Summary
우리는 냉동 된 조직에 다중 스펙트럼 이미징을 수행하는 빠른 염색 방법을 설명합니다.
Abstract
포르말린 고정 파라핀 임베디드(FFPE) 조직에 대한 다스펙트럼 형광 이미징을 통해 단일 조직 샘플에서 여러 마커를 검출할 수 있어 마커의 항원 공발 및 공간 분포에 대한 정보를 제공할 수 있습니다. 그러나, 포르말린 고정 조직에 적합한 항체의 부족은 검출될 수 있는 마커의 성질을 제한할 수 있다. 또한, 염색 방법은 시간이 많이 걸립니다. 여기에서 우리는 동결된 조직에 다중 스펙트럼 형광 화상 진찰을 능력을 발휘하는 급속한 방법을 기술합니다. 이 방법은 사용되는 형광공 조합, 마우스 및 인간 냉동 조직의 염색을 위한 상세한 단계, 및 스캐닝, 획득 및 분석 절차를 포함한다. 염색 분석을 위해 시판되는 반자동 다스펙트럼 형광 이미징 시스템이 사용됩니다. 이 방법을 통해, 단일 냉동 조직 섹션에서 최대 6개의 상이한 마커를 염색하고 검출하였다. 기계 학습 분석 소프트웨어는 정량 분석에 사용될 수 있는 표현형 세포를 표현할 수 있다. 동결 된 조직에 대해 여기에 설명된 방법은 FFPE 조직에서 검출 할 수 없거나 항체가 FFPE 조직에 사용할 수없는 마커의 검출에 유용합니다.
Introduction
현미경 화상 진찰 기술에 있는 최근 어드밴스는 생물학 프로세스 및 질병 상태의 우리의 지식 그리고 이해를 현저하게 향상했습니다. 염색체 면역 조직 화학 (IHC)를 통해 조직에 있는 단백질의 situ 탐지에서는 병리학에서 일상적으로 수행됩니다. 그러나, 발색성 IHC 염색을 이용한 다중 마커의 검출은 다중 면역형광(mIF) 염색 접근법을 사용하는1가지 및 새로운 방법이며, 여기서 다중 생물학적 마커는 단일 조직 샘플에 표지되고, 개발되고 있다. 다중 생물학적 마커의 검출은 조직 구조, 세포의 공간 분포 및 항원 공생과 관련된 정보가 모두 단일 조직 샘플2에서포착되기 때문에 유용하다. 다중 스펙트럼 형광 화상 진찰 기술의 사용은 다중 생물학 마커의 검출가능하게 했습니다. 이 기술에서는, 특정 광학을 사용하여 각 개별 형광공의 형광 스펙트럼을 분리하거나 "혼합되지 않은", 어떤 스펙트럼 크로스토크 없이 다중 마커의 검출을 가능하게한다 3. 다스펙트럼 형광 이미징은 세포 생물학, 전임상 약물 개발, 임상 병리학 및 종양 면역 프로파일링4,,5,,6에서중요한 접근법이 되고 있다. 중요하게도, 면역 세포(특히 CD8 T 세포)의 공간 분포는 기존 종양을 가진 환자에 대한 예후 인자로서 작용할 수 있다7.
멀티플렉스 형광 염색에 대한 다양한 접근법이 개발되어 동시에 또는 순차적으로 수행될 수 있습니다. 동시 염색 방법에서, 모든 항체는 조직을 라벨링하는 단일 단계에서 칵테일로서 함께 첨가된다. UltraPlex 기술은 융동포극성 1차 항체의 칵테일을 사용하고, 그 다음에 는 형광공화 항체-합텐 이차 항체의 칵테일을 사용합니다. InSituPlex 기술8은 조직에 동시에 첨가되는 독특한 DNA 공액 1차 항체의 칵테일을 사용하여 증폭 단계와 최종적으로 1차 항체상에서 각각의 독특한 DNA 서열에 상보적인 플루오로포폴화 결합 프로브를 사용한다. 이 두 가지 기술은 핵 염색을 위한 4개의 마커와 4', 6-다이아미노-2-페닐린들레(DAPI)를 검출할 수 있게 합니다. 동시 멀티플렉스 염색을 위한 두 가지 다른 접근법은 이차 이온 질량분석9를기반으로 한다. 하이페리온 이미징 시스템은 이미징 질량 세포 분석10을 사용하여 최대 37개의 마커를 감지합니다. 이 기술은 금속 공액 항체의 칵테일을 사용하여 조직을 염색하고 조직의 특정 영역은 레이저에 의해 압산되어 금속 이온이 검출되는 질량 세포계로 옮겨지습니다. 또 다른 유사한 기술은 다중 이온 빔 이미징 기술11을사용하는 IONPath입니다. 이 기술은 금속 공액 항체를 제거하기 위해 레이저 대신 수정된 질량 분석 기기와 산소 이온 소스를 사용합니다. 이러한 모든 동시 멀티플렉스 염색 접근법은 여러 마커의 검출을 가능하게 하는 반면, 항체에 DNA, 합텐 또는 금속을 결합시키는 데 수반되는 비용, 절제로 인한 조직의 손실 및 혼합을 위한 광범위한 이미지 처리를 과소평가할 수 없습니다. 또한 키트 및 염색 프로토콜은 현재 FFPE 조직에서만 사용할 수 있으며 사용자 지정 패널을 개발하는 것은 추가 시간과 지출을 수반합니다.
이와 는 대조적으로 순차적 멀티플렉스 염색 방법은 하나의 마커에 항체로 조직을 라벨링하고, 항체를 제거하기 위해 스트립을 하고, 이 과정의 순차적 반복을 통해 다중마커(12)를표지하는 것을 포함한다. 티라미드 신호 증폭(TSA)은 가장 자주 사용되는 순차 적중 법입니다. 다른 두 개의 멀티플렉싱 기술은 동시 및 순차적 염색 방법의 조합을 사용합니다. CODEX 플랫폼13은 색인 된 중합 단계를 사용하여 결국 불소로 표지되는 독특한 DNA 올리고뉴클레오티드 서열에 결합된 항체의 칵테일을 채택하고 이미징, 스트립 및 반복하여 최대 50개의 마커를 검출하는 과정을 반복한다. MultiOmyx 멀티플렉스 염색 접근법14는 3~4개의 형광공형 항체의 칵테일로 염색을 반복하고, 형광을 담금질하고, 이 주기를 반복하여 단일 섹션에서 최대 60개의 마커를 검출한다. 동시 멀티플렉스 염색 방법과 유사하게 광범위한 마커를 검출할 수 있지만 염색, 이미지 수집, 처리 및 분석에 수반되는 시간은 광범위합니다. 스트리핑/담금질 단계는 가열 및/또는 조직 견본을 표백하는 관련시키고, 이렇게, 순차적인 다중 배차 염색 접근은 가열 또는 표백시 조직 무결성을 유지하는 FFPE 조직에 일반적으로 수행됩니다.
포르말린 고정 및 후속 파라핀 삽입은 임상 환경에서 용이하게 수행되고, 조직 블록은 저장이 용이하며, 여러 멀티플렉스 염색 프로토콜을 사용할 수 있다. 그러나, FFPE 조직의 처리, 포함 및 탈파화뿐만 아니라 항원회수(15)는항체가 에피토프에 더 잘 접근할 수 있는 과정은 시간이 많이 걸린다. 더욱이, FFPE 조직에 관여하는 처리는자가형광(16) 및 마스크 표적 에피토프에 기여하며, 그 결과 FFPE 조직17,,18,,19에서항원을 검출할 수 있는 항체 클론의 가변성 및 결여를 초래한다. 일례로 인간 백혈구 항원(HLA) 클래스 I Alleles20이다. 대조적으로, 조직의 스냅 동결은 항원회수(21,,22)의필요성을 우회하고, 광범위한 표적을 검출하는 데 유익하게 하기 전 또는 후에 광범위한 처리 단계를 수반하지 않는다. 따라서 다스펙트럼 형광 이미징에 냉동 조직을 사용하여 전임상 및 임상 연구를 위한 표적을 검출하는 것이 유용할 수 있습니다.
FFPE 조직을 사용할 때 위에서 언급 한 한계를 감안할 때, 우리는 다중 스펙트럼 형광 이미징이 냉동 조직에서 수행 될 수 있는지 여부를 물었다. 이 문제를 해결하기 위해, 우리는 여러 항원을 검출하기 위해 형광 공조 항체의 패널을 사용하여 동시 멀티 플렉스 염색 방법을 테스트하고 반자동 다중 스펙트럼 이미징 시스템을 사용하여 염색을 분석했다. 우리는 90 분 안에 단 하나 조직 단면도에 있는 6개의 마커까지 동시에 얼룩을 수 있었습니다.
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Protocol
마우스 비장 및 HLF16 마우스 종양조직(23)은 당사의 실험실로부터 수득되었다. 인간 편도선 조직은 상용 공급 업체로부터 구입되었습니다. 자세한 내용은 재료 표에제공됩니다.
1. 조직 포함
- OCT (최적의 절삭 온도) 용액에 신선한 조직을 포함하고 드라이 아이스 또는 액체 질소를 사용하여 동결을 스냅.
- 조직을 -80 °C에서 보관하십시오.
2. 냉동 부속
- -25 °C로 설정된 온도로 저온 극저온에서 8 μm 섹션을 잘라냅니다.
참고: 선호하는 단면 두께를 조정하여 선명한 이미지를 생성할 수 있습니다. - 충전된 유리 슬라이드에 섹션을 놓습니다.
- 10 분 동안 반학 등급 얼음 차가운 아세톤에 고정하기 전에 실온 (RT)에서 1 시간 동안 섹션을 공기 건조.
참고: 아세톤은 수용성 단백질의 응고를 일으키고 지질을 추출하지만 탄수화물 함유 성분에는 영향을 미치지 않습니다. 대조적으로, 포르말린은 대부분의 지질을 보존하고탄수화물24에거의 영향을 미치지 않습니다. 고정물의 선택은 검출되는 마커의 선택에 따라 중요합니다. - 슬라이드를 -20°C에 보관합니다.
3. 항체 및 형광단의 선택
참고: 조직 염색 전에, 아세톤 고정 조직에서 순차적 섹션 내에서 관심있는 항원을 견고하고 구체적으로 염색하는 항체 클론은 검증되어야합니다. 몇몇 항체는 상이한 고정제를 요구할 수 있고, 패널에 있는 그밖 항체와의 그들의 호환성은 또한 경험적으로 결정되어야 할 것이다. 목표는 또한 DAPI, FITC, Cy3, 텍사스 레드 및 Cy5에 대한 epifluorescence 필터로 검출될 수 있는 최소한의 중첩으로 형광단을 식별하는 것입니다.
- 공지된 발현 표적 항원을 가진 조직 단면도에서 종래의 IHC 또는 면역형광(IF) 검출에 의한 염색을 확인한다.
- 반자동 이미징 시스템에서 이용 가능한 여기 및 방출 필터 세트를 사용하고 불소-이형 1차 항체의 다양한 조합을 테스트한 후, 최소한의 스펙트럼 중첩을 가지는 플루오로포를 준비한다(예를 들어, 표 1참조).
4. 염색
참고: 조직 재수화 및 슬라이드 세차를 코플린 항아리에서 수행하였습니다. 차단 및 항체 배양 단계는 가습 슬라이드 박스에서 수행되었다.
- 슬라이드를 RT로 5-10분 동안 데워두십시오.
- 인산염 완충 식염수(PBS)에서 5분 동안 수화합니다.
- 항체로 조직을 염색하기 전에 차단 단계를 수행하십시오. 마우스 섹션의경우 RT에서 10분 동안 특수 차단 솔루션(재료 표 참조)을 사용합니다. 인간 섹션의 경우, RT에서 15분 동안 PBS에서 희석한 10% 정상 풀린 인간 혈청(NHS)을 사용하십시오.
참고: 사용할 후속 절차에 따라 섹션의 특정 속성을 보존하기 위해 필요에 따라 다른 차단 버퍼를 테스트할 수 있습니다. - 차단 후 PBS에서 5 분 동안 슬라이드를 씻으십시오.
- 멀티플렉스 염색의 경우, 미리 결정된 최적의 희석에서 호환형 형광소와 항체의 칵테일을 준비하십시오.
- 슬라이드에 불소 응고 항체의 칵테일을 추가합니다. 단일 마커 염색의 경우, 슬라이드에 1차 공액 항체만 추가합니다.
- 임의의 원발성 컨쥬게이트 항체를 첨가하지 않고 동일한 염색 절차를 거치는 제어 무스테인드 슬라이드를 포함한다.
- 어두운 RT에서 1 시간 동안 슬라이드를 인큐베이션 한 다음 슬라이드를 PBS로 2 x 로 각각 5 분 동안 씻습니다. 여기에서, 결과 슬라이드는 멀티플렉스 스테인드라고합니다.
- 역점으로, 멀티플렉스 스테인드 슬라이드에 DAPI를 추가하고 RT에서 어둠 속에서 7 분 동안 배양하고 슬라이드를 5 분 동안 PBS로 2 x 씻어. 염색이 적고 얼룩지지 않은 슬라이드에 대항하지 마십시오.
- 덮개를 덮려면 마운팅 매체를 한 방울 떨어뜨리고 유리 커버슬립을 티슈 위에 부드럽게 놓습니다.
5. 스펙트럼 라이브러리 준비
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이미지 수집
- 램프 전원을 100%로 설정합니다. 일반적으로 FFPE 조직에 대한 형광 검출은 신호 증폭 단계를 포함하기 때문에 전력은 10%로 설정됩니다.
- 현미경 작동 소프트웨어를 열어 시작합니다(재료 표참조).
- 프로토콜 편집을 선택한 다음 새 프로토콜을선택합니다.
- "프로토콜 이름"을 제공하고 이미징 모드에서 형광을 선택하고 "연구 이름"을 제공합니다.
- 단일 스테인드 슬라이드를 스테이지에 놓고 해당 형광 채널의 각 마커를 검사하여 얼룩이 있는지 확인합니다. 마커에 대한 가장 강한 신호를 발현하는 조직 상에서 영역을 선택합니다.
- 자동 초점 및 자동 노출 옵션을 사용하여 노출 시간을 조정합니다.
- 스테인드 및 스테인되지 않은 단일 슬라이드에 대한 스냅샷을 수집하여 프로토콜을 저장합니다.
참고: 다음 단계는 기계 학습 소프트웨어(재료 표참조)에서 수행되며, 단일 스테인드 및 스테인드되지 않은 슬라이드를 사용하여 특정 염색을 확인하고 항체 교차 토크를 결정합니다. - 소프트웨어의 라이브러리 빌드 탭에서 스테인드된 각 슬라이드 이미지를 로드하고 적절한 플루어를 선택한 다음 추출을클릭합니다. 소프트웨어는 형광에서 선택한 형광 신호를 자동으로 추출합니다.
- 추출된 색상을 저장하려면 저장하기 저장을 클릭합니다. "새 그룹"을 만들거나 추출된 색상을 기존 그룹에 저장할 수 있습니다.
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스펙트럼 라이브러리 확인
- 각 필터 세트에 대해 추출된 이미지의 오른쪽에 있는 방출 스펙트럼 곡선 창을 확인합니다.
참고: 추출된 신호는 불소가 검출되는 필터 세트에서만 스펙트럼 곡선이 관찰되는 경우 정확합니다. 잘못된 필터 세트에서 스펙트럼 곡선이 관찰되면 필터 세트에서 예상되는 기본 신호가 충분히 강하지 않거나 소프트웨어가 스펙트럼 중복으로 인해 너무 높은 다른 신호를 감지하고 있음을 의미할 수 있습니다. 이 경우 먼저 처리 영역 그리기 도구를 사용하여 이미지에서 형광 마커 및 자동 형광을 표현하는 영역 주변 영역을 그립니다. 이것은 실제 신호를 감지하고 간섭 신호를 제거하는 소프트웨어를 훈련시요. 이것이 작동하지 않는 경우에, 다른 항체 적정을 시험하기 위하여 단 하나 염색한 미끄럼을 위한 염색 과정을 반복합니다.
- 각 필터 세트에 대해 추출된 이미지의 오른쪽에 있는 방출 스펙트럼 곡선 창을 확인합니다.
6. 다중 스펙트럼 이미징
참고: 스펙트럼 라이브러리가 생성되고 확인되면 다중 스테인드 슬라이드에 대해 다음 단계를 수행합니다.
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전체 슬라이드 스캔
- 섹션 5.1에서 언급한 대로 멀티플렉스 스테인드 슬라이드의 초점 및 노출 시간을조정합니다.
- 슬라이드 스캔에서 새 작업을 만들고 위에 저장된 프로토콜을 선택합니다.
- 멀티플렉스 스테인드 슬라이드에서 전체 슬라이드 스캔을 수행합니다.
- 전체 슬라이드 스캔 소프트웨어를 사용하여 전체 슬라이드 스캔 이미지를 엽니다. 이 이미지는 스펙트럼적으로 혼합되지 않았습니다.
- 스탬프 또는 ROI 도구를 사용하여 전체 슬라이드 스캔 이미지에서 관심 영역(ROI)을 선택합니다. ROI 이러한 ROI는 6.1.1에 설정된 노출 시간을 사용하여 스캔하여 스펙트럼 언혼합 및 분석에 사용됩니다.
- 프로세스 슬라이드를 클릭하여 20배 배율로 ROI를 획득합니다.
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스펙트럼 혼합 해제
- ROI가 획득되면 기계 학습 소프트웨어에서 수동 분석 탭에서 파일아래에서 열기를 클릭하여 멀티플렉스 스테인드 이미지를 로드합니다.
- 스펙트럼 라이브러리 소스 드롭다운 메뉴에서 플루오르 선택을 클릭합니다.
- 새 창이 열립니다. 여기서 위에 작성된 스펙트럼 라이브러리 또는 그룹을 선택합니다.
- 스테인드되지 않은 슬라이드 이미지를 로드합니다. 선택한 스펙트럼 라이브러리 위에 있는 AF 잉크 마커 아이콘을 클릭하고 스테인되지 않은 슬라이드에 선 또는 영역을 그려 조직에서 자가형광을 식별합니다.
- 마커 및 색상 편집 탭에서 각 마커에 이름을 지정합니다. 이 단계에서 의사 색상을 지정할 수 있습니다.
참고: 자동 형광 이미지의 색상은 기본적으로 DarkSlateGray로 설정됩니다. 검은색으로 변경합니다. - 모두 준비를 클릭합니다.
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스펙트럼적으로 혼합되지 않은 이미지 확인
참고: 스펙트럼 언혼합 단계가 완료되면 모든 색상으로 구성된 합성 이미지가 만들어집니다.- 눈 보기 편집 아이콘을 클릭합니다. 여기서, "구성 요소 디스플레이"의 각 색상을 끄거나 켜서 각 개별 마커의 얼룩을 볼 수 있습니다.
- 생물학적으로 관련이 없는 한 세포의 염색과 형태를 시각적으로 검사하여 마커가 겹치지 않도록 합니다. 병리학자는 염색을 확인하는 데 도움이 될 수 있습니다.
참고: 다중슬라이드의 염색은 한 번에 하나의 형광포를 남기고 염색 패턴을 검토하여 검증되어야 합니다. 또한, 검증은 또한 항체 크로스 토크 또는 블리드스루로 인접 스펙트럼에 나타나는 강한 형광을 식별하는 데 도움이 될 것이다. - 각 형광 마커에 대해 밝은 필드 이미지를 시뮬레이션하는 병리학 보기의경우 구성 요소 이미지 선택 단추를 클릭합니다. 여기서 시뮬레이션된 브라이트필드 이미지를 보려면 마커를 선택합니다.
7. 세포 세분화 및 표현형 분석을 통한 다중 스펙트럼 이미지 분석
참고: 스펙트럼적으로 혼합되지 않은 이미지를 확인한 후 기계 학습 소프트웨어를 사용하여 셀 세분화를 수행할 수 있으며, 이 소프트웨어는 단계별 지침을 제공합니다. 조직 세분화는 여기서 수행되지 않았다. 패널이 하나 이상의 조직 특이적 마커를 포함하는 경우, 특히 조직이 지저분한 경우, 조직 세분화를 수행해야한다.
- '세그먼트' 옵션에서"세포질"및"멤브레인"을 선택합니다.
참고: "핵"은기본적으로 선택됩니다. - 패널에서 마커를 선택합니다. 핵, 세포질 또는 막을 검출하도록 마커를 구성합니다. 예를 들어, DAPI는 멤브레인에 대한 핵 및 CD3를 검출하도록 선택될 수 있다.
- 타원 버튼 ('...')을 클릭하여 "이 신호를 사용하여 "에서 옵션을선택하십시오. 예를 들어, DAPI에 대한 '핵'. 분할을 위해 패널의 여러 마커를 선택할 수 있습니다.
참고: 세포질 또는 멤브레인 마커의 경우"이 신호를 사용하여 핵 세분화를 지원하십시오"옵션을 선택합니다. - 이 소프트웨어는 이미지의 핵, 세포질 및 멤브레인에 대해 각각 마스크를 자동으로 감지하고 만듭니다.
- 모든 셀이 분할을 위해 '마스에'있는지 확인합니다. 조정하려면 7.3에서선택한 특정 마커에 대한 병리학 보기로 전환합니다. 소프트웨어의 구성 옵션을 사용합니다.
- 셀을분할하려면 "모든" 세그먼트를 클릭합니다.
- 세포 분절 후 표현형 세포를 진행합니다. 이 단계에서 는 자형질 에 필요한 마커를 선택하고 선택한 마커로 밝게 염색된 5개 이상의 셀을 수동으로 선택합니다. 이렇게 하면 소프트웨어가 이미지에서 선택한 마커로 얼룩진 모든 셀을 자동으로 감지하도록 훈련합니다.
- 표현형 맵이 작성됩니다. 마커로 염색된 세포가 올바르게 표현되었는지 분석합니다.
참고: 세포 자형질은 반복적인 과정이 될 수 있습니다. 소프트웨어가 세포를 올바르게 표현할 수 없는 경우 교육이 부적절하거나 올바르지 않다는 의미입니다. 이 경우 사용자는 수동으로 더 많은 셀을 선택하고 소프트웨어를 다시 학습하고 사용자가 교육에 만족할 때까지 이 단계를 반복해야 합니다. - "기타"라는 그룹을 만들고 마커에 대해 더러워지지 않은 셀을 포함합니다.
참고: 이 단계는 모든 얼룩지지 않은 세포를 자형질에서 제외하도록 소프트웨어를 훈련하는 것이 중요합니다.
8. 이미지 및 분석 테이블 내보내기
- 내보내기 단추를 클릭하여 설정 내보내기 패널을 봅니다.
- "내보내기 디렉토리"에서 찾아보기를 클릭하여 이미지를 내보낼 위치를 선택합니다.
- "이미지 내보내기 옵션"에서 이미지 출력 형식을 선택합니다.
- "내보낼 이미지" 목록에서 내보낼 이미지를 선택합니다. "합성 이미지"는 최종 의사 색 혼합되지 않은 이미지입니다. "병리학 보기"는 개별 시뮬레이션 된 브라이트 필드 이미지이며 "구성 요소 이미지 (다중 이미지 TIFF)"는 타사 분석 소프트웨어에서 사용할 수있는 구성 요소 데이터의 다중 이미지 TIFF 파일입니다.
- "모두내보내기"버튼을 클릭하여 이미지를 내보냅니다.
참고: 이 단계에서 분석테이블을 선택하고 내보낼 수도 있습니다.
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Representative Results
냉동 비장 섹션에서 단일 염색 마커 검출
반자동 이미징 시스템은 더 넓은 범위의 파장검출(25)을가능하게 하는 액정 튜닝 필터(LCTF) 시스템을 사용하며, 여기서 신호 증폭 단계가 수행되지 않기 때문에 현미경의 각 마커에 대한 1차 공액 항체의 검출을 먼저 최적화했습니다. 그림 1에는각 단일 염색 마커가 의사 색상의 빨간색인 예가 나와 있습니다. 여기에서 사용된 알렉사 플루어 공액 항체는 면역형광 및 유세포 측정을 위한 회사에 의해 검증되었습니다. 그러나 Per-CP-Cy5.5 형광단은 유세포 측정에 대해서만 검증됩니다. 우리는 우리의 단 하나 염색한 미끄럼틀에서 이 색깔을 검출할 수 있었습니다, 다중 스펙트럼 화상 진찰에서 사용하기 위하여 유세포 측정 검증 항체의 적합성을 지원하고 2개의 다른 기술 (즉, 유동 세포분석 및 다중 스펙트럼 화상 진찰)를 사용하여 관측을 검증하기 위하여 그 같은 항체를 사용하는 이득을 제공했습니다. 우리는 그 때 동결한 조직에 다중 스펙트럼 화상 진찰을 능력을 발휘하기 위하여 진행했습니다.
냉동 마우스 비장의 다색 형광 검출
멀티플렉스 염색 방법과 스펙트럼 이미징을 테스트하기 위해, 우리는 면역 세포가 풍부한 마우스 냉동 비장 조직을 사용했다. 도 2는 동결된 마우스 비장의 단면에서 상이한 마커의 스펙트럼 혼합되지 않은 이미지를 나타낸다. 염색에 사용되는 항체, 클론 및 농도는 표 2에기재되어 있다. 캡처된 이미지는 CD3, CD4 및 CD8 마커의 존재에 의해 확인된 T 세포 영역의 일부를 나타내며, 대부분 한계 영역에서 관찰된 CD11b를 발현하는 골수성 세포에 둘러싸여 있다. Ki67을 발현하는 증식 세포의 지구는 주로 발아 센터에서 관찰됩니다. 각 마커에 대한 "병리학 보기" 옵션은 조직 내의 개별적인 염색 패턴을 보였다. CD11b, Ki67 및 CD3, CD4 및 CD8 마커에 대한 뚜렷한 염색 패턴이 함께 관찰되었으며, 이는 멀티플렉스 염색 방법 및 스펙트럼 이미징이 냉동 조직에서 작용했음을 시사한다.
냉동 인간 편도선에 대한 다색 형광 검출
마우스 조직에 적합한 염색 패널을 테스트한 후, 우리는 냉동 인간 편도선 조직에 대한 별도의 패널을 평가했습니다. 도 3은 사용된 상이한 마커의 스펙트럼 미혼합 이미지를 나타낸다. 염색에 사용되는 항체, 클론 및 농도는 표 2에 기재되어 있다. 캡처된 이미지는 CD20 마커에 의해 확인된 B 세포를 발현하는 여포 발아센터(26)를 나타낸다. 여포 발아 센터에서 증식 세포는 Ki67에 의해 확인되었다. 이들 증식 세포 중 일부는 CD20으로 유액화되고 활성 체세포 과돌연변이를 겪는 순진한 B 세포인27세포일수 있다. 여포 발아 센터는 CD3, CD4 및 CD8의 발현에 의해 확인된 여포 간 T 세포 영역으로 둘러싸여 있었다. 다시 말하지만, 뚜렷한 염색 패턴이 여기에서 관찰되어 방법론이 냉동 조직에서 효과가 있음을 확인했습니다.
냉동 마우스 종양 조직에 다스펙트럼 형광 이미징의 적용
다중 스펙트럼 화상 진찰은 면역 요법을 위한 예후로 종양에 있는 면역 세포 침투를 감시하기 위한 유용한 공구입니다. 이를 위해, 우리는 동결된 마우스 종양 조직 견본을 얼룩지게 하고 면역 세포 침투를 검출하기 위하여 착수했습니다. HLF16 세포주는 HLA-A*0201 형질전환 마우스28에서자궁경부암의 인간 유두종 바이러스(HPV)+ 종양 모델로 사용된다. 형질전환 세포주들은 HPV16 E6 및 E7 종양유전자 및 H-Ras V1228로HLA-A*0201에서 심장 폐 섬유아세포를 트랜스펙팅하여 개발되었다. T 세포 및 종양 관련 대식세포는 종양29에존재하는 가장 흔한 면역 침윤제이다. 도 4는 병리학적 견해와 함께 동결된 HLF16 종양 섹션상에서 스펙트럼미혼합 영상을 나타낸다; 개별 염색 패턴은 보충 그림 1에나와 있습니다. 염색에 사용되는 항체, 클론 및 농도는 표 2에 기재되어 있다. 캡처된 이미지는 CD11b 마커에 의해 확인된 다른 골수성 세포 혈통의 존재와 함께 CD3 및 CD8 마커에 의해 확인된 종양 침투 T 세포의 영역을 보여줍니다. 포획된 영역은 또한Ki67+로검출된 몇몇 증식 세포와 밀접하게 연관되는 CD206마커(30)에의해 검출된 M2 표현형의 종양 관련 대식세포(TAM)를 나타낸다.
기계 학습 소프트웨어2는 조직 및 세포 분석과 같은 기능을 제공합니다. 이러한 분석은 일반적으로 신호 증폭으로 얼룩진 FFPE 조직에서 수행됩니다. 우리의 방법론은 신호 증폭을 사용하지 않기 때문에, 우리는 소프트웨어가 동결 된 조직에 얼룩을 분석하는 데 사용할 수 있는지 테스트하고 싶었다. 소프트웨어의 적응 기능을 사용하여 핵 및 멤브레인 마커를 기반으로 세포를 분할하고 염색에 사용되는 마커에 따라 세포를 표현할 수 있었습니다. 도 5는 소프트웨어에 의해 분석된 각 마커에 대한 세포 세분화 및 표현형 맵 및 염색된 세포의 수를 나타내며, 동결된 조직에 대한 다중 스펙트럼 염색의 정량화에 소프트웨어가 사용될 수 있음을 입증한다.
그림 1: 액정 튜닝 필터 현미경을 사용하여 1차 공액 항체를 검출합니다. 표시된 마커에 대한 1차 공액 항체는 동결된 마우스 비장상에 염색되었고 20x 목표 하에서 Vectra 3.0 다중 스펙트럼 이미징 시스템을 사용하여 검출하였다. 알렉사 플루어 488의 CD3, 알렉사 플루어 594의 CD8, CP당 Cy5.5의 CD11b, 알렉사 플루어 647의 CD206, 알렉사 플루어 555의 Ki67이 사용되었다. 각 마커는 의사 색 빨간색입니다. 이 슬라이드에는 카운터스테인이 사용되지 않았습니다. 배율 막대 = 20 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 동결된 마우스 비장상에 다중 스펙트럼 이미징. (A)4배 목표 하에서 찍은 멀티플렉스 스테인드 슬라이드의 전체 슬라이드 스캔. 조직의 다른 지역에 걸쳐 2 x 2 스탬프는 다중 스펙트럼 화상 진찰을 위해 선택되었습니다. 배율 막대 = 100 μm. (B)스펙트럼 언혼합 후 20배 목표 하에서 촬영한 합성 이미지. 의사 색 마커가 표시되고 빨간색 상자 내의 확대 된 이미지가 이미지 옆에 표시됩니다. 배율 막대 = 20 μm. (C)각 개별 마커에 대한 병리학 보기. 빨간색 상자 내의 각 마커에 대한 확대된 이미지가 이미지 옆에 표시됩니다. 배율 막대 = 20 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 동결된 인간 편도선상에서다중스펙트럼 영상. (A)4배 객관적으로 찍은 멀티플렉스 스테인드 슬라이드의 전체 슬라이드 스캔. 조직의 상이한 영역에 걸쳐 1 x 1 스탬프 (669 μm x 500 μm)는 다중 스펙트럼 이미징을 위해 선택되었다. 배율 막대 = 100 μm. (B)20배 목표 하에서 촬영된 스펙트럼 언혼합 후 합성 이미지. 의사 색 마커가 표시되고 빨간색 상자 내의 확대 된 이미지가 이미지 옆에 표시됩니다. 배율 막대 = 20 μm. (C)각 개별 마커에 대한 병리학 보기. 빨간색 상자 내의 각 마커에 대한 확대된 이미지가 이미지 옆에 표시됩니다. 배율 막대 = 20 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 동결된 마우스 종양에 다중 스펙트럼 화상 진찰. 다중 스펙트럼 이미징은 20x 목표 하에 촬영된 동결 마우스 HLF16 종양의 1 x 1 영역에서 수행되었다. 합성 이미지(위)입니다. 의사 색 마커가 표시되고 각 개별 마커에 대한 병리학 적 견해 (아래)가 묘사됩니다. 빨간색 상자 내의 각 마커에 대한 확대된 이미지가 원본 이미지 옆에 표시됩니다. 배율 표시줄 = 20 μm 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5: 동결된 마우스 종양 섹션의 분석. (A)셀 세분화 맵. inForm을 사용하여 적응형 세포 세분화를 수행했습니다. 이 소프트웨어는 핵(녹색) 및 멤브레인(적색)을 식별하도록 훈련되었다. (B)각 스테인드 마커에 대한 표현형 맵. 이 소프트웨어는 염색에 기초하여 표현형을 식별하도록 훈련되었다. 컬러 점은 표시된 마커를 나타냅니다. "기타"(검정)는 표시된 마커에 대해 염색되지 않은 세포를 지칭한다. (C)바 플롯(mean ±STDEV)은 2개의 다중 스펙트럼 이미지에서 각 마커에 대한 염색된 세포의 수를 나타남을 수있다. 숫자는 각 이미지에서 표현된 셀을 나타내지만 마커가 서로 표현되는지 나타내는지는 않습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 플루오로포어 | 여기 최대(nm) | 배출량 최대(nm) | 필터 세트의 예상 검색(이름) |
| 알렉사 플루어 488 | 488 | 519 | Fitc |
| 알렉사 플루어 555 | 555 | 580 | Cy3 및 텍사스 레드 |
| 알렉사 플루어 594 | 590 | 617 | 텍사스 레드 |
| 알렉사 플루어 647 | 650 | 668 | 텍사스 레드 와 Cy5 |
| DAPI | 350 | 470 | DAPI |
| 퍼CP-Cy 5.5 | 482 | 690 | Cy3, 텍사스 레드 및 Cy5 |
표 1: 최대 여기 및 방출 파장이 있는 형광단 목록과 적절한 필터 세트에서 검출이 예상됩니다.
| 냉동 마우스 비장 | |||
| 항체/염료 | 복제 | 농도(μg/mL) | |
| 알렉사 플루어 594 안티 마우스 CD8a | 53-6.7 | 10 | |
| 알렉사 플루어 488 안티 마우스 CD3 | 17A2 | 20 | |
| 알렉사 플루어 647 안티 마우스 CD4 | GK1.5 | 10 | |
| PerCP-Cy 5.5 래트 안티 CD11b | M1/70 | 2 | |
| 알렉사 플루어 555 마우스 안티 기-67 | B56 | 10 | |
| DAPI | 0.1 | ||
| 얼어붙은 마우스 종양 | |||
| 항체/염료 | 복제 | 농도(μg/mL) | |
| 알렉사 플루어 594 안티 마우스 CD8a | 53-6.7 | 20 | |
| 알렉사 플루어 488 안티 마우스 CD3 | 17A2 | 20 | |
| 알렉사 플루어 647 안티 마우스 CD206 (MMR) | C068C2 | 5 | |
| PerCP-Cy5.5 쥐 안티 CD11b | M1/70 | 1 | |
| 알렉사 플루어 555 마우스 안티 기-67 | B56 | 0.25 | |
| DAPI | 0.1 | ||
| 냉동 휴먼 편도선 | |||
| 항체/염료 | 복제 | 농도(μg/mL) | |
| 알렉사 플루어 594 안티 인간 CD3 | 우흐트1 | 10 | |
| PerCP/시아닌5.5 반인간 CD4 | RPA-T4 | 4 | |
| 알렉사 플루어 647 안티 인간 CD8a | C8/144B | 10 | |
| 알렉사 플루어 488, e바이오사이언스 안티휴먼 CD20 | L26 | 10 | |
| 알렉사 플루어 555 마우스 안티 기-67 | B56 | 1 | |
| DAPI | 0.1 | ||
표 2: 사용된 항체, 클론 및 농도 목록.
보충 도 1: 스펙트럼 언혼합 후 동결된 HLF16 종양의 개별 염색 패턴. 배율 표시줄 = 20 μm 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
냉동 조직은 MIF 이미징을 위해 광범위하게 사용되어 왔으며 전통적으로 직접 및 간접 방법32를사용하여 조직에 3~4개의마커(31)를 검출하였다. 직접적인 방법에서, 항체는 조직을 표지하기 위하여 형광 염료 또는양자점(33)에 공액되고, 반면 간접적인 방법에서는, 비공액 1차 항체는 1차 항체를 특이적으로 인식하는 형광공 결합이차 항체에 선행하여 조직을 표지하는데 사용된다. 앞서 논의된 최근의 동시 멀티플렉스 염색 접근법 중 일부는 냉동 조직을 염색하고 4개 이상의 마커를 검출하는 데에도 사용될 수 있다. 그러나 시약에 대한 비용과 염색에 소요되는 시간은 검출되는 마커의 수에 따라 집중적이 된다. 동결 된 조직에 대한 또 다른 멀티 플렉스 기술은 다중 에피토프 - 리간드 - 지도 제작 (MELC)34입니다. 기술은 불소 공액 항체, 화상 진찰 및 불소의 광표백으로 견본을 염색하는 관련시킵니다. 이 기술의 주요 주의 사항은 조직의 한 분야 또는 영역만 다중화 될 수 있다는 것입니다. 다른 필드 나 지역을 멀티 플렉스하기 위해서는 시간이 많이 걸리거나 비용이 많이 드는 자동화가 필요한 기술을 수동으로 수행해야합니다. 한그룹(35)은 직접, 간접 및 TSA 염색의 조합을 사용하여 냉동 조직에서 6가지 색상을 검출할 수 있었다. 그러나, 조직 염색은 2 일이 걸렸습니다. 이에 비해, 우리의 방법론은 90 분 이내에 냉동 조직을 염색하기 위해 5 개의 직접 공액 항체 플러스 DAPI의 칵테일을 적용하는 동시 멀티 플렉스 염색 방법을 사용합니다. 또한, 반자동 다스펙트럼 형광 이미징 시스템을 사용하여, 우리는 이 단순화된 멀티플렉스 염색 기술을 사용하여 냉동 비장, 편도선 및 종양 조직에서 6개의 마커를 분광하여 검출할 수 있었습니다. Cy3, 텍사스 레드 및 현미경에서 사용할 수 있는 Cy5 필터 세트는 추가형형광체를 검출할 수 있는 기회를 제공하므로 냉동 조직에서 동시에 검출할 수 있는 마커의 수가 증가할 수 있습니다.
FFPE 조직에 대한 TSA 접근법을 이용한 멀티플렉스 염색은 순차적 라벨링, 세척 및 스트리핑 단계에 이어 항원 회수 단계를 필요로 한다. 항체에 사용되는 배양 시간에 따라 1-2일 범위의 시술을 수행하는6. 최근, 미세유체 조직 프로세서를 사용하여, TSA 접근법을 이용한 4-플렉스 염색을 90분 미만의 FFPE 조직에서 수행되었다. FFPE 조직에 대한 다른 멀티플렉스 기술은 자동화 된 염색기를 사용하여 4-5 시간 아래에 수행 될 수 있습니다. 그러나, 적절한 항원 검색 단계는항체(36)에대한 에피토프 가용성을 보장하기 위해 최적화되어야 하며, 이는 차례로 검출되는 마커의 순서뿐만 아니라 항체 클론의 신중한 고려에 의존한다. 예를 들어, CD3의 일부 항체 클론은 이후에 CD4 및 CD8 항체가 검출되지 않기 때문에37을사용할 수 없다. 유사하게, 이용 가능한 항체 클론 들 중 항원 검출의 가변성이17,,18. 따라서 FFPE 조직의 멀티플렉스 염색은 항체 클론, 농도 및 염색 순서의 최적화가 필요하며 모두 시간이 많이 걸립니다. 대조적으로, 동결 된 조직의 광범위한 조직 처리의 부족은 높은 특이성을 가진 다양한 항체 클론의 사용을 허용합니다. 더욱이, 동결된 조직에 유효한 항체 클론은 또한 다양한 분석에 걸쳐 동시 검증을 허용하는 유세포 측정 및 ELISA에서 사용될 수 있습니다. 조직 구조는 또한 냉동 조직(38)에관한 관심사이다. 냉동 조직에 여기에 표시된 멀티플렉스 염색은 TSA 접근법보다 훨씬 빠릅니다. 형광공 조합은 항체가 서로 를 약하게 방해하지 않도록 하기 위해 마커의 신중한 선택이 필요하며, 특히 동일한 세포 위치에서 발현되는 다른 항원이 검출될 때 더욱 그렇다. 우리는 더 나은 검출을 가능하게 하는 분광으로 분리된 형광에 다른 세포를 얼룩지게 하는 마커를 선택했습니다. 항체 농도는 또한 최적화를 필요로 하지만 염색 프로토콜이 빠르기 때문에 최적화를 위해 소요되는 전체 시간은 시간이 많이 걸리지 않습니다. 우리의 방법에 주의 해야 할 조직에서 낮은 발현 마커를 감지 하는 무 능력 있을 수 있습니다. FFPE 조직에 대한 멀티플렉스 염색 접근법 중 일부는 낮은 발현 마커를 검출하는 데 유용한 신호 증폭 단계를 수반한다. 그러나, 이차 및 삼차 항체의 사용은 신호를 강화하기 위하여 이용될 수 있다. 이러한 경우 패널의 항체에 대한 교차 반응성은 결과의 잘못된 해석을 방지하기 위해 피해야 합니다.
면역 세포가 풍부한 마우스 비장 및 인간 편도선 조직 외에도, 우리는 동결 된 조직의 제안 된 다스펙트럼 형광 이미징을위한 예로 종양 조직을 사용했습니다. 종양에서의 다스펙트럼 형광 이미징은 종양 미세환경(TME)39의특성화, 악성 흑색종 40에서의 입양 T 세포 전이의 성공 예측, 종양 신호 전달경로(41)에서단백질 의 특성화와 같은 귀중한 정보를 제공했다.40 종양에서 일반적으로 발견되는 면역 세포에 특이적인 마커를 사용하여, 우리는 이 연구 결과에서 사용된 HLF16 종양 조직에 있는 CD8 T 세포 및 TAM침투를 검출할 수 있었습니다. 우리는 기계 학습 소프트웨어를 사용하여 세포를 성공적으로 분할하고 표현형했습니다. FFPE 조직을 위한 멀티플렉스 염색은 신호-잡음(SNR) 비율을 향상시키기 위해 신호 증폭 단계를 채택하여 이미지 처리 및정량화(42,,43)를돕는다. 기계 학습 소프트웨어는 신호 증폭2로얼룩진 FFPE 조직에 대한 분석에 사용되었습니다. 여기에 존재하는 방법론은 신호 증폭을 사용하지 않지만 소프트웨어를 사용하여 세포를 성공적으로 분할하고 표현형 할 수있었습니다. 추가 분석(예: 표현형 공동표현 및 공간 관계)과 정량에 대한 정확한 해석을 위해 소프트웨어 교육에는 교육 세트, 테스트 세트 및 유효성 검사 세트를 사용하여 유효성 검사가 필요합니다. 반복 프로세스에서 한 세트의 이미지(즉, 교육 세트)는 별도의 이미지 집합(예: 테스트 세트)에 대한 모델의 예측이 정확할 때까지 기계 학습 소프트웨어를 학습하여 표현형을 식별하도록 교육하는 데 사용됩니다. 교육이 완료되면 최종 이미지 배치(예: 유효성 검사 집합)를 분석하여 과다 피팅이 있었는지 확인합니다.
결론적으로, 여기에 제시된 방법론은 동결된 조직을 사용하여 다중 스펙트럼 형광 이미징을 수행하는 빠른 방법입니다. 이 방법은 항체가 사용할 수 없거나 FFPE 조직에서 검출될 수 없는 마커를 검출하는 데 유용합니다. 기계 학습 소프트웨어와 함께, 정량적 분석을 수행하는 데 걸린 시간은 신속한 전임상 및 임상 진단을 현저하게 용이하게 할 수 있으며 냉동조직(44)을이용하는 고분해능 공간 전사체 의 분야에서 적용될 수 있다.
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Disclosures
저자는 공개할 이해상충이 없습니다.
Acknowledgments
화상 진찰 및 분석 지도는 연구 자원 센터에 의해 제공되었습니다 – 연구 조직학 및 시카고에 있는 일리노이 대학에 있는 조직 화상 진찰 코어는 연구를 위한 부총장의 사무실에서 지원으로 설치했습니다. 이 작품은 NIH/NCI RO1CA11317에 의해 CLP에, NIH/NIAMS (SBDRC 교부금 1P30AR075049-01)에 의해 A. Paller 박사에게, 그리고 노스웨스턴 대학의 면역 요법 평가 코어에 로버트 H. 루리 종합 암 센터의 지원에 의해 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone (histological grade) | Fisher Scientific | A16F-1GAL | Fixing tissues |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse CD3 | BioLegend | 100212 | Clone - 17A2; primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 488, eBioscience anti-human CD20 | ThermoFisher Scientific | 53-0202-82 | Clone - L26; primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 555 Mouse anti-Ki-67 | BD Biosciences | 558617 | Primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 594 anti-human CD3 | BioLegend | 300446 | Clone - UCHT1; primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 594 anti-mouse CD8a | BioLegend | 100758 | Clone - 53-6.7; primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 647 anti-human CD8a | BioLegend | 372906 | Clone - C8/144B; primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 647 anti-mouse CD206 (MMR) | BioLegend | 141711 | Clone - C068C2; primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 647 anti-mouse CD4 Antibody | BioLegend | 100426 | Clone - GK1.5; primary conjugated antibody |
| C57BL/6 Mouse | Charles River Laboratories | 27 | Mouse frozen tissues used for multispectral training |
| Coplin Jar | Sigma Aldrich | S6016-6EA | Rehydrating and washing slides |
| DAPI Solution | BD Biosciences | 564907 | Nucleic Acid stain |
| Diamond White Glass Charged Slides | DOT Scientific | DW7590W | Adhering tissue sections |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1x (without Ca and Mg) | Fisher Scientific | MT21031CV | Washing and diluent |
| Gold Seal Cover Slips | ThermoFisher Scientific | 3306 | Protecting stained tissues |
| Human Normal Tonsil OCT frozen tissue block | AMSBio | AMS6023 | Human frozen tissue used for multispectral staining |
| Human Serum 1x | Gemini Bio-Products | 100-512 | Blocking and diluent for human tissues |
| inForm | Akoya Biosciences | Version 2.4.1 | Machine learning software |
| PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD4 | BioLegend | 300529 | Clone - RPA-T4; primary conjugated antibody |
| PerCP-Cy 5.5 Rat Anti-CD11b | BD Biosciences | 550993 | Clone - M1/70; primary conjugated antibody |
| Phenochart | Akoya Biosciences | Version 1.0.8 | Whole slide scan software |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36965 | Mounting medium |
| Research Cryostat | Leica Biosystems | CM3050 S | Sectioning tissues |
| Superblock 1x | ThermoFisher Scientific | 37515 | Blocking mouse tissues |
| Tissue-Tek O.C.T Solution | Sakura Finetek | 4583 | Embedding tissues |
| Vectra 3.0 Automated Quantitative Pathology Imaging System, 6 Slide | Akoya Biosciences | CLS142568 | Semi-automated multispectral imaging system |
| Vectra Software | Akoya Biosciences | Version 3.0.5 | Software to operate microscope |
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