Summary
Wir beschreiben eine schnelle Färbemethode zur multispektralen Bildgebung an gefrorenen Geweben.
Abstract
Multispektrale Fluoreszenz-Bildgebung auf formalinfixiertem Paraffin-eingebetteten (FFPE)-Gewebe ermöglicht den Nachweis mehrerer Marker in einer einzigen Gewebeprobe, die Informationen über Antigenkoexpression und räumliche Verteilung der Marker liefern können. Ein Mangel an geeigneten Antikörpern für formalfixierte Gewebe kann jedoch die Art der Marker einschränken, die nachgewiesen werden können. Darüber hinaus ist die Färbemethode zeitaufwändig. Hier beschreiben wir eine schnelle Methode zur Multispektralfluoreszenz-Bildgebung an gefrorenen Geweben. Die Methode umfasst die verwendeten Fluorophorkombinationen, detaillierte Schritte zur Färbung von Maus- und menschlichen gefrorenen Geweben sowie die Scan-, Erfassungs- und Analyseverfahren. Für die Färbeanalyse wird ein handelsübliches multispektrales Fluoreszenz-Bildgebungssystem eingesetzt. Durch diese Methode wurden bis zu sechs verschiedene Marker in einem einzigen gefrorenen Gewebeabschnitt gebeizt und nachgewiesen. Die Machine Learning-Analysesoftware kann Zellen phänotypieren, die für die quantitative Analyse verwendet werden können. Die hier beschriebene Methode für gefrorene Gewebe ist nützlich für den Nachweis von Markern, die in FFPE-Geweben nicht nachgewiesen werden können oder für die Antikörper für FFPE-Gewebe nicht verfügbar sind.
Introduction
Jüngste Fortschritte bei mikroskopischen Bildgebungstechniken haben unser Wissen und Verständnis von biologischen Prozessen und Krankheitszuständen deutlich verbessert. Der In-situ-Nachweis von Proteinen in Geweben über die chromogene Immunhistochemie (IHC) wird routinemäßig in der Pathologie durchgeführt. Der Nachweis mehrerer Marker mit chromogener IHC-Färbung ist jedoch eine Herausforderung1 und neuere Methoden zur Verwendung von Multiplex-Immunfluoreszenz-Färbeansätzen (mIF), bei denen mehrere biologische Marker auf einer einzigen Gewebeprobe gekennzeichnet sind, werden entwickelt. Der Nachweis mehrerer biologischer Marker ist nützlich, da Informationen zur Gewebearchitektur, zur räumlichen Verteilung von Zellen und zur Antigen-Co-Expression alle in einer einzigen Gewebeprobe erfasst werden2. Der Einsatz multispektraler Fluoreszenz-Bildgebungstechnologie hat den Nachweis mehrerer biologischer Marker ermöglicht. In dieser Technologie können die Fluoreszenzspektren jedes einzelnen Fluorophors durch spezifische Optik getrennt oder "ungemischt" werden, was die Detektion mehrerer Marker ohne Spektralüberlaufermöglicht 3. Multispektrale Fluoreszenz-Bildgebung wird zu einem kritischen Ansatz in der Zellbiologie, präklinischen Arzneimittelentwicklung, klinischen Pathologie und Tumorimmunprofilierung4,5,6. Wichtig ist, dass die räumliche Verteilung von Immunzellen (speziell CD8-T-Zellen) als prognostischer Faktor für Patienten mit bestehenden Tumoren dienen kann7.
Verschiedene Ansätze zur Multiplexfluoreszenzfärbung wurden entwickelt und können entweder gleichzeitig oder sequenziell durchgeführt werden. Bei der gleichzeitigen Färbemethode werden alle Antikörper als Cocktail in einem einzigen Schritt zusammengefügte, um das Gewebe zu kennzeichnen. Die UltraPlex-Technologie verwendet einen Cocktail von haptenkonjugierten Primärantikörpern, gefolgt von einem Cocktail fluorophor-konjugierter antihapten sekundärer Antikörper. Die InSituPlex-Technologie8 verwendet einen Cocktail aus einzigartigen DNA-konjugierten Primärantikörpern, die dem Gewebe gleichzeitig zugesetzt werden, gefolgt von einem Amplifikationsschritt und schließlich fluorophorkonjugierten Sonden, die jede einzigartige DNA-Sequenz am primären Antikörper ergänzen. Beide Technologien ermöglichen den Nachweis von vier Markern plus 4',6-Diamino-2-Phenylindole (DAPI) für die kerntechnische Färbung. Zwei weitere Ansätze zur simultanen Multiplexfärbung basieren auf der sekundären Ionenmassenspektrometrie9. Das Hyperion Imaging System verwendet bildgebende Massenzytometrie10, um bis zu 37 Marker zu erkennen. Diese Technologie verwendet einen Cocktail aus metallkonjugierten Antikörpern, um das Gewebe zu färben, und bestimmte Bereiche des Gewebes werden durch einen Laser ablated und auf ein Massenzytometer übertragen, wo die Metallionen nachgewiesen werden. Eine weitere ähnliche Technologie ist der IONPath, der Multiplex-Ionen-Strahl-Bildgebungstechnologie11verwendet. Diese Technologie verwendet ein modifiziertes Massenspektrometrieinstrument und eine Sauerstoffionenquelle anstelle von Laser, um die metallkonjugierten Antikörper abzuschleifen. Während all diese simultanen Multiplex-Färbeansätze den Nachweis mehrerer Marker ermöglichen, sind die Kosten für die Konjugation von DNA, Hapten oder Metallen zu Antikörpern, der Gewebeverlust durch Ablation und die umfangreiche Bildverarbeitung zum Entmischen nicht zu unterschätzen. Darüber hinaus sind Kits und Färbeprotokolle derzeit nur für FFPE-Gewebe verfügbar, und die Entwicklung von kundenspezifischen Panels erfordert zusätzlichen Zeit- und Aufwand.
Die sequenzielle Multiplex-Färbungsmethode hingegen umfasst die Kennzeichnung des Gewebes mit einem Antikörper auf einen Marker,, um den Antikörper zu entfernen, gefolgt von sequenziellen Wiederholungen dieses Prozesses, um mehrere Marker12zu beschriften. Die Tyramidsignalverstärkung (TSA) ist die am häufigsten verwendete sequenzielle Multiplexing-Methode. Zwei weitere Multiplexing-Technologien verwenden eine Kombination aus simultanen und sequentiellen Färbemethoden. Die CODEX-Plattform13 verwendet einen Cocktail von Antikörpern, die zu einzigartigen DNA-Oligonukleotidsequenzen konjugiert sind, die schließlich mit einem Fluorophor mit einem indizierten Polymerisationsschritt gekennzeichnet werden, gefolgt von Bildgebung, Abisolieren und Wiederholen des Prozesses, um bis zu 50 Marker zu erkennen. Der MultiOmyx Multiplex-Färbungsansatz14 ist eine Iteration der Färbung mit einem Cocktail von drei bis vier fluorophorkonjugierten Antikörpern, bildgebend, das Abschrecken der Fluorophore und die Wiederholung dieses Zyklus, um bis zu 60 Marker auf einem einzigen Abschnitt zu erkennen. Ähnlich wie bei der gleichzeitigen Multiplex-Färbungsmethode, während eine breite Palette von Markern erkannt werden kann, ist die Zeit, die mit Färbung, Bildaufnahme, Verarbeitung und Analyse verbunden ist, umfangreich. Der Stripping/Quenching-Schritt beinhaltet das Erhitzen und/oder Bleichen der Gewebeprobe und somit wird der sequenzielle Multiplex-Färbungsansatz häufig an FFPE-Geweben durchgeführt, die die Gewebeintegrität beim Erhitzen oder Bleichen erhalten.
Formalin Fixierung und nachfolgende Paraffin-Einbettung wird leicht in einer klinischen Umgebung durchgeführt, Gewebeblöcke sind einfach zu lagern, und mehrere Multiplex-Färbung Protokolle sind verfügbar. Die Verarbeitung, Einbettung und Deparaffinisierung von FFPE-Geweben sowie Antigenabruf15, ein Prozess, bei dem Antikörper besser auf Epitope zugreifen können, ist jedoch zeitaufwändig. Darüber hinaus trägt die Verarbeitung in FFPE-Geweben zur Autofluoreszenz16 bei und maskiert Zielepitope, was zu der Variabilität und dem Mangel an Antikörperklon führt, die zum Nachweis von Antigenen in FFPE-Geweben17,18,19zur Verfügung stehen. Ein Beispiel ist die menschliche Leukozytenantigen (HLA) Klasse I Allele20. Im Gegensatz dazu beinhaltet das Einfrieren von Geweben keine umfangreichen Verarbeitungsschritte vor oder nach der Fixierung, wodurch die Notwendigkeit eines Antigenabrufs21,22umgangen wird und es für die Erkennung einer breiteren Palette von Zielen von Vorteil ist. Daher kann die Verwendung von gefrorenem Gewebe für die multispektrale Fluoreszenz-Bildgebung wertvoll sein, um Ziele für präklinische und klinische Studien zu detektieren.
Angesichts der oben genannten Einschränkungen bei der Verwendung von FFPE-Geweben haben wir gefragt, ob multispektrale Fluoreszenz-Bildgebung an gefrorenen Geweben durchgeführt werden kann. Um diese Frage zu beantworten, testeten wir eine simultane Multiplex-Färbungsmethode mit einem Panel von fluorophorkonjugierten Antikörpern, um mehrere Antigene zu erkennen, und analysierten die Färbung mit einem semiautomatisierten multispektralen Bildgebungssystem. Wir konnten innerhalb von 90 min bis zu sechs Marker in einem einzigen Gewebeabschnitt färben.
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Protocol
Mausmilz und HLF16 Maustumorgewebe23 wurden aus unserem Labor gewonnen. Menschliches Mandelgewebe wurde von einem kommerziellen Anbieter gekauft. Einzelheiten finden Sie in der Tabelle der Materialien.
1. Gewebeeinbettung
- Einbetten von frischem Gewebe in OCT (optimale Schnitttemperatur) Lösung und Schnappgefrieren mit Trockeneis oder flüssigem Stickstoff.
- Gewebe bei -80 °C lagern.
2. Kryosektion
- Schneiden Sie die Abschnitte in einem Kryostat mit Temperaturen von -25 °C.
HINWEIS: Die bevorzugte Schnittdicke kann angepasst werden, um gestochen scharfe Bilder zu erzeugen. - Platzieren Sie Abschnitte auf geladenen Glasgletten.
- Die Abschnitte für 1 h bei Raumtemperatur (RT) vor der Fixierung in der Histologie für eiskaltes Aceton für 10 min.
HINWEIS: Aceton verursacht die Gerinnung von wasserlöslichen Proteinen und extrahiert Lipide, wirkt sich aber nicht auf kohlenhydrathaltige Bestandteile aus. Im Gegensatz dazu, formalin konserviert die meisten Lipide und hat wenig Einfluss auf Kohlenhydrate24. Die Wahl des Fixativs ist wichtig, abhängig von der Wahl des Markers, der erkannt wird. - Bewahren Sie die Dias bei -20 °C auf.
3. Auswahl von Antikörpern und Fluorophoren
HINWEIS: Vor der Gewebefärbung müssen Antikörperklone validiert werden, die ihre Antigene, die sie interessieren, innerhalb sequenzieller Abschnitte aus acetonfestem Gewebe robust und gezielt färben. Einige Antikörper können eine andere Fixierung erfordern, und ihre Kompatibilität mit anderen Antikörpern im Panel muss ebenfalls empirisch bestimmt werden. Das Ziel ist auch, Fluorophore mit minimalen Überlappungen zu identifizieren, die mit den Epifluoreszenzfiltern für DAPI, FITC, Cy3, Texas Red und Cy5 nachgewiesen werden können.
- Bestätigen Sie die Färbung durch konventionellen IHC- oder Immunfluoreszenz-Nachweis (IF) in Gewebeabschnitten mit bekanntem Expressionszielantigen.
- Bereiten Sie mit den am halbautomatischen Bildgebungssystem verfügbaren Anregungs- und Emissionsfiltersätzen und nach dem Testen verschiedener Kombinationen fluorophorkonjugierter Primärantikörper Fluorophore vor, die minimale spektrale Überlappung haben (siehe Tabelle 1).
4. Färbung
HINWEIS: Die Geweberehydratation und Diawaschachen wurden in einem Coplin-Glas durchgeführt. Die Blockier- und Antikörperinkubationsschritte wurden in einer befeuchteten Diabox durchgeführt.
- Lassen Sie die Dias für 5-10 min auf RT erwärmen.
- Rehydrat in Phosphat gepufferter Saline (PBS) für 5 min.
- Führen Sie einen Blockierungsschritt vor der Färbung von Geweben mit Antikörpern durch. Verwenden Sie für Mausabschnitte eine spezielle Blockierlösung (siehe Materialtabelle) für 10 min bei RT. Für menschliche Abschnitte verwenden Sie 10% normales gepooltes menschliches Serum (NHS), das in PBS für 15 min bei RT verdünnt wird.
HINWEIS: Je nach den zu verwendenden Folgeverfahren können bei Bedarf verschiedene Blockierpuffer getestet werden, um die spezifischen Eigenschaften der Abschnitte beizubehalten. - Waschen Sie die Dias für 5 min in PBS nach der Blockierung.
- Für Multiplex-Färbung, bereiten Sie einen Cocktail von Antikörpern mit kompatiblen Fluorophoren bei vorgegebenen optimalen Verdünnungen.
- Fügen Sie den Cocktail von fluorophor-konjugierten Antikörpern zu den Dias hinzu. Für die Einmarkerfärbung nur den primär konjugierten Antikörper zum Dia hinzufügen.
- Schließen Sie eine Kontrollrutsche ein, die dem gleichen Färbeverfahren unterzogen wird, ohne dass ein primär konjugierter Antikörper zufügnet.
- Inkubieren Sie die Dias für 1 h bei RT im Dunkeln und waschen Sie dann die Dias 2x mit PBS für jeweils 5 min. Von hier aus wird die resultierende Folie als Multiplex-befleckt bezeichnet.
- Um der Folie entgegenzuwirken, fügen Sie DAPI dem Multiplex-befleckten Dia hinzu, brüten Sie 7 min im Dunkeln bei RT und waschen Sie die Dias 2x mit PBS für jeweils 5 min. Nicht eingefärbte und ungefärbte Dias gegenstainen.
- Um den Deckel abzudecken, fügen Sie einen Tropfen des Montagemediums hinzu und legen Sie den Glasdeckel vorsichtig über das Gewebe.
5. Vorbereiten einer Spektralbibliothek
-
Bildaufnahme
- Stellen Sie die Lampenleistung auf 100 % ein. Normalerweise ist die Leistung auf 10% eingestellt, da die Fluoreszenzdetektion auf FFPE-Geweben einen Signalverstärkungsschritt enthält.
- Beginnen Sie mit dem Öffnen der Mikroskop-Betriebssoftware (siehe Tabelle der Materialien).
- Wählen Sie Protokoll bearbeiten und dann Neues Protokollaus.
- Geben Sie einen "Protokollnamen" an, und wählen Sie Fluoreszenz unter Imaging-Modusaus, und geben Sie einen "Studiennamen" an.
- Legen Sie die eingefärbten Dias auf die Bühne und untersuchen Sie jeden Marker in seinem entsprechenden Fluoreszenzkanal, um die Färbung zu gewährleisten. Wählen Sie einen Bereich auf dem Gewebe aus, der das stärkste Signal für den Marker ausdrückt.
- Passen Sie die Belichtungszeiten mit den Optionen Autofokus und Autoexpose an.
- Erfassen Sie Snapshots für die eingefärbten und ungefärbten Folien, und speichern Sie das Protokoll.
HINWEIS: Die folgenden Schritte werden in Machine Learning-Software (siehe Tabelle der Materialien) durchgeführt, indem die einzelnen gebeizten und ungefärbten Dias verwendet werden, um bestimmte Färbungen zu überprüfen und Antikörper-Cross-Talk zu bestimmen. - Laden Sie unter der Registerkarte Bibliotheken erstellen in der Software jedes einzelne Diabild, wählen Sie den entsprechenden Fluor aus, und klicken Sie auf Extrahieren. Die Software extrahiert automatisch das fluoreszenzsignal, das im Fluor ausgewählt wurde.
- Um die extrahierte Farbe zu speichern, klicken Sie auf Speichern im Speicher. Eine "Neue Gruppe" kann erstellt oder die extrahierte Farbe in einer vorhandenen Gruppe gespeichert werden.
-
Überprüfen der Spektralbibliothek
- Überprüfen Sie für jeden Filtersatz das Fenster der Emissionsspektralkurve, das sich rechts neben dem extrahierten Bild befindet.
HINWEIS: Das extrahierte Signal ist korrekt, wenn die Spektralkurve nur in den Filtersätzen beobachtet wird, in denen das Fluorophor nachgewiesen wird. Wenn eine Spektralkurve im falschen Filtersatz beobachtet wird, kann dies bedeuten, dass entweder das im Filtersatz erwartete primärsignal nicht stark genug ist, oder die Software ein anderes Signal erkennt, das zu hoch ist, möglicherweise aufgrund spektraler Überlappung. Versuchen Sie in diesem Fall zunächst, mit dem Werkzeug Verarbeitungsbereiche zeichnen Bereiche um Bereiche zu zeichnen, die den Fluoreszenzmarker und die Autofluoreszenz im Bild ausdrücken. Dies trainiert die Software, um das wahre Signal zu erkennen und alle störenden Signale zu entfernen. Wenn dies nicht funktioniert, wiederholen Sie den Färbevorgang für den eingefärbten Schlitten, um verschiedene Antikörpertitrationen zu testen.
- Überprüfen Sie für jeden Filtersatz das Fenster der Emissionsspektralkurve, das sich rechts neben dem extrahierten Bild befindet.
6. Multispektrale Bildgebung
HINWEIS: Nachdem die Spektralbibliothek erstellt und überprüft wurde, führen Sie die folgenden Schritte für die Multiplex-befleckte Folie aus.
-
Ganzer Dia-Scan
- Passen Sie fokussieren und Belichtungszeiten auf dem Multiplex-befleckten Schlitten anpassen, wie unter Abschnitt 5.1erwähnt.
- Erstellen Sie unter Folien scanneneine neue Aufgabe, und wählen Sie das oben gespeicherte Protokoll aus.
- Führen Sie einen ganzen Diascan auf der Multiplex-befleckten Folie durch.
- Öffnen Sie mit der gesamten Folienscansoftware das gesamte Diascanbild. Dieses Bild wurde nicht spektral ungemischt.
- Wählen Sie mit dem Stamp- oder ROI-Tool Bereiche von Interesse (ROI) für das gesamte Folienscanbild aus. Diese ROIs werden mit den belichtungszeiten in 6.1.1 gescannt, die für die spektrale Unmischung und Analyse verwendet werden.
- Klicken Sie auf Prozessfolie, um ROIs mit 20-facher Vergrößerung zu erwerben
-
Spektrales Unmixing
- Sobald die ROIs erworben wurden, laden Sie in der Machine Learning-Software unter der Registerkarte Manuelle Analyse die multiplexen gebeizten Bilder, indem Sie unter Dateiöffnen klicken.
- Klicken Sie im Dropdown-Menü Spektralbibliotheksquelle auf Fluors auswählen.
- Ein neues Fenster wird geöffnet. Wählen Sie hier die obige Spektralbibliothek oder -gruppe aus.
- Laden Sie das unbefleckte Folienbild. Klicken AF Sie auf das AF-Farbmarkierungssymbol oberhalb der ausgewählten Spektralbibliothek, und zeichnen Sie eine Linie oder region auf der unbefleckten Folie, um die Autofluoreszenz im Gewebe zu identifizieren.
- Weisen Sie auf der Registerkarte Marker und Farben bearbeiten Namen für jede Markierung zu. In diesem Schritt können Pseudofarben zugewiesen werden.
HINWEIS: Die Farbe für das Autofluoreszenzbild ist standardmäßig DarkSlateGray. Ändern Sie dies in Schwarz. - Klicken Sie auf Alle vorbereiten.
-
Überprüfen spektral ungemischter Bilder
HINWEIS: Wenn der Spektral-Unmixing-Schritt abgeschlossen ist, wird ein zusammengesetztes Bild erstellt, das aus allen Farben besteht.- Klicken Sie auf das Symbol "Auge bearbeiten". Hier kann jede Farbe im "Komponentendisplay" ausgeschaltet oder eingeschaltet werden, um die Färbung jedes einzelnen Markers anzuzeigen.
- Überprüfen Sie visuell die Färbung und die Morphologie der Zellen, um sicherzustellen, dass es keine Überlappung des Markers gibt, es sei denn, er ist biologisch relevant. Ein Pathologe kann auch helfen, die Färbung zu überprüfen.
HINWEIS: Die Färbung auf dem Multiplex-Dia sollte validiert werden, indem jeweils ein Fluorophor weggelassen und das Färbemuster überprüft wird. Darüber hinaus wird die Validierung auch dazu beitragen, starke Fluorophore zu identifizieren, die in benachbarten Spektren aufgrund von Antikörper-Cross-Talk oder Durchblutung auftreten. - Klicken Sie für Pathologieansichten, die Hellfeldbilder für jeden Fluoreszenzmarker simulieren, auf die Schaltfläche Komponentenbild auswählen. Wählen Sie hier einen Marker aus, um ein simuliertes Hellfeldbild anzuzeigen.
7. Analysieren von multispektralen Bildern über Zellsegmentierung und Phenotypisierung
HINWEIS: Nach der Überprüfung des spektral ungemischten Bildes kann die Zellsegmentierung mit der Machine Learning-Software durchgeführt werden, die Schritt-für-Schritt-Anleitungen liefert. Die Gewebesegmentierung wurde hier nicht durchgeführt. Wenn das Panel einen oder mehrere gewebespezifische Marker enthält und insbesondere, wenn das Gewebe chaotisch ist, sollte eine Gewebesegmentierung durchgeführt werden.
- Wählen Sie "Zytoplasma" und "Membran" unter der Option 'Segment'.
HINWEIS: "Nuclei" ist standardmäßig ausgewählt. - Wählen Sie einen Marker aus dem Bedienfeld aus. Konfigurieren Sie den Marker, um entweder Kerne, Zytoplasma oder Membran zu erkennen. Beispielsweise kann DAPI ausgewählt werden, um Kerne und CD3 für die Membran zu erkennen.
- Klicken Sie auf die Auslassungsschaltfläche ('...'), um eine Option unter "Verwenden Sie dieses Signal zu finden" auszuwählen. Beispiel: 'nuclei' für DAPI. Für die Segmentierung können mehrere Marker aus dem Bedienfeld ausgewählt werden.
HINWEIS: Wählen Sie für Zytoplasma- oder Membranmarker die Option "Verwenden Sie dieses Signal, um die nukleare Segmentierung zu unterstützen". - Die Software erkennt und erstellt automatisch eine Maske für den Kern, das Zytoplasma und die Membran im Bild.
- Stellen Sie sicher, dass alle Zellen für die Segmentierung "maskiert" sind. Um das anzupassen, wechseln Sie zur Pathologieansicht für den in 7.3ausgewählten Marker. und verwenden Sie die Konfigurationsoptionen in der Software.
- Klicken Sie auf "Segment Alle", um Zellen zu segmentieren.
- Fahren Sie nach der Zellsegmentierung mit Phänotypisierungszellen fort. Wählen Sie in diesem Schritt die Marker aus, die für die Phänotypisierung benötigt werden, und wählen Sie manuell mindestens fünf Zellen aus, die mit dem ausgewählten Marker hell befleckt sind. Dadurch wird die Software so trainiert, dass alle Zellen, die mit dem gewählten Marker im Bild befleckt sind, automatisch erkannt werden.
- Es wird eine Phänotypzuordnung erstellt. Analysieren Sie, um sicherzustellen, dass die mit dem Marker befleckte Zelle korrekt phänotypisiert ist.
HINWEIS: Zellphänotypisierung kann ein iterativer Prozess sein. Wenn die Software nicht in der Lage ist, die Zellen richtig zu phänotypisieren, bedeutet dies, dass das Training unzureichend oder falsch ist. In diesem Fall muss der Benutzer manuell mehr Zellen auswählen und die Software neu trainieren und diesen Schritt wiederholen, bis der Benutzer mit dem Training zufrieden ist. - Erstellen Sie eine Gruppe mit dem Namen "Andere" und schließen Sie Zellen ein, die für keinen der Marker befleckt sind.
HINWEIS: Dieser Schritt ist wichtig, um die Software zu trainieren, um alle ungefärbten Zellen von der Phänotypisierung auszuschließen.
8. Exportieren von Bildern und Analysetabellen
- Klicken Sie auf die Schaltfläche Exportieren, um das Bedienfeld "Exporteinstellungen" anzuzeigen.
- Klicken Sie im "Export-Verzeichnis" auf Durchsuchen, um einen Speicherort zum Exportieren der Bilder auszuwählen.
- Wählen Sie in den "Bildexportoptionen" das Bildausgabeformataus.
- Wählen Sie in der Liste "Bilder zum Exportieren" die zu exportierenden Bilder aus. "Composite image" ist das letzte pseudofarbene ungemischte Bild. "Pathology Views" sind die einzelnen simulierten Hellfeldbilder und die "Component Images (Multi-Image TIFF)" ist eine Multi-Image-TIFF-Datei mit Komponentendaten, die von Drittanbieter-Analysesoftware verwendet werden kann.
- Klicken Sie auf "Export for All", um die Bilder zu exportieren.
HINWEIS: Tabellen aus der Analyse können in diesem Schritt auch ausgewählt und exportiert werden.
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Representative Results
Nachweis von einscheinigten Markern auf gefrorenen Milzabschnitten
Da das halbautomatische Bildgebungssystem ein Flüssigkristall-Tunable-Filter-System (LCTF) verwendet, das einen größeren Bereich der Wellenlängendetektion25ermöglicht und hier keine Signalverstärkungsschritte durchgeführt wurden, haben wir zunächst die Detektion unserer primär konjugierten Antikörper für jeden Marker auf dem Mikroskop optimiert. Ein Beispiel ist in Abbildung 1dargestellt, in der jeder einzelne fleckige Marker pseudorot ist. Die hier verwendeten konjugierten Alexa Fluor-Antikörper wurden von den Unternehmen für Immunfluoreszenz und Durchflusszytometrie validiert. Das Per-CP-Cy5.5 Fluorophor ist jedoch nur für die Durchflusszytometrie validiert. Wir waren in der Lage, diese Farbe in unseren eingefärbten Dias zu erkennen, die die Eignung von durchFlusszytometrie validierten Antikörpern für den Einsatz in der multispektralen Bildgebung unterstützten und den Vorteil boten, solche Antikörper zur Validierung von Beobachtungen mit zwei verschiedenen Techniken (z. B. Durchflusszytometrie und multispektrale Bildgebung) zu verwenden. Anschließend wurden multispektrale Aufnahmen an gefrorenen Geweben durchgeführt.
Mehrfarbige Fluoreszenzerkennung auf gefrorener Mausmilenz
Um die Multiplex-Färbungsmethode und die Spektralbildgebung zu testen, verwendeten wir mausgefrorenes Milzgewebe, das eine Fülle von Immunzellen hat. Abbildung 2 zeigt ein spektral ungemischtes Bild verschiedener Marker in einem Abschnitt der gefrorenen Mausmilz. Die Antikörper, Klone und Konzentrationen, die für die Färbung verwendet werden, sind in Tabelle 2beschrieben. Das aufgenommene Bild zeigt einen Teil der T-Zellzone, der durch das Vorhandensein von CD3-, CD4- und CD8-Markern identifiziert wird, umgeben von myeloischen Zellen, die CD11b exdrücken, die meist in der Randzone beobachtet werden. Regionen von sich ausbreitenden Zellen, die Ki67 exemiten, werden hauptsächlich in Keimzentren beobachtet. Die Option "Pathology Views" für jeden Marker zeigte sein individuelles Färbungsmuster im Gewebe. Es wurden deutliche Färbemuster für CD11b, Ki67 und die CD3-, CD4- und CD8-Marker zusammen beobachtet, was darauf hindeutet, dass die Multiplex-Färbungsmethode und die Spektralbildgebung auf dem gefrorenen Gewebe wirkten.
Mehrfarbige Fluoreszenzerkennung auf gefrorenen menschlichen Mandeln
Nach dem Testen einer Färbeplatte, die für Mausgewebe geeignet ist, haben wir als nächstes ein separates Panel für gefrorenes menschliches Tonsillengewebe bewertet. Abbildung 3 zeigt ein spektral ungemischtes Bild der verschiedenen verwendeten Marker. Die Antikörper, Klone und Konzentrationen, die für die Färbung verwendet werden, sind in Tabelle 2 beschrieben. Das aufgenommene Bild zeigt ein follikuläres Keimzentrum26, das B-Zellen exdrückt, die durch den CD20-Marker identifiziert wurden. Proliferierende Zellen im follikulären Keimzentrum wurden von Ki67 identifiziert. Einige dieser vermehrenden Zellen mit CD20 costainiert und können Zentroblasten27, naive B-Zellen, die aktive somatische Hypermutation durchlaufen. Die follikulären Keimzentren waren von der interfollikulären T-Zellregion umgeben, die durch die Expression von CD3, CD4 und CD8 identifiziert wurde. Auch hier wurden deutliche Färbemuster beobachtet, die bestätigen, dass die Methodik auf einem gefrorenen Gewebe funktionierte.
Anwendung multispektraler Fluoreszenzbildgebung auf gefrorenem Maustumorgewebe
Multispektrale Bildgebung ist ein nützliches Werkzeug zur Überwachung der Infiltration von Immunzellen in Tumoren als Prognose für Immuntherapien. Zu diesem Zweck haben wir uns vorgenommen, eine gefrorene Maustumor-Gewebeprobe zu färben und Immunzellinfiltrate zu erkennen. Die HLF16-Zelllinie wird als humanes Papillomavirus (HPV)+ Tumormodell von Gebärmutterhalskrebs bei transgenen HlA-A*0201 transgenen Mäusen28verwendet. Die transgene Zelllinie wurde durch Transfizieren von Herz-Lungen-Fibroblasten von HLA-A*0201 mit HPV16 E6 und E7 onkogenes und H-Ras V1228entwickelt. T-Zellen und tumorassoziierte Makrophagen sind die häufigsten Immuninfiltrate, die in Tumoren29vorkommen. Abbildung 4 zeigt ein spektral ungemischtes Bild auf einem gefrorenen HLF16-Tumorabschnitt zusammen mit den Pathologieansichten; die einzelnen Färbemuster sind in DerErgänzungsabbildung 1dargestellt. Die Antikörper, Klone und Konzentrationen, die für die Färbung verwendet werden, sind in Tabelle 2 beschrieben. Das aufgenommene Bild zeigt Regionen tumorinfiltrierender T-Zellen, die durch die CD3- und CD8-Marker identifiziert wurden, zusammen mit dem Vorhandensein anderer myeloischer Zelllinien, die durch den CD11b-Marker identifiziert wurden. Der erfasste Bereich zeigt auch tumorassoziierte Makrophagen (TAMs), möglicherweise des M2-Phänotyps, der vom CD206-Marker30erkannt wurde, der eng mit mehreren proliferierenden Zellen verbunden ist, die als Ki67+detektiert wurden.
Die Machine Learning Software2 kommt mit Funktionen wie Gewebe- und Zellanalysen. Diese Analysen werden häufig an FFPE-Geweben durchgeführt, die mit Signalverstärkung gefärbt sind. Da unsere Methodik keine Signalverstärkung verwendet, wollten wir testen, ob die Software zur Analyse von Färbungen an gefrorenen Geweben verwendet werden kann. Mit der adaptiven Funktion der Software konnten wir Zellen auf Basis eines Kern- und Membranmarkers segmentieren und Zellen auf der Grundlage der Marker, die für die Färbung verwendet werden, phänotypisieren. Abbildung 5 zeigt die Zellsegmentierung und Phänotypkarten und die Anzahl der von der Software analysierten gebeizten Zellen für jeden von der Software analysierten Marker, was zeigt, dass die Software für die Quantifizierung multispektraler Färbung auf gefrorenen Geweben verwendet werden kann.
Abbildung 1: Detektieren primärkonjugierter Antikörper mit einem flüssigkristallen Filtermikroskop. Primärkonjugierte Antikörper gegen die angegebenen Marker wurden auf einer gefrorenen Mausmilz befleckt und mit dem multispektralen Bildgebungssystem Vectra 3.0 unter 20x Objektiven nachgewiesen. CD3 auf Alexa Fluor 488, CD8 auf Alexa Fluor 594, CD11b auf Per-CP Cy5.5, CD206 auf Alexa Fluor 647 und Ki67 auf Alexa Fluor 555 wurden verwendet. Jeder Marker ist pseudofarben rot. Auf diesen Folien wurde kein Gegenfleck verwendet. Skalenbalken = 20 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Multispektrale Bildgebung auf einer gefrorenen Mausmilz. (A) Ganzer Dia-Scan der multiplexierten gebeizten Folie unter 4x Objektiven. Für die multispektrale Bildgebung wurde ein 2 x 2-Stempel über verschiedene Bereiche des Gewebes gewählt. Skalenbalken = 100 m. (B) Zusammengesetztes Bild, das unter einem 20-fachen Objektiv nach spektraler Unmischung aufgenommen wurde. Die pseudofarbenen Markierungen werden angezeigt und ein vergrößertes Bild innerhalb des roten Feldes wird neben dem Bild angezeigt. Skalenbalken = 20 m. (C) Pathologieansichten für jeden einzelnen Marker. Neben dem Bild wird ein vergrößertes Bild für jede Markierung innerhalb des roten Feldes angezeigt. Skalenbalken = 20 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Multispektrale Bildgebung auf einer gefrorenen menschlichen Mandel. (A) Ganzer Diascan des multiplexierten gebeizten Dias, der unter einem 4x Objektiv aufgenommen wurde. Für die multispektrale Bildgebung wurde ein 1 x 1 Stempel (669 x 500 m) über verschiedene Bereiche des Gewebes gewählt. Skalenbalken = 100 m. (B) Zusammengesetztes Bild nach spektraler Unmischung unter einem 20-fachen Objektiv. Die pseudofarbenen Markierungen werden angezeigt und ein vergrößertes Bild innerhalb des roten Feldes wird neben dem Bild angezeigt. Skalenbalken = 20 m. (C) Pathologieansichten für jeden einzelnen Marker. Neben dem Bild wird ein vergrößertes Bild für jede Markierung innerhalb des roten Feldes angezeigt. Skalenbalken = 20 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Multispektrale Bildgebung an einem gefrorenen Maustumor. Die multispektrale Bildgebung wurde an einem 1 x 1 Bereich eines gefrorenen Maus-HLF16-Tumors durchgeführt, der unter einem 20-fachen Objektiv aufgenommen wurde. Das zusammengesetzte Bild (oben). Die pseudofarbenen Marker werden angezeigt und die Pathologieansichten (unten) für jeden einzelnen Marker dargestellt. Neben dem Originalbild wird ein vergrößertes Bild für jede Markierung innerhalb des roten Feldes angezeigt. Maßstabsleiste = 20 'm Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Analyse eines gefrorenen Maustumorabschnitts. (A) Zellsegmentierungskarte. Die adaptive Zellsegmentierung mit inForm wurde durchgeführt. Die Software wurde zur Identifizierung von Kernen (grün) und Membran (rot) geschult. (B) Phänotypkarten für jeden gebeizten Marker. Die Software wurde trainiert, um Phänotypen basierend auf der Färbung zu identifizieren. Farbiger Punkt stellt den angegebenen Marker dar. "Andere" (schwarz) bezieht sich auf Zellen, die nicht für den angegebenen Marker befleckt waren. (C) Balkendiagramm (Mittelwert STDEV), das die Anzahl der gebeizten Zellen für jeden Marker in zwei multispektralen Bildern darstellt. Die Zahl gibt Zellen an, die in jedem Bild phänotypisiert sind, gibt jedoch nicht an, ob die Marker koexprimiert sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Fluorophor | Erregungsmaximum (nm) | Emissionsmaximum (nm) | Erwartete Erkennung im Filtersatz (Name) |
| Alexa Fluor 488 | 488 | 519 | Fitc |
| Alexa Fluor 555 | 555 | 580 | Cy3 und Texas Red |
| Alexa Fluor 594 | 590 | 617 | Texas Red |
| Alexa Fluor 647 | 650 | 668 | Texas Red und Cy5 |
| Dapi | 350 | 470 | Dapi |
| PerCP-Cy 5,5 | 482 | 690 | Cy3, Texas Rot und Cy5 |
Tabelle 1: Liste der Fluorophore mit ihren maximalen Anregungs- und Emissionswellenlängen und der erwarteten Detektion in geeigneten Filtersätzen.
| Gefrorene Maus Milz | |||
| Antikörper/Dye | Klon | Konzentration (g/ml) | |
| Alexa Fluor 594 Anti-Maus CD8a | 53-6.7 | 10 | |
| Alexa Fluor 488 Anti-Maus CD3 | 17A2 | 20 | |
| Alexa Fluor 647 Anti-Maus CD4 | GK1.5 | 10 | |
| PerCP-Cy 5.5 Ratte Anti-CD11b | M1/70 | 2 | |
| Alexa Fluor 555 Maus Anti-Ki-67 | B56 | 10 | |
| Dapi | 0.1 | ||
| Gefrorene Maus Tumor | |||
| Antikörper/Dye | Klon | Konzentration (g/ml) | |
| Alexa Fluor 594 Anti-Maus CD8a | 53-6.7 | 20 | |
| Alexa Fluor 488 Anti-Maus CD3 | 17A2 | 20 | |
| Alexa Fluor 647 Anti-Maus CD206 (MMR) | C068C2 | 5 | |
| PerCP-Cy5.5 Ratte Anti-CD11b | M1/70 | 1 | |
| Alexa Fluor 555 Maus Anti-Ki-67 | B56 | 0.25 | |
| Dapi | 0.1 | ||
| Gefrorene menschliche Tonsil | |||
| Antikörper/Dye | Klon | Konzentration (g/ml) | |
| Alexa Fluor 594 antihuman CD3 | UCHT1 | 10 | |
| PerCP/Cyanin5.5 antihuman CD4 | RPA-T4 | 4 | |
| Alexa Fluor 647 antihuman CD8a | C8/144B | 10 | |
| Alexa Fluor 488, eBioscience antihuman CD20 | L26 | 10 | |
| Alexa Fluor 555 Maus Anti-Ki-67 | B56 | 1 | |
| Dapi | 0.1 | ||
Tabelle 2: Liste der verwendeten Antikörper, Klone und Konzentrationen.
Ergänzende Abbildung 1: Individuelle Färbemuster des gefrorenen HLF16-Tumors nach spektraler Unmischung. Maßstabsleiste = 20 m Bitte klicken Sie hier, um diese Zahl herunterzuladen.
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Discussion
Gefrorene Gewebe wurden ausgiebig für die mIF-Bildgebung verwendet, um traditionell drei bis vier Marker31 auf einem Gewebe mit der direkten und indirekten Methode32zu erkennen. Bei der direkten Methode werden Antikörper mit fluoreszierenden Farbstoffen oder Quantenpunkten33 konjugiert, um das Gewebe zu kennzeichnen, während bei der indirekten Methode ein unkonjugierter Primärantikörper verwendet wird, um das Gewebe zu kennzeichnen, gefolgt von einem fluorophorkonjugierten Sekundärantikörper, der den primären Antikörper spezifisch erkennt. Einige der kürzlich diskutierten simultanen Multiplex-Färbungsansätze können auch verwendet werden, um gefrorenegewebe zu färben und mehr als vier Marker zu erkennen. Aber die Kosten für die Reagenzien und die Zeit für die Färbung werden intensiv, abhängig von der Anzahl der Marker, die erkannt werden. Eine weitere Multiplex-Technik für gefrorenes Gewebe ist die Multi-Epitop-Ligand-Kartographie (MELC)34. Die Technik beinhaltet die Färbung der Probe mit fluorophorkonjugierten Antikörpern, Bildgebung und Photobleichung des Fluorophors. Ein wesentlicher Vorbehalt dieser Technik ist, dass nur ein Feld oder eine Region des Gewebes multiplexiert werden kann. Um andere Felder oder Regionen zu multiplexen, muss die Technik manuell ausgeführt werden, was zeitaufwändig ist oder eine Automatisierung erfordert, was kostspielig ist. Eine Gruppe35 konnte sechs Farben auf gefrorenem Gewebe mithilfe einer Kombination aus direkter, indirekter und TSA-Färbung erkennen. Die Gewebefärbung dauerte jedoch 2 Tage. Im Vergleich dazu verwendet unsere Methodik eine simultane Multiplex-Färbungsmethode, bei der ein Cocktail aus fünf direkt konjugierten Antikörpern plus DAPI verwendet wird, um gefrorenegewebe innerhalb von 90 min zu färben. Darüber hinaus konnten wir mit Hilfe eines semispektralen Fluoreszenz-Bildgebungssystems sechs Marker in gefrorenen Milz-, Mandel- und Tumorgeweben mit dieser vereinfachten Multiplex-Färbungstechnik spektral trennen und detektieren. Die cy3, Texas Red und die Cy5-Filtersätze, die auf dem Mikroskop verfügbar sind, bieten Möglichkeiten, zusätzliche Fluorophore zu erkennen, wodurch die Anzahl der Marker, die gleichzeitig in gefrorenen Geweben nachgewiesen werden können, potenziell erhöht werden kann.
Multiplex-Färbung mit dem TSA-Ansatz auf FFPE-Gewebeerfordert einen Antigen-Retrieval-Schritt, gefolgt von sequenziellen Etikettierungs-, Wasch- und Abisolierschritten. Die Durchführung des Verfahrens reicht von 1-2 Tagen, abhängig von den Inkubationszeiten, die für dieAntikörper6 verwendet werden. Kürzlich wurde mit einem mikrofluidischen Gewebeprozessor eine Vierplexfärbung nach dem TSA-Ansatz an FFPE-Geweben unter 90 min durchgeführt. Andere Multiplex-Techniken für FFPE-Gewebe können mit einem automatisierten Färbemittel unter 4–5 h durchgeführt werden. Allerdings müssen die entsprechenden Antigen-Retrieval-Schritte optimiert werden, um die Epitopverfügbarkeit für die Antikörper36zu gewährleisten, was wiederum auf der sorgfältigen Berücksichtigung der Antikörperklone sowie der Reihenfolge der marker beruht, die erkannt werden. Beispielsweise können einige Antikörper-Klone von CD3 nicht verwendet werden, da anschließend CD4- undCD8-Antikörpernicht erkannt werden 37 . Ebenso gibt es eine Variabilität der Antigendetektion zwischen den verfügbaren Antikörperklonen17,18. Daher erfordert die Multiplexfärbung von FFPE-Geweben die Optimierung von Antikörperklonen, deren Konzentrationen und der Reihenfolge, in der sie gefärbt sind, was alles zeitaufwändig ist. Im Gegensatz dazu ermöglicht der Mangel an umfangreicher Gewebeverarbeitung von gefrorenem Gewebe die Verwendung verschiedener Antikörperklone mit hoher Spezifität. Darüber hinaus können Antikörperklone, die für gefrorenegewebe verfügbar sind, auch in der Durchflusszytometrie und ELISA verwendet werden, was eine gleichzeitige Validierung über verschiedene Assays hinweg ermöglicht. Gewebearchitektur ist auch ein Problem in gefrorenenGeweben 38. Die hier gezeigte Multiplexfärbung auf gefrorenem Gewebe ist deutlich schneller als der TSA-Ansatz. Die Fluorophor-Kombinationen erfordern eine sorgfältige Auswahl von Markern, um sicherzustellen, dass Antikörper sich nicht sterisch behindern, insbesondere wenn verschiedene Antigene, die an der gleichen zellulären Stelle ausgedrückt werden, nachgewiesen werden. Wir haben Marker ausgewählt, die verschiedene Zellen auf Fluorophoren färben, die spektral getrennt sind, was eine bessere Detektion ermöglicht. Die Antikörperkonzentrationen erfordern ebenfalls eine Optimierung, aber da das Färbeprotokoll schnell ist, ist die Gesamtzeit für die Optimierung nicht zeitaufwändig. Ein Vorbehalt unserer Methode kann die Unfähigkeit sein, niedrig exsemitende Marker in Geweben zu erkennen. Einige der Multiplex-Färbungsansätze auf FFPE-Geweben beinhalten einen Signalverstärkungsschritt, der nützlich ist, um niedrig exszierende Marker zu erkennen. Jedoch, die Verwendung von sekundären und tertiären Antikörpern kann verwendet werden, um das Signal zu steigern. In solchen Fällen sollte eine Kreuzreaktivität gegenüber Antikörpern im Panel vermieden werden, um eine falsche Interpretation der Ergebnisse zu vermeiden.
Neben Mausmilzen und menschlichen Mandelgeweben, die reich an Immunzellen sind, haben wir Tumorgewebe als Beispiel für die vorgeschlagene multispektrale Fluoreszenzbildgebung von gefrorenen Geweben verwendet. Multispektrale Fluoreszenz-Bildgebung in Tumoren hat wertvolle Informationen geliefert, wie die Charakterisierung der Tumor-Mikroumgebung (TME)39, Vorhersage des Erfolgs von Adoptiv-T-Zell-Transfers bei malignem Melanom40, und charakterisierende Proteine in Tumorsignaltransduktionsbahnen41. Mithilfe von Markern, die spezifisch für Immunzellen sind, die häufig in Tumoren gefunden werden, konnten wir infiltrierende CD8-T-Zellen und TAMs im in dieser Studie verwendeten TUMORgewebe HLF16 erkennen. Wir nutzten die Machine Learning-Software, um Zellen des Typs Maschinell erfolgreich zu segmentieren und zu phänotypieren. Multiplex-Färbung für FFPE-Gewebe verwendet einen Signalverstärkungsschritt, um das Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) zu verbessern, das die Bildverarbeitung und Quantifizierung42,43unterstützt. Die Machine Learning Software wurde für Analysen an FFPE-Geweben verwendet, die mit Signalverstärkung2gefärbt sind. Die hier vorliegende Methodik verwendet keine Signalverstärkung, aber wir konnten Zellen mit der Software erfolgreich segmentieren und phänotypieren. Für die weitere Analyse (z. B. Phänotyp-Koexpression und räumliche Beziehungen) und eine genaue Interpretation der Quantifizierung erfordert das Softwaretraining eine Validierung mit einem Trainingssatz, einem Testsatz und einem Validierungssatz. In einem iterativen Prozess wird ein Satz von Bildern (d. h. der Trainingssatz) verwendet, um die Machine Learning-Software zu trainieren, um die Phänotypen zu identifizieren, bis die Vorhersagen des Modells für einen separaten Satz von Bildern (d. h. der Testsatz) korrekt sind. Nach Abschluss der Schulung wird eine endgültige Flächenstillegungsserie (d. h. der Validierungssatz) analysiert, um festzustellen, ob eine Überanpassung vorliegt.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die hier vorgestellte Methode eine schnelle Methode zur Durchführung multispektraler Fluoreszenz-Bildgebung mit gefrorenem Gewebe darstellt. Die Methode ist nützlich, um Marker zu erkennen, für die entweder Antikörper nicht verfügbar sind oder die in FFPE-Geweben nicht erkannt werden können. In Verbindung mit der Machine Learning-Software kann die Zeit für die Durchführung quantitativer Analysen schnelle präklinische und klinische Diagnosen erheblich erleichtern und kann im Bereich der hochauflösenden räumlichen Transkriptomik angewendet werden, die gefrorenegewebe verwendet44.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Acknowledgments
Die Anleitung zur Bildgebung und Analyse wurde vom Research Resources Center – Research Histology and Tissue Imaging Core an der University of Illinois at Chicago mit Unterstützung des Büros des Vizekanzlers für Forschung bereitgestellt. Die Arbeit wurde von NIH/NCI RO1CA191317 an CLP, von NIH/NIAMS (SBDRC Grant 1P30AR075049-01) an Dr. A. Paller und mit Unterstützung des Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center an den Immunotherapy Assessment Core an der Northwestern University unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone (histological grade) | Fisher Scientific | A16F-1GAL | Fixing tissues |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse CD3 | BioLegend | 100212 | Clone - 17A2; primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 488, eBioscience anti-human CD20 | ThermoFisher Scientific | 53-0202-82 | Clone - L26; primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 555 Mouse anti-Ki-67 | BD Biosciences | 558617 | Primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 594 anti-human CD3 | BioLegend | 300446 | Clone - UCHT1; primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 594 anti-mouse CD8a | BioLegend | 100758 | Clone - 53-6.7; primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 647 anti-human CD8a | BioLegend | 372906 | Clone - C8/144B; primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 647 anti-mouse CD206 (MMR) | BioLegend | 141711 | Clone - C068C2; primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 647 anti-mouse CD4 Antibody | BioLegend | 100426 | Clone - GK1.5; primary conjugated antibody |
| C57BL/6 Mouse | Charles River Laboratories | 27 | Mouse frozen tissues used for multispectral training |
| Coplin Jar | Sigma Aldrich | S6016-6EA | Rehydrating and washing slides |
| DAPI Solution | BD Biosciences | 564907 | Nucleic Acid stain |
| Diamond White Glass Charged Slides | DOT Scientific | DW7590W | Adhering tissue sections |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1x (without Ca and Mg) | Fisher Scientific | MT21031CV | Washing and diluent |
| Gold Seal Cover Slips | ThermoFisher Scientific | 3306 | Protecting stained tissues |
| Human Normal Tonsil OCT frozen tissue block | AMSBio | AMS6023 | Human frozen tissue used for multispectral staining |
| Human Serum 1x | Gemini Bio-Products | 100-512 | Blocking and diluent for human tissues |
| inForm | Akoya Biosciences | Version 2.4.1 | Machine learning software |
| PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD4 | BioLegend | 300529 | Clone - RPA-T4; primary conjugated antibody |
| PerCP-Cy 5.5 Rat Anti-CD11b | BD Biosciences | 550993 | Clone - M1/70; primary conjugated antibody |
| Phenochart | Akoya Biosciences | Version 1.0.8 | Whole slide scan software |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36965 | Mounting medium |
| Research Cryostat | Leica Biosystems | CM3050 S | Sectioning tissues |
| Superblock 1x | ThermoFisher Scientific | 37515 | Blocking mouse tissues |
| Tissue-Tek O.C.T Solution | Sakura Finetek | 4583 | Embedding tissues |
| Vectra 3.0 Automated Quantitative Pathology Imaging System, 6 Slide | Akoya Biosciences | CLS142568 | Semi-automated multispectral imaging system |
| Vectra Software | Akoya Biosciences | Version 3.0.5 | Software to operate microscope |
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