Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

En snabb metod för multispektrala fluorescensavbildning av frysta vävnadssektioner

doi: 10.3791/60806 Published: March 30, 2020

Summary

Vi beskriver en snabb färgning metod för att utföra multispektrala imaging på frysta vävnader.

Abstract

Multispektrala fluorescensavbildning på formalin-fasta paraffin-inbäddade (FFPE) vävnader gör det möjligt att upptäcka flera markörer i ett enda vävnadsprov som kan ge information om antigen coexpression och rumslig fördelning av markörer. Avsaknaden av lämpliga antikroppar för formalin-fasta vävnader kan dock begränsa arten av markörer som kan detekteras. Dessutom är färgningsmetoden tidskrävande. Här beskriver vi en snabb metod för att utföra multispektrala fluorescens imaging på frysta vävnader. Metoden omfattar fluorofore kombinationer som används, detaljerade steg för färgning av mus och mänskliga frysta vävnader, och skanning, förvärv och analys förfaranden. För färgningsanalys används ett kommersiellt tillgängligt halvautomatiskt multispektralt fluorescensavbildningssystem. Genom denna metod, upp till sex olika markörer var färgas och upptäcktes i en enda fryst vävnad avsnitt. Machine learning-analysprogrammet kan fenotypa celler som kan användas för kvantitativ analys. Den metod som beskrivs här för frysta vävnader är användbar för att upptäcka markörer som inte kan detekteras i FFPE-vävnader eller för vilka antikroppar inte är tillgängliga för FFPE-vävnader.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De senaste framstegen inom mikroskopisk avbildning tekniker har avsevärt förbättrat vår kunskap och förståelse för biologiska processer och sjukdomstillstånd. In situ detektion av proteiner i vävnader via kromogena immunohistochemistry (IHC) utförs rutinmässigt i patologi. Detektion av flera markörer med hjälp av kromogenAHC färgning är dock utmanande1 och nyare metoder för att använda multiplex immunofluorescens (mIF) färgning metoder, där flera biologiska markörer är märkta på ett enda vävnadsprov, håller på att utvecklas. Detektion av flera biologiska markörer är användbart, eftersom information om vävnadsarkitektur, rumslig fördelning av celler och antigensamuttryck alla fångas upp i ett enda vävnadsprov2. Användningen av multispektrala fluorescensavbildningsteknik har möjliggjort deteringar av flera biologiska markörer. I denna teknik, med hjälp av specifik optik fluorescensspektra av varje enskild fluorofore kan separeras eller "oblanda", vilket gör det möjligt att upptäcka flera markörer utan spektrala överhörning3. Multispektrala fluorescens imaging blir en kritisk strategi i cellbiologi, preklinisk läkemedelsutveckling, klinisk patologi, och tumör immun-profilering4,,5,6. Viktigt, den spacial fördelningen av immunceller (särskilt CD8 T-celler) kan fungera som en prognostisk faktor för patienter med befintliga tumörer7.

Olika metoder för multiplexfluorescensfärgning har utvecklats och kan utföras antingen samtidigt eller sekventiellt. I den samtidiga färgningsmetoden tillsätts alla antikroppar tillsammans som en cocktail i ett enda steg för att märka vävnaden. UltraPlex-tekniken använder en cocktail av haptenkonjugerade primära antikroppar följt av en cocktail av fluoroforekonjugerade anti-hapten sekundära antikroppar. InSituPlex-teknik8 använder en cocktail av unika DNA-konjugerade primära antikroppar som samtidigt tillsätts vävnaden följt av ett förstärkningssteg och slutligen fluoroforekonjugerade sonder som kompletterar varje unik DNA-sekvens på den primära antikroppen. Båda dessa tekniker möjliggör detektion av fyra markörer plus 4',6-diamino-2-fenylindole (DAPI) för kärnfläckning. Två andra metoder för samtidig multiplexfärgning är baserade på sekundär jonmasspektrometri9. Hyperion Imaging System använder imaging massa cytometri10 för att upptäcka upp till 37 markörer. Denna teknik använder en cocktail av metallkonjugerade antikroppar för att färga vävnaderna, och specifika områden i vävnaderna ablated av en laser och överförs till en massa cytometer där metalljoner upptäcks. En annan liknande teknik är IONPath, som använder multiplexerad jonstrålebildteknik11. Denna teknik använder en modifierad masspektrometri instrument och en syrejonkälla i stället för laser för att ablate metallkonjugerade antikroppar. Medan alla dessa samtidiga multiplex färgning metoder möjliggör detektion av flera markörer, kostnaderna för konjugera DNA, haptens, eller metaller till antikroppar, förlust av vävnad på grund av ablation, och omfattande bildbehandling för oblandning kan inte underskattas. Dessutom, kit och färgning protokoll är för närvarande endast tillgängliga för FFPE vävnader och utveckla anpassade paneler medför ytterligare tid och utgifter.

Den sekventiella multiplexfärgningsmetoden omfattar däremot märkning av vävnaden med en antikropp till en markör, strippning för att avlägsna antikroppen, följt av sekventiella upprepningar av denna process för att märka flera markörer12. Tyramidsignalförstärkning (TSA) är den vanligaste sekventiella multiplexeringsmetoden. Två andra multiplexeringstekniker använder en kombination av samtidiga och sekventiella färgningsmetoder. CODEX-plattformen13 använder en cocktail av antikroppar som är konjugerade till unika DNA-oligonukleotidsekvenser som så småningom är märkta med en fluorofore med hjälp av ett indexerat polymerisationssteg följt av bildbehandling, strippning och upprepande av processen för att upptäcka upp till 50 markörer. MultiOmyx multiplex färgning strategi14 är en iteration av färgning med en cocktail av tre till fyra fluoroforekonjugerade antikroppar, imaging, släcka fluorofores, och upprepa denna cykel för att upptäcka upp till 60 markörer på en enda sektion. I likhet med den samtidiga multiplexfärgningsmetoden, medan ett brett spektrum av markörer kan detekteras, är tiden som är involverad i färgning, bildförvärv, bearbetning och analys omfattande. Strippnings-/släckningssteget innebär uppvärmning och/eller blekning av vävnadsprovet och därmed utförs den sekventiella multiplexfärgningsmetoden vanligen på FFPE-vävnader som bibehåller vävnadsintegritet vid uppvärmning eller blekning.

Formalin fixering och efterföljande paraffin inbäddning utförs lätt i en klinisk miljö, vävnad block är lätta att lagra, och flera multiplex färgning protokoll finns tillgängliga. Emellertid, bearbetning, inbäddning och deparaffinisering av FFPE vävnader, samt antigenhämtning 15, en process genom vilken antikroppar bättre kan komma åt epitopes, är tidskrävande. Dessutom bidrar bearbetningen i FFPE-vävnader till autofluorescens16 och masker måleptoper, vilket resulterar i variationer och brist på antikroppsklon tillgängliga för att upptäcka antigener i FFPE-vävnaderna17,,18,19. Ett exempel är human leukocyte antigen (HLA) klass I alleler20. Däremot innebär snap frysning av vävnader inte omfattande bearbetningssteg före eller efter fastställande, kringgå behovet av antigen hämtning21,22, och gör det fördelaktigt för att upptäcka ett bredare spektrum av mål. Därför kan det vara värdefullt att använda frysta vävnader för multispektrala fluorescensavbildning för att upptäcka mål för prekliniska och kliniska studier.

Med tanke på de ovan nämnda begränsningarna vid användning av FFPE vävnader, frågade vi om multispektrala fluorescens imaging kan utföras på frysta vävnader. För att ta itu med denna fråga testade vi en samtidig multiplex färgning metod med hjälp av en panel av fluoroforekonjugerade antikroppar för att upptäcka flera antigener och analyserade färgning med hjälp av en halvautomatad multispektrala bildsystem. Vi kunde samtidigt färga upp till sex markörer i en enda vävnad avsnitt inom 90 min.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Mus mjälte och HLF16 mus tumör vävnader23 erhölls från vårt laboratorium. Mänsklig tonsill vävnad köptes från en kommersiell leverantör. Detaljer finns i tabellen över material.

1. Vävnad inbäddning

  1. Bädda in färsk vävnad i OCT -lösningen (optimal skärtemperatur) och snäppfrys med antingen torris eller flytande kväve.
  2. Lagra vävnader vid -80 °C.

2. Kryosectioning

  1. Skär 8 μm sektioner i en kryostat med temperaturer inställda på -25 °C.
    OBS: Den föredragna snitttjockleken kan justeras för att generera skarpare bilder.
  2. Placera sektioner på laddade glasrutschbanor.
  3. Lufttorka sektionerna i 1 h vid rumstemperatur (RT) före fixering i histologi klass iskalla aceton i 10 min.
    OBS: Aceton orsakar koagulation av vattenlösliga proteiner och extraherar lipider men påverkar inte kolhydrathaltiga komponenter. Däremot bevarar formalin de flesta lipider och har liten inverkan på kolhydrater24. Valet av fixativ är viktigt beroende på valet av markör som upptäcks.
  4. Förvara rutschbanorna vid -20 °C.

3. Urval av antikroppar och fluorofores

OBS: Före vävnad färgning, antikroppar kloner som kommer att robust och specifikt färga deras antigener av intresse inom sekventiella sektioner från aceton fast vävnad måste valideras. Vissa antikroppar kan kräva en annan fixativ, och deras kompatibilitet med andra antikroppar i panelen måste också empiriskt fastställas. Målet är också att identifiera fluorofores med minimal överlappning som kan detekteras med epifluorescensfilter för DAPI, FITC, Cy3, Texas Red och Cy5.

  1. Bekräfta färgning genom konventionell IHC eller immunofluorescens (IF) detektion i vävnadssektioner med känt uttryck mål antigen.
  2. Med hjälp av de excitations- och utsläppsfiltersatser som finns tillgängliga på det halvautomatiserade bildsystemet och efter att ha testat olika kombinationer av fluoroforekonjugerade primära antikroppar, bered fluoroforeer som ska användas som har minimal spektralöverlappning (t.ex. se tabell 1).

4. Färgning

OBS: Vävnaden rehydrering och diatvättar utfördes i en Coplin burk. De blockerande och antikroppar inkubation steg utfördes i en fuktad slide box.

  1. Låt bilderna värmas upp till RT i 5–10 minuter.
  2. Rehydrera i fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) i 5 min.
  3. Utför ett blockerande steg innan färgning vävnader med antikroppar. För mussektioner, använd specialiserad blockeringslösning (se Tabell över material) i 10 min vid RT. För mänskliga sektioner, använd 10% normalt poolat humant serum (NHS) utspätt i PBS i 15 min vid RT.
    OBS: Olika blockeringsbuffertar kan testas efter behov för att bevara avsnittens specifika egenskaper beroende på vilka uppföljningsprocedurer som ska användas.
  4. Tvätta rutschbanorna i 5 min i PBS efter blockering.
  5. För multiplexfärgning, förbered en cocktail av antikroppar med kompatibla fluorofores vid förutbestämda optimala utspädningar.
  6. Tillsätt cocktail av fluoroforekonjugerade antikroppar till diabilderna. För enmarkörfärgning, lägg bara till den primärkonjugerade antikroppen på bilden.
  7. Inkludera en kontroll ofläckad bild som genomgår samma färgningsprocedur utan tillsats av primärkonjugerad antikropp.
  8. Inkubera bilderna i 1 h vid RT i mörker och tvätta sedan rutschbanorna 2x med PBS i 5 min vardera. Från och med nu kallas den resulterande bilden multiplex-färgade.
  9. För att motverka, lägg till DAPI till multiplex-färgade bilden, inkubera i 7 min i mörkret på RT, och tvätta bilderna 2x med PBS i 5 min vardera. Motbehåll inte enkelfärgade och ofläckade diabilder.
  10. Till coverslip, tillsätt en droppe av monteringsmediet, och försiktigt placera glasöverklädet över vävnaden.

5. Förbereda ett spektralbibliotek

  1. Bild förvärv
    1. Ställ in lampeffekten på 100%. Vanligtvis är effekten inställd på 10% eftersom fluorescens detektion på FFPE vävnader innehåller en signal förstärkning steg.
    2. Börja med att öppna mikroskopets operativsystem (se Tabell över material).
    3. Välj Redigera protokoll och sedan Nytt protokoll.
    4. Ange ett "protokollnamn" och välj Fluorescens under bildningslägeoch ange ett "studienamn".
    5. Placera de enfärgade rutschbanorna på scenen och undersök varje markör i motsvarande fluorescenskanal för att säkerställa färgning. Välj en region på vävnaden som uttrycker den starkaste signalen för markören.
    6. Justera exponeringstiderna med alternativen Autofokus och Automatiskexponering.
    7. Hämta ögonblicksbilder för enfärgade och ofläckade bilder och spara protokollet.
      OBS: Följande steg utförs i maskininlärningsprogramvara (se Tabell över material),med hjälp av enfärgade och ofläckade bilder för att verifiera specifik färgning samt för att bestämma antikroppskorssamtal.
    8. Läs in varje bildbild med en färgas, välj lämplig Fluor under fliken Bygg bibliotek i programvaran, välj lämplig Fluor och klicka på Extrahera. Programvaran extraherar automatiskt fluorescenssignalen som valts i Fluor.
    9. Om du vill spara den extraherade färgen klickar du på Spara för att lagra. En "ny grupp" kan skapas eller den extraherade färgen kan lagras i en befintlig grupp.
  2. Verifiera det spektrala biblioteket
    1. Kontrollera fönstret för utsläppsspektrala kurv, som ligger till höger om den extraherade bilden, för varje filteruppsättning.
      OBS: Den extraherade signalen är korrekt om den spektrala kurvan endast observeras i de filteruppsättningar där fluorofore detekteras. Om en spektralkurva observeras i fel filteruppsättning kan det innebära att antingen den primära signal som förväntas i filteruppsättningen inte är tillräckligt stark eller att programvaran detekterar en annan signal som är för hög, möjligen på grund av spektralöverlappning. I det här fallet kan du först prova att använda verktyget Rita bearbetningsregioner för att rita områden runt områden som uttrycker fluorescerande markör och autoflöde i bilden. Detta tränar programvaran för att upptäcka den sanna signalen och ta bort eventuella störande signaler. Om detta inte fungerar, upprepa färgningsprocessen för den enfärgade bilden för att testa olika antikroppstitreringar.

6. Multispektrala imaging

OBS: När det spektrala biblioteket har skapats och verifierats utför du följande steg för den multiplexfärgade bilden.

  1. Hela bildsökning
    1. Justera fokus- och exponeringstiderna på den multiplexfärgade bilden enligt avsnitt 5.1.
    2. Skapa en ny uppgift under Skanna bilderoch välj det protokoll som sparats ovan.
    3. Utför en hel bildsökning på den multiplexfärgade bilden.
    4. Med hjälp av hela bildsökningsprogramvaran öppnar du hela bildsökningsbilden. Den här bilden har inte blandats i spectrally.
    5. Välj intressanta områden över hela bildsökningsbilden med stämpel- eller ROI-verktyget. Dessa ROIs kommer att skannas med hjälp av de exponeringstider som anges i 6.1.1 som ska användas för spektrala blandning och analys.
    6. Klicka på Process slide för att hämta ROIs vid 20x förstoring
  2. Spektralblanda
    1. När ROIs har förvärvats, i maskininlärningsprogram, under fliken Manuell analys, ladda multiplex färgade bilder genom att klicka på Öppna under Arkiv.
    2. Klicka på Välj fluoreri listrutan Spektrala bibliotekskälla .
    3. Ett nytt fönster öppnas. Här väljer du det spektralbibliotek eller den grupp som skapats ovan.
    4. Läs in den ofläckade bildbilden. Klicka AF på af-bläckmarkörikonen ovanför det valda spektralbiblioteket och rita en linje eller region på den ofläckade bilden för att identifiera autofluorescens i vävnaden.
    5. Under fliken Redigera markörer och färger tilldelar du namn för varje markör. Pseudofärger kan tilldelas i det här steget.
      OBS: Färgen för bilden för autofluorescens som standard darkslategray. Ändra detta till Svart.
    6. Klicka på Förbered alla.
  3. Verifiera bild av bild av bild av bild
    När
    det spektrala avblandningssteget är klart skapas en sammansatt bild som består av alla färger.
    1. Klicka på ikonen Redigera visa ögat. Här kan varje färg i "Komponentdisplayen" stängas av eller slås på för att visa färgningen av varje enskild markör.
    2. Inspektera cellernas färgning och morfologi visuellt för att säkerställa att det inte finns någon överlappning av markör, såvida den inte är biologiskt relevant. En patolog kan hjälpa till att kontrollera färgning också.
      OBS: Färgning på multiplexed bilden bör valideras genom att utelämna en fluorofore i taget och granska färgning mönster. Dessutom kommer valideringen också att bidra till att identifiera starka fluorofores som visas i intilliggande spektra på grund av antikroppar kors prata eller avblöda.
    3. För patologivyer, som simulerar ljusfältsbilder för varje fluorescerande markör, klickar du på knappen Välj en komponentbild. Här väljer du en markör för att visa en simulerad ljusfältsbild.

7. Analysera multispektrala bilder via cellsegmentering och fenotypning

OBS: När du har verifierat den spectrally oblandade bilden kan cellsegmentering utföras med hjälp av maskininlärningsprogrammet, som ger steg-för-steg-instruktioner. Vävnadssegmentering utfördes inte här. Om panelen innehåller en eller flera vävnadsspecifika markör och särskilt om vävnaden är rörig, vävnad segmentering bör utföras.

  1. Välj "Cytoplasma" och "Membran" under alternativet Segment.
    "Nuclei" väljs som standard.
  2. Välj en markör på panelen. Konfigurera markören för att upptäcka antingen kärnor, cytoplasma eller membran. Till exempel kan DAPI väljas för att upptäcka kärnor och CD3 för membran.
  3. Klicka på ellipsknappen ('...') för att välja ett alternativ under "använd denna signal för att hitta". Till exempel "kärnor" för DAPI. Flera markörer från panelen kan väljas för segmentering.
    OBS: För cytoplasmatiska markörer eller membranmarkörer väljer du alternativet "Använd den här signalen för att hjälpa till med kärnsegmentering".
  4. Programvaran upptäcker automatiskt och skapar en mask vardera för kärnan, cytoplasma och membran i bilden.
  5. Se till att alla celler är "maskerade" för segmentering. För att justera, växla till patologivyn för den specifika markör som valts i 7.3. och använda konfigurationsalternativen i programvaran.
  6. Klicka på "Segmentera alla" för att segmentera celler.
  7. Efter cellsegmentering, fortsätt med fenotypning celler. I det här steget väljer du de markörer som behövs för fenotypning och manuellt väljer minst fem celler som är ljust färgade med den valda markören. Detta tränar programvaran för att sedan automatiskt upptäcka alla celler färgas med den valda markören i bilden.
  8. En fenotypkarta skapas. Analysera för att säkerställa att cellen färgas med markören är korrekt fenotypad.
    OBS: Cell fenotypning kan vara en iterativ process. Om programvaran inte kan fenotypa cellerna korrekt, betyder det att utbildningen är otillräcklig eller felaktig. I det här fallet måste användaren manuellt välja fler celler och träna om programvaran och upprepa det här steget tills användaren är nöjd med utbildningen.
  9. Skapa en grupp med namnet "Andra" och inkludera celler som inte är färgade för någon av markörerna.
    OBS: Detta steg är viktigt att träna programvaran för att utesluta alla ofläckade celler från fenotypning.

8. Exportera bilder och analystabeller

  1. Klicka på knappen Exportera om du vill visa panelen Exportera inställningar.
  2. I "Exportkatalogen" klickar du på Bläddra för att välja en plats för att exportera bilderna.
  3. I "Bildexportalternativ" väljer du bildutdataformatet.
  4. I listan "Bilder att exportera" väljer du de bilder som ska exporteras. "Sammansatt bild" är den slutliga pseudofärgade oblandade bilden. "Patologi views" är de enskilda simulerade ljusfältsbilderna och "Komponentbilder (multi-image TIFF)" är en TIFF-fil med flera bilder av komponentdata som kan användas av analysprogram från tredje part.
  5. Klicka på knappenExportera för allaom du vill exportera bilderna.
    OBS: Tabeller från analys kan också väljas och exporteras i det här steget.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Detektion av enfärgade markörer på frysta mjältesektioner
Eftersom det halvautomatiska bildsystemet använder ett LCTF-system (Liquid Crystal Tunable Filter) som möjliggör ett bredare spektrum av våglängdsdetektering25, och eftersom inga signalförstärkningssteg utfördes här optimerade vi först detektionen av våra primärkonjugerade antikroppar för varje markör på mikroskopet. Ett exempel visas i figur 1, där varje markör med en färgning är pseudofärgad röd. De Konjugerade Aleksaler som används här har validerats av företagen för immunofluorescens och flödescytometri. Per-CP-Cy5.5 fluorofore valideras dock endast för flödescytometri. Vi kunde upptäcka denna färg i våra single-färgade diabilder, stödja lämpligheten av flödet cytometri validerade antikroppar för användning i multispektrala imaging och ge fördelen av att använda sådana antikroppar för att validera observationer med hjälp av två olika tekniker (dvs flöde cytometri och multispektrala imaging). Vi fortsatte sedan att utföra multispektrala imaging på frysta vävnader.

Multicolor fluorescensdetektering på frusen mus mjälte
För att testa multiplexfärgningsmetoden och spektralavbildning använde vi musfryst mjältevävnad, som har ett överflöd av immunceller. Figur 2 visar en spektrally oblandad bild av olika markörer i en del av frusen mus mjälte. De antikroppar, kloner och koncentrationer som används för färgning beskrivs i tabell 2. Den tagna bilden visar en del av T-cellzonen som identifieras genom närvaron av CD3-, CD4- och CD8-markörer, omgiven av myeloisk celler som uttrycker CD11b som oftast observeras i marginalzonen. Regioner av prolifererande celler som uttrycker Ki67 observeras främst i germinal centra. Alternativet "Patologivyer" för varje markör visade sitt individuella färgningsmönster i vävnaden. Distinkta färgning mönster för CD11b, Ki67 och CD3, CD4 och CD8 markörer tillsammans observerades, vilket tyder på att multiplex färgning metod och spektrala imaging arbetat på den frusna vävnaden.

Fluorescensdetektering i flera färger på frusen tonsill
Efter att ha testat en färgning panel lämpad för musvävnad, bedömde vi nästa en separat panel för frysta mänskliga tonsill vävnad. Bild 3 visar en spektrig oblandad bild av de olika markörer som används. De antikroppar, kloner och koncentrationer som används för färgning beskrivs i tabell 2. Den tagna bilden visar ett follikulärt germinalcenter26 som uttrycker B-celler som identifierats av CD20-markören. Prolifererande celler i follikulära germinal centrum identifierades av Ki67. Några av dessa prolifererande celler kostnadsbegåvade med CD20 och kan vara centroblasts27, naiva B-celler som genomgår aktiv somatisk hypermutation. Follikulära germinal centra omgavs av interfollicular T cell regionen identifieras av uttrycket av CD3, CD4 och CD8. Återigen observerades distinkta färgningsmönster här, vilket bekräftar att metoden fungerade på en frusen vävnad.

Tillämpning av multispektrala fluorescensavbildning på frusen mustumörvävnad
Multispektrala imaging är ett användbart verktyg för övervakning av immuncellinfiltration i tumörer som en prognos för immunterapier. För detta ändamål bestämde vi oss för att färga en frusen mus tumör vävnad prov och upptäcka immun cell infiltrates. HLF16 cellinje används som ett humant papillomvirus (HPV)+ tumör modell av livmoderhalscancer i HLA-A * 0201 transgena möss28. Den transgena cellinjen utvecklades genom transfecting hjärt lung fibroblaster från HLA-A * 0201 med HPV16 E6 och E7 onkogener och H-Ras V1228. T-celler och tumör associerade makrofager är de vanligaste immun infiltrates närvarande i tumörer29. Figur 4 visar en spectrally oblandad bild på en frusen HLF16 tumör avsnitt tillsammans med patologi åsikter; de enskilda färgningsmönstren visas i tilläggssiffra 1. De antikroppar, kloner och koncentrationer som används för färgning beskrivs i tabell 2. Den tagna bilden visar regioner av tumör-infiltrera T-celler som identifierats av CD3 och CD8 markörer tillsammans med förekomsten av andra myeloisk cell härstamningar identifieras av CD11b markör. Den fångade regionen visar också tumör associerade makrofager (TAMs), möjligen av M2 fenotyp, upptäcks av CD206 markör30, som är nära associerad med flera prolifererande celler upptäcks som Ki67+.

Machine learning software2 levereras med funktioner som vävnads- och cellanalyser. Dessa analyser utförs ofta på FFPE vävnader färgas med signal förstärkning. Eftersom vår metod inte använder signalförstärkning, ville vi testa om programvaran kan användas för att analysera färgning på frysta vävnader. Med hjälp av den adaptiva funktionen i programvaran, kunde vi segmentera celler baserat på en nukleär och membran markör och fenotyp celler baserat på markörer som används för färgning. Figur 5 visar cellsegmentering och fenotyp kartor och antalet färgade celler för varje markör analyseras av programvaran, visar att programvaran kan användas för kvantifiering av multispektrala färgning på frysta vävnader.

Figure 1
Figur 1: Detekterar primärkonjugerade antikroppar med hjälp av ett flytande kristalltämpande filtermikroskop. Primära konjugerade antikroppar mot de angivna markörer var färgas på en fryst mus mjälte och upptäcktes med vectra 3.0 multispektrala imaging systemet under 20x mål. CD3 på Alexa Fluor 488, CD8 på Alexa Fluor 594, CD11b på Per-CP Cy5.5, CD206 på Alexa Fluor 647 och Ki67 på Alexa Fluor 555 användes. Varje markör är pseudofärgad röd. Ingen motstain användes på dessa bilder. Skalstång = 20 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Bild 2: Multispektral avbildning på en frusen mus mjälte. (A)Hela bildskanning av multiplexfärgad färgad bild som tagits under 4x-mål. En 2 x 2 stämpel över olika regioner i vävnaden valdes för multispektrala imaging. Skalstång = 100 μm. (B)Sammansatt bild tagen under ett 20x-mål efter spektralbllandning. De pseudofärgade markrarna visas och en förstorad bild i den röda rutan visas bredvid bilden. Skalstång = 20 μm. (C)Patologi vyer för varje enskild markör. En förstorad bild för varje markör i den röda rutan visas bredvid bilden. Skalstång = 20 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Multispektralavbildning på en frusen mänsklig tonsill. (A)Hela bildskanning av multiplexfärgad färgad bild som tagits under ett 4x-mål. En stämpel på 1 x 1 (669 μm x 500 μm) över olika delar av vävnaden valdes för multispektralavbildning. Skalstång = 100 μm. B)Sammansatt bild efter spektralbllandande tagen under ett 20x-mål. De pseudofärgade markrarna visas och en förstorad bild i den röda rutan visas bredvid bilden. Skalstång = 20 μm. (C)Patologi vyer för varje enskild markör. En förstorad bild för varje markör i den röda rutan visas bredvid bilden. Skalstång = 20 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Multispektralavbildning på en frusen mustumör. Multispektrala imaging utfördes på en 1 x 1 region av en fryst mus HLF16 tumör tas under en 20x mål. Den sammansatta bilden (ovan). De pseudofärgade markrarna anges och patologivyerna (nedan) för varje enskild markör avbildas. En förstorad bild för varje markör i den röda rutan visas bredvid den ursprungliga bilden. Skala bar = 20 μm Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: Analys av en frusen mus tumör avsnitt. (A) Cell segmentering karta. Adaptiv cellsegmentering med inForm utfördes. Programvaran har utbildats för att identifiera kärnor (grön) och membran (röd). (B)Fenotyp kartor för varje färgade markör. Programvaran har utbildats för att identifiera fenotyper baserat på färgning. Färgad punkt representerar den angivna markören. "Övrigt" (svart) avser celler som inte har färgats för den angivna markören. (C)Stapelområde (medelvärde ± STDEV) som visar antalet färgade celler för varje markör i två multispektrala bilder. Talet anger celler som är fenotypade i varje bild men anger inte om markörerna är uttryckta. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Fluorofore Maximal excitation (nm) Högsta utsläpp (nm) Förväntad identifiering i filteruppsättning (namn)
Alexa Fluor 488 488 519 Fitc
Alexa Fluor 555 555 580 Cy3 och Texas Red
Alexa Fluor 594 590 617 Texas Röd
Alexa Fluor 647 650 668 Texas Röd och Cy5
DAPI (av samma här) 350 470 DAPI (av samma här)
PerCP-Cy 5,5 482 690 Cy3, Texas Röd och Cy5

Tabell 1: Förteckning över fluorofores med deras maximala excitation och utsläppsvåglängder och förväntad detektion i lämpliga filtermängder.

Frusen mus mjälte
Antikropp/färgämne Klon Koncentration (μg/ml)
Alexa Fluor 594 anti-mus CD8a 53-6.7 10
Alexa Fluor 488 anti-mus CD3 17A2 (PÅ ANDRA) sätt 20
Alexa Fluor 647 anti-mus CD4 GK1.5 10
PerCP-Cy 5,5 Råtta Anti-CD11b M1/70 2
Alexa Fluor 555 Mus anti-Ki-67 B56 (på andra) 10
DAPI (av samma här) 0.1
Fryst mus tumör
Antikropp/färgämne Klon Koncentration (μg/ml)
Alexa Fluor 594 anti-mus CD8a 53-6.7 20
Alexa Fluor 488 anti-mus CD3 17A2 (PÅ ANDRA) sätt 20
Alexa Fluor 647 anti-mus CD206 (MMR) C068C2 5
PerCP-Cy5.5 Råtta Anti-CD11b M1/70 1
Alexa Fluor 555 Mus anti-Ki-67 B56 (på andra) 0.25
DAPI (av samma här) 0.1
Frysta mänskliga tonsill
Antikropp/färgämne Klon Koncentration (μg/ml)
Alexa Fluor 594 anti-mänskliga CD3 UCHT1 (PÅ ETT SÄTT) 10
PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD4 RPA-T4 4
Alexa Fluor 647 anti-mänskliga CD8a C8/144B 10
Alexa Fluor 488, eBioscience anti-mänskliga CD20 L26 (på andra sätt) 10
Alexa Fluor 555 Mus anti-Ki-67 B56 (på andra) 1
DAPI (av samma här) 0.1

Tabell 2: Förteckning över använda antikroppar, kloner och koncentrationer.

Kompletterande figur 1: Individuella färgningsmönster av den frysta HLF16-tumören efter spektralbllandning. Skala bar = 20 μm Klicka här för att ladda ner denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Frysta vävnader har i stor utsträckning använts för mIF-avbildning för att traditionellt upptäcka tre till fyra markörer31 på en vävnad med den direkta och indirekta metoden32. I den direkta metoden konjugeras antikroppar till fluorescerande färgämnen eller kvantprickar33 för att märka vävnaden, medan en okonjugerad primärantikropp i den indirekta metoden används för att märka vävnaden följt av en fluoroforekonjugerad sekundär antikropp som specifikt känner igen den primära antikroppen. Några av de senaste samtidiga multiplex färgning metoder diskuteras tidigare kan också användas för att färga frysta vävnader och upptäcka mer än fyra markörer. Men kostnaden för reagenserna och den tid det tar för färgning blir intensiv beroende på antalet markörer som upptäcks. En annan multiplex teknik för frysta vävnader är multi-epitop-ligand-cartography (MELC)34. Tekniken innebär färgning provet med fluoroforekonjugerade antikroppar, bildframställning och fotobleaching av fluorofore. En stor varning för denna teknik är att endast ett fält eller region i vävnaden kan multiplexeras. För att multiplex andra fält eller regioner tekniken måste utföras manuellt, vilket är tidskrävande, eller kräver automatisering, vilket är dyrt. En grupp35 kunde upptäcka sex färger på frysta vävnader med hjälp av en kombination av direkt, indirekt och TSA färgning. Vävnaden färgning tog dock 2 dagar. I jämförelse använder vår metod en samtidig multiplex färgning metod som innebär tillämpning av en cocktail av fem direkt konjugerade antikroppar plus DAPI att färga frysta vävnader inom 90 min. Dessutom, med hjälp av en halvautomatiska multispektrala fluorescens bildsystem, kunde vi spectrally separera och upptäcka sex markörer i fryst mjälte, tonsill och tumör vävnader med hjälp av denna förenklade multiplex färgning teknik. Cy3, Texas Red, och Cy5 filteruppsättningar som finns på mikroskopet ger möjligheter att upptäcka ytterligare fluorofores, vilket potentiellt ökar antalet markörer som kan upptäckas samtidigt i frysta vävnader.

Multiplex färgning med hjälp av TSA strategi på FFPE vävnader kräver en antigen hämtning steg följt av sekventiell märkning, tvättning och strippning steg. Att utföra proceduren varierar från 1 till 2 dagar beroende på de inkubationstider som används för antikropparna6. Nyligen, med hjälp av en mikrofluidisk vävnad processor, en fyra-plex färgning med TSA metoden utfördes på FFPE vävnader under 90 min. Andra multiplex tekniker för FFPE vävnader kan utföras under 4-5 h med hjälp av en automatiserad stainer. Lämpliga åtgärder för antigenhämtning måste dock optimeras för att säkerställa epitoptillgänglighet för antikropparna36, vilket i sin tur är beroende av att antikroppsklonerna noggrant beaktas samt ordningen på markörer som detekteras. Vissa antikroppskloner av CD3 kan till exempel inte användas, eftersom därefter CD4- och CD8-antikroppar inte detekteras37. På samma sätt finns det variationer i antigendetektering bland de tillgängliga antikroppsklonerna17,,18. Därför kräver multiplexfärgning av FFPE-vävnader optimering av antikroppskloner, deras koncentrationer och i vilken ordning de färgas, som alla är tidskrävande. Däremot möjliggör bristen på omfattande vävnadsbehandling av frysta vävnader för användning av olika antikroppskloner med hög specificitet. Dessutom kan antikroppskloner som finns tillgängliga för frysta vävnader också användas i flödescytometri och ELISA, vilket möjliggör samtidig validering över olika analyser. Vävnadsarkitektur är också ett problem i frysta vävnader38. Multiplex färgning visas här på frysta vävnader är betydligt snabbare än TSA strategi. Fluoroforekombinationerna kräver ett noggrant urval av markörer för att säkerställa att antikroppar inte sterically hindrar varandra, särskilt när olika antigener uttryckta på samma cellulära plats detekteras. Vi valde markörer som färgar olika celler på fluorofores som är spectrally separata, vilket möjliggör bättre upptäckt. Antikroppskoncentrationerna kräver också optimering, men eftersom färgningsprotokollet är snabbt är den totala tiden för optimering inte tidskrävande. En varning till vår metod kan vara oförmågan att upptäcka låg uttrycksmarkörer i vävnader. Några av de multiplex färgning metoder på FFPE vävnader innebär en signal förstärkning steg som är användbart för att upptäcka låg uttryck markörer. Användningen av sekundära och tertiära antikroppar kan dock användas för att öka signalen. I sådana fall bör korsreaktivitet mot antikroppar i panelen undvikas för att förhindra felaktig tolkning av resultaten.

Förutom mus mjälte och mänskliga tonsill vävnader, som är rika på immunceller, har vi använt tumörvävnad som ett exempel för den föreslagna multispektrala fluorescensavbildning av frysta vävnader. Multispektrala fluorescensavbildning i tumörer har gett värdefull information, såsom karakterisering av tumörmikromiljön (TME)39, förutsäga framgången för adoptiv T-cellöverföringar i malignt melanom40, och karakterisera proteiner i tumör signaltransduktionsvägar41. Med hjälp av markörer som är specifika för immunceller som vanligen finns i tumörer, kunde vi upptäcka infiltrera CD8 T-celler och TAMs i HLF16 tumör vävnad som används i denna studie. Vi använde maskininlärningsprogramvaran för att framgångsrikt segmentera och fenotypceller. Multiplex färgning för FFPE vävnader använder en signal förstärkning steg för att förbättra signal-brus (SNR) förhållande som hjälper bildbehandling och kvantifiering42,43. Maskininlärningsprogrammet har använts för analyser av FFPE-vävnader som färgats med signalförstärkning2. Den metod som finns här använder inte signalförstärkning, men vi kunde framgångsrikt segmentera och fenotyp celler med hjälp av programvaran. För vidare analys (t.ex. fenotyp coexpression och rumsliga relationer) och korrekt tolkning av kvantifieringen kräver programvaruutbildningen validering med hjälp av en utbildningsuppsättning, testuppsättning och valideringsuppsättning. I en iterativ process används en uppsättning bilder (dvs. träningsuppsättningen) för att träna maskininlärningsprogrammet för att identifiera fenotyperna tills modellens förutsägelser för en separat uppsättning bilder (dvs. testuppsättningen) är korrekta. Efter att utbildningen är klar analyseras en slutlig grupp av bilder (dvs. valideringsuppsättningen) för att se om det har förekommit övermontering.

Sammanfattningsvis är den metod som presenteras här ett snabbt sätt att utföra multispektrala fluorescens imaging med frusna vävnader. Metoden är användbar för att upptäcka markörer som antingen antikroppar inte är tillgängliga eller inte kan detekteras i FFPE vävnader. I samband med maskininlärningsprogrammet kan den tid det tar att utföra kvantitativa analyser avsevärt underlätta snabba prekliniska och kliniska diagnoser och kan tillämpas inom området högupplösta rumsliga transkriptomik som använder frysta vävnader44.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.

Acknowledgments

Imaging och analys vägledning tillhandahölls av Research Resources Center - Forskning Histologi och Tissue Imaging Core vid University of Illinois i Chicago inrättades med stöd från kontoret för vicekansler för forskning. Arbetet stöddes av NIH/NCI RO1CA191317 till CLP, av NIH/NIAMS (SBDRC grant 1P30AR075049-01) till Dr. A. Paller, och med stöd av Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center till Immunotherapy Assessment Core vid Northwestern University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone (histological grade) Fisher Scientific A16F-1GAL Fixing tissues
Alexa Fluor 488 anti-mouse CD3 BioLegend 100212 Clone - 17A2; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 488, eBioscience anti-human CD20 ThermoFisher Scientific 53-0202-82 Clone - L26; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 555 Mouse anti-Ki-67 BD Biosciences 558617 Primary conjugated antibody
Alexa Fluor 594 anti-human CD3 BioLegend 300446 Clone - UCHT1; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 594 anti-mouse CD8a BioLegend 100758 Clone - 53-6.7; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 647 anti-human CD8a BioLegend 372906 Clone - C8/144B; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 647 anti-mouse CD206 (MMR) BioLegend 141711 Clone - C068C2; primary conjugated antibody
Alexa Fluor 647 anti-mouse CD4 Antibody BioLegend 100426 Clone - GK1.5; primary conjugated antibody
C57BL/6 Mouse Charles River Laboratories 27 Mouse frozen tissues used for multispectral training
Coplin Jar Sigma Aldrich S6016-6EA Rehydrating and washing slides
DAPI Solution BD Biosciences 564907 Nucleic Acid stain
Diamond White Glass Charged Slides DOT Scientific DW7590W Adhering tissue sections
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1x (without Ca and Mg) Fisher Scientific MT21031CV Washing and diluent
Gold Seal Cover Slips ThermoFisher Scientific 3306 Protecting stained tissues
Human Normal Tonsil OCT frozen tissue block AMSBio AMS6023 Human frozen tissue used for multispectral staining
Human Serum 1x Gemini Bio-Products 100-512 Blocking and diluent for human tissues
inForm Akoya Biosciences Version 2.4.1 Machine learning software
PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD4 BioLegend 300529 Clone - RPA-T4; primary conjugated antibody
PerCP-Cy 5.5 Rat Anti-CD11b BD Biosciences 550993 Clone - M1/70; primary conjugated antibody
Phenochart Akoya Biosciences Version 1.0.8 Whole slide scan software
ProLong Diamond Antifade Mountant ThermoFisher Scientific P36965 Mounting medium
Research Cryostat Leica Biosystems CM3050 S Sectioning tissues
Superblock 1x ThermoFisher Scientific 37515 Blocking mouse tissues
Tissue-Tek O.C.T Solution Sakura Finetek 4583 Embedding tissues
Vectra 3.0 Automated Quantitative Pathology Imaging System, 6 Slide Akoya Biosciences CLS142568 Semi-automated multispectral imaging system
Vectra Software Akoya Biosciences Version 3.0.5 Software to operate microscope

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. van der Loos, C. M. Chromogens in Multiple Immunohistochemical Staining Used for Visual Assessment and Spectral Imaging: The Colorful Future. Journal of Histotechnology. 33, (1), 31-40 (2010).
  2. Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: A review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70, (1), 46-58 (2014).
  3. Bian, L., et al. Multispectral imaging using a single bucket detector. Scientific Reports. 6, 24752 (2016).
  4. Zhou, L., El-Deiry, W. S. Multispectral fluorescence imaging. Journal of Nuclear Medicine. 50, (10), 1563-1566 (2009).
  5. Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7, (1), 13380 (2017).
  6. Wickenhauser, C., et al. Immune Checkpoint Blockade: Methods and Protocols. Pico de Coaña, Y. Springer. New York. 13-31 (2019).
  7. Feng, Z., et al. Multispectral imaging of formalin-fixed tissue predicts ability to generate tumor-infiltrating lymphocytes from melanoma. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 3, (1), 47 (2015).
  8. Manesse, M., Patel, K. K., Bobrow, M., Downing, S. R. The InSituPlex((R)) Staining Method for Multiplexed Immunofluorescence Cell Phenotyping and Spatial Profiling of Tumor FFPE Samples. Methods in Molecular Biology. 2055, 585-592 (2020).
  9. Gamble, L. J., Anderton, C. R. Secondary Ion Mass Spectrometry Imaging of Tissues, Cells, and Microbial Systems. Microscopy Today. 24, (2), 24-31 (2016).
  10. Giesen, C., et al. Highly multiplexed imaging of tumor tissues with subcellular resolution by mass cytometry. Nature Methods. 11, (4), 417-422 (2014).
  11. Angelo, M., et al. Multiplexed ion beam imaging of human breast tumors. Nature Medicine. 20, (4), 436-442 (2014).
  12. Tsujikawa, T., et al. Quantitative Multiplex Immunohistochemistry Reveals Myeloid-Inflamed Tumor-Immune Complexity Associated with Poor Prognosis. Cell Reports. 19, (1), 203-217 (2017).
  13. Goltsev, Y., et al. Deep Profiling of Mouse Splenic Architecture with CODEX Multiplexed Imaging. Cell. 174, (4), 968-981 (2018).
  14. Gerdes, M. J., et al. Highly multiplexed single-cell analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, (29), 11982-11987 (2013).
  15. Shi, S. R., Key, M. E., Kalra, K. L. Antigen retrieval in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: an enhancement method for immunohistochemical staining based on microwave oven heating of tissue sections. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 39, (6), 741-748 (1991).
  16. Viegas, M. S., Martins, T. C., Seco, F., do Carmo, A. An improved and cost-effective methodology for the reduction of autofluorescence in direct immunofluorescence studies on formalin-fixed paraffin-embedded tissues. European Journal of Histochemistry. 51, (1), 59-66 (2007).
  17. Sorensen, I. V., et al. Characterization of anti-TIMP-1 monoclonal antibodies for immunohistochemical localization in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 54, (10), 1075-1086 (2006).
  18. Parra, E. R., Villalobos, P., Mino, B., Rodriguez-Canales, J. Comparison of Different Antibody Clones for Immunohistochemistry Detection of Programmed Cell Death Ligand 1 (PD-L1) on Non-Small Cell Lung Carcinoma. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 26, (2), 83-93 (2018).
  19. Boger, C., Kalthoff, H., Goodman, S. L., Rocken, C. Validation and comparison of anti-alphavbeta3 and anti-alphavbeta5 rabbit monoclonal versus murine monoclonal antibodies in four different tumor entities. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 21, (6), 553-560 (2013).
  20. Torigoe, T., et al. Establishment of a monoclonal anti-pan HLA class I antibody suitable for immunostaining of formalin-fixed tissue: unusually high frequency of down-regulation in breast cancer tissues. Pathology International. 62, (5), 303-308 (2012).
  21. Dapson, R. W. Macromolecular changes caused by formalin fixation and antigen retrieval. Biotechnic & Histochemistry. 82, (3), 133-140 (2007).
  22. Sompuram, S. R., Vani, K., Hafer, L. J., Bogen, S. A. Antibodies Immunoreactive With Formalin-Fixed Tissue Antigens Recognize Linear Protein Epitopes. American Journal of Clinical Pathology. 125, (1), 82-90 (2006).
  23. Cassetti, M. C., et al. Antitumor efficacy of Venezuelan equine encephalitis virus replicon particles encoding mutated HPV16 E6 and E7 genes. Vaccine. 22, (3-4), 520-527 (2004).
  24. Kiernan, J. A. Histological and Histochemical Methods: Theory and Practice, 3rd Edition. Shock. 12, (6), 479 (1999).
  25. Favreau, P., et al. Thin-film tunable filters for hyperspectral fluorescence microscopy. Journal of Biomedical Optics. 19, (1), 011017 (2014).
  26. van Kempen, M. J., Rijkers, G. T., Van Cauwenberge, P. B. The immune response in adenoids and tonsils. International Archives of Allergy and Immunology. 122, (1), 8-19 (2000).
  27. Klein, U., Dalla-Favera, R. Germinal centres: role in B-cell physiology and malignancy. Nature Reviews Immunology. 8, (1), 22-33 (2008).
  28. Eiben, G. L., et al. Establishment of an HLA-A*0201 Human Papillomavirus Type 16 Tumor Model to Determine the Efficacy of Vaccination Strategies in HLA-A*0201 Transgenic Mice. Cancer Research. 62, 5792-5799 (2002).
  29. Gonzalez, H., Hagerling, C., Werb, Z. Roles of the immune system in cancer: from tumor initiation to metastatic progression. Genes & Development. 32, (19-20), 1267-1284 (2018).
  30. Sica, A., Schioppa, T., Mantovani, A., Allavena, P. Tumour-associated macrophages are a distinct M2 polarised population promoting tumour progression: potential targets of anti-cancer therapy. European Jorunal of Cancer. 42, (6), 717-727 (2006).
  31. Au-Granier, C., et al. Multiplexed Immunofluorescence Analysis and Quantification of Intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T Cells. Journal of Visualized Experiments. (132), e56606 (2018).
  32. Odell, I. D., Cook, D. Immunofluorescence Techniques. Journal of Investigative Dermatology. 133, (1), 1-4 (2013).
  33. Xing, Y., et al. Bioconjugated quantum dots for multiplexed and quantitative immunohistochemistry. Nature Protocols. 2, (5), 1152-1165 (2007).
  34. Schubert, W., et al. Analyzing proteome topology and function by automated multidimensional fluorescence microscopy. Nature Biotechnology. 24, (10), 1270-1278 (2006).
  35. de Vries, N. L., et al. High-dimensional cytometric analysis of colorectal cancer reveals novel mediators of antitumour immunity. Gut. 03 (2019).
  36. Scalia, C. R., et al. Antigen Masking During Fixation and Embedding, Dissected. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry : Official Journal of the Histochemistry Society. 65, (1), 5-20 (2017).
  37. Sorrelle, N., et al. Improved Multiplex Immunohistochemistry for Immune Microenvironment Evaluation of Mouse Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Tissues. Journal of Immunology. 202, (1), 292-299 (2019).
  38. Ackerman, L. V., Ramirez, G. A. The indications for and limitations of frozen section diagnosis; a review of 1269 consecutive frozen section diagnoses. British Journal of Surgery. 46, (198), 336-350 (1959).
  39. Mezheyeuski, A., et al. Multispectral imaging for quantitative and compartment-specific immune infiltrates reveals distinct immune profiles that classify lung cancer patients. The Journal of Pathology. 244, (4), 421-431 (2018).
  40. Feng, Z., et al. Multiparametric immune profiling in HPV- oral squamous cell cancer. JCI insight. 2, (14), 93652 (2017).
  41. Yang, L., Liu, Z., Tan, J., Dong, H., Zhang, X. Multispectral imaging reveals hyper active TGF-β signaling in colorectal cancer. Cancer Biology & Therapy. 19, (2), 105-112 (2018).
  42. Blom, S., et al. Systems pathology by multiplexed immunohistochemistry and whole-slide digital image analysis. Scientific Reports. 7, (1), 15580-15580 (2017).
  43. Roy, S., Axelrod, H. D., Valkenburg, K. C., Amend, S., Pienta, K. J. Optimization of prostate cancer cell detection using multiplex tyramide signal amplification. Journal of Cellular Biochemistry. 120, (4), 4804-4812 (2019).
  44. Vickovic, S., et al. High-density spatial transcriptomics arrays for in situ tissue profiling. bioRxiv. 563338 (2019).
En snabb metod för multispektrala fluorescensavbildning av frysta vävnadssektioner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jaishankar, D., Cosgrove, C., Deaton, R. J., Le Poole, I. C. A Rapid Method for Multispectral Fluorescence Imaging of Frozen Tissue Sections. J. Vis. Exp. (157), e60806, doi:10.3791/60806 (2020).More

Jaishankar, D., Cosgrove, C., Deaton, R. J., Le Poole, I. C. A Rapid Method for Multispectral Fluorescence Imaging of Frozen Tissue Sections. J. Vis. Exp. (157), e60806, doi:10.3791/60806 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter