Summary
Biz dondurulmuş dokularda multispektral görüntüleme gerçekleştirmek için hızlı bir boyama yöntemi açıklar.
Abstract
Formalin-sabit parafin gömülü (FFPE) dokularda multispektral floresan görüntüleme, tek bir doku örneğinde antijen koekspresyonu ve belirteçlerin mekansal dağılımı hakkında bilgi sağlayabilen birden fazla belirteç saptanmasını sağlar. Ancak, formalin-sabit dokular için uygun antikoreksikliği tespit edilebilir belirteçlerin doğasını kısıtlayabilir. Buna ek olarak, boyama yöntemi zaman alıcıdır. Burada dondurulmuş dokularda multispektral floresan görüntüleme yapmak için hızlı bir yöntem açıklanmaktadır. Yöntem kullanılan florofor kombinasyonları, fare ve insan dondurulmuş dokuların boyama için ayrıntılı adımlar ve tarama, edinim ve analiz prosedürleri içerir. Boyama analizi için, ticari olarak kullanılabilen yarı otomatik multispektral floresan görüntüleme sistemi kullanılır. Bu yöntemle, en fazla altı farklı belirteçler lekeli ve tek bir dondurulmuş doku bölümünde tespit edildi. Makine öğrenme analiz yazılımı kantitatif analiz için kullanılabilecek hücreleri fenotip olabilir. Burada dondurulmuş dokular için açıklanan yöntem FFPE dokularında tespit edilemeyen veya FFPE dokuları için antikor bulunmayan belirteçlerin saptanmasında yararlıdır.
Introduction
Mikroskobik görüntüleme tekniklerindeki son gelişmeler, biyolojik süreçler ve hastalık durumları hakkındaki bilgi mizi ve anlayışımızı önemli ölçüde geliştirmiştir. Kromozomimmünohistokimya (IHC) yoluyla dokularda proteinlerin yerinde tespiti patolojide rutin olarak yapılmaktadır. Ancak, kromojenik IHC boyama kullanarak birden fazla belirteç lerin saptanması1 zorlu ve birden fazla biyolojik belirteçtekbir doku örneğinde etiketlendiği multipleks immünoresans (mIF) boyama yaklaşımları kullanmak için yeni yöntemler geliştirilmektedir. Doku mimarisi, hücrelerin mekansal dağılımı ve antijen ko-ekspresyonu ile ilgili bilgiler tek bir doku örneği2yakalanır, çünkü birden fazla biyolojik belirteçlerin tespiti yararlıdır. Multispektral floresan görüntüleme teknolojisinin kullanımı birden fazla biyolojik belirteç lerin tespitini mümkün kılmıştır. Bu teknolojide, belirli optik kullanarak her bir florofor floresan spektrumları ayrılabilir veya "karışmamış", herhangi bir spektral crosstalk olmadan birden fazla belirteçlerin algılanmasını sağlayan3. Multispektral floresan görüntüleme hücre biyolojisi, preklinik ilaç gelişimi, klinik patoloji ve tümör immün profilleme4,5,5,6kritik bir yaklaşım haline gelmektedir. Daha da önemlisi, bağışıklık hücrelerinin aralıklı dağılımı (özellikle CD8 T hücreleri) mevcut tümörleri olan hastalar için bir prognostik faktör olarak hizmet verebilir7.
Çokleksi floresan boyama için çeşitli yaklaşımlar geliştirilmiştir ve aynı anda veya sırayla yapılabilir. Eşzamanlı boyama yönteminde, tüm antikorlar tek bir adımda bir kokteyl olarak doku etiketlemek için bir araya eklenir. UltraPlex teknolojisi hapten konjuge birincil antikorlar bir kokteyl ve florofor konjuge anti-hapten ikincil antikorlar bir kokteyl kullanır. InSituPlex teknolojisi8 aynı anda bir amplifikasyon adım ve son olarak birincil antikor her benzersiz DNA dizisi tamamlayıcı florofor konjuge problar takip doku eklenir benzersiz DNA konjuge birincil antikorlar bir kokteyl kullanır. Bu teknolojilerin her ikisi de nükleer boyama için dört belirteç artı 4',6-diamino-2-fenilindole (DAPI) tespitisağlar. Eşzamanlı multipleks boyama için diğer iki yaklaşım ikincil iyon kütle spektrometresi dayanmaktadır9. Hyperion Görüntüleme Sistemi 37 belirteçleri tespit etmek için görüntüleme kitle sitometri10 kullanır. Bu teknoloji dokuları lekelemek için metal konjuge antikorlar bir kokteyl kullanır, ve dokuların belirli alanlarda bir lazer tarafından ablated ve metal iyonları tespit edilen bir kitle sitometre aktarılır. Başka bir benzer teknoloji IONPath, hangi multiplexed iyon ışını görüntüleme teknolojisi11kullanır. Bu teknoloji, metal konjuge antikorları ablate lazer yerine değiştirilmiş bir kütle spektrometresi alet ve oksijen iyon kaynağı kullanır. Tüm bu eşzamanlı multipleks boyama yaklaşımları birden fazla belirteçlerin saptanmasını sağlarken, DNA, haptens veya metallerin antikorlara konjugasyonu için yapılan maliyetler, ablasyon nedeniyle doku kaybı ve karıştırmayı ortadan çıkarmak için kapsamlı görüntü işleme hafife alınamaz. Ayrıca, kitleri ve boyama protokolleri şu anda sadece FFPE dokular için kullanılabilir ve özel paneller geliştirmek ek zaman ve harcama gerektirir.
Sıralı multipleks boyama yöntemi, aksine, bir işaretleyici bir antikor ile doku etiketleme içerir, antikor kaldırmak için sıyırma, birden fazla işaretleri etiketlemek için bu sürecin ardışık tekrarları takip12. Tiramid sinyal amplifikasyonu (TSA) en sık kullanılan ardışık çoklama yöntemidir. Diğer iki çoklama teknolojisi, eşzamanlı ve sıralı boyama yöntemlerinin bir kombinasyonunu kullanır. CODEX platformu13, 50'ye kadar belirteç tespit etmek için süreci görüntüleme, sıyırma ve yineleme nin ardından indeksli polimerizasyon adımı kullanılarak florofor ile etiketlenen benzersiz DNA oligonükleotid dizilerine konjuge antikorlardan oluşan bir kokteyl kullanır. MultiOmyx multiplex boyama yaklaşımı14 üç ila dört florofor konjuge antikorlar bir kokteyl ile boyama bir yineleme, görüntüleme, floroforlar söndürme, ve tek bir bölümde 60 belirteçleri kadar tespit etmek için bu döngünüks. Eşzamanlı multipleks boyama yöntemine benzer şekilde, çok çeşitli belirteçler tespit edilebilirken, boyama, görüntü edinme, işleme ve analiz de dahil olmak üzere zaman geniştir. Sıyırma/söndürme adımı, doku örneğinin ısıtılması ve/veya beyazlatma işlemini içerir ve böylece, sıralı multipleks boyama yaklaşımı genellikle ısıtma veya ağartma üzerine doku bütünlüğünü koruyan FFPE dokularda gerçekleştirilir.
Formalin fiksasyonu ve sonraki parafin katıştırma klinik ortamda kolayca yapılır, doku blokları nın saklanması kolaydır ve birkaç multipleks boyama protokolü mevcuttur. Ancak, işleme, katıştırma ve FFPE dokuların deparafinizasyon, yanı sıra antijen alma15, antikorlar daha iyi epitoplar erişebilirsiniz hangi bir süreç, zaman alıcıdır. Ayrıca, FFPE dokularında yer alan işleme otofloresans katkıda16 ve maskeler hedef epitoplar, değişkenlik ve FFPE dokularda antijenleri tespit etmek için mevcut antikor klon eksikliği ile sonuçlanan17,18,19. Bir örnek insan lökosit antijeni (HLA) sınıf I alel20olduğunu. Buna karşılık, dokuların hızlı dondurma önce veya sabitleme sonra kapsamlı işleme adımları içermez, antijen alma ihtiyacını atlatmak21,22, ve hedeflerin daha geniş bir yelpazede tespit etmek için yararlı hale. Bu nedenle, multispektral floresan görüntüleme için dondurulmuş dokuların kullanılması preklinik ve klinik çalışmalar için hedefleri tespit etmek için değerli olabilir.
FFPE dokuları kullanırken yukarıda belirtilen sınırlamalar göz önüne alındığında, dondurulmuş dokularda multispektral floresan görüntüleme yapılıp yapılamayacağını sorduk. Bu soruyu çözmek için, birden fazla antijeni tespit etmek için florofor konjuge antikorlardan oluşan bir panel kullanarak eşzamanlı çok katlı boyama yöntemini test ettik ve yarı otomatik multispektral görüntüleme sistemi kullanarak boyama analiz ettik. Aynı anda 90 dakika içinde tek bir doku bölümünde altı belirteçleri kadar leke başardık.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Laboratuarımızdan fare dalak ve HLF16 fare tümör dokuları23 elde edildi. İnsan bademcik dokusu ticari bir satıcıdan satın alındı. Ayrıntılar Malzeme Tablosu'ndaverilmiştir.
1. Doku Katıştırma
- Taze dokuyu OCT (optimum kesme sıcaklığı) çözeltisi ve kuru buz veya sıvı nitrojen kullanarak ani donma yerleştirin.
- Dokuları -80 °C'de saklayın.
2. Kriyoding
- -25 °C sıcaklıkta ayarlanmış bir kriyostatta 8 μm kesitler kesin.
NOT: Tercih edilen kesit kalınlığı daha net görüntüler oluşturmak için ayarlanabilir. - Bölümleri yüklü cam slaytlara yerleştirin.
- Histoloji sınıfı buz gibi aseton 10 dakika sabitleme den önce oda sıcaklığında (RT) 1 saat boyunca bölümleri hava kurutun.
NOT: Aseton suda çözünen proteinlerin pıhtılaşmasına neden olur ve lipidleri ayıklar ancak karbonhidrat içeren bileşenleri etkilemez. Buna karşılık, formalin en lipidler korur ve karbonhidratlar üzerinde çok az etkisi vardır24. Fiksatif seçimi, algılanan işaretçi seçimine bağlı olarak önemlidir. - Slaytları -20 °C'de saklayın.
3. Antikor ve Florofororların Seçimi
NOT: Doku boyama önce, sağlam ve özellikle aseton sabit doku sıralı bölümler içinde ilgi onların antijenleri leke olacak antikor klonları doğrulanmalıdır. Bazı antikorlar farklı bir fiksatif gerektirebilir ve paneldeki diğer antikorlarla uyumlulukları da ampirik olarak belirlenmelidir. Amaç aynı zamanda DAPI, FITC, Cy3, Texas Red ve Cy5 için epifloresan filtreleri ile tespit edilebilir minimal örtüşme ile florofores belirlemektir.
- Bilinen ekspresyon hedef antijeni ile doku kesitlerinde konvansiyonel IHC veya immünofloresan (IF) tespiti ile boyama onaylayın.
- Yarı otomatik görüntüleme sisteminde bulunan uyarma ve emisyon filtre setlerini kullanarak ve florofokonskonslu primer antikorların çeşitli kombinasyonlarını test ettikten sonra, en az spektral çakışma olan floroforları hazırlayın (örn. Tablo 1'ebakınız).
4. Boyama
NOT: Doku rehidrasyonu ve kaymayı Coplin kavanozunda yapıldı. Bloke ve antikor kuluçka adımları nemlendirilmiş bir slayt kutusunda gerçekleştirildi.
- Slaytların 5-10 dakika boyunca RT'ye ısınmasına izin verin.
- Fosfatta rehidrat 5 dk.
- Antikorlar ile dokuları boyama önce bir engelleme adımı gerçekleştirin. Fare bölümleri için, RT'de 10 dakika boyunca özel engelleme çözümünün (Bkz. Malzeme Tablosu)kullanın. İnsan kesitleri için PBS'de 15 dakika boyunca seyreltilmiş %10 normal havuzlu insan serumu (NHS) RT kullanın.
NOT: Kullanılacak takip prosedürlerine bağlı olarak bölümlerin belirli özelliklerini korumak için gerektiğinde farklı engelleme arabellekleri test edilebilir. - Tıkalı ktan sonra pbs 5 dakika slaytlar yıkayın.
- Multipleks boyama için, önceden belirlenmiş optimal seyreltmelerde uyumlu floroforlarla antikorlardan oluşan bir kokteyl hazırlayın.
- Slaytlara florofor konjuge antikorkokteylekleyin. Tek işaretli boyama için, slayta yalnızca birincil konjuge antikor ekleyin.
- Herhangi bir birincil konjuge antikor ilave sayılmadan aynı boyama işleminden geçen bir kontrol lekesiz slayt ekleyin.
- Karanlıkta RT'de 1 saat slaytları kuluçkaya yatırın ve slaytları 5 dakika boyunca PBS ile 2x yıkayın. Bundan sonra, ortaya çıkan slayt çokkanlı olarak adlandırılır.
- Karşı leke için, çokkatlı slayt dapi ekleyin, RT karanlıkta 7 dakika kuluçka ve 5 dakika her için PBS ile slaytlar 2x yıkayın. Tek lekeli ve lekesiz slaytları lekelemeyin.
- Coverslip için, montaj ortamı bir damla ekleyin ve yavaşça doku üzerinde cam kapak kayma yerleştirin.
5. Spektral Kütüphane Hazırlama
-
Görüntü edinimi
- Lambanın gücünü %100'e ayarlayın. FFPE dokularında floresan tespiti bir sinyal amplifikasyon adımı içerdiğinden genellikle güç %10'a ayarlanır.
- Mikroskop işletim yazılımını açarak başlayın (bkz. Malzeme Tablosu).
- Protokolü Edit'i ve ardından Yeni Protokol'useçin.
- Bir "Protokol Adı" sağlayın ve Görüntüleme Modualtında Floresan'ı seçin ve bir "Çalışma Adı" sağlayın.
- Tek lekeli slaytları sahneye yerleştirin ve boyama sağlamak için her belirteçleri ilgili floresan kanalında inceleyin. Doku üzerinde işaretçi için en güçlü sinyali ifade eden bir bölge seçin.
- Otomatik Netleme ve Otomatik Pozlama seçeneklerini kullanarak pozlama sürelerini ayarlayın.
- Tek lekeli ve lekesiz slaytlar için anlık görüntüler edinin ve protokolü kaydedin.
NOT: Aşağıdaki adımlar, belirli boyamaları doğrulamak ve antikor çapraz konuşmasını belirlemek için tek lekeli ve lekesiz slaytlar kullanılarak makine öğrenimi yazılımında (bkz. Malzemeler Tablosu'nabakınız) gerçekleştirilir. - Yazılımdaki Kitaplıkoluştur sekmesinin altında, her tek lekeli slayt görüntüsünü yükleyin, uygun Flor'u seçin ve Ayıkla'yıtıklatın. Yazılım otomatik olarak Fluor seçilen floresan sinyali ayıklamak olacaktır.
- Çıkarılan rengi kaydetmek için Mağazaya Kaydet'itıklatın. Bir "Yeni Grup" oluşturulabilir veya çıkarılan renk varolan bir gruba depolanabilir.
-
Spektral kitaplığı doğrulama
- Her filtre kümesi için çıkarılan görüntünün sağında bulunan emisyon spektral eğrisi penceresini kontrol edin.
NOT: Spektral eğri yalnızca florofor tespit edilen filtre kümelerinde gözlenirse çıkarılan sinyal doğrudur. Yanlış filtre kümesinde bir spektral eğri gözlenirse, filtre kümesinde beklenen birincil sinyalin yeterince güçlü olmadığı veya yazılımın muhtemelen spektral çakışma nedeniyle çok yüksek başka bir sinyal algıladığını söyleyebilir. Bu durumda, ilk olarak görüntüdeki floresan işaretçisini ve otofloresansı ifade eden bölgelerin etrafında bölgeler çizmek için İşleme Bölgeleri Çizimi aracını kullanmayı deneyin. Bu, yazılımı gerçek sinyali algılamak ve müdahale eden sinyalleri kaldırmak için eğitiyor. Bu işe yaramazsa, farklı antikor titrasyonları test etmek için tek lekeli slayt için boyama işlemini tekrarlayın.
- Her filtre kümesi için çıkarılan görüntünün sağında bulunan emisyon spektral eğrisi penceresini kontrol edin.
6. Multispektral Görüntüleme
NOT: Spektral kitaplık oluşturulduktan ve doğrulandıktan sonra, çoklekeli slayt için aşağıdaki adımları gerçekleştirin.
-
Tüm slayt tonu
- Bölüm 5.1'de belirtildiği gibi çok lekeli slayttaki odak ve pozlama süreleriniayarlayın.
- Slaytları Tarayıp, Yeni Görev oluşturun ve yukarıda kaydedilen protokolü seçin.
- Çok lekeli slaytta tüm slayt tayini gerçekleştirin.
- Tüm slayt tonu yazılımını kullanarak, slayt tonu görüntüsünün tamamını açın. Bu görüntü, karıştırılmamış olarak spekülasyon olmamıştır.
- Damga veya YG aracını kullanarak tüm slayt tonu görüntüsünde ilgi çekici bölgeleri (YG) seçin. Bu ROI'lar spektral karıştırma ve analiz için kullanılmak üzere 6.1.1'de belirlenen pozlama süreleri kullanılarak taranır.
- 20x büyütmede ROI'lar elde etmek için İşlem Slaytı'na tıklayın
-
Spektral unmixing
- ROI'lar alındıktan sonra, makine öğrenimi yazılımında, Manuel Analiz sekmesi altında, Dosyaaltında Aç'a tıklayarak çok katlı resimleri yükleyin.
- Spektral Kütüphane Kaynak açılır menüsünde Florseç'itıklatın.
- Yeni bir pencere açılacak. Burada, yukarıda oluşturulan spektral kitaplığı veya grubu seçin.
- Lekelenmemiş slayt görüntüsünü yükleyin. Seçili spektral kitaplığın üzerinde bulunan AF mürekkep işaretsimgesine tıklayın ve dokudaki otofloresanlığı tanımlamak için lekesiz slayta bir çizgi veya bölge çizin.
- İşaretçileri ve Renkleri Edit sekmesinin altında, her işaretçi için adatayın. Sözde renkler bu adımda atanabilir.
NOT: Autofloresan görüntünün rengi varsayılan olarak DarkSlateGray'e gelir. Bunu Black olarak değiştir. - Tümlerini Hazırla'yıtıklatın.
-
Spektrometredeki karışık olmayan görüntülerin doğrulanması
NOT: Spektral karıştırma adımı tamamlandığında, tüm renklerden oluşan kompozit bir görüntü oluşturulur.- Göz Görünümü simgesini edit'i tıklatın. Burada, "Bileşen Ekranı"ndaki her renk, her bir işaretçinin boyamasını görüntülemek için kapatılabilir veya açılabilir.
- Biyolojik olarak alakalı olmadığı sürece, belirteçle çakışma olmadığından emin olmak için hücrelerin boyanmasını ve morfolojisini görsel olarak inceleyin. Bir patolog da boyama doğrulamak yardımcı olabilir.
NOT: Çok katlı slayttaki boyama, bir seferde bir florofor bırakılarak ve boyama deseni gözden geçirilerek doğrulanmalıdır. Buna ek olarak, doğrulama da antikor çapraz konuşma veya kanama-through nedeniyle komşu spektrumlarda görünen güçlü floropores belirlemek için yardımcı olacaktır. - Her floresan işaretçi için parlak alan görüntülerini simüle eden Patoloji Görünümleriiçin Bileşen Görüntüsü Seç düğmesini tıklatın. Burada, benzetilen bir brightfield görüntüsünü görüntülemek için bir işaretçi seçin.
7. Hücre Segmentasyonu ve Fenotitipleme Yoluyla Multispektral Görüntülerin Analizi
NOT: Gözlüklü karışık olmayan görüntüyü doğruladıktan sonra, hücre segmentasyonu adım adım talimatlar sağlayacak makine öğrenme yazılımı kullanılarak gerçekleştirilebilir. Doku segmentasyonu burada yapılmadı. Panelde bir veya daha fazla dokuspesifik belirteç varsa ve özellikle doku dağınıksa doku segmentasyonu yapılmalıdır.
- 'Segment' seçeneği altında "Sitoplazma" ve "Membran" seçeneğini belirleyin.
NOT: "Nuclei" varsayılan olarak seçilir. - Panelden bir işaretçi seçin. İşaretleyiciyi çekirdek, sitoplazma veya membranı algılayabilmek için yapılandırın. Örneğin, membran için çekirdekleri ve CD3'ü algılamak için DAPI seçilebilir.
- " bulmak içinbu sinyali kullan" altında bir seçenek seçmek için elips düğmesine ('...') tıklayın. Örneğin, DAPI için 'çekirdekler'. Segmentasyon için panelden birden çok işaretçi seçilebilir.
NOT: Sitoplazmik veya membran belirteçleri için "Nükleer segmentasyona yardımcı olmak için bu sinyali kullanın"seçeneğini belirleyin. - Yazılım, görüntüdeki çekirdek, sitoplazma ve membran için her biri otomatik olarak bir maske algılar ve oluşturur.
- Tüm hücrelerin segmentasyon için 'maskeli' olduğundan emin olun. Ayarlamak için, 7.3'teseçilen belirli işaretçi için Patoloji Görünümü'ne geçin. ve yazılımdaki yapılandırma seçeneklerini kullanın.
- Hücrelerisegmentlemekiçin " Segment Tümlerini " tıklatın.
- Hücre segmentasyonundan sonra, fenotilik hücreleri ile devam edin. Bu adımda, fenotileme için gereken işaretleri seçin ve seçilen işaretçiyle parlak bir şekilde boyanmış en az beş hücreyi el ile seçin. Bu, yazılımı, görüntüdeki seçilen işaretçiyle boyanmış tüm hücreleri otomatik olarak algılaması için eğitir.
- Bir fenotip eşlemi oluşturulur. İşaretleyici ile boyanmış hücrenin doğru şekilde fenotip olduğundan emin olmak için analiz edin.
NOT: Hücre fenotipleme bir yinelemeli bir süreç olabilir. Yazılım hücreleri doğru bir şekilde fenotipleyemiyorsa, bu eğitimin yetersiz veya yanlış olduğu anlamına gelir. Bu durumda, kullanıcı el ile daha fazla hücre seçmek ve yazılımı yeniden eğitmek ve kullanıcı eğitim memnun olana kadar bu adımı yinelemek zorundadır. - "Diğerleri" adlı bir grup oluşturun ve işaretçilerin hiçbiri için lekeli olmayan hücreler ekleyin.
NOT: Bu adım, tüm lekesiz hücreleri fenotiplemeden dışlamak için yazılımı eğitmek önemlidir.
8. Görüntü ve Analiz Tablolarının İhracatı
- Dışa Aktarma Ayarları panelini görüntülemek için Dışa Aktarma düğmesini tıklatın.
- "Dışa Aktarma Dizini"nde, görüntüleri dışa aktarmak için bir konum seçmek için Gözat'ı tıklatın.
- "Görüntü Verme Seçenekleri"nde, Görüntü Çıktı biçimi'niseçin.
- "Dışa Aktaracak Görüntüler" listesinde, dışa aktak edilecek resimleri seçin. "Bileşik görüntü" son sözde renkli olmayan karışık görüntüdür. "Patoloji Görünümleri" bireysel simüle brightfield görüntüleri ve "Bileşen Görüntüler (multi-image TIFF)" üçüncü taraf analiz yazılımı tarafından kullanılabilecek bileşen verilerinin bir çok görüntü TIFF dosyasıdır.
- Görüntüleridışaaktarmak için " Tümü için Dışa Aktar " butonuna tıklayın.
NOT: Analiz tabloları da bu adımda seçilebilir ve dışa aktarılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dondurulmuş dalak kesitlerinde tek lekeli belirteçlerin tespiti
Yarı otomatik görüntüleme sistemi, daha geniş bir dalga boyu algılama25aralığına olanak tanıyan sıvı kristal konserve filtre (LCTF) sistemi kullandığından ve burada sinyal amplifikasyon adımları yapılmadığından, ilk olarak mikroskoptaki her bir belirteç için birincil çekimli antikorlarımızın tespitini optimize ettik. Bir örnek Şekil 1'degösterilmiştir , her tek lekeli işaretçi sözde renkli kırmızıdır. Burada kullanılan Alexa Fluor konjuge antikorlar immünofloresan ve akış sitometrisi için şirketler tarafından doğrulanmıştır. Ancak, Per-CP-Cy5.5 florofor sadece akış sitometri için doğrulanır. Bu rengi tek lekeli slaytlarımızda tespit edebildik, multispektral görüntülemede kullanılmak üzere akış sitometrisinin doğrulanmış antikorlarının uygunluğunu destekledik ve iki farklı teknikle (yani akış sitometrisi ve multispektral görüntüleme) gözlemleri doğrulamak için bu antikorları kullanmanın yararını sağladık. Daha sonra dondurulmuş dokular üzerinde multispektral görüntüleme yapmaya devam etti.
Dondurulmuş fare dalak üzerinde çok renkli floresan algılama
Multipleks boyama yöntemini ve spektral görüntülemeyi test etmek için, bağışıklık hücrelerinin bololduğu fare dondurulmuş dalak dokusunu kullandık. Şekil 2, dondurulmuş fare dalağının bir bölümünde farklı işaretçilerin işaretlenmemiş bir görüntüsünü gösterir. Boyama için kullanılan antikorlar, klonlar ve konsantrasyonlar Tablo 2'deaçıklanmıştır. Yakalanan görüntü, çoğunlukla marjinal bölgede gözlenen CD11b ifade miyeloid hücreleri ile çevrili CD3, CD4 ve CD8 belirteçleri varlığı ile tanımlanan T hücre bölgesinin bir kısmını gösterir. Ki67'yi ifade eden çoğalan hücrelerin bölgeleri öncelikle germinal merkezlerde gözlenmektedir. Her belirteç için "Patoloji Görünümleri" seçeneği doku içinde bireysel boyama deseni gösterdi. CD11b, Ki67 ve CD3, CD4 ve CD8 belirteçleri için belirgin boyama desenleri birlikte gözlendi, bu da çokkatlı boyama yöntemi nin ve spektral görüntülemenin donmuş doku üzerinde çalıştığını düşündürmektedir.
Dondurulmuş insan bademcik üzerinde çok renkli floresan algılama
Fare dokusu için uygun bir boyama paneli test ettikten sonra, daha sonra dondurulmuş insan bademcik dokusu için ayrı bir panel değerlendirildi. Şekil 3, kullanılan farklı işaretçilerin işaretlenmemiş bir görüntüsünü gösterir. Boyama için kullanılan antikorlar, klonlar ve konsantrasyonlar Tablo 2'de tanımlanmıştır. Yakalanan görüntü, CD20 belirteci tarafından tanımlanan B-hücrelerini ifade eden foliküler germinal merkezi26'yı göstermektedir. Foliküler germinal merkezde çoğalan hücreler Ki67 ile tanımlanmıştır. Cd20 ile costained bu çoğalan hücrelerin bazıları ve centroblasts olabilir27, aktif somatik hipermutasyon geçiren naif B-hücreleri. Foliküler germinal merkezleri CD3, CD4 ve CD8 ekspresyonu ile tanımlanan interfolliküler T hücre bölgesi ile çevriliydi. Yine burada farklı boyama şekilleri gözlendi ve metodolojinin donmuş bir doku üzerinde çalıştığını doğruladı.
Dondurulmuş fare tümör dokusuna multispektral floresan görüntüleme uygulaması
Multispektral görüntüleme immünoterapiler için bir prognoz olarak tümörlerde immün hücre infiltrasyonu izlemek için yararlı bir araçtır. Bu amaçla, donmuş fare tümörü doku örneğini lekelemek ve bağışıklık hücresi infiltrasyonlarını tespit etmek için yola çıktık. HLF16 hücre hattı hla-A*0201 transgenik farelerde human papillomavirus (HPV)+ servikal kanser tümör modeli olarak kullanılır28. Transgenik hücre hattı, HLA-A*0201'den gelen kalp akciğer fibroblastlarının HPV16 E6 ve E7 onkogenleri ile H-Ras V1228ile transfekslenerek geliştirilmiştir. T hücreleri ve tümörilişkili makrofajlar tümörlerde en sık görülen immün infiltratlardır29. Şekil 4 patoloji görünümleri ile birlikte dondurulmuş HLF16 tümör bölümünde bir spectrally unmixed görüntü gösterir; bireysel boyama desenleri Ek Şekil 1'degösterilmiştir. Boyama için kullanılan antikorlar, klonlar ve konsantrasyonlar Tablo 2'de tanımlanmıştır. Yakalanan görüntü, CD3 ve CD8 belirteçleri ile tanımlanan tümöre infiltrasyon lu T hücrelerinin bölgelerini ve CD11b belirteci ile tanımlanan diğer miyeloid hücre soylarının varlığını göstermektedir. Yakalanan bölge de tümör ilişkili makrofajlar gösterir (TAMs), muhtemelen M2 fenotip, CD206 marker tarafından tespit30, hangi yakından Ki67 olarak tespit birkaç çoğalan hücreler ile ilişkilidir+.
Makine öğrenimi yazılımı2 doku ve hücre analizleri gibi özelliklere sahiptir. Bu analizler genellikle sinyal amplifikasyonu ile boyanmış FFPE dokularda yapılmaktadır. Metodolojimiz sinyal amplifikasyonu kullanmadığı için, yazılımın dondurulmuş dokularda ki lekelenmeyi analiz etmek için kullanılabileceğini test etmek istedik. Yazılımın adaptif özelliğini kullanarak, hücreleri nükleer ve membran belirteci ne dayalı olarak segmente etmeyi ve boyama için kullanılan belirteçlere dayalı fenotip hücreleri elde ettik. Şekil 5 hücre segmentasyonunu ve fenotip haritalarını ve yazılım tarafından analiz edilen her bir belirteç için lekeli hücre sayısını göstererek, yazılımın dondurulmuş dokularda multispektral boyamanın ölçülmesi için kullanılabileceğini göstermektedir.
Şekil 1: Sıvı kristal konserve filtre mikroskobu kullanılarak birincil konjuge antikorların saptandırılmaması. Belirtilen belirteçlere birincil konjuge antikorlar dondurulmuş fare dalak üzerinde boyanmış ve 20x hedefleri altında Vectra 3.0 multispectral görüntüleme sistemi kullanılarak tespit edilmiştir. Alexa Fluor 488'de CD3, Alexa Fluor 594'te CD8, Per-CP Cy5.5'te CD11b, Alexa Fluor 647'de CD206 ve Alexa Fluor 555'te Ki67 kullanıldı. Her işaretçi sözde renkli kırmızıdır. Bu slaytlarda karşı leke kullanılmadı. Ölçek çubuğu = 20 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Donmuş fare dalağını n için multispektral görüntüleme. (A) 4x hedefleri altında alınan çok katlı lekeli slaytın tüm slayt tonu. Multispektral görüntüleme için dokunun farklı bölgelerine 2 x 2 damga seçilmiştir. Ölçek çubuğu = 100 μm. (B) Spektral karıştırmadan sonra 20x hedefi altında alınan kompozit görüntü. Sözde renkli işaretçiler gösterilir ve kırmızı kutu içinde büyütülmüş bir görüntü görüntünün yanında gösterilir. Ölçek çubuğu = 20 μm. (C) Her bir belirteç için patoloji görünümleri. Kırmızı kutudaki her işaretçi için büyütülmüş bir görüntü görüntünün yanında gösterilir. Ölçek çubuğu = 20 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Donmuş bir insan bademcik üzerinde multispektral görüntüleme. (A) 4x hedefi altında alınan çok katlı lekeli slaytın tüm slayt tonu. Multispektral görüntüleme için dokunun farklı bölgelerinde 1 x 1 pul (669 μm x 500 m) seçilmiştir. Ölçek çubuğu = 100 μm. (B) 20x hedefi altında alınan spektral karıştırma dan sonra kompozit görüntü. Sözde renkli işaretçiler gösterilir ve kırmızı kutu içinde büyütülmüş bir görüntü görüntünün yanında gösterilir. Ölçek çubuğu = 20 μm. (C) Her bir belirteç için patoloji görünümleri. Kırmızı kutudaki her işaretçi için büyütülmüş bir görüntü görüntünün yanında gösterilir. Ölçek çubuğu = 20 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Donmuş fare tümöründe multispektral görüntüleme. 20x hedefi altında çekilen donmuş fare HLF16 tümörünün 1 x 1 bölgesine multispektral görüntüleme yapıldı. Bileşik görüntü (üstte). Sözde renkli belirteçler gösterilir ve her bir belirteç için patoloji görünümleri (aşağıda) gösterilmiştir. Kırmızı kutudaki her işaretçi için büyütülmüş bir görüntü orijinal görüntünün yanında gösterilir. Ölçek çubuğu = 20 μm Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Donmuş fare tümörü bölümünün analizi. (A) Hücre segmentasyon haritası. inForm kullanılarak adaptif hücre segmentasyonu gerçekleştirildi. Yazılım çekirdekleri tanımlamak için eğitildi (yeşil) ve membran (kırmızı). (B) Her lekeli işaretçi için fenotip haritaları. Yazılım boyama dayalı fenotipleri tanımlamak için eğitildi. Renkli nokta belirtilen işaretçiyi temsil eder. "Diğer" (siyah), belirtilen işaretçi için lekeli olmayan hücreleri ifade eder. (C) Çubuk çizimi (ortalama ± STDSAPMA) iki multispektral görüntüde her belirteç için lekeli hücre sayısını gösteren. Sayı, her görüntüde fenotiplenmiş hücreleri gösterir, ancak işaretçilerin birlikte ifade edilip edilmeydiğini göstermez. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Florofor | Uyarma maksimum (nm) | Emisyon maksimum (nm) | Filtre Kümesinde Beklenen Algılama (ad) |
| Alexa Flor 488 | 488 | 519 | FITC |
| Alexa Flor 555 | 555 | 580 | Cy3 ve Teksas Kırmızısı |
| Alexa Flor 594 | 590 | 617 | Teksas Kırmızısı |
| Alexa Flor 647 | 650 | 668 | Teksas Kırmızı ve Cy5 |
| Demir | 350 | 470 | Demir |
| PerCP-Cy 5.5 | 482 | 690 | Cy3, Teksas Kırmızı ve Cy5 |
Tablo 1: Maksimum uyarma ve emisyon dalga boylarına sahip floroforların listesi ve uygun filtre setlerinde beklenen algılama.
| Dondurulmuş Fare Dalağını | |||
| Antikor/Boya | Klon | Konsantrasyon (3g/mL) | |
| Alexa Fluor 594 fare karşıtı CD8a | 53-6.7 | 10 | |
| Alexa Fluor 488 fare karşıtı CD3 | 17A2 | 20 | |
| Alexa Fluor 647 fare karşıtı CD4 | GK1.5 | 10 | |
| PerCP-Cy 5.5 Sıçan Anti-CD11b | M1/70 | 2 | |
| Alexa Flor 555 Fare anti-Ki-67 | B56 | 10 | |
| Demir | 0.1 | ||
| Dondurulmuş Fare Tümörü | |||
| Antikor/Boya | Klon | Konsantrasyon (3g/mL) | |
| Alexa Fluor 594 fare karşıtı CD8a | 53-6.7 | 20 | |
| Alexa Fluor 488 fare karşıtı CD3 | 17A2 | 20 | |
| Alexa Fluor 647 fare karşıtı CD206 (MMR) | C068C2 | 5 | |
| PerCP-Cy5.5 Sıçan Anti-CD11b | M1/70 | 1 | |
| Alexa Flor 555 Fare anti-Ki-67 | B56 | 0.25 | |
| Demir | 0.1 | ||
| Dondurulmuş İnsan Bademcik | |||
| Antikor/Boya | Klon | Konsantrasyon (3g/mL) | |
| Alexa Fluor 594 anti-insan CD3 | UCHT1 | 10 | |
| PerCP/Siyanür5.5 anti-insan CD4 | RPA-T4 | 4 | |
| Alexa Fluor 647 anti-insan CD8a | C8/144B | 10 | |
| Alexa Fluor 488, eBioscience anti-insan CD20 | L26 | 10 | |
| Alexa Flor 555 Fare anti-Ki-67 | B56 | 1 | |
| Demir | 0.1 | ||
Tablo 2: Kullanılan antikorlar, klonlar ve konsantrasyonların listesi.
Ek Şekil 1: Spektral unmixing sonra dondurulmuş HLF16 tümörün bireysel boyama desenleri. Ölçek çubuğu = 20 μm Bu rakamı indirmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dondurulmuş dokular yaygın geleneksel doğrudan ve dolaylı yöntem32kullanarak bir doku üzerinde üç ila dört belirteçleri31 tespit etmek için mIF görüntüleme için kullanılmıştır. Doğrudan yöntemde, antikorlar floresan boyalar veya kuantum nokta33 doku etiketlemek için konjuge edilir, dolaylı yöntemde ise, konjuge olmayan bir birincil antikor özellikle birincil antikor tanıyan bir florofor-konjuge ikincil antikor takip doku etiketlemek için kullanılır. Daha önce tartışılan son eşzamanlı multipleks boyama yaklaşımlarından bazıları dondurulmuş dokuları lekelemek ve dörtten fazla belirteçleri tespit etmek için de kullanılabilir. Ancak reaktiflerin maliyeti ve boyama için alınan süre, tespit edilen belirteç sayısına bağlı olarak yoğunlaşır. Dondurulmuş dokular için başka bir multipleks tekniği multi-epitop-ligand-kartografya (MELC)34. Bu teknik, numunenin florofor konjuge antikorlar, görüntüleme ve florofor fotobeyazrlanması ile boyandırılmasını içerir. Bu tekniğin önemli bir uyarı doku sadece bir alan veya bölge multiplexed olabilir. Diğer alanları veya bölgeleri çok katlı bir şekilde yapabilmek için tekniğin el ile gerçekleştirilmesi gerekir, bu da zaman alıcıdır veya otomasyon gerektirir, ki bu da maliyetlidir. Bir grup35 doğrudan, dolaylı ve TSA boyama kombinasyonu kullanarak dondurulmuş dokularda altı renk tespit edebildi. Ancak doku boyama 2 gün sürdü. Buna karşılık, bizim metodoloji 90 dakika içinde dondurulmuş dokuları leke beş doğrudan konjuge antikorlar artı DAPI bir kokteyl uygulanmasını içeren eşzamanlı bir multipleks boyama yöntemi kullanır. Ayrıca, yarı otomatik multispektral floresan görüntüleme sistemi kullanarak, bu basitleştirilmiş multipleks boyama tekniğini kullanarak dondurulmuş dalak, bademcik ve tümör dokularında altı belirteçleri ayırıp tespit edebildik. Mikroskopta bulunan Cy3, Texas Red ve Cy5 filtre setleri ek floroforları tespit etmek için fırsatlar sunarak dondurulmuş dokularda aynı anda tespit edilebilen belirteçlerin sayısını artırır.
FFPE dokularında TSA yaklaşımını kullanarak multipleks boyama, sıralı etiketleme, yıkama ve sıyırma adımlarını takip eden bir antijen alma adımı gerektirir. İşlemin yapılması antikorlar için kullanılan kuluçka sürelerine bağlı olarak 1-2 gün arasında değişmektedir6. Son zamanlarda, bir mikroakışkan doku işlemcisi kullanılarak, 90 dk altında FFPE dokularda TSA yaklaşımı kullanılarak dört pleks boyama yapıldı. FFPE dokuları için diğer multipleks teknikleri otomatik bir lekeleyici kullanılarak 4-5 saat altında gerçekleştirilebilir. Ancak, uygun antijen alma adımları antikorlar için epitop kullanılabilirliğini sağlamak için optimize edilmesi gerekir36, hangi sırayla antikor klonları dikkatli dikkate yanı sıra tespit edilen belirteçlerin sırasına dayanır. Örneğin, CD3 bazı antikor klonları kullanılamaz, çünkü daha sonra CD4 ve CD8 antikorları tespit edilmez37. Benzer şekilde, mevcut antikor klonları arasında antijen tespiti değişkenlik vardır17,18. Bu nedenle, FFPE dokularının multipleks boyama antikor klonları optimizasyonu gerektirir, konsantrasyonları, ve bunların lekeli olduğu sırası, hepsi zaman alıcıdır. Buna karşılık, dondurulmuş dokuların geniş doku işleme eksikliği yüksek özgüllük ile çeşitli antikor klonların kullanımına olanak sağlar. Ayrıca, dondurulmuş dokular için mevcut antikor klonları da akış sitometri ve ELISA kullanılabilir, çeşitli tahliller arasında eşzamanlı doğrulama sağlayan. Doku mimarisi de dondurulmuş dokularda bir endişe38. Burada dondurulmuş dokularda gösterilen çokluk boyama TSA yaklaşımından çok daha hızlıdır. Florofor kombinasyonları, antikorların özellikle aynı hücresel konumda ifade edilen farklı antijenler tespit edildiğinde, steral olarak birbirini engellememesini sağlamak için dikkatli bir belirteç seçimi gerektirir. Florofororlarda farklı hücreleri lekeleyen ve daha iyi tespit için ayrı ayrı belirteçler seçtiklerini seçtik. Antikor konsantrasyonları da optimizasyon gerektirir, ancak boyama protokolü hızlı olduğundan, optimizasyon için alınan genel süre zaman alıcı değildir. Metodumuza yapılan bir uyarı dokularda düşük ifade edici belirteçleri tespit edememe olabilir. FFPE dokularında multipleks boyama yaklaşımlarından bazıları, düşük ifade edici belirteçleri tespit etmek için yararlı olan bir sinyal amplifikasyon adımı içerir. Ancak, ikincil ve üçüncül antikorların kullanımı sinyal artırmak için istihdam edilebilir. Bu gibi durumlarda, sonuçların yanlış yorumlanmasını önlemek için paneldeki antikorlara çapraz reaktiviteden kaçınılmalıdır.
Bağışıklık hücreleri açısından zengin olan fare dalağını ve insan bademcik dokularına ek olarak, dondurulmuş dokuların önerilen multispektral floresan görüntülemesine örnek olarak tümör dokusunu kullandık. Tümörlerde multispektral floresan görüntüleme, tümör mikroçevre karakterize gibi değerli bilgiler sağlamıştır (TME)39, malign melanom da benimseyen T hücre transferlerinin başarısını tahmin40, ve tümör sinyal transdüksiyon yolları proteinleri karakterize41. Tümörlerde yaygın olarak bulunan bağışıklık hücrelerine özgü belirteçler kullanarak, bu çalışmada kullanılan HLF16 tümör dokusunda cd8 T hücreleri ve TAM'lara sızmayı tespit edebildik. Hücreleri başarılı bir şekilde segmente etmek ve fenotiplemek için makine öğrenimi yazılımını kullandık. FFPE dokuları için multipleks boyama görüntü işleme ve nicelik42,43yardımcı olan sinyal-gürültü (SNR) oranını artırmak için bir sinyal amplifikasyon adımı kullanır. Makine öğrenme yazılımı ffpe dokular sinyal amplifikasyon2ile boyanmış analizler için kullanılmıştır. Burada bulunan metodoloji sinyal amplifikasyonu kullanmaz, ancak yazılımı kullanarak hücreleri başarıyla segmente etmeyi ve fenotipleri segmente etmeyi başardık. Daha fazla analiz (örn. fenotip birlikte ifade ve mekansal ilişkiler) ve niceliğin doğru yorumlanması için, yazılım eğitimi bir eğitim kümesi, test seti ve doğrulama kümesi kullanılarak doğrulama gerektirir. Yinelemeli bir işlemde, bir dizi görüntü (yani, eğitim kümesi) modelin farklı bir görüntü kümesi (yani test kümesi) için öngörüleri doğru olana kadar fenotipleri tanımlamak için makine öğrenimi yazılımını eğitmek için kullanılır. Eğitim tamamlandıktan sonra, son bir kenara bırakma resmi grubu (yani doğrulama kümesi) aşırı uyum olup olmadığını görmek için analiz edilir.
Sonuç olarak, burada sunulan metodoloji dondurulmuş dokular kullanılarak multispektral floresan görüntüleme yapmanın hızlı bir yoludur. Yöntem, FFPE dokularında antikorların bulunamadığı veya tespit edilemeyen belirteçleri tespit etmek için yararlıdır. Makine öğrenimi yazılımı ile birlikte, nicel analizler yapmak için geçen süre hızlı preklinik ve klinik tanıları önemli ölçüde kolaylaştırabilir ve dondurulmuş dokuları kullanan yüksek çözünürlüklü uzamsal transkripsiyon lar alanında uygulanabilir44.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların ifşa etmesi gereken çıkar çatışmaları yok.
Acknowledgments
Görüntüleme ve analiz rehberliği, Chicago'daki Illinois Üniversitesi'nde Araştırma Kaynakları Merkezi - Araştırma Histolojisi ve Doku Görüntüleme Çekirdeği tarafından, Araştırma dan sorumlu Rektör Yardımcısı'nın desteğiyle kurulmuştur. Çalışma NIH / NCI RO1CA191317 clp, NIH / NIAMS (SBDRC hibe 1P30AR075049-01) Dr A. Paller ve Robert H. Lurie Kapsamlı Kanser Merkezi desteği ile Northwestern Üniversitesi'nde İmmünoterapi Değerlendirme Çekirdek desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone (histological grade) | Fisher Scientific | A16F-1GAL | Fixing tissues |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse CD3 | BioLegend | 100212 | Clone - 17A2; primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 488, eBioscience anti-human CD20 | ThermoFisher Scientific | 53-0202-82 | Clone - L26; primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 555 Mouse anti-Ki-67 | BD Biosciences | 558617 | Primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 594 anti-human CD3 | BioLegend | 300446 | Clone - UCHT1; primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 594 anti-mouse CD8a | BioLegend | 100758 | Clone - 53-6.7; primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 647 anti-human CD8a | BioLegend | 372906 | Clone - C8/144B; primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 647 anti-mouse CD206 (MMR) | BioLegend | 141711 | Clone - C068C2; primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 647 anti-mouse CD4 Antibody | BioLegend | 100426 | Clone - GK1.5; primary conjugated antibody |
| C57BL/6 Mouse | Charles River Laboratories | 27 | Mouse frozen tissues used for multispectral training |
| Coplin Jar | Sigma Aldrich | S6016-6EA | Rehydrating and washing slides |
| DAPI Solution | BD Biosciences | 564907 | Nucleic Acid stain |
| Diamond White Glass Charged Slides | DOT Scientific | DW7590W | Adhering tissue sections |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1x (without Ca and Mg) | Fisher Scientific | MT21031CV | Washing and diluent |
| Gold Seal Cover Slips | ThermoFisher Scientific | 3306 | Protecting stained tissues |
| Human Normal Tonsil OCT frozen tissue block | AMSBio | AMS6023 | Human frozen tissue used for multispectral staining |
| Human Serum 1x | Gemini Bio-Products | 100-512 | Blocking and diluent for human tissues |
| inForm | Akoya Biosciences | Version 2.4.1 | Machine learning software |
| PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD4 | BioLegend | 300529 | Clone - RPA-T4; primary conjugated antibody |
| PerCP-Cy 5.5 Rat Anti-CD11b | BD Biosciences | 550993 | Clone - M1/70; primary conjugated antibody |
| Phenochart | Akoya Biosciences | Version 1.0.8 | Whole slide scan software |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36965 | Mounting medium |
| Research Cryostat | Leica Biosystems | CM3050 S | Sectioning tissues |
| Superblock 1x | ThermoFisher Scientific | 37515 | Blocking mouse tissues |
| Tissue-Tek O.C.T Solution | Sakura Finetek | 4583 | Embedding tissues |
| Vectra 3.0 Automated Quantitative Pathology Imaging System, 6 Slide | Akoya Biosciences | CLS142568 | Semi-automated multispectral imaging system |
| Vectra Software | Akoya Biosciences | Version 3.0.5 | Software to operate microscope |
References
- van der Loos, C. M. Chromogens in Multiple Immunohistochemical Staining Used for Visual Assessment and Spectral Imaging: The Colorful Future. Journal of Histotechnology. 33 (1), 31-40 (2010).
- Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: A review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
- Bian, L., et al. Multispectral imaging using a single bucket detector. Scientific Reports. 6, 24752 (2016).
- Zhou, L., El-Deiry, W. S. Multispectral fluorescence imaging. Journal of Nuclear Medicine. 50 (10), 1563-1566 (2009).
- Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).
- Wickenhauser, C., et al. Immune Checkpoint Blockade: Methods and Protocols. Pico de Coaña, Y. , Springer. New York. 13-31 (2019).
- Feng, Z., et al. Multispectral imaging of formalin-fixed tissue predicts ability to generate tumor-infiltrating lymphocytes from melanoma. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 3 (1), 47 (2015).
- Manesse, M., Patel, K. K., Bobrow, M., Downing, S. R. The InSituPlex((R)) Staining Method for Multiplexed Immunofluorescence Cell Phenotyping and Spatial Profiling of Tumor FFPE Samples. Methods in Molecular Biology. 2055, 585-592 (2020).
- Gamble, L. J., Anderton, C. R. Secondary Ion Mass Spectrometry Imaging of Tissues, Cells, and Microbial Systems. Microscopy Today. 24 (2), 24-31 (2016).
- Giesen, C., et al. Highly multiplexed imaging of tumor tissues with subcellular resolution by mass cytometry. Nature Methods. 11 (4), 417-422 (2014).
- Angelo, M., et al. Multiplexed ion beam imaging of human breast tumors. Nature Medicine. 20 (4), 436-442 (2014).
- Tsujikawa, T., et al. Quantitative Multiplex Immunohistochemistry Reveals Myeloid-Inflamed Tumor-Immune Complexity Associated with Poor Prognosis. Cell Reports. 19 (1), 203-217 (2017).
- Goltsev, Y., et al. Deep Profiling of Mouse Splenic Architecture with CODEX Multiplexed Imaging. Cell. 174 (4), 968-981 (2018).
- Gerdes, M. J., et al. Highly multiplexed single-cell analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 11982-11987 (2013).
- Shi, S. R., Key, M. E., Kalra, K. L. Antigen retrieval in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: an enhancement method for immunohistochemical staining based on microwave oven heating of tissue sections. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 39 (6), 741-748 (1991).
- Viegas, M. S., Martins, T. C., Seco, F., do Carmo, A. An improved and cost-effective methodology for the reduction of autofluorescence in direct immunofluorescence studies on formalin-fixed paraffin-embedded tissues. European Journal of Histochemistry. 51 (1), 59-66 (2007).
- Sorensen, I. V., et al. Characterization of anti-TIMP-1 monoclonal antibodies for immunohistochemical localization in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 54 (10), 1075-1086 (2006).
- Parra, E. R., Villalobos, P., Mino, B., Rodriguez-Canales, J. Comparison of Different Antibody Clones for Immunohistochemistry Detection of Programmed Cell Death Ligand 1 (PD-L1) on Non-Small Cell Lung Carcinoma. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 26 (2), 83-93 (2018).
- Boger, C., Kalthoff, H., Goodman, S. L., Rocken, C. Validation and comparison of anti-alphavbeta3 and anti-alphavbeta5 rabbit monoclonal versus murine monoclonal antibodies in four different tumor entities. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 21 (6), 553-560 (2013).
- Torigoe, T., et al. Establishment of a monoclonal anti-pan HLA class I antibody suitable for immunostaining of formalin-fixed tissue: unusually high frequency of down-regulation in breast cancer tissues. Pathology International. 62 (5), 303-308 (2012).
- Dapson, R. W. Macromolecular changes caused by formalin fixation and antigen retrieval. Biotechnic & Histochemistry. 82 (3), 133-140 (2007).
- Sompuram, S. R., Vani, K., Hafer, L. J., Bogen, S. A. Antibodies Immunoreactive With Formalin-Fixed Tissue Antigens Recognize Linear Protein Epitopes. American Journal of Clinical Pathology. 125 (1), 82-90 (2006).
- Cassetti, M. C., et al. Antitumor efficacy of Venezuelan equine encephalitis virus replicon particles encoding mutated HPV16 E6 and E7 genes. Vaccine. 22 (3-4), 520-527 (2004).
- Kiernan, J. A. Histological and Histochemical Methods: Theory and Practice, 3rd Edition. Shock. 12 (6), 479 (1999).
- Favreau, P., et al. Thin-film tunable filters for hyperspectral fluorescence microscopy. Journal of Biomedical Optics. 19 (1), 011017 (2014).
- van Kempen, M. J., Rijkers, G. T., Van Cauwenberge, P. B. The immune response in adenoids and tonsils. International Archives of Allergy and Immunology. 122 (1), 8-19 (2000).
- Klein, U., Dalla-Favera, R. Germinal centres: role in B-cell physiology and malignancy. Nature Reviews Immunology. 8 (1), 22-33 (2008).
- Eiben, G. L., et al. Establishment of an HLA-A*0201 Human Papillomavirus Type 16 Tumor Model to Determine the Efficacy of Vaccination Strategies in HLA-A*0201 Transgenic Mice. Cancer Research. 62, 5792-5799 (2002).
- Gonzalez, H., Hagerling, C., Werb, Z. Roles of the immune system in cancer: from tumor initiation to metastatic progression. Genes & Development. 32 (19-20), 1267-1284 (2018).
- Sica, A., Schioppa, T., Mantovani, A., Allavena, P. Tumour-associated macrophages are a distinct M2 polarised population promoting tumour progression: potential targets of anti-cancer therapy. European Jorunal of Cancer. 42 (6), 717-727 (2006).
- Au-Granier, C., et al. Multiplexed Immunofluorescence Analysis and Quantification of Intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T Cells. Journal of Visualized Experiments. (132), e56606 (2018).
- Odell, I. D., Cook, D. Immunofluorescence Techniques. Journal of Investigative Dermatology. 133 (1), 1-4 (2013).
- Xing, Y., et al. Bioconjugated quantum dots for multiplexed and quantitative immunohistochemistry. Nature Protocols. 2 (5), 1152-1165 (2007).
- Schubert, W., et al. Analyzing proteome topology and function by automated multidimensional fluorescence microscopy. Nature Biotechnology. 24 (10), 1270-1278 (2006).
- de Vries, N. L., et al. High-dimensional cytometric analysis of colorectal cancer reveals novel mediators of antitumour immunity. Gut. , 03 (2019).
- Scalia, C. R., et al. Antigen Masking During Fixation and Embedding, Dissected. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry : Official Journal of the Histochemistry Society. 65 (1), 5-20 (2017).
- Sorrelle, N., et al. Improved Multiplex Immunohistochemistry for Immune Microenvironment Evaluation of Mouse Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Tissues. Journal of Immunology. 202 (1), 292-299 (2019).
- Ackerman, L. V., Ramirez, G. A. The indications for and limitations of frozen section diagnosis; a review of 1269 consecutive frozen section diagnoses. British Journal of Surgery. 46 (198), 336-350 (1959).
- Mezheyeuski, A., et al. Multispectral imaging for quantitative and compartment-specific immune infiltrates reveals distinct immune profiles that classify lung cancer patients. The Journal of Pathology. 244 (4), 421-431 (2018).
- Feng, Z., et al. Multiparametric immune profiling in HPV- oral squamous cell cancer. JCI insight. 2 (14), 93652 (2017).
- Yang, L., Liu, Z., Tan, J., Dong, H., Zhang, X. Multispectral imaging reveals hyper active TGF-β signaling in colorectal cancer. Cancer Biology & Therapy. 19 (2), 105-112 (2018).
- Blom, S., et al. Systems pathology by multiplexed immunohistochemistry and whole-slide digital image analysis. Scientific Reports. 7 (1), 15580-15580 (2017).
- Roy, S., Axelrod, H. D., Valkenburg, K. C., Amend, S., Pienta, K. J. Optimization of prostate cancer cell detection using multiplex tyramide signal amplification. Journal of Cellular Biochemistry. 120 (4), 4804-4812 (2019).
- Vickovic, S., et al. High-density spatial transcriptomics arrays for in situ tissue profiling. bioRxiv. , 563338 (2019).
