Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Cell Surface Receptor Identification Med hjälp av genomskala CRISPR/Cas9 Genetiska skärmar

Published: June 6, 2020 doi: 10.3791/60803
Automatic Translation
1,2, 1
1Cell Surface Signalling Laboratory, Wellcome Trust Sanger Institute, 2EMBL-EBI, Wellcome Genome Campus

Summary

Detta manuskript beskriver en genomskala cell-baserade screening metod för att identifiera extracellulära receptor-ligand interaktioner.

Abstract

Intercellulär kommunikation medierad genom direkt interaktion mellan membran-inbäddade cellytceptorer är avgörande för normal utveckling och funktion av flercelliga organismer. Upptäcka dessa interaktioner är dock fortfarande tekniskt utmanande. Detta manuskript beskriver en systematisk genomskala CRISPR/Cas9 knockout genetisk screening metod som avslöjar cellulära vägar som krävs för specifika cell yta erkännande händelser. Denna analys använder rekombinanta proteiner som produceras i ett däggdjur protein uttryckssystem som ivrig bindande sonder för att identifiera interaktion partner i en cellbaserad genetisk skärm. Denna metod kan användas för att identifiera de gener som behövs för interaktioner med cellytor som detekteras av rekombinanta bindningssonder som motsvarar ectodomains av membraninbäddade receptorer. Viktigt, med tanke på genomet-skala karaktär av detta tillvägagångssätt, det har också fördelen av att inte bara identifiera den direkta receptorn utan också de cellulära komponenter som krävs för presentation av receptorn på cellytan, vilket ger värdefulla insikter i biologi receptorn.

Introduction

Extracellulära interaktioner genom cellytanreceptorproteiner direkt viktiga biologiska processer såsom vävnadsorganisation, host-patogen erkännande, och immun reglering. Att undersöka dessa interaktioner är av intresse för det bredare biomedicinska samhället, eftersom membranreceptorer är genomförbara mål för systematiskt levererade terapier såsom monoklonala antikroppar. Trots deras betydelse, studera dessa interaktioner är fortfarande tekniskt utmanande. Detta beror främst på att membraninbäddade receptorer är amfipatiska, vilket gör dem svåra att isolera från biologiska membran för biokemisk manipulation, och deras interaktioner kännetecknas av de svaga interaktionsaffiniteterna (KDi μM-mM-området)1. Följaktligen är många vanliga metoder olämpliga för att upptäcka denna klass av proteininteraktioner1,2.

En rad metoder har utvecklats för att specifikt undersöka extracellulära receptor-ligand interaktioner som tar deras unika biokemiska egenskaper beaktas3. Ett antal av dessa metoder innebär att uttrycka hela ectodomain av en receptor som ett lösligt rekombinant protein i däggdjur eller insektscellbaserade system för att säkerställa att dessa proteiner innehåller posttranslationala modifieringar som är strukturellt viktiga, såsom glykaner och disulfidbindningar. För att övervinna den lågaffinitet bindande, ectodomains är ofta oligomeriserade att öka deras bindande avidity. Avid protein ectodomains har framgångsrikt använts som bindande sonder för att identifiera interaktion partner i direkt rekombinant protein-protein interaktion skärmar4,5,6,7. Medan i stort sett framgångsrika, rekombinanta proteinbaserade metoder kräver att ectodomain av en membranreceptor produceras som ett lösligt protein. Därför är det endast allmänt tillämpligt på proteiner som innehåller en sammanhängande extracellulär region (t.ex. enkelpass typ I, typ II eller GPI-förankrad) och är i allmänhet inte lämplig för receptorkomplex och membranproteiner som spänner över membranet flera gånger.

Uttryck kloning tekniker där ett bibliotek av kompletterande DNAs (cDNAs) är transfected till celler och testas för en vinst-av-bindande fenotyp har också använts för att identifiera extracellulära protein-protein interaktioner8. Tillgången till stora samlingar av klonade och sekvenserade cDNA uttryck plasmider under de senaste åren har underlättat metoder där cellinjer överuttryck cDNAs kodning cellyteceptorer screenas för bindning av rekombinanta proteiner för att identifiera interaktioner9,10. CDNA overexpression-baserade metoder, till skillnad från rekombinanta proteinbaserade metoder, ger möjlighet att identifiera interaktioner i samband med plasmamembranet. Framgången med att använda cDNA-uttryckskonstruktioner beror dock på cellernas förmåga att överuttrycka proteinet i korrekt vikt form, men detta kräver ofta cellulära tillbehörsfaktorer som transportörer, förkläde och korrekt oligomeric-sammansättning. Att transfecting en enda cDNA kan därför inte vara tillräckligt för att uppnå cellytan uttryck.

Screeningtekniker med hjälp av cDNA-konstruktioner eller rekombinanta proteinsonder är resurskrävande och kräver stora samlingar av cDNA- eller rekombinanta proteinbibliotek. Särskilt utformade masspektrometribaserade metoder har nyligen använts för att identifiera extracellulära interaktioner som inte kräver montering av stora bibliotek. Dessa tekniker kräver dock kemisk manipulering av cellytan, vilket kan förändra den biokemiska karaktären hos de molekyler som finns på cellernas yta och som för närvarande endast är tillämpliga för interaktioner som medierats av glykosylaterade proteiner11,12. Majoriteten av de för närvarande tillgängliga metoderna fokuserar också kraftigt på interaktioner mellan proteiner samtidigt som man till stor del ignorerar bidraget från membranemikromiljön, inklusive molekyler som glykaner, lipider och kolesterol.

Den senaste tidens utveckling av högeffektiv bialleleic inriktning med hjälp av CRISPR-baserade metoder har möjliggjort genom-skala bibliotek av celler som saknar definierade gener i en enda pool som kan screenas på ett systematiskt och opartiskt sätt att identifiera cellulära komponenter som är involverade i olika sammanhang, inklusive dissekering av cellulära signalprocesser, identifiering av störningar som ger resistens mot läkemedel, toxiner och patogener, och bestämma specificitet av antikroppar13,,14,,15,16. Här beskriver vi en genomskalas CRISPR-baserad knockoutcellscreeninganalys som ger ett alternativ till de nuvarande biokemiska metoderna för att identifiera extracellulära receptor-ligandinteraktioner. Detta tillvägagångssätt för att identifiera interaktioner som medieras av membranreceptorer genom genetiska skärmar är särskilt lämpligt för forskare som har ett fokuserat intresse för enskilda ligander eftersom det undviker behovet av att sammanställa stora bibliotek av cDNAs eller rekombinanta proteiner.

Denna analys består av tre huvudsteg: 1) Mycket ivrig rekombinant protein bindande sonder som består av de extracellulära regionerna av en receptor av intresse produceras och används i fluorescens-baserade flöde cytometri-baserade bindande analyser; 2) De bindande analyserna används för att identifiera en cellinje som uttrycker interaktionspartnern för den rekombinanta proteinsonden; 3) En Cas9-uttrycksversion av cellinjen som interagerar med det protein som är av intresse produceras och en genomskalas CRISPR/Cas9-baserad knockoutskärm utförs (figur 1). I denna genetiska skärm används bindning av ett rekombinant protein till cellinjer som en mätbar fenotyp där celler i knockout-biblioteket som har förlorat förmågan att binda sonden sorteras med fluorescensbaserad aktiverad cellsortering (FACS) och de gener som orsakade förlusten av den bindande fenotyp som identifierats genom sekvensering. I princip identifieras de gener som kodar den receptor som är ansvarig för att binda ivrigsonden och de som krävs för dess cellyt display.

Det första steget i detta protokoll innebär produktion av ivrig rekombinanta proteinsonder som representerar ectodomain av de membranbundna receptorerna. Dessa receptorer är kända för att ofta behålla sina extracellulära bindningsfunktioner när deras ectodomainer uttrycks som ett rekombinantlösligt protein1. För ett protein av intresse kan lösliga rekombinanta proteiner produceras i alla lämpliga eukaryota proteinuttryckssystem i alla format, förutsatt att det kan oligomeriseras för ökad bindningsaviditet, och det innehåller taggar som kan användas i fluorescensbaserade flödescytometribaserade bindningsanalyser (t.ex. FLAG-tag, biotin-tag). Detaljerade protokoll för produktion av lösliga ectodomainer av membranreceptorer med hjälp av HEK293 proteinuttryckssystem, samt olika multimeriseringstekniker och proteinuttryckskonstruktioner för produktion av både pentameriska proteiner och monomeraproteiner har tidigare beskrivits1,17. Protokollet här kommer att beskriva stegen för att generera fluorescerande ivrig sonder från monomera biotinylerade proteiner genom att konjugera dem till streptavidin konjugerade till en fluorokrom (t.ex. fykoerythrin, eller PE), som kan användas direkt i cellbaserade bindande analyser och har fördelen av att inte kräva en sekundär antikropp för detektion. Allmänna protokoll för att utföra genom-skala skärmar har redan beskrivits20,21, vilket protokollet främst fokusera på detaljerna i utför flöde cytometri-baserade rekombinanta protein bindande skärmar med hjälp av CRISPR/Cas9 knockout screening system med hjälp av Human V1 ("Yusa") bibliotek18.

Protocol

1. Produktion och rening av biotinylerade his-märkta proteiner

  1. Använd ett proteinuttryckssystem som bygger på däggdjur eller insektsceller för att framställa lösliga rekombinanta his-märkta biotinylerade proteiner (se plasmidkonstruktioner i tabell 1).
    OBS: Ett detaljerat protokoll för produktion av monomeriska biotin och his-taggade proteiner med HEK293 cell uttryckssystem beskrivs av Kerr et al.17. Proteinekodomainer uttryckta med hjälp av HEK293 uttryckssystem utsöndras i odlingsmediet.
  2. Samla lösliga proteiner genom att pelleting cellerna genom centrifugering på 3000 x g i 20 min.
  3. Filtrera supernatanten genom ett 0,22 μm filter och tillsätt Ni2+-NTA-agarose pärlorna till det filtrerade proteinsupernatanten i ett 1:1 000-förhållande (dvs. 50 μL 50% agaros slam i 50 ml supernatant). Inkubera över natten eller minst 4-5 h vid 4 °C på en roterande plattform.
  4. Tvätta polypropylenkolonnen genom att lägga till 5 ml tvättbuffert för hans rening. Se tabell 2 för alla buffertsammansättningar.
  5. Häll hela pärla-protein supernatant blandningen i kolumnen. Pärlor kommer att ackumuleras vid basen.
  6. Tvätta pärlorna 2x med 15 ml tvättbuffert. För att undvika proteinutspädning, dra försiktigt den återstående tvättbufferten från kolonnen med en 5 ml spruta och kassera.
  7. Tillsätt försiktigt 300-500 μL his-rening elueringsbuffert direkt till pärlorna och inkubera i minst 1 h. Samla upp det eluerade proteinet genom att återigen försiktigt dra ut vätskan med en 1 ml spruta. Byt ut elueringsbufferten till önskad buffert (t.ex. normalt PBS eller HBS) med hjälp av avsaltningskolumner. Förvara alla proteiner vid 4 °C tills vidare användning.

2. Kvantifiering och oligomerisering av monomeriskt biotinylerat protein

OBS: För att öka den bindande avidity, oligomerisera biotinylerade monomeriska proteiner på tetrameric streptavidin-PE innan du använder dem i bindande analyser. Uppnå optimal konjugeringsförhållanden för monomerer och tetrameric streptavidin-PE genom att testa en utspädningsserie av biotinylerade monomerer mot en fast koncentration av streptavidin och genom att empiriskt fastställa den minsta utspädning vid vilken inga överskott biotinylerade monomerer kan detekteras.

  1. Gör minst åtta seriella utspädningar av biotinylerade proteinprover med hjälp av en lämplig utspädningsbuffert (antingen PBS eller HBS med 1 % bovinumserumalbumin [BSA]) i en 96-brunnsplatta. Se till att den slutliga volymen för varje utspädning är minst 200 μL.
  2. Gör en dubblettplatta av proverna genom att ta bort 100 μL från varje brunn och överföra till en ny 96-brunnsplatta. Inkludera alltid en kontroll. I detta fall kontroller är endast tag-proteiner (dvs biotinylated Hans-taggade Cd4 domän 3 +4 protein). Detta kommer att användas som en kontrollsond i alla bindningsanalyser.
  3. Späd streptavidin-PE till 0,1 μg/ml i utspädningsbufferten.
  4. På bara en av plattorna, tillsätt 100 μL av den utspädda streptavidin-PE. Dubblettplattan fungerar som en kontroll. Tillsätt 100 μl utspädningsbuffert i kontrollplattan för att utjämna volymerna.
  5. Inkubera i 20 min vid rumstemperatur (RT). Under tiden, blockera brunnarna på en streptavidin-belagd platta med utspädningsbufferten i 15 min.
  6. Överför provets totala volym från båda plattorna till enskilda brunnar av de streptavidinbelagda plattorna och inkubera i 1 h vid RT.
  7. Tvätta plattan 3x med 200 μl tvättbuffert (dvs. antingen PBS eller HBS med 0,1% Tween-20, 2% BSA). Tillsätt 100 μL μg av 2 μg/mL mus anti-råtta Cd4d3+4 IgG (OX68) och inkubera i 1 h vid RT.
  8. Tvätta plattan 3x med tvättbufferten. Tillsätt 100 μL av en antimusalkad fosfataskonjugat vid 0,2 μg/ml i 1 h vid RT.
  9. Tvätta plattan 3x med tvättbuffert och 1x i utspädningsbuffert.
  10. Förbered p-nitrofenylfosfat vid 1 mg/ml i ditanolaminbuffert. Tillsätt 100 μL i varje brunn och inkubera i 15 min.
  11. Ta absorbans avläsningar vid 405 nm. Använd den minsta utspädning vid vilken det inte finns någon signal på plattan som lämplig utspädningsfaktor för att skapa tetramerer (figur 2).
  12. Gör en 10x tetramer färgningslösning för alla prover och kontroller genom inkubering 4 μg/ml streptavidin-PE och lämplig biotinylerad proteinutspädning i 30 min vid RT. Förvara konjugerade proteiner i ett ljusskyddat rör vid 4 °C tills vidare användning.

3. Flödescytometribaserade cellbindningsanalyser

  1. För vidhäftningsceller, ta bort odlingsmedia och tvätta 1x med PBS utan divalent katjoner. Tillsätt sedan lösningar för cellavlossning (t.ex. Låt cellerna lossna i 5-10 min. Knacka försiktigt på kolven för att frigöra cellerna.
    OBS: Undvik att använda trypsin-baserade produkter eftersom de kan klyva cellytproteiner.
  2. Samla fristående celler i ett rör. För celler som växer i suspension (t.ex. HEK293 celler), direkt samla cellerna från odlingsflaskor i ett rör.
  3. Pelletceller vid 200 x g i 5 min. Ta bort supernatanten och resuspend pelleten i tvättbuffert (dvs. PBS/1% BSA).
  4. Räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer och justera koncentrationen till 2,5 x 105-1 x 106 celler/ml. Aliquot 100 μL beredd cellblandning på en 96-brunn U- eller V-bottenplatta. Snurra plattan i 5 min vid 400 x g. Ta bort supernatanten med en flerkanalig pipett.
  5. Tillsätt 100 μl normaliserade fluorescerande märkta mycket ivrigproteinsonder och kontroller i de tidigare preparerade plattorna med celler och inkubera i 1 h vid 4 °C. Efter bindning i 1 h, snurra plattan i 400 x g i 5 min.
  6. Ta bort supernatanten och tillsätt 200 μl tvättbuffert (dvs. PBS/1% BSA). Blanda väl genom pipettering upp och ner.
  7. Pellet cellerna genom centrifugering vid 400 x g i 5 min. Upprepa tvättsteget 1x. Efter två tvättar, ta bort supernatanten helt och återsuspend cellpelleten i 100 μL PBS.
  8. Analysera cellerna genom flöde cytometri. Använd den gulgröna lasern (dvs. 561 nm) för att upptäcka PE-fluorescens.
    1. Analysera först de celler som har färgats med kontrollsonden. Baserat på fördelningen av PE-fluorescens, dra en grind för bindande population så att inte mer än 1% av kontrollcellen faller i denna grind.
    2. Analysera provet och bestäm den del av cellerna som faller i bindningsporten.
      OBS: Cellinjer som visar en högre bindningspopulation önskas för genetiska skärmar, eftersom de har ett högre signal-brusförhållande. Helst bör över 80% av cellerna falla inom denna port.

4. Fastställande av bindande bidrag från värmelabbila epitoper och heparansulfatsilkkedjor

OBS: Aktiviteten hos många proteiner är värme labile, så förlust av bindande aktivitet efter värmebehandling är uppmuntrande. Det rekommenderas att fastställa bidraget från negativt laddade glykosaminoglykaner, främst heparansulfat (HS), i medling bindning av rekombinanta proteiner. Detta beror på att bindningen av HS i den cellbindande analys som beskrivs här kan vara additiv snarare än codependent på andra receptorer19. Detta innebär att den observerade bindningen helt kan medieras av HS sidokedjor av cellytans proteoglykaner och inte av en specifik receptor. Bindning till HS på cellytan är inte nödvändigtvis ospecifik, utan snarare en egenskap hos ett protein, vilket är användbart att veta innan du utför en hel genetisk skärm.

  1. Förbered värmebehandlade proteinprover att använda i bindande analyser.
    1. Värm det normaliserade men okonjugerade monomeriska proteinet vid 80 °C i 10 min.
    2. Konjugera det värmebehandlade proteinet till streptavidin-PE under förutsättning att samma konjugeringsförhållande som dess obehandlade motsvarighet bestäms av ELISA (se avsnitt 2).
  2. Förbered heparinblockerade proteinprover.
    1. Förbered åtta 1:3 utspädningar lösliga heparin i PBS med en startkoncentration på 2 mg/ml och slutlig volym på 100 μL.
    2. Inkubera 100 μL beredda bindningssonder i heparinutspädningarna i minst 30 minuter.
  3. Använd värmebehandlat protein och hela 200 μl heparin/proteinblandning i de bindande analyser som beskrivs i avsnitt 3. Representativa resultat visas i figur 3A,B.

5. Val av cellinjer som är stabilt uttrycker Cas9

OBS: Innan cellinjen som binder den av intressesonden kan användas vid CRISPR-screening måste den först konstrueras för att uttrycka Cas9-nukleasen och en mycket aktiv klon vald19.

  1. Använd följande allmänna lentivirusproduktionsprotokoll för att producera lentivirus med hjälp av den lånade konstrueran för Cas9-uttrycket (se tabell 1).
    1. Kultur HEK293-FT celler i DMEM/10% FBS media vid 37 °C och 5% CO2. Seed HEK293-FT celler 1 dag före transfection så att de är ~ 80% konfluent på dagen för transfection.
      OBS: HEK293FT-celler är löst vidhäftade; Därför, när de används för produktion av lentiviruses, överväga plätering dem på kulturflaskor belagda med 0,1% (w / v) gelatin för att öka följsamhet.
    2. Utför transfections på morgonen. Lägg till överföringsvektor, förpackningsblandning och transfection reagens i förvärmda transfection kompatibla medier (t.ex. Blanda genom att vända röret 10-15x. Inkubera i 5 min vid RT. Se tabell 3 för exakta volymer.
    3. Tillsätt transfection reagens som föreslagits av tillverkaren. Blanda genom snabb virvelring. Inkubera i 30 min på RT.
    4. Mycket försiktigt aspirera det använda mediet. Lägg till transfection kompatibla medier till plattan.
    5. Tillsätt transfection reagens / DNA-komplex dropwise på sidan av plattan och långsamt sprida sig genom plattan genom virvlande mycket försiktigt.
    6. Inkubera vid 37 °C i 3-5 timmar och byt ut mediet mot D10 medium. Inkubera över natten.
    7. Nästa dag på morgonen, byt ut mediet mot färskt D10-medium. Inkubera över natten.
    8. Nästa dag sent på eftermiddagen, samla viral supernatant. Filtrera med ett 0,45 μm filter med låg proteinbindning. Alternativt, tillsätt färska D10 medium, inkubera över natten och minnas supernatant nästa dag.
    9. Virus supernatants är stabila vid 4 °C för endast för ett par dagar. Förvaras vid -80 °C för långtidsförvaring.
      OBS: För att generera en mycket koncentrerad lentiviral beredning, vilket kan vara önskvärt för transduktion av svåra att transduce celler, supernatants kan också koncentreras genom centrifugering vid 6.000 x g över natten vid 4 °C. Markera den genomskinliga viruspelleten med en etanolbeständig penna och kassera supernatanten. Resuspend pelleten i 1/100th av den ursprungliga volymen för en 100x ökning av koncentrationen.
  2. Transduce cellerna med lentiviruses.
    1. Platta 1 x 106 celler per brunn i en 6-brunnsplatta med 3 ml lämpligt kulturmedia. Vissa celler är lättare omdauceras än andra. För lätt att transduce celler (t.ex. HEK celler), direkt lägga till lentivirus till cellerna. För svåra att transduce celler, kan det vara nödvändigt att följa ett spinylering protokoll som beskrivs nedan.
      1. Aliquot 2 ml 2-5 x 106 celler/ml i ett koniskt rör på 15 ml.
      2. Tillsätt lentivirus tillsammans med 8 μg/ml hexadimethrine bromid och inkubera vid RT i 30 min.
      3. Centrifug i 100 min vid 800 x g vid 32 °C. Sedan återsuspenderade cellerna i samma medium och tillsätt cellfjädringen i lämpliga kulturflaskor med lämpligt medium.
    2. Låt transductions i minst 24 timmar. Ta sedan bort mediet som innehåller viruset och tillsätt färskt medium.
    3. Efter ytterligare 24 h, ändra media till en som kompletteras med lämpliga antibiotika. Cas9 konstruktion innehåller en blasticidin motstånd kassett för val.
      OBS: Mängden blasticidin måste optimeras för varje cellinje genom att utföra en dosrespons kill kurva. En blasticidinkoncentration mellan 2,5-50 μg/ml bör döda de flesta oöversändade cellinjer inom 10 dagar efter transduktionen.
  3. Utför val tills alla celler i kontrollplattan (dvs. icke-transducerade celler som har behandlats med samma koncentration av urvalantibiotika) dödas.

6. Välja kloner med hög Cas9-aktivitet

Polyklonal Cas9 kan användas för att framgångsrikt utföra genetiska skärmar; Om du väljer en klon med hög Cas9-aktivitet förbättras screeningresultaten18.

  1. Använd begränsande utspädning eller single-cell sortera enskilda blasticidin-resistenta celler i brunnar av tre 96 brunn plattor som innehåller odlingsmedia kompletteras med blasticidin. Kloner kommer att börja dyka upp mellan 2-4 veckor. Välj 10-20 kloner och expandera i 6 brunnsplattor.
  2. Analysera klonerna för Cas9-aktivitet med hjälp av snabbbedömda GFP-BFP-systemet (grön fluorescerande proteinblå fluorescerande protein), som använder ett exogent gen knockout-system där celler tillverkas antingen med en konstruktion som uttrycker GFP med ett gRNA-målande GFP eller ett tomt gRNA som kontroll18.
    1. Beställa reporterplasmider: GFP-BFP plasmid, Control-BFP plasmid (tabell 1).
    2. Producera lentivirus för både GFP-BFP plasmid och Control-BFP plasmid med hjälp av lentivirus produktionsprotokoll som beskrivs i avsnitt 5.1.
    3. Transduce varje Cas9-uttryck celllinje klon med lentivirus kodning GFP-BFP-systemet och Control-BFP separat. Följ protokollet i avsnitt 5.2.
    4. Efter 3 dagars transduktion, undersök GFP-BFP fluorescens av varje klon med hjälp av flöde cytometri. Använd 488 nm laser och 405 nm laser för att upptäcka GFP och BFP respektive.
    5. Kvantifiera Cas9-aktiviteten i varje klon genom att endast undersöka förhållandet mellan BFP och GFP-BFP-dubbla positiva celler. Hög aktivitet Cas9 celler bör helst ha > 95% GFP knockout effektivitet (Figur 4).

7. Generering av genomomfattande CRISPR-Cas9 screening knockout bibliotek

  1. För den genomomfattande screeningen med humant V1-bibliotek18,beställ det genomomfattande biblioteket (se tabell 1) och förbered plasmidbiblioteket från bakterieskitet med hjälp av protokollet som finns under "Protokoll för biblioteksreplikering" i tillverkarens handbok.
  2. Använd den genomomfattande plasmidpreparatet för att ta fram ett lentiviralt bibliotekskodning av gRNAs för riktade störningar av mänskliga gener med hjälp av det lentivirusproduktionsprotokoll som beskrivs i avsnitt 5.1.
    OBS: En god praxis är att producera en enda sats av lentiviral beredning som är optimerad för transduktion för att förbättra experimentell konsistens.
  3. Använd transduktionsprotokollet i avsnitt 5.2 för att utföra småskaliga testtransductioner för att bestämma den erforderliga mängden virus för varje cellinje för att uppnå 30% transduktion. Använd flödescytometri för att bedöma BFP-fluorescens som en proxy för transduktionseffektivitet.
  4. För att transduce HEK293 celler, helt enkelt lägga till förutbestämda lentiviral beredning till 30-50 x 106 celler odlade i normal tillväxt media för ~ 4 h. Ta sedan bort mediet med lentivirus och ersätt med färsk tillväxtmedia.
  5. För andra cellinjer, använd spinokuleringsprotokollet i avsnitt 5.2.1 men i större skala, så att totalt 30-50 x 106 celler omförs. För detta, aliquot 2 ml 5 x 106 celler/ml i en 15 ml konisk rör och fortsätt som anges.
  6. För vidhäftande cellinjer, välj transducerade celler genom att lägga puromycin 24 h efter transduktion.
    OBS: Optimera puromycinkoncentrationerna genom att utföra en dosrespons killkurva. Normalt bör koncentrationer mellan 1-10 μg/ml döda icke-översatta celler inom 3-5 dagar. Undvik att använda högre koncentrationer av puromycin eftersom detta kan öka risken för att välja celler som har förbundets effekt av mer än onesingle guide RNA (sgRNA).
  7. För suspensionsceller, skörd transduced (dvs. BFP positiva) celler 3 dagar posttransduktion med hjälp av en cell sorterare och generera bibliotek som innehåller minst 10 x 106 celler. När du har valt med hjälp av BFP, odla cellerna i media kompletteras med lämplig mängd puromycin.
    OBS: Undvik endast val med puromycin för suspensionscelllinjer, eftersom det är svårt att ta bort döda celler och skräp från suspensionscellkulturer som kan störa cellsortering.
  8. Kultur mutant bibliotek för 9-16 dagar posttransduktion med regelbunden passage var 2-3 dagar.

8. Genetisk screening för bindning av cellytor

  1. Pellet mutantcellbiblioteket på 200 x g i 5 min och återsuspend cellerna i PBS.
  2. Dela upp cellerna i två koniska rör på 15 ml med minst 50 x 106 celler i varje rör.
  3. Snurra ett koniskt rör i 200 x g i 5 min, ta bort supernatanten och frys cellpelleten vid -20 °C. Detta är kontrollpopulationen och kommer att behandlas senare.
  4. Resuspend pelleten i det andra röret i 10 ml PBS/1% BSA. Avsätt 100 μL celler som en negativ kontroll på en 96-brunnsplatta.
  5. Tillsätt lämpligt preconjugated rekombinant protein till cellfjädringen i det koniska röret och negativa kontrollproteiner till 96-brunnsplattan.
  6. Utför cellfärgning i minst 1 h vid 4 °C på en bänkrotor med skonsam rotation (6 varv/min).
  7. Pellet cellerna på 200 x g i 5 min, ta bort supernatanten. Utför två tvättsteg och sedan återsuspend cellerna i 5 ml PBS.
  8. Sila cellerna genom en 30 μm cell sil för att ta bort cellkluster. Analysera med hjälp av en flödessorterare.
  9. Använd det negativa kontrollprovet till grinden för BFP+/PE-celler.
  10. Sortera provet och samla in BFP+/PE-cellerna. Sorteringsportarna beror på cellernas bindning till proteinet, men är normalt 1-5% av PE negativa prover samlas in. Ett exempel på en sorteringsgrind finns i tilläggsbild 1.
  11. Samla 500.000-1.000.000 celler från den valda porten. Med tanke på det låga antalet celler, överväga att samla in proverna i en 1,5 ml centrifugeringsrör för att minimera förluster.
  12. Pellet de sorterade cellerna genom centrifugering vid 500 x g i 5 min. Ta försiktigt bort supernatanten och kassera. Det är möjligt att förvara pelleten vid -20 °C i upp till 6 månader.

9. Genomisk DNA-extraktion och första PCR för gRNA-anrikning

  1. Extrahera genomiskt DNA från högkomplexitetskontrollpopulation.
    1. Om kontrollpopulationen frystes vid -20 °C, ta ut det koniska röret och tillsätt PBS. Håll på is för att tina pelleten.
    2. Använd ett kommersiellt kit (se Materialförteckning)med hjälp av tillverkarens rekommendationer för att extrahera genomiskt DNA från 50 x 106 celler. Justera DNA-koncentrationen till 1 mg/ml.
    3. För varje prov, ställ in en huvudblandning för PCR motsvarande 72 μg DNA. Aliquot 50 μL per brunn i 36 brunnar av en 96-brunn PCR-platta. De nödvändiga grundfärgssekvenserna anges i tabell 4. Använd guiden i tabell 5 och 6.
    4. Lös 5 μl av PCR från 6-12 representativa prover på en 2% (w/v) agarosgel. Ett enda tydligt band på ~250 bp bör observeras. Om banden är svaga upprepar du PCR för ytterligare 2-3 cykler.
    5. Använd en flerkanalig pipett för att samla in 5 μl PCR-produkter från varje brunn (totalt 180 μL) och slå dem i en behållare med 900 μl bindningsbuffert från en kommersiell sats (se Materialförteckning).
    6. Rena PCR-produkterna med hjälp av ett kommersiellt PCR-reningssats. Eluera DNA till 50 μL elueringsbuffert från en kommersiell sats (se materialförteckning)och mät DNA-koncentrationen.
  2. Prover som har sorterats för förlust av bindande fenotyp kommer sannolikt inte att bestå av ett stort antal oberoende kloner. Därför är det inte nödvändigt att utföra PCR med 72 μg DNA. Isolera DNA:t med hjälp aven lämplig kommersiell sats (se Tabell över material ). Ställ in 3-4 PCR-reaktioner med det protokoll som beskrivs före (avsnitt 9.1.3) med 100 ng/μL DNA. Om det sorterade cellnumret är mindre än 100 000 använder du celllystetter i stället för genomiska DNA-preparat.
    1. Aliquot ungefärligt 10.000 celler/brunn i en 96 väl PCR-pläterar.
    2. Pellet cellerna i plattan och försiktigt ta bort de flesta av supernatant. Pelleten syns inte.
    3. Tillsätt 25 μl vatten i varje brunn och värm proverna vid 95 °C i 10 min.
    4. Tillsätt 5 μL 2 mg/ml nyspädd proteinas K till varje brunn i 1 h och inkubera vid 56 °C. Värm sedan provet i 10 min vid 95 °C för att inaktivera proteinasen K.
    5. Använd 10 μl celllyst blandning per PCR-reaktion. Lyserter ska användas inom 24 timmar.

10. Andra omgången PCR för index barcoding och sekvensering

  1. Späd produkterna från den första omgången PCR till 40 pg/μL.
  2. Ställ in en PCR per prov (använd guiden i tabellerna 7 och 8). Användningen av en high-fidelity polymeras är viktigt att minimera fel som införts av polymeras under sgRNA förstärkning.
  3. Lös 5 μl PCR-produkter på en 2% (w/v) agarosgel. Ett enda tydligt band på ~330 bps bör observeras.
  4. Rena PCR-produkter med paramagnetiska pärlor genom att tillsätta 31,5 μl (0,7 x total volym) av resuspended pärlor till PCR-produkterna, blanda väl och ruva i 5 min vid RT.
  5. Placera röret på ett magnetställ i 3 min. Pärlorna ska fångas på sidan av plattan och lösningen ska vara klar. Ta försiktigt bort och kassera supernatanten.
  6. Tillsätt 150 μl 80% nybearberedda etanol till röret. Inkubera i 30 s, och sedan försiktigt ta bort och kassera supernatanten.
  7. Upprepa steg 13.6, denna gång med 180 μL. Sedan lufttorka pärlorna i 5 min.
  8. Ta bort röret från magneten. Elute DNA-mål från pärlor till 35 μL steril EB-buffert. Inkubera i 3 min och sätt sedan tillbaka röret i magnetstället i 3 min.
  9. Överför cirka 30 μl av supernatanten som innehåller de eluerade PCR-produkterna till ett rent rör.
  10. Sekvensera proverna på nästa generations sekvenseringsplattform. För HumanV1 gRNA-biblioteket använder du den anpassade primern som anges i tabell 4 till sekvens 19 bp.

11. Bioinformatikanalys för att identifiera receptorn och relaterade vägar

  1. Kartsekvenser från sorterad och osorterad population till referensbiblioteket med hjälp av funktionen antal mageck. Funktionen ger en råräkningsfil (tilläggstabell 1).
    OBS: Detaljerade instruktioner om installation av MAGeCK och användning av olika funktioner inom MAGeCK beskrivs i ett tidigare publicerat protokoll av Wang et al.20.
  2. Kontrollera den tekniska standarden för det kontrollbibliotek som används på skärmen.
    1. Median normalisera de råa räknen och använd ggplot2-paketet i R21 eller motsvarande programvara för att rita ett empiriskt kumulativt densitetsfunktionsområde för antalet i plasmid och kontrollera osorterade prover (figur 5A).
    2. Kör -testfunktionen för MAGeCK med hjälp av räknas från plasmidpopulationen som "kontroll" och antalet från osorterade kontrollprover som "testprov". Funktionen kommer att ge en gensammanfattningsfil (tilläggstabell 1).
    3. Öppna gensammanfattningsfilen och rita fördelningen av log-fold-changes (neg|lfc kolumn) för tidigare kategoriserade väsentliga och ouppnämbara gener22 (figur 5B).
    4. Välj betydligt utarmade gener (neg|fdr < 0.05) och utför analys av anrikningsvägar med hjälp av enrichr23-paketet eller motsvarande anrikningsförpackningar i R (figur 5C).
  3. Kör -testfunktionen för MAGeCK med standardinställning. Använd råantal från osorterat kontrollprov som "kontroll" och räknas från sorterat prov som "behandling" när analysen utförs.
  4. Öppna gensammanfattningsfilen som genereras av MAGeCK och rangordna kolumnen pos|rank i stigande ordning. Använd FDR (pos|fdr-kolumn) < 0,05 som en brytpunkt för identifiering av träffar. Receptorn rankas vanligtvis högt, ofta i första positionen.
  5. Rita resultaten för Robust-Ranking-Algorithm (RRA) för positivt urval(pos|score)i R eller motsvarande programvara (figur 5D).
  6. Välj genträffar och utför analys av anrikningsvägar med hjälp av anrikningspaketet eller motsvarande anrikningspaket i R för att identifiera de berikade vägarna.

Representative Results

Sekvenseringsdata från två representativa knockout-skärmar i genomskala för identifiering av bindningspartnern för mänskliga TNFSF9 och P. falciparum RH5 som utförs i NCI-SNU-1 respektive HEK293-celler tillhandahålls(tilläggstabell 1). Det bindande beteendet hos RH5 påverkades av både heparansulfat och dess kända receptor BSG24 (figur 3C), medan TNFRSF9 specifikt bundna till dess kända receptor TNFSF9 och inte förlora bindande vid preincubation med lösliga heparin. Protein 3 i figur 3B representerar TNFRSF9.

För båda cellinjerna tillhandahålls också fördelningen av gRNA i kontrollmutantbiblioteket efter 3 dagar (9, 14 och 16 dagar efterfördduktion)(tilläggstabell 1). GRNA-distributionen visade att bibliotekets komplexitet bibehölls under hela experimentet (figur 5A). Den genetiska skärmen för identifiering av ligand för TNFSF9 utfördes på dag 14 posttransduktion, medan det för RH5 utfördes dag 9 posttransduktion. Skärmarnas tekniska kvalitet bedömdes genom att man undersökte fördelningen av observerade vikförändringar av gRNAs som var inriktade på en referensuppsättning av oskärutansgener jämfört med fördelningen för referensuppsättning av väsentliga gener22 (figur 5B). Dessutom visade anrikning på vägnivå att förväntade väsentliga vägar identifierades och berikades avsevärt i populationen "drop-out" när kontrollprovet jämfördes med det ursprungliga plasmidbiblioteket. Ett exempel med prov för dag 14 NCI-SNU-1 visas i figur 5C.

Fördelningen av gRNAs i kontroll kontra sorterad population med hjälp av -testfunktionen av MAGeCK (se kompletterande tabell 1 för gensammanfattningsutdata från MAGeCK) användes för att identifiera receptorn från fenotypiska skärmar. Den modifierade RRA-poäng som rapporterats av MAGeCK i gennivåanalysen plottas mot de gener som rangordnas efter p-värden. RRA-poängen i MAGeCK ger ett mått där gRNAs rankas konsekvent högre än väntat. På skärmen för TNFRSF9 var den översta träffen TNFSF9, som är en känd bindande partner till TNFRSF9 (Figur 5D). Dessutom identifierades också ett antal gener relaterade till TP53-vägen. När det gäller RH5 identifierades också ytterligare en gen (SLC16A1),utöver den kända receptorn(BSG)och den gen som krävs för produktion av sulfaterade GAGs(SLC35B2)(figur 5E). SLC16A1 är ett förkläde som krävs för handel BSG till ytan av cellerna25. Tillsammans visar dessa resultat skärmens förmåga att identifiera direkt interagerande receptorer och de cellulära komponenter som krävs för att receptorn ska uttryckas på cellernas yta i funktionell form.

Figure 1
Figur 1: Översikt över den genetiska screeningmetoden för att identifiera cellytceptorer. Denna analys består av tre huvudsteg: För det första uttrycks rekombinanta proteiner som representerar ectodomain av cellytceptorer i en cellinje som kan lägga till strukturellt kritiska posttranslationala modifieringar som HEK293-celler. Monomeric protein ectodomains oligomerized genom konjugating till streptavidin-PE att öka deras bindande avidity. För det andra används dessa ivrigsonder i cellulära bindningsanalyser där ljus färgning på cellinjerna indikeras av en framträdande förändring i PE-fluorescens (i grönt) jämfört med ett negativt kontrollprotein (i svart) visar närvaron av en cellytbindningspartner. För det tredje väljs receptorpositiva Cas9-uttryckande cellinjer ut och genomskalasscreening med gRNAs som riktar sig mot de allra flesta proteinkodande gener utförs. Samtidigt som du genererar mutanta bibliotek är det vanligt att använda 30% transduktionseffektivitet, som baseras på Poisson-distributionssannolikheten som säkerställer att varje cell får ett enda gRNA så att den resulterande fenotypen tillskrivs en specifik knockout. BFP-markören som uttrycks av de transducerade cellerna används för att välja celler som innehåller gRNAs med FACS. Fenotypiska skärmar utförs mellan 9-16 dagar posttransduktion. På skärmens dag är den totala mutanta cellpopulationen uppdelad i två. Ena halvan hålls som kontrollpopulationen och den andra hälften väljs för rekombinant proteinbindning. Cellerna från det muterade biblioteket som inte längre kan binda det rekombinanta proteinet sorteras med FACS och anrikningen av gRNAs i den sorterade kontra kontrollpopulationen används för att identifiera gener som krävs för cellytans bindning av den märkta ivrigsonden. Steg i protokollet som kräver avsevärd tid anges. Denna siffra har ändrats från Sharma et al.19. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Fastställa förhållandet mellan biotinylerat protein och streptavidin-PE med hjälp av en ELISA-baserad metod. Ett exempel på streptavidin-PE konjugation strategi som används för att generera en ivrig sond från en biotinylated monomerumärt protein. En utspädning serie biotinylated monomers inkuberades mot en fast koncentration av streptavidin. Den minsta utspädning vid vilken inga överskott av biotinylerade monomerer kan detekteras bestämdes av ELISA. ELISA utfördes med eller utan att föregripa en rad proteinutspädningar med 10 ng streptavidin-PE. I närvaro av streptavidin-PE beräknades den minsta utspädning vid vilken ingen signal identifierades (inringad svart) och den mängd protein som krävs för mättnadslösningen för att generera en 10x stamlösning med 4 μg/ml streptavidin-PE. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Representativ bindning av proteiner till cellinjer. (A)Proteinbindning till cellinjer hade en tydlig ökning av cellrelaterad fluorescens jämfört med kontrollprovet. Värmebehandling (80 °C för 10 min) av rekombinant protein upphävde alla bindning tillbaka till en negativ kontroll, vilket visar att det bindande beteendet var beroende av korrekt vikta protein. (B)Olika klasser av proteinbindande beteende till cellytor; beroendet av god redovisningsständigsständig. Från vänster till höger kan proteinerna delas in i tre typer: Protein typ 1 endast adsorbs till HS. Dessa proteiner förlorar sin bindning efter preincubation med heparin koncentrationer över 0,2 mg/ml. Protein typ 2 binder till HS utöver en specifik receptor. Dessa proteiner förlorar partiell bindning i förblockeringsexperimenten. Proteintyp 3 binder inte HS. Dessa proteiner förlorar inte bindning jämfört med föräldralinjer. (C)Ett exempel på ett protein (dvs. RH5) som binder till HS och en specifik receptor på ett tillsatssätt. Inriktning antingen receptorn (dvs BSG) eller enzymer som krävs för HS-syntes (t.ex. SLC35B2, EXTL3) minskar endast delvis bindningen av RH5 till celler i förhållande till kontroller. Transduced polyklonala linjer kan användas i sådana experiment för att fastställa bindande beteende. Denna siffra har ändrats från Sharma et al.19. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Bild 4: Välja klonala cellinjer med hög Cas9-aktivitet. Genomredigeringseffektiviteten hos både polyklonala och klonade linjer av NCI-SNU-1-cellinjer bedömdes med hjälp av GFP-BFP-reportersystemet, där cellinjer har införlivats med virus med ett gRNA-målande plasmidkodat GFP eller utan (dvs. "tom"). Ett schema avbildas. Flöde cytometri användes för att testa både BFP och GFP uttryck efter transduktion och jämfört med oinfekterade kontroll. GFP-uttryck användes som proxy för Cas9-aktivitet, medan BFP-uttryck markerade transducerade celler. Profilen för oinfekterade och tomma infekterade celler såg liknande för alla kloner. Representativa profiler visas i den vänstra panelen. Alla fem kloner av NCI-SNU-1 cellinjen visade en högre förlust av GFP jämfört med polyklonal linje (höger panel), med klon 4 visar den högsta effektiviteten med den lägsta eldfasta befolkningen. Denna siffra har ändrats från Sharma et al.19. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: Representativa resultat från genetiska skärmar för identifiering av cellytans bindningspartner. (A)Kumulativa fördelningsfunktionsområden som jämför gRNA-förekomst i plasmidbiblioteket med de muterade biblioteken i HEK-293-E- och NCI-SNU-1-celler dag 9, 14 och 16 dagar eftertransduktion. För ett visst tal rapporterar funktionen kumulativ densitet procentandelen datapunkter som låg under tröskelvärdet. Den lilla förskjutningen av den muterade cellpopulationen jämfört med den ursprungliga plasmidpopulationen representerar utarmningen i en delmängd av gRNA jämfört med plasmidbiblioteket. ( B)Fördelning av stock-fold förändringar i gener som tidigare har kategoriserats som väsentliga (röd) eller icke väsentliga (svart) i HEK293 och NCI-SNU-1 cellinjer. Fördelningen av vik-förändringar för icke väsentliga gener centrerad på ~ 0, medan det för viktiga gener flyttas till vänster mot negativa gånger förändringar. (C)Signifikant berikade vägar i gener utarmat i NCI-SNU-1 mutant kontrollpopulation 14 dagar posttransduktion. Förväntade kända cell-väsentliga vägar identifierades. (D)Robust Rank Algorithm (RRA)-poäng för gener som berikades i de sorterade cellerna som hade förlorat förmågan att binda TNFRSF9-sonden. Gener rankades enligt RRA-poängen. Den kända interaktionspartnern TNFSF9 och gener relaterade till TP53-vägen (märkt i rött) identifierades på skärmen. (E) Rank-beställt RRA-poäng för gener som identifierats från gRNA anrikning analys som krävs för RH5 bindning till HEK293 celler (vänster panel). SLC35B2 och SLC16A1 identifierades inom en tröskel för falsk identifieringshastighet (FDR) på 5 %. Två ytterligare gener i HS biosyntes utbildningsavsnitt (dvs EXTL3 och NDST1) identifierades inom FDR av 25%. Schematisk som visar den allmänna GAG biosyntesen väg med relevanta gener mappas till motsvarande steg (panel 2). Gener som krävs för åtagandet att kondroitinsulfatbiogenes (dvs. CSGALNACT1/2)identifierades inte på skärmen. Denna siffra har ändrats från Sharma et al.19. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Plasmid namn Plasmiden # Använda
Protein uttryck konstruktion: CD200RCD4d3 +4-bio-linker-hans Addgene: 36153 Produktion av rekombinant protein med CD4d3 +4, biotin och 6-his taggar.
pMD2.G Addgene: 12259 VSV-G kuvert uttrycker plasmid; produktion av lentivirus
psPAX2 (på andra) Addgene: 12260 Lentiviral förpackning plasmid, produktion av lentivirus
Cas9-konstruera: pKLV2-EF1a-Cas9Bsd-W Addgene: 68343 Produktion av konstituerande uttrycker Cas9 linje
gRNA-uttryckskonstruktion: pKLV2-U6gRNA5(BbsI)-PGKpuro2ABFP-W Addgene: 67974 CRISPR gRNA-uttrycksvektor med förbättrad byggnadsställning och puro/BFP-markörer
Mänskligt förbättrat genomomfattande Knockout CRISPR-bibliotek Addgene: 67989 Ett gRNA-bibliotek mot 18 010 mänskliga gener, utformat för användning i lentivirus.
GFP-BFP konstruktion: pKLV2-U6gRNA5(gGFP)-PGKBFP2AGFP-W Addgene: 67980 Cas9 aktivitet reporter med BFP och GFP.
Tom konstruktion: pKLV2-U6gRNA5(tom)-PGKBFP2AGFP-W Addgene: 67979 Cas9 aktivitet reporter (kontroll) med BFP och GFP.

Tabell 1: Plasmider som används i detta tillvägagångssätt.

Buffertnamn Komponenter
HBS (10X) 1,5 M NaCl och 200 mM HEPES i MiliQ vatten, justera till pH 7,4
PBS (10X) 80 g NaCl, 2 g KCl, 14,4 g Na2HPO4 och 2,4 g KH2PO4 i MiliQ vatten, justera till pH 7.4
Natriumfosfatbuffert (80mM-lager) 7,1 g Na2HPO4.2H2O, 5,55 g NaH2PO4, justera till pH 7.4
Bindningsbuffert för hans rening 20 mM natriumfosfatbuffert, 0,5 M NaCl och 20 mM Imidazol, justera till pH 7,4
Hans-rening eluering buffert 20 mM natriumfosfatbuffert, 0,5 M NaCl och 400 mM Imidazol, justera till pH 7,4
Buffert för ditanolamin 10% dietatanolamin och 0,5 mM MgCl2 i MiliQ vatten, justera till pH 9.2:
D10 (på) DMEM, 1% penicillin-streptomycin (100 enheter/ml) och 10% värme inaktiverad FBS

Tabell 2: Buffertar som krävs för denna studie.

Komponenter 10 cm maträtt 6-brunnsplatta
293FT celler 70–80% konfluent 70–80% konfluent
Transfection kompatibla medier (Opti-MEM) (Steg 5.1.2) 3 ml 500 μl
Transfection kompatibla medier (Opti-MEM) (Steg 5.1.4) 5 ml 2 ml
Lentiviral överföringsvektor 3 μg 0,5 μg
psPax2 (se tabell 1) 7,4 μg 1,2 μg
pMD2.G (se tabell 1) 1,6 μg 0,25 μg
PLUS-reagens 12 μl 2 μl
Lipofectamin LTX 36 μl 6 μl
D10 (Steg 7.1.7) 5 ml 1,5 mL
D10 (steg 7.1.8 och 7.1.10) 8 ml 2 ml

Tabell 3: Mängder och volymer av reagenser för lentivirusförpackningsblandning.

Tabell 4: Primersekvenser för förstärkning av gRNA och NGS. Klicka här för att se den här filen (Högerklicka för att ladda ner).

Reagens Volym per reaktion Master mix (x38)
Q5 Hot Start High-Fidelity 2x 25 μl 950 μl
Primer (L1/U1) blandning (10 μM vardera) 1 μl 38 μl
Genomiskt DNA (1 mg/ml) 2 μl 72 μl
H2O 22 μl 1100 μl
Totala 50 μl 1900 μl

Tabell 5: PCR för förstärkning av gRNAs från hög komplexitet prover.

Cykelnummer Denaturera Glödgning Förlängning
1 98 °C, 30-talet
2-24 98 °C, 10s 61 °C, 15s 72 °C, 20-talet
25 72 °C, 2 min

Tabell 6: PCR-villkor för den första PCR.

Reagens Volym per reaktion
KAPA HiFi HotStart ReadyMix 25 μl
Primer (PE1.0/index primer) mix (5 μM vardera) 2 μl
Första PCR-produkten (40 pg/μL) 5 μl
H2O 18 μl
Totala 50 μl

Tabell 7: PCR för indexmärkning av sgRNAs från genetiska skärmar.

Cykelnummer Denaturera Glödgning Förlängning
1 98 °C, 30-talet
2-15 98 °C, 10s 66 °C, 15s 72 °C, 20-talet
16 72 °C, 5 min

Tabell 8: PCR-villkor för andra PCR.

Supplementary Figure 1
Kompletterande figur S1: En guide till att rita grindar för sortering av den icke-bindande populationen. (A) En idealisk proteinkandidat för screening bör ha en tydlig förskjutning av bindningspopulationen jämfört med kontrollpopulationen och bindningen bör behållas på celler som saknar maskiner för HS-biosyntes. Ett heparinblockeringsexperiment kan användas i stället för testning på SLC35B2 riktade cellinjer. B) Celler som saknade ytfärgning från proteinet ectodomain men som uttrycker BFP-fluorescens från lentiviral transduktion samlades in. De celler som visas är från en skärm för identifiering av receptor för GABBR222. Denna siffra har ändrats från Sharma et al.19. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Supplementary Figure 2
Kompletterande figur S2: Cellyta glykoprotein transkriptomik baserad PCA tomt med RNA-seq data från över 1000 cancer cellinjer. Cellinjer från Cell Model Passport27 var klustrade med K-medel klustring enligt FPKM-värdena på ~1 500 cellytaglykoproteiner. Representativa cellinjer från varje kluster är märkta. Kluster 5 bestod helt av cellinjer av hematopoietiskt ursprung (se även tilläggstabell 2). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Supplementary Figure 3
Kompletterande figur S3: Essentialitetspoäng för KEGG-anteckning proteinexport och N-linked glykosylering gener från projektresultat. Justerade Bayes-essentialitetspoäng för ~330 cellinjer (kolumner, ej märkta) ritas för gener av proteinexport och N-linked glykosyleringsväg (X-axeln). Poäng högre än 0 representerar betydande utarmning i den muterade befolkningen jämfört med den ursprungliga plasmid biblioteket. Generna kan delas in i tre olika kluster som representerar olika nivåer av väsentlighet i cellinjerna. Den här klustringen kan användas för att bestämma dagen för sortering. Om skärmen utförs vid en sen tidpunkt (dag 16) är det möjligt att gener som är kända för att vara väsentliga för celler (kluster 1 och 3) inte kommer att identifieras. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Tilläggstabell 1: Raw-räknefiler för och MAGeCK-programvara som genereras gene_summary filer relaterade till de representativa genetiska skärmarna. Klicka här för att se den här filen (Högerklicka för att ladda ner).

Tilläggstabell 2: Klustring av cellinjer enligt uttryck för cellytceptorer. Klicka här för att se den här filen (Högerklicka för att ladda ner).

Discussion

En CRISPR-baserad screeningstrategi för att identifiera gener som kodar cellulära komponenter som är involverade i cellulär igenkänning beskrivs. Ett liknande tillvägagångssätt med CRISPR-aktivering ger också ett genetiskt alternativ för att identifiera direkt interagerande receptorer av rekombinanta proteiner utan att behöva generera stora proteinbibliotek26. En stor fördel med detta tillvägagångssätt är dock att det är tillämpligt på interaktioner medierade av ytmolekyler som inbyggt visas på cellen och inte beror på överuttryck av receptorer, vilket kan påverka receptorns bindande aviditet. Till skillnad från andra metoder, därför gör denna teknik inga antaganden om biokemisk natur eller cellbiologi av receptorerna och ger en möjlighet att studera interaktioner medierad av proteiner som normalt är svåra att studera med hjälp av biokemiska metoder, såsom mycket stora proteiner, eller de som korsar membranet flera gånger eller bildar komplex med andra proteiner, och andra molekyler än proteiner såsom glykaner, glykolipider och fosfolipider. Med tanke på metodens genomskalaskaraktär har detta tillvägagångssätt också fördelen att inte bara identifiera receptorn utan även ytterligare cellulära komponenter som krävs för den bindande händelsen, vilket ger insikter i receptorns cellbiologi.

En av de viktigaste begränsningarna med denna metod när du använder den för att identifiera receptorn för ett särläkemedel protein är det ursprungliga kravet att först identifiera en cellinje som binder till proteinet. Detta är inte alltid lätt och identifiera en cellinje som visar en bindande fenotyp som också är tillåtande för genetiska skärmar kan vara det tidsbegränsande steget för att distribuera denna analys. Vissa cellinjer tenderar att binda till fler proteiner än andra. Detta är särskilt relevant för proteiner som binder HS, eftersom dessa proteiner tenderar att binda till någon cellinje som visar HS sidokedjor, oavsett den inhemska bindande sammanhang. Dessutom har vi observerat att uppreglering av syndekaner (dvs. proteoglykaner som innehåller HS) i cellinjer leder till ökad bindning av HS-bindande proteiner26. Detta kan vara en faktor att ta hänsyn till när du väljer cellinjen för screening. Men också viktigt att notera är att tillsatsbindningen av HS inte stör bindningen till en specifik receptor. Detta innebär att om bindningen följs är det möjligt att den endast förmedlas av HS, eftersom den bindning som HS förmedlar i denna analys är additiv snarare än medberoende19. I ett sådant scenario kan heparinblockeringsmetoden identifiera sådana beteenden utan att behöva utföra en hel genetisk skärm.

En användbar resurs för att välja cellinjer är Cell Model Passport, som innehåller genomik, transkriptomik och kulturvillkorsinformation för ~1 000 cancercelllinjer27. Beroende på det biologiska sammanhanget kan celler väljas baserat på deras uttrycksprofiler. För att underlätta valet av cellinjer, grupperade vi ~ 1.000 cellinjer i Cell Modell Passport enligt uttrycket ~1.500 föranmälda mänskliga cellen yta glykoproteiner28 (Kompletterande figur 2; kluster information för varje cellinje tillsammans med tillväxtvillkor finns i kompletterande tabell 2). Vid testning av bindning av ett protein med okänd funktion är det användbart att välja en panel av representativa cellinjer från varje kluster för att öka risken för att täcka ett brett spektrum av receptorer. Med tanke på ett val, rekommenderas att välja cellinjer som är lätta att odla och lätt att transduce. Eftersom dessa cellinjer kommer att användas vid genomskalasscreening är det bättre att de lätt kan odlas i stora mängder och är tillåtande förlentiviral transduktion, eftersom det är den vanligaste metoden för leverans av sgRNA för CRISPR-baserad genetisk screening i de senare stegen.

I allmänhet utförs fenotypvalen i en enda sort. Detta bestäms dock av ljusstyrkan hos den färgade cellpopulationen jämfört med kontrollen. Iterativa urvalsrundor kan antas för scenarier där signal-brus-förhållandet mellan den önskade fenotypen är låg, eller när syftet med skärmen är att identifiera mutanter som har starka fenotyper. När du använder en iterativ urvalsmetod för FACS-baserade skärmar är det viktigt att tänka på att sorteringsprocessen kan orsaka celldöd, främst på grund av sorterarens blotta kraft. Således kommer inte alla insamlade celler att representeras i nästa sortningsrunda.

Bibliotekskomplexitet är en mycket viktig faktor för att utföra framgångsrika genetiska skärmar, särskilt för negativa urvalsskärmar eftersom omfattningen av utarmning i dessa endast kan bestämmas genom att jämföra resultaten med vad som fanns i startbiblioteket. För negativa urvalsskärmar är det vanligt att behålla bibliotek med 500-1 000 x komplexitet. Positiva urvalsskärmar är dock mer robusta för biblioteksstorlekar, eftersom endast ett litet antal mutanter i sådana skärmar förväntas väljas för en viss fenotyp. Därför, i den positiva urvalsskärmen som beskrivs här, kan bibliotekets storlek minskas till 50-100x komplexitet utan att kompromissa med skärmens kvalitet. Dessutom, i dessa skärmar är det också möjligt att använda ett kontrollbibliotek för en viss cellinje på en viss dag som en "allmän kontroll" för alla prover sorterade på dagen för den angivna cellinjen. Detta minskar antalet kontrollbibliotek som behöver produceras och sekvenseras.

En annan viktig faktor för att använda detta tillvägagångssätt är begränsningarna av förlust av funktion skärmar för att identifiera gener som är nödvändiga för in vitro-celltillväxt. Tidpunkten för skärmarna är avgörande i detta avseende, eftersom ju längre de muterade cellerna hålls i kultur, desto högre är sannolikheten att celler med mutationer i viktiga gener blir olönsam och inte längre representeras i mutantbiblioteket. De senaste genetiska skärmarna som utförs som en del av project score-initiativet i över 300 cellinjer visar att flera gener i KEGG-kommenterade proteinsekretion och N-glykosyleringsväg ofta identifieras som nödvändiga för ett antal cellinjer(tilläggsbild 3)29. Detta kan beaktas vid utformningen av skärmar om effekten av gener som krävs för spridning och livskraft ska undersökas i samband med cellulär igenkänningsprocess. I detta fall skulle det i allmänhet vara lämpligt att utföra skärmar vid en tidig tidpunkt (t.ex. posttransduktion dag 9). Men om metoden används för att identifiera några mål med starka storlekseffekter snarare än allmänna cellulära vägar, kan det vara lämpligt att utföra skärmar vid en senare tidpunkt (t.ex. dag 15-16 posttransduktion).

Resultaten från screeningen är mycket robusta. i åtta rekombinanta proteinbindningsskärmar som utförts tidigare var cellytans receptor den översta träffen i varje fall19. När man använder denna metod för att identifiera interaktionspartnern bör man därför förvänta sig att receptorn och de faktorer som bidrar till dess presentation på ytan identifieras med högt statistiskt förtroende. När skärmen utförs och en träff valideras med hjälp av en enda gRNA knockout, ytterligare uppföljningar kan utföras med hjälp av befintliga biokemiska metoder såsom AVEXIS4 och direkt mättnad bindning av renade proteiner med hjälp av ytan plasmon resonans. Den metod som beskrivs här är tillämplig för alla proteiner för vilka det är möjligt att generera en löslig rekombinant bindningssond.

Sammanfattningsvis är detta en genomskalad CRISPR knockout-metod för att identifiera interaktioner som medierats av cellytproteiner. Denna metod är i allmänhet tillämplig för att identifiera cellulära vägar som krävs för att igenkänna cellytan i ett brett spektrum av olika biologiska sammanhang, bland annat mellan en organisms egna celler (t.ex. neurala och immunologiska erkännanden), samt mellan värdceller och patogenproteiner. Denna metod ger ett genetiskt alternativ till biokemiska metoder avsedda för receptoridentifiering, och eftersom det inte kräver några tidigare antaganden om den biokemiska naturen eller cellbiologi receptorerna har stor potential att göra helt oväntade upptäckter.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av Wellcome Trust grant nummer 206194 som tilldelades GJW. Vi tackar Cytometry Core anläggningen: Bee Ling Ng, Jennifer Graham, Sam Thompson, och Christopher Hall för hjälp med FACS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-mouse alkaline phosphatase Sigma A4656
Blasticidin Chem-Cruz SC-204655
Blood & Cell Culture DNA Maxi Kit Qiagen 13362
BSA Sigma A9647-100G
Diethanolamine Sigma 398179
DMEM Gibco 31966-021
Dneasy Blood and Tissue kit Qiagen 69504
DynaMag-96 Side Magnet Invitrogen 12331D
HEK293T packaging cells ATCC CRL-3216
Heparin Sigma H4784-1G
KAPA HiFi HotStart ReadyMix Kapa KK2602
Lipofectamine LTX with PLUS reagent Invitrogen 15338100
MoFlo XDP cell sorter BD
Ni2+-NTA agarose beads Jena Bioscience AC-501-25
OPTI-MEM Life Technologies 31985-070
OX-68 antibody AbD Serotec MCA1022R
p-nitrophenyl phosphate Sigma 1040-506
PD-10 desalting columns GE healthcare 17085101
Polybrene Millipore TR-1003-G
Polypropylene tubes with 5 mL bed volume Qiagen 34964
Proteinase K, recombinant, PCR Grade Roche 3115879001
Puromycin Gibco A11138-03
Q5 Hot Start High-Fidelity 2× Master Mix NEB M0494L
QIAquick PCR purification kit Qiagen 28104
SCFA filter Nalgene 190-2545
Sony Cell sorter Sony
SPRI beads (Agencourt AMPure XP beads) Beckman A63881
Streptavidin-coated microtitre plates Nalgene 734-1284
Streptavidin-PE Biolegend 405204

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wright, G. J. Signal initiation in biological systems: the properties and detection of transient extracellular protein interactions. Molecular bioSystems. 5 (12), 1405-1412 (2009).
  2. van der Merwe, P. A., Barclay, A. N. Transient intercellular adhesion: the importance of weak protein-protein interactions. Trends in Biochemical Sciences. 19 (9), 354-358 (1994).
  3. Wood, L., Wright, G. J. Approaches to identify extracellular receptor-ligand interactions. Current Opinion in Structural Biology. 56, 28-36 (2019).
  4. Bushell, K. M., Söllner, C., Schuster-Boeckler, B., Bateman, A., Wright, G. J. Large-scale screening for novel low-affinity extracellular protein interactions. Genome Research. 18 (4), 622-630 (2008).
  5. Visser, J. J., et al. An extracellular biochemical screen reveals that FLRTs and Unc5s mediate neuronal subtype recognition in the retina. eLife. 4, e08149 (2015).
  6. Özkan, E., et al. An extracellular interactome of immunoglobulin and LRR proteins reveals receptor-ligand networks. Cell. 154 (1), 228-239 (2013).
  7. Martinez-Martin, N., et al. An Unbiased Screen for Human Cytomegalovirus Identifies Neuropilin-2 as a Central Viral Receptor. Cell. 174 (5), 1158-1171 (2018).
  8. Bianchi, E., Doe, B., Goulding, D., Wright, G. J. Juno is the egg Izumo receptor and is essential for mammalian fertilization. Nature. 508 (7497), 483-487 (2014).
  9. Mullican, S. E., et al. GFRAL is the receptor for GDF15 and the ligand promotes weight loss in mice and nonhuman primates. Nature Medicine. 23 (10), 1150-1157 (2017).
  10. Turner, L., et al. Severe malaria is associated with parasite binding to endothelial protein C receptor. Nature. 498 (7455), 502-505 (2013).
  11. Frei, A. P., et al. Direct identification of ligand-receptor interactions on living cells and tissues. Nature Biotechnology. 30 (10), 997-1001 (2012).
  12. Sobotzki, N., et al. HATRIC-based identification of receptors for orphan ligands. Nature Communications. 9 (1), 1519 (2018).
  13. Sharma, S., Petsalaki, E. Application of CRISPR-Cas9 Based Genome-Wide Screening Approaches to Study Cellular Signalling Mechanisms. International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), (2018).
  14. Gebre, M., Nomburg, J. L., Gewurz, B. E. CRISPR-Cas9 Genetic Analysis of Virus-Host Interactions. Viruses. 10 (2), (2018).
  15. Zotova, A., Zotov, I., Filatov, A., Mazurov, D. Determining antigen specificity of a monoclonal antibody using genome-scale CRISPR-Cas9 knockout library. Journal of Immunological Methods. 439, 8-14 (2016).
  16. Puschnik, A. S., Majzoub, K., Ooi, Y. S., Carette, J. E. A CRISPR toolbox to study virus-host interactions. Nature Reviews. Microbiology. 15 (6), 351-364 (2017).
  17. Kerr, J. S., Wright, G. J. Avidity-based extracellular interaction screening (AVEXIS) for the scalable detection of low-affinity extracellular receptor-ligand interactions. Journal of Visualized Experiments. (61), e3881 (2012).
  18. Tzelepis, K., et al. A CRISPR Dropout Screen Identifies Genetic Vulnerabilities and Therapeutic Targets in Acute Myeloid Leukemia. Cell Reports. 17 (4), 1193-1205 (2016).
  19. Sharma, S., Bartholdson, S. J., Couch, A. C. M., Yusa, K., Wright, G. J. Genome-scale identification of cellular pathways required for cell surface recognition. Genome Research. 28 (9), 1372-1382 (2018).
  20. Wang, B., et al. Integrative analysis of pooled CRISPR genetic screens using MAGeCKFlute. Nature Protocols. 14 (3), 756-780 (2019).
  21. R Core team. A language and environment for statistical computing. , http://www.R-project.org (2013).
  22. Hart, T., et al. Evaluation and Design of Genome-Wide CRISPR/SpCas9 Knockout Screens. G3. 7 (8), 2719-2727 (2017).
  23. Kuleshov, M. V., et al. Enrichr: a comprehensive gene set enrichment analysis web server 2016 update. Nucleic Acids Research. 44 (W1), W90-W97 (2016).
  24. Crosnier, C., et al. Basigin is a receptor essential for erythrocyte invasion by Plasmodium falciparum. Nature. 480 (7378), 534-537 (2011).
  25. Kirk, P., et al. CD147 is tightly associated with lactate transporters MCT1 and MCT4 and facilitates their cell surface expression. The EMBO Journal. 19 (15), 3896-3904 (2000).
  26. Chong, Z. S., Ohnishi, S., Yusa, K., Wright, G. J. Pooled extracellular receptor-ligand interaction screening using CRISPR activation. Genome Biology. 19 (1), 205 (2018).
  27. van der Meer, D., et al. Cell Model Passports-a hub for clinical, genetic and functional datasets of preclinical cancer models. Nucleic Acids Research. 47 (D1), D923-D929 (2019).
  28. Bausch-Fluck, D., et al. A mass spectrometric-derived cell surface protein atlas. PloS One. 10 (3), e0121314 (2015).
  29. Behan, F. M., et al. Prioritization of cancer therapeutic targets using CRISPR-Cas9 screens. Nature. 568 (7753), 511-516 (2019).

Tags

Genetik utgåva 160 CRISPR/Cas9 rekombinanta proteiner cellvidhäftning cellytoror genomskalasscreening extracellulära proteininteraktioner
Cell Surface Receptor Identification Med hjälp av genomskala CRISPR/Cas9 Genetiska skärmar
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sharma, S., Wright, G. J. Cell… More

Sharma, S., Wright, G. J. Cell Surface Receptor Identification Using Genome-Scale CRISPR/Cas9 Genetic Screens. J. Vis. Exp. (160), e60803, doi:10.3791/60803 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter