित आवश्यक रास्तों की पहचान की गई और मूल प्लाज्मिड पुस्तकालय के नियंत्रण नमूने की तुलना करते समय "ड्रॉप-आउट" आबादी में काफी समृद्ध किया गया । दिन 14 एनसीआई-SNU-1 नमूने के साथ एक उदाहरण चित्रा 5सीमें चित्रित किया गया है ।

MAGeCK के परीक्षण समारोह का उपयोग कर नियंत्रण बनाम हल आबादी में gRNAs के वितरण (MAGeCK से जीन सारांश उत्पादन के लिए पूरक तालिका 1 देखें) फेनोटाइपिक स्क्रीन से रिसेप्टर की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । जीन स्तर के विश्लेषण में MAGeCK द्वारा रिपोर्ट संशोधित आरआरए स्कोर पी मूल्यों द्वारा स्थान पर जीन के खिलाफ साजिश रची है । MAGeCK में आरआरए स्कोर एक उपाय है जिसमें gRNAs लगातार उम्मीद से अधिक स्थान पर हैं प्रदान करता है । TNFRSF9 के लिए स्क्रीन में, शीर्ष हिट TNFSF9 था, जो TNFRSF9(चित्रा 5डी)का एक ज्ञात बाध्यकारी साझेदार है । इसके अलावा टीपी53 पाथवे से संबंधित कई जीन की भी पहचान की गई। RH5 के मामले में, ज्ञात रिसेप्टर(बीएसजी)और सल्फेटेड गाग्स(एसएलसी35बी2)के उत्पादन के लिए आवश्यक जीन के अलावा, एक अतिरिक्त जीन(एसएलसी16ए1)की भी पहचान की गई(चित्रा 5ई)। SLC16A1 बीएसजी की तस्करी के लिए आवश्यक एक चपरोन है जो25कोशिकाओं की सतह पर है । साथ में, ये परिणाम स्क्रीन की क्षमता को सीधे बातचीत करने वाले रिसेप्टर्स और उस रिसेप्टर के लिए आवश्यक सेलुलर घटकों की पहचान करने की क्षमता प्रदर्शित करते हैं जो एक कार्यात्मक रूप में कोशिकाओं की सतह पर व्यक्त किए जाते हैं।

Figure 1
चित्रा 1: कोशिका सतह रिसेप्टर्स की पहचान करने के लिए आनुवंशिक स्क्रीनिंग दृष्टिकोण का अवलोकन। इस परख में तीन प्रमुख कदम होते हैं: सेल सतह रिसेप्टर्स के एक्टोडोमेन का प्रतिनिधित्व करने वाले पहले, पुनर्संयोजन प्रोटीन को सेल लाइन में व्यक्त किया जाता है जो हेक293 कोशिकाओं जैसे संरचनात्मक रूप से महत्वपूर्ण पोस्टट्रांसलेशनल संशोधनों को जोड़ सकता है। मोनोमेरिक प्रोटीन एक्टोडोमेन को उनके बाध्यकारी avidity को बढ़ाने के लिए स्ट्रेप्टाविडिन-पीई को संयुग्मित करके ओलिगोमर्मीकृत किया जाता है। दूसरा, इन शौकीन चावला जांच सेलुलर बाध्यकारी परख में उपयोग किया जाता है, जहां सेल लाइनों पर उज्ज्वल धुंधला पीई फ्लोरेसेंस (हरे रंग में) में एक प्रमुख बदलाव द्वारा संकेत दिया एक नकारात्मक नियंत्रण प्रोटीन (काले रंग में) की तुलना में एक सेल सतह बाध्यकारी साथी की उपस्थिति को दर्शाता है । तीसरा, रिसेप्टर-पॉजिटिव Cas9-व्यक्त सेल लाइनों का चयन किया जाता है और जीनोम-स्केल स्क्रीनिंग का उपयोग करके जीआरएनए प्रोटीन-कोडिंग जीन के विशाल बहुमत को लक्षित किया जाता है । उत्परिवर्ती पुस्तकालयों का उत्पादन करते समय, 30% ट्रांसड्यूक्शन दक्षता का उपयोग करना आम बात है, जो पॉइसन वितरण संभावना पर आधारित है जो यह सुनिश्चित करता है कि प्रत्येक कोशिका को एक ही gRNA प्राप्त होता है ताकि परिणामी फेनोटाइप को एक विशिष्ट नॉकआउट के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सके। ट्रांसड्यूड कोशिकाओं द्वारा व्यक्त किए गए बीएफपी मार्कर का उपयोग एफएसीएस का उपयोग करके जीआरएनए युक्त कोशिकाओं का चयन करने के लिए किया जाता है। फेनोटाइपिक स्क्रीन 9-16 दिनों के बाद के बीच किया जाता है। स्क्रीन के दिन, कुल उत्परिवर्ती सेल आबादी को दो में विभाजित किया गया है। एक आधा नियंत्रण जनसंख्या के रूप में रखा जाता है और दूसरे आधे को पुनः संयोजन प्रोटीन बाध्यकारी के लिए चुना जाता है । उत्परिवर्ती पुस्तकालय से कोशिकाओं है कि अब recombinant प्रोटीन बांधने में सक्षम है FACS का उपयोग कर हल कर रहे है और हल बनाम नियंत्रण आबादी में gRNAs के संवर्धन के लिए लेबल शौकीन चावला जांच के सेल सतह बाध्यकारी के लिए आवश्यक जीन की पहचान करने के लिए प्रयोग किया जाता है । प्रोटोकॉल में कदम है कि काफी समय की आवश्यकता है संकेत दिया जाता है । शर्मा एट अल19से इस आंकड़े को संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: एलिसा आधारित विधि का उपयोग करके स्ट्रेप्टाविडिन-पीई के लिए बायोटिनी प्रोटीन के अनुपात की स्थापना। स्ट्रेप्टाविडिन-पीई कन्जुगनेशन रणनीति का एक उदाहरण जिसका उपयोग बायोटिनेटेड मोनोमेरिक प्रोटीन से शौकीन चावला जांच उत्पन्न करने के लिए किया जाता है। स्ट्रेप्टाविडिन की एक निश्चित एकाग्रता के खिलाफ बायोटिनेटेड मोनोमर की एक कमजोर पड़ने की श्रृंखला को इनक्यूबेट किया गया था। न्यूनतम कमजोर पड़ने का पता नहीं लगाया जा सकता है एलिसा द्वारा निर्धारित किया गया था। एलिसा के साथ या स्ट्रेप्टाविडिन-पीई के 10 एनजी के साथ प्रोटीन कमजोर होने की एक श्रृंखला preincubating बिना प्रदर्शन किया गया था । स्ट्रेप्टाविडिन-पीई की उपस्थिति में, न्यूनतम कमजोर पड़ने की पहचान (काले रंग की परिक्रमा) और संतृप्ति के लिए आवश्यक प्रोटीन की मात्रा की गणना 4 μg/mL स्ट्रेप्टाविडिन-पीई के साथ 10x स्टॉक समाधान उत्पन्न करने के लिए की गई थी । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: सेल लाइनों के लिए प्रोटीन के प्रतिनिधि बाध्यकारी । (A)कोशिका रेखाओं के लिए प्रोटीन बाध्यकारी नियंत्रण नमूने की तुलना में सेल से जुड़े फ्लोरेसेंस में स्पष्ट वृद्धि हुई थी । रीकॉम्बिनेंट प्रोटीन के हीट ट्रीटमेंट (10 मिन के लिए 80 डिग्री सेल्सियस) ने सभी को नकारात्मक नियंत्रण में वापस बाध्यकारी कर दिया, जिससे यह प्रदर्शित होता है कि बाध्यकारी व्यवहार सही ढंग से मुड़ा हुआ प्रोटीन पर निर्भर था। (ख)कोशिका सतहों के लिए प्रोटीन बाध्यकारी व्यवहार के विभिन्न वर्ग; GAGs पर निर्भरता। बाएं से दाएं, प्रोटीन को तीन प्रकारों में वर्गीकृत किया जा सकता है: प्रोटीन प्रकार 1 केवल एसोर्ब्स से एचएस तक। ये प्रोटीन 0.2 मिलीग्राम/mL पर हेपरिन सांद्रता के साथ preincubation के बाद अपने बाध्यकारी खो देते हैं। प्रोटीन टाइप 2 एक विशिष्ट रिसेप्टर के अलावा एचएस से बांधता है। ये प्रोटीन प्रीब्लॉकिंग प्रयोगों में आंशिक बाध्यकारी खो देते हैं। प्रोटीन टाइप 3 एचएस को बांधता नहीं है। ये प्रोटीन माता-पिता की रेखाओं की तुलना में बाध्यकारी नहीं खोते हैं। (ग)एक प्रोटीन (यानी, RH5) का एक उदाहरण जो एचएस और एक विशिष्ट रिसेप्टर को योजक तरीके से बांधता है। या तो रिसेप्टर (यानी, बीएसजी) या एचएस संश्लेषण (जैसे, SLC35B2, EXTL3) के लिए आवश्यक एंजाइमों को लक्षित करना केवल नियंत्रण के सापेक्ष कोशिकाओं को RH5 की बाध्यकारी को आंशिक रूप से कम कर देता है। बाध्यकारी व्यवहार स्थापित करने के लिए ऐसे प्रयोगों में ट्रांसड्यूस पॉलीक्लोनल लाइनों का उपयोग किया जा सकता है। शर्मा एट अल19से इस आंकड़े को संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: उच्च Cas9 गतिविधि के साथ क्लोनल सेल लाइनों का चयन। एनसीआई-एसएनयू-1 सेल लाइनों की पॉलीक्लोनल और क्लोन दोनों लाइनों की जीनोम-संपादन दक्षता का मूल्यांकन जीएफपी-बीएफपी रिपोर्टर सिस्टम का उपयोग करके किया गया था, जिसमें सेल लाइनों को वायरस के साथ एक gRNA-टार्पोड एन्कोड जीएफपी या बिना (यानी, "खाली") के साथ स्थानांतरित किया गया था। एक योजनाबद्ध चित्रित किया गया है। ट्रांसड्यूक्शन के बाद बीएफपी और जीएफपी अभिव्यक्ति दोनों का परीक्षण करने के लिए और असंक्रमित नियंत्रण की तुलना में फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग किया गया था। जीएफपी अभिव्यक्ति का उपयोग Cas9 गतिविधि के लिए प्रॉक्सी के रूप में किया जाता था, जबकि बीएफपी अभिव्यक्ति ने ट्रांसड्यूड कोशिकाओं को चिह्नित किया था। असंक्रमित और खाली संक्रमित कोशिकाओं के लिए प्रोफ़ाइल सभी क्लोन के लिए समान लग रही थी । प्रतिनिधि प्रोफाइल बाएं पैनल में चित्रित कर रहे हैं। एनसीआई-एसएनयू-1 सेल लाइन के सभी पांच क्लोन ने पॉलीक्लोनल लाइन (दाएं पैनल) की तुलना में जीएफपी का अधिक नुकसान दिखाया, क्लोन 4 के साथ सबसे कम रिफ्रैक्टरी आबादी के साथ उच्चतम दक्षता दिखा रहा है । शर्मा एट अल19से इस आंकड़े को संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: सेल सतह बाध्यकारी भागीदारों की पहचान के लिए आनुवंशिक स्क्रीन से प्रतिनिधि परिणाम । (A)संचयी वितरण समारोह भूखंडों प्लाज्मिड पुस्तकालय में gRNA बहुतायत की तुलना HEK-293-E और NCI-SNU-1 कोशिकाओं के उत्परिवर्ती पुस्तकालयों के लिए 9, 14, और 16 दिन के बाद ट्रांसलेडक्शन । किसी भी संख्या के लिए, संचयी घनत्व फ़ंक्शन उस सीमा से नीचे मौजूद डेटापॉइंट के प्रतिशत की रिपोर्ट करता है। मूल प्लाज्मिड आबादी की तुलना में उत्परिवर्ती कोशिका आबादी का छोटा बदलाव प्लाज्मिड लाइब्रेरी की तुलना में जीआरएनए के सबसेट में कमी का प्रतिनिधित्व करता है। (ख)एचके293 और एनसीआई-एसएनयू-1 सेल लाइनों में आवश्यक (लाल) या गैरजरूरी (काला) के रूप में पहले वर्गीकृत किए गए जीन में लॉग-फोल्ड परिवर्तनों का वितरण । अनावश्यक जीन के लिए गुना परिवर्तन का वितरण ~ 0 पर केंद्रित है, जबकि आवश्यक जीन के लिए नकारात्मक गुना परिवर्तन की ओर बाईं ओर स्थानांतरित कर दिया । (ग)एनसीआई-एसएनयू-1 उत्परिवर्ती नियंत्रण जनसंख्या 14 दिनों के बाद से समाप्त होने वाले जीन में काफी समृद्ध रास्ते । अपेक्षित ज्ञात सेल-आवश्यक रास्तों की पहचान की गई । (D)मजबूत रैंक एल्गोरिदम (आरआरए) -उन जीनों के लिए स्कोर जो हल की गई कोशिकाओं में समृद्ध थे, जिन्होंने TNFRSF9 जांच को बांधने की क्षमता खो दी थी। आरए-स्कोर के अनुसार जीन को स्थान दिया गया । ज्ञात इंटरैक्शन पार्टनर टीएनएफएसएफ9 और टीपी53 पाथवे (लाल रंग में लेबल) से संबंधित जीन की पहचान स्क्रीन में की गई थी । (ई)एचएच5 बाध्यकारी एचएच5 के लिए आवश्यक जीआरएनए संवर्धन विश्लेषण से पहचाने गए जीन के लिए रैंक-ऑर्डर किए गए आरआरए-स्कोर HEK293 कोशिकाओं (बाएं पैनल) के लिए बाध्यकारी है । SLC35B2 और SLC16A1 5% की झूठी खोज दर (एफडीआर) दहलीज के भीतर की पहचान की गई । एचएस बायोसिंथेसिस पाथवे (यानी, EXTL3 और NDST1)में दो अतिरिक्त जीन 25% की एफडीआर के भीतर पहचाने गए थे। संबंधित जीन के साथ सामान्य गैग बायोसिंथेसिस मार्ग का चित्रण योजनाबद्ध संबंधित चरणों (पैनल 2) के लिए मैप किया गया है। स्क्रीन में कॉन्ड्रोइटिन सल्फेट बायोजेनेसिस (यानी, CSGALNACT1/2)की प्रतिबद्धता के लिए आवश्यक जीन की पहचान नहीं की गई थी। शर्मा एट अल19से इस आंकड़े को संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

प्लाज्मिड नाम प्लाज्मिड # उपयोग
प्रोटीन अभिव्यक्ति का निर्माण: CD200RCD4d3 + 4-बायो-लिंकर-उनके ऐडजीन: 36153 CD4d3 +4, बायोटिन और 6-उसके टैग के साथ रिकॉम्बिनेंट प्रोटीन का उत्पादन।
pMD2.G ऐडजीन: 12259 वीवीएस-जी लिफाफा प्लाज्मिड व्यक्त; लेंटिवायरस का उत्पादन
psPAX2 ऐडजीन: 12260 लेंटिवायरल पैकेजिंग प्लाज्मिड, लेंटिवायरस का उत्पादन
Cas9-निर्माण: pKLV2-EF1a-Cas9Bsd-W ऐडजीन: 68343 Cas9 लाइन व्यक्त करने वाले संविलियन का उत्पादन
gRNA अभिव्यक्ति का निर्माण: pKLV2-U6gRNA5 (BbsI)-PGKpuro2ABFP-W ऐडजीन: 67974 एक बेहतर पाड़ और puro/BFP मार्कर के साथ CRISPR gRNA अभिव्यक्ति वेक्टर
मानव बेहतर जीनोम चौड़ा नॉकआउट CRISPR पुस्तकालय ऐडजीन: 67989 18,010 मानव जीन के खिलाफ एक gRNA पुस्तकालय, लेंटिवायरस में उपयोग के लिए बनाया गया है।
GFP-BFP निर्माण: pKLV2-U6gRNA5 (gGFP)-PGKBFP2AGFP-W ऐडजीन: 67980 BFP और GFP के साथ Cas9 गतिविधि रिपोर्टर ।
खाली निर्माण: पीकेएलवी2-यू6जीआरएनए (खाली)-PGKBFP2AGFP-W ऐडजीन: 67979 BFP और GFP के साथ Cas9 गतिविधि रिपोर्टर (नियंत्रण) ।

तालिका 1: इस दृष्टिकोण में उपयोग किए जाने वाले प्लाज्मिड्स।

बफर नाम घटक
एचबीएस (10X) 1.5 एम NaCl और 200 mM HEPES MiliQ पानी में, पीएच 7.4 को समायोजित करें
पीबीएस (10X) 80 ग्राम NaCl, 2 ग्राम केसीएल, 14.4 ग्राम एनए2एचपीओ4 और 2.4 ग्राम KH2पीओ4 मिलीक्यू पानी में, पीएच 7.4 को समायोजित करें
सोडियम फॉस्फेट बफर (80mM स्टॉक) 7.1 ग्राम एनए2एचपीओ4.2 H2O, 5.55 ग्राम NaH2PO4,पीएच 7.4 को समायोजित करें
उसकी शुद्धि बाध्यकारी बफर 20 एमएम सोडियम फॉस्फेट बफर, 0.5 एम NaCl और 20 m Imidazole, पीएच 7.4 को समायोजित करें
उनकी शुद्धि एलुशन बफर 20 एमएम सोडियम फॉस्फेट बफर, 0.5 M NaCl और 400 mM इमिडाजोल, पीएच 7.4 को समायोजित करें
डिएथेनामाइन बफर 10% डिथेनॉलामामाइन और मिलीक्यू पानी में 0.5 mM MgCl2, पीएच 9.2 में समायोजित करें:
D10 डीएमईएम, 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (100 यूनिट/mL) और 10% हीट इनएक्टिवेटेड एफबीएस

तालिका 2: इस अध्ययन के लिए आवश्यक बफ़र्स।

घटक 10-सेमी पकवान 6-अच्छी तरह से प्लेट
293FT कोशिकाएं 70-80% अनुकूल 70-80% अनुकूल
ट्रांसफेक्शन संगत मीडिया (ऑप्टी-एमईएम) (चरण 5.1.2) 3 एल 500 माइक्रोन
ट्रांसफेक्शन संगत मीडिया (ऑप्टी-एमईएम) (चरण 5.1.4) 5 लाख 2 एल
लेंटिवायरल ट्रांसफर वेक्टर 3 μg 0.5 μg
psPax2 (तालिका 1 देखें) 7.4 μg 1.2 μg
pMD2.G (तालिका 1 देखें) 1.6 μg 0.25 μg
प्लस रिएजेंट 12 माइक्रोन 2 माइक्रोन
लिपोफेक्टामाइन एलटीएक्स 36 माइक्रोन 6 माइक्रोन
D10 (चरण 7.1.7) 5 लाख 1.5 लाख
D10 (चरण 7.1.8 और 7.1.10) 8 लाख 2 एल

तालिका 3: लेंटिवायरस पैकेजिंग मिश्रण के लिए अभिकर्मकों की मात्रा और मात्रा।

तालिका 4: एसआरएनए और एनजीएस को बढ़ाने के लिए प्राइमर दृश्य। कृपया इस फ़ाइल को देखने के लिए यहां क्लिक करें (डाउनलोड करने के लिए सही क्लिक करें)।

अभिकर्मक प्रति प्रतिक्रिया मात्रा मास्टर मिक्स (x38)
Q5 हॉट स्टार्ट हाई-फिडेलिटी 2x 25 माइक्रोन 950 माइक्रोन
प्राइमर (L1/U1) मिश्रण (10 μM प्रत्येक) 1 μL 38 माइक्रोन
जीनोमिक डीएनए (1 मिलीग्राम/mL) 2 माइक्रोन 72 माइक्रोन
एच2 22 माइक्रोन 1100 μL
कुल 50 माइक्रोन 1900 μL

तालिका 5: उच्च जटिलता नमूनों से जीआरएनए के प्रवर्धन के लिए पीसीआर।

साइकिल संख्या विनेचर एनियलिंग एक्सटेंशन
1 98 डिग्री सेल्सियस, 30
2-24 98 डिग्री सेल्सियस, 10s 61 डिग्री सेल्सियस, 15s 72 डिग्री सेल्सियस, 20s
25 72 डिग्री सेल्सियस, 2 मिन

तालिका 6: पहली पीसीआर के लिए पीसीआर की स्थिति।

अभिकर्मक प्रति प्रतिक्रिया मात्रा
कापा हिफी हॉटस्टार्ट रेडीमिक्स 25 माइक्रोन
प्राइमर (PE1.0/index प्राइमर) मिश्रण (5 μM प्रत्येक) 2μL
पहला पीसीआर उत्पाद (40 स्नातकोत्तर/माइक्रोन) 5 माइक्रोन
एच2 18 माइक्रोन
कुल 50 माइक्रोन

तालिका 7: जेनेटिक स्क्रीन से एसजीआरएनए के इंडेक्स टैगिंग के लिए पीसीआर।

साइकिल संख्या विनेचर एनियलिंग एक्सटेंशन
1 98 डिग्री सेल्सियस, 30
2-15 98 डिग्री सेल्सियस, 10s 66 डिग्री सेल्सियस, 15s 72 डिग्री सेल्सियस, 20s
16 72 डिग्री सेल्सियस, 5 मिन

तालिका 8: दूसरी पीसीआर के लिए पीसीआर की शर्तें।

Supplementary Figure 1
अनुपूरक चित्रS1: गैर बाध्यकारी आबादी छंटाई के लिए फाटक ड्राइंग के लिए एक गाइड । (क)स्क्रीनिंग के लिए एक आदर्श प्रोटीन उम्मीदवार के नियंत्रण आबादी की तुलना में बाध्यकारी आबादी का स्पष्ट बदलाव होना चाहिए और एचएस बायोसिंथेसिस के लिए मशीनरी की कमी वाली कोशिकाओं पर बाध्यकारी बनाए रखा जाना चाहिए । SLC35B2 लक्षित सेल लाइनों पर परीक्षण के स्थान पर एक हेपरिन अवरुद्ध प्रयोग का उपयोग किया जा सकता है। (ख)प्रोटीन एक्टोडोमेन से सतह धुंधला की कमी कोशिकाओं लेकिन लेंटिवायरल ट्रांसड्यूक्शन से बीएफपी फ्लोरेसेंस व्यक्त एकत्र किए गए । प्रदर्शित कोशिकाएं GABBR222के लिए रिसेप्टर की पहचान के लिए एक स्क्रीन से हैं । शर्मा एट अल19से इस आंकड़े को संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Supplementary Figure 2
अनुपूरक चित्रा S2: सेल सतह ग्लाइकोप्रोटीन ट्रांसक्रिप्टोमिक्स आधारित पीसीए प्लॉट 1,000 से अधिक कैंसर सेल लाइनों से आरएनए-सीक्यू डेटा का उपयोग करके। सेल मॉडल पासपोर्ट27 से सेल लाइनों ~1,500 सेल सतह ग्लाइकोप्रोटीन के FPKM मूल्यों के अनुसार कश्मीर का मतलब क्लस्टरिंग का उपयोग कर संकुल थे। प्रत्येक क्लस्टर से प्रतिनिधि सेल लाइनों लेबल हैं। क्लस्टर 5 पूरी तरह से हेमेटोपोइटिक मूल की सेल लाइनों से बना था (पूरक तालिका 2भी देखें)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Supplementary Figure 3
अनुपूरक चित्रा S3: परियोजना स्कोर से KEGG-एनोटेशन प्रोटीन निर्यात और एन-लिंक्ड ग्लाइकोसिलेशन जीन के लिए अनिवार्यता स्कोर । समायोजित Bayes-~३३० सेल लाइनों के लिए अनिवार्यता स्कोर (कॉलम, लेबल नहीं) प्रोटीन निर्यात और एन से जुड़े ग्लाइकोसिलेशन पाथवे (एक्स-एक्सिस) के जीन के लिए साजिश रची जाती है । 0 से अधिक स्कोर मूल प्लाज्मिड लाइब्रेरी की तुलना में उत्परिवर्ती आबादी में महत्वपूर्ण कमी का प्रतिनिधित्व करते हैं। जीन को तीन अलग-अलग समूहों में विभाजित किया जा सकता है जो कोशिका रेखाओं में अनिवार्यता के विभिन्न स्तरों का प्रतिनिधित्व करते हैं। इस क्लस्टरिंग का इस्तेमाल छंटाई के दिन तय करने के लिए किया जा सकता है। यदि स्क्रीन देर से समय बिंदु (दिन 16) पर किया जाता है, तो यह संभव है कि जीन जो कोशिकाओं (समूह1 और 3) के लिए आवश्यक माने जाते हैं, की पहचान नहीं की जाएगी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक तालिका 1: रॉ काउंट फाइल्स फॉर और एमएजेकॉक सॉफ्टवेयर ने प्रतिनिधि जेनेटिक स्क्रीन से संबंधित फाइलों gene_summary उत्पन्न किया। कृपया इस फ़ाइल को देखने के लिए यहां क्लिक करें (डाउनलोड करने के लिए सही क्लिक करें)।

अनुपूरक तालिका 2: सेल सतह रिसेप्टर्स की अभिव्यक्ति के अनुसार सेल लाइनों का क्लस्टरिंग। कृपया इस फ़ाइल को देखने के लिए यहां क्लिक करें (डाउनलोड करने के लिए सही क्लिक करें)।

Discussion

सेलुलर मान्यता में शामिल सेलुलर घटकों को एन्कोडिंग करने वाले जीन की पहचान करने के लिए एक CRISPR आधारित स्क्रीनिंग रणनीति का वर्णन किया गया है । CRISPR सक्रियण का उपयोग करने वाला एक समान दृष्टिकोण बड़े प्रोटीन पुस्तकालयों कोउत्पन्नकरने की आवश्यकता के बिना पुनः संयोजन प्रोटीन के सीधे बातचीत रिसेप्टर्स की पहचान करने के लिए एक आनुवंशिक विकल्प भी प्रदान करता है । हालांकि, इस दृष्टिकोण का एक प्रमुख लाभ यह है कि यह सतह के अणुओं द्वारा मध्यस्थता की गई बातचीत पर लागू होता है जो मूल रूप से कोशिका पर प्रदर्शित होते हैं और रिसेप्टर्स की अतिअभिव्यक्ति पर निर्भर नहीं करते हैं, जो रिसेप्टर की बाध्यकारी शौकीनता को प्रभावित कर सकते हैं। अन्य तरीकों के विपरीत, इसलिए, यह तकनीक रिसेप्टर्स की जैव रासायनिक प्रकृति या सेल जीव विज्ञान के बारे में कोई अनुमान नहीं लगाती है और प्रोटीन द्वारा मध्यस्थता की गई बातचीत का अध्ययन करने का अवसर प्रदान करती है जो आम तौर पर जैव रासायनिक दृष्टिकोणों का उपयोग करके अध्ययन करना मुश्किल होता है, जैसे कि बहुत बड़े प्रोटीन, या जो झिल्ली को कई बार पार करते हैं या अन्य प्रोटीन के साथ जटिल बनाते हैं, और प्रोटीन के अलावा अन्य अणु, ग्लाइकोडाइड, और फोलिफाइड और फोलिफाइड। विधि के जीनोम-स्केल प्रकृति को देखते हुए, इस दृष्टिकोण में न केवल रिसेप्टर की पहचान करने का लाभ है बल्कि अतिरिक्त सेलुलर घटक भी हैं जो बाध्यकारी घटना के लिए आवश्यक हैं, जिससे रिसेप्टर के सेल जीव विज्ञान में अंतर्दृष्टि प्रदान की जाती है।

इस विधि की प्रमुख सीमाओं में से एक जब इसका उपयोग करने के लिए एक अनाथ प्रोटीन के रिसेप्टर की पहचान करने के लिए प्रारंभिक आवश्यकता है पहले एक सेल लाइन है कि प्रोटीन के लिए बांध की पहचान है । यह हमेशा आसान नहीं होता है और एक सेल लाइन की पहचान करना जो एक बाध्यकारी फेनोटाइप प्रदर्शित करता है जो आनुवंशिक स्क्रीन के लिए भी स्वीकार्य है, इस परख को तैनात करने के लिए समय-सीमित कदम हो सकता है। कुछ सेल लाइनें दूसरों की तुलना में अधिक प्रोटीन के लिए बांध करते हैं । यह प्रोटीन के लिए विशेष रूप से प्रासंगिक है जो एचएस को बांधते हैं, क्योंकि ये प्रोटीन किसी भी सेल लाइन से बांधते हैं जो एचएस साइड चेन प्रदर्शित करता है, चाहे मूल बाध्यकारी संदर्भ कुछ भी हो। इसके अतिरिक्त, हमने देखा है कि कोशिका लाइनों में सिंडेकान (यानी, एचएस वाले प्रोटेओग्लिकन) के अपरेगुलेशन से एचएस-बाइंडिंग प्रोटीन26की बाध्यकारी वृद्धि होती है। स्क्रीनिंग के लिए सेल लाइन का चयन करते समय इसे ध्यान में रखना एक कारक हो सकता है। हालांकि, यह भी ध्यान दें कि एचएस के योजक बाध्यकारी एक विशिष्ट रिसेप्टर के लिए बाध्यकारी के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है महत्वपूर्ण है । इसका मतलब यह है कि यदि बाध्यकारी मनाया जाता है, तो यह संभव है कि यह पूरी तरह से एचएस द्वारा मध्यस्थता की जाए क्योंकि इस परख में एचएस द्वारा मध्यस्थता की गई बाध्यकारी मध्यस्थता19के बजाय योजक है। ऐसे परिदृश्य में, वर्णित हेपरिन अवरुद्ध दृष्टिकोण पूर्ण आनुवंशिक स्क्रीन प्रदर्शन करने की आवश्यकता के बिना ऐसे व्यवहारों की पहचान कर सकता है।

सेल लाइनों को चुनने के लिए एक उपयोगी संसाधन सेल मॉडल पासपोर्ट है, जिसमें ~ 1,000 कैंसर सेल लाइनों27के लिए जीनोमिक्स, ट्रांसक्रिप्टोमिक्स और संस्कृति स्थिति की जानकारी शामिल है। जैविक संदर्भ के आधार पर, कोशिकाओं को उनकी अभिव्यक्ति प्रोफाइल के आधार पर चुना जा सकता है। सेल लाइनों के चयन में सहायता करने के लिए, हमने सेल मॉडल पासपोर्ट में ~ 1,000 सेल लाइनों को ~ 1,500 प्रीनोटेटेड ह्यूमन सेल सरफेस ग्लाइकोप्रोटीन28 (सप्लीमेंट्री फिगर 2;विकास की स्थिति के साथ प्रत्येक सेल लाइन के लिए क्लस्टर जानकारी पूरक तालिका 2में प्रदान की जाती है) की अभिव्यक्ति के अनुसार संकुल मॉडल पासपोर्ट में ~ 1,000 सेल लाइनों को संकुल किया। अज्ञात फ़ंक्शन के साथ प्रोटीन के बंधन का परीक्षण करते समय, रिसेप्टर्स की एक विस्तृत श्रृंखला को कवर करने की संभावना बढ़ाने के लिए प्रत्येक क्लस्टर से प्रतिनिधि सेल लाइनों के एक पैनल का चयन करना उपयोगी है। एक विकल्प को देखते हुए, सेल लाइनों का चयन करने की सिफारिश की जाती है जो संस्कृति के लिए आसान हैं और ट्रांसड्यू करना आसान है। चूंकि इन सेल लाइनों का उपयोग जीनोम-स्केल स्क्रीनिंग में किया जाएगा, इसलिए यह बेहतर है कि उन्हें बड़ी मात्रा में आसानी से उगाया जा सकता है और लेंटिवायरल ट्रांसड्यूक्शन के लिए स्वतंत्र हैं, क्योंकि यह बाद के चरणों में CRISPR आधारित आनुवंशिक स्क्रीनिंग के लिए sgRNA के वितरण के लिए सबसे अधिक उपलब्ध विधि है ।

आम तौर पर, फेनोटाइप चयन एक ही प्रकार में किए जाते हैं। हालांकि, यह नियंत्रण की तुलना में दाग कोशिका आबादी की चमक से निर्धारित होता है। चयन के पुनरावृत्ति दौर परिदृश्यों के लिए अपनाए जा सकते हैं जिनमें वांछित फेनोटाइप का सिग्नल-टू-शोर अनुपात कम होता है, या जब स्क्रीन का उद्देश्य उन म्यूटेंट की पहचान करना है जिनके पास मजबूत फेनोटाइप होते हैं। जब FACS आधारित स्क्रीन के लिए एक पुनरावृत्ति चयन दृष्टिकोण का उपयोग कर, यह विचार करना महत्वपूर्ण है कि छंटाई प्रक्रिया सेल मौत का कारण बन सकता है, मुख्य रूप से सॉर्टर के सरासर बल के कारण । इस प्रकार, छंटाई के अगले दौर में सभी एकत्र कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व नहीं किया जाएगा।

पुस्तकालय जटिलता सफल आनुवंशिक स्क्रीन प्रदर्शन में एक बहुत महत्वपूर्ण कारक है, विशेष रूप से नकारात्मक चयन स्क्रीन के लिए, क्योंकि इन में कमी की सीमा केवल शुरू पुस्तकालय में मौजूद था क्या करने के लिए परिणामों की तुलना द्वारा निर्धारित किया जा सकता है । नकारात्मक चयन स्क्रीन के लिए, 500-1,000 एक्स जटिलता के पुस्तकालयों को बनाए रखना आम बात है। सकारात्मक चयन स्क्रीन, हालांकि, पुस्तकालय के आकार के लिए अधिक मजबूत हैं, क्योंकि ऐसी स्क्रीन में केवल एक विशेष फेनोटाइप के लिए कम संख्या में म्यूटेंट चुने जाने की उम्मीद है। इसलिए, यहां वर्णित सकारात्मक चयन स्क्रीन में, स्क्रीन की गुणवत्ता से समझौता किए बिना पुस्तकालय के आकार को 50-100x जटिलता तक कम किया जा सकता है। इसके अलावा, इन स्क्रीन में किसी दिए गए दिन पर किसी दिए गए सेल लाइन के लिए नियंत्रण पुस्तकालय का उपयोग करना भी संभव है क्योंकि उस दिए गए सेल लाइन के लिए दिन में हल किए गए सभी नमूनों के लिए "सामान्य नियंत्रण" है। इससे उन नियंत्रण पुस्तकालयों की संख्या में कमी आएगी, जिन्हें उत्पादित और अनुक्रमित करने की आवश्यकता है ।

इस दृष्टिकोण का उपयोग करने के लिए एक और महत्वपूर्ण विचार जीन है कि इन विट्रो सेल विकास के लिए आवश्यक है की पहचान करने में नुकसान के समारोह स्क्रीन की सीमाएं है । स्क्रीन के समय इस संबंध में महत्वपूर्ण है, के रूप में अब उत्परिवर्ती कोशिकाओं संस्कृति में रखा जाता है, उच्च संभावना है कि आवश्यक जीन में उत्परिवर्तन के साथ कोशिकाओं को अव्यवहार्य हो जाते है और अब उत्परिवर्ती पुस्तकालय में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं । हाल ही में 300 से अधिक सेल लाइनों में परियोजना स्कोर पहल के एक भाग के रूप में प्रदर्शन आनुवंशिक स्क्रीन से पता चलता है कि KEGG-एनोटेटेड प्रोटीन स्राव और एन ग्लाइकोसिलेशन मार्ग में कई जीन अक्सर सेल लाइनों(अनुपूरक चित्रा 3)29के एक नंबर के लिए आवश्यक होने के रूप में पहचाने जाते हैं । यदि सेलुलर मान्यता प्रक्रिया के संदर्भ में प्रसार और व्यवहार्यता के लिए आवश्यक जीन के प्रभाव की जांच की जानी है तो स्क्रीन डिजाइन करते समय इस पर ध्यान दिया जा सकता है । इस मामले में, शुरुआती टाइमपॉइंट (जैसे, दिन 9 पोस्टट्रांसड्यूक्शन) पर स्क्रीन करना आम तौर पर उपयुक्त होगा। हालांकि, यदि दृष्टिकोण का उपयोग सामान्य सेलुलर रास्तों के बजाय मजबूत आकार प्रभावों के साथ कुछ लक्ष्यों की पहचान करने के लिए किया जाता है, तो बाद के समय बिंदु (जैसे, दिन 15-16 पोस्टट्रांसड्यूक्शन) पर स्क्रीन करना उचित हो सकता है।

स्क्रीनिंग से परिणाम बहुत मजबूत हैं; आठ रिकॉम्बिनेंट प्रोटीन बाध्यकारी स्क्रीन अतीत में प्रदर्शन में, सेल सरफेस रिसेप्टर हर मामले में शीर्ष हिट19था . इस दृष्टिकोण का उपयोग करते समय इंटरैक्शन पार्टनर की पहचान करने के लिए, इसलिए रिसेप्टर और सतह पर इसकी प्रस्तुति में योगदान देने वाले कारकों को उच्च सांख्यिकीय आत्मविश्वास के साथ पहचाना जाना चाहिए। एक बार स्क्रीन का प्रदर्शन किया जाता है और एक हिट को एक ही एसआरएनए नॉकआउट का उपयोग करके मान्य किया जाता है, तो एवेक्सिस4 जैसे मौजूदा जैव रासायनिक तरीकों का उपयोग करके और सतह प्लाज्मोन अनुनाद का उपयोग करके शुद्ध प्रोटीन के प्रत्यक्ष स्थिर बंधन का उपयोग करके आगे अनुवर्ती प्रदर्शन किया जा सकता है। यहां वर्णित दृष्टिकोण सभी प्रोटीन के लिए लागू होता है जिसके लिए घुलनशील पुनः संयोजन बाध्यकारी जांच उत्पन्न करना संभव है।

सारांश में, यह सेल सतह प्रोटीन द्वारा मध्यस्थता बातचीत की पहचान करने के लिए एक जीनोम-स्केल CRISPR नॉकआउट दृष्टिकोण है। यह विधि आम तौर पर विभिन्न जैविक संदर्भों की एक विस्तृत श्रृंखला में सेल सतह मान्यता के लिए आवश्यक सेलुलर रास्तों की पहचान करने के लिए लागू होती है, जिसमें जीव की अपनी कोशिकाओं (जैसे, तंत्रिका और प्रतिरक्षा त्मक मान्यता) के साथ-साथ मेजबान कोशिकाओं और रोगजनक प्रोटीन के बीच भी शामिल है। यह विधि रिसेप्टर पहचान के लिए डिज़ाइन किए गए जैव रासायनिक दृष्टिकोणों के लिए एक आनुवंशिक विकल्प प्रदान करती है, और क्योंकि इसमें बायोकेमिकल प्रकृति या रिसेप्टर्स के सेल जीव विज्ञान के बारे में किसी पूर्व मान्यताओं की आवश्यकता नहीं होती है, इसमें पूरी तरह से अप्रत्याशित खोजों को बनाने की अपार क्षमता है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को जीजेएमडब्ल्यू को दिए गए वेलकम ट्रस्ट ग्रांट नंबर 206194 ने सपोर्ट किया। हम साइटोमेट्री कोर सुविधा का शुक्रिया अदा करते हैं: मधुमक्खी लिंग एनजी, जेनिफर ग्राहम, सैम थॉम्पसन, और क्रिस्टोफर हॉल FACS के साथ मदद के लिए ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-mouse alkaline phosphatase Sigma A4656
Blasticidin Chem-Cruz SC-204655
Blood & Cell Culture DNA Maxi Kit Qiagen 13362
BSA Sigma A9647-100G
Diethanolamine Sigma 398179
DMEM Gibco 31966-021
Dneasy Blood and Tissue kit Qiagen 69504
DynaMag-96 Side Magnet Invitrogen 12331D
HEK293T packaging cells ATCC CRL-3216
Heparin Sigma H4784-1G
KAPA HiFi HotStart ReadyMix Kapa KK2602
Lipofectamine LTX with PLUS reagent Invitrogen 15338100
MoFlo XDP cell sorter BD
Ni2+-NTA agarose beads Jena Bioscience AC-501-25
OPTI-MEM Life Technologies 31985-070
OX-68 antibody AbD Serotec MCA1022R
p-nitrophenyl phosphate Sigma 1040-506
PD-10 desalting columns GE healthcare 17085101
Polybrene Millipore TR-1003-G
Polypropylene tubes with 5 mL bed volume Qiagen 34964
Proteinase K, recombinant, PCR Grade Roche 3115879001
Puromycin Gibco A11138-03
Q5 Hot Start High-Fidelity 2× Master Mix NEB M0494L
QIAquick PCR purification kit Qiagen 28104
SCFA filter Nalgene 190-2545
Sony Cell sorter Sony
SPRI beads (Agencourt AMPure XP beads) Beckman A63881
Streptavidin-coated microtitre plates Nalgene 734-1284
Streptavidin-PE Biolegend 405204

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