Summary
Nous décrivons une méthode de coloration rapide pour effectuer l’imagerie multispectrale sur les tissus congelés.
Abstract
L’imagerie multispectrale de fluorescence sur les tissus formalin-fixes de paraffine-embedded (FFPE) permet la détection de marqueurs multiples dans un seul échantillon de tissu qui peut fournir des informations sur la coexpression d’antigène et la distribution spatiale des marqueurs. Cependant, un manque d’anticorps appropriés pour les tissus formalin-fixes peut restreindre la nature des marqueurs qui peuvent être détectés. En outre, la méthode de coloration prend beaucoup de temps. Ici, nous décrivons une méthode rapide pour effectuer la formation image de fluorescence multispectrale sur les tissus congelés. La méthode comprend les combinaisons de fluorophore utilisées, des étapes détaillées pour la coloration des tissus congelés de souris et humains, et les procédures de numérisation, d’acquisition et d’analyse. Pour l’analyse des colorants, un système d’imagerie multispectral de fluorescence semi-automatique disponible dans le commerce est utilisé. Grâce à cette méthode, jusqu’à six marqueurs différents ont été tachés et détectés dans une seule section de tissu congelé. Le logiciel d’analyse de l’apprentissage automatique peut cellules phénotype qui peuvent être utilisés pour l’analyse quantitative. La méthode décrite ici pour les tissus congelés est utile pour la détection de marqueurs qui ne peuvent pas être détectés dans les tissus de la FFPE ou pour lesquels les anticorps ne sont pas disponibles pour les tissus FFPE.
Introduction
Les progrès récents dans les techniques d’imagerie microscopique ont considérablement amélioré nos connaissances et notre compréhension des processus biologiques et des états pathologiques. La détection in situ des protéines dans les tissus par immunohistochimie chromogénique (IHC) est régulièrement effectuée en pathologie. Cependant, la détection de marqueurs multiples utilisant la coloration chromogénique de LHC est difficile1 et de nouvelles méthodes pour employer des approches de coloration d’immunofluorescence multiplex (mIF), où plusieurs marqueurs biologiques sont étiquetés sur un seul échantillon de tissu, sont en cours de développement. La détection de marqueurs biologiques multiples est utile, parce que les informations liées à l’architecture des tissus, la distribution spatiale des cellules, et la co-expression des antigènes sont tous capturés dans un seul échantillon de tissu2. L’utilisation de la technologie d’imagerie par fluorescence multispectrale a rendu possible la détection de plusieurs marqueurs biologiques. Dans cette technologie, en utilisant des optiques spécifiques les spectres de fluorescence de chaque fluorophore individuel peuvent être séparés ou «non mélangés», permettant la détection de marqueurs multiples sans aucune traque spectrale3. L’imagerie multispectrielle de fluorescence devient une approche critique dans la biologie cellulaire, le développement préclinique de drogue, la pathologie clinique, et le profilage immunitaire de tumeur4,,5,6. Fait important, la distribution spaciale des cellules immunitaires (en particulier les lymphocytes T CD8) peut servir de facteur pronostique pour les patients atteints de tumeurs existantes7.
Diverses approches de coloration de fluorescence multiplex ont été développées et peuvent être effectuées simultanément ou séquentiellement. Dans la méthode de coloration simultanée, tous les anticorps sont ajoutés ensemble comme un cocktail en une seule étape pour étiqueter le tissu. La technologie UltraPlex utilise un cocktail d’anticorps primaires conjugués à l’hapten, suivi d’un cocktail d’anticorps secondaires anti-hapten conjugués au fluorophore. InSituPlex technology8 utilise un cocktail d’anticorps primaires conjugués à l’ADN uniques qui sont simultanément ajoutés au tissu suivis d’une étape d’amplification et enfin de sondes épurées au fluorophore qui sont complémentaires à chaque séquence d’ADN unique sur l’anticorps primaire. Ces deux technologies permettent la détection de quatre marqueurs plus 4',6-diamino-2-phenylindole (DAPI) pour la coloration nucléaire. Deux autres approches pour la coloration simultanée de multiplex sont basées sur la spectrométrie secondaire de masse d’ion9. Le système d’imagerie Hyperion utilise la cytométrie de massed’imagerie 10 pour détecter jusqu’à 37 marqueurs. Cette technologie utilise un cocktail d’anticorps conjugués au métal pour tacher les tissus, et des zones spécifiques des tissus sont ablés par un laser et transférées à un cytomètre de masse où les ions métalliques sont détectés. Une autre technologie similaire est l’IONPath, qui utilise la technologie d’imagerie à faisceau d’ions multiplexed11. Cette technologie utilise un instrument de spectrométrie de masse modifié et une source d’ions d’oxygène au lieu d’un laser pour abler les anticorps conjugués au métal. Bien que toutes ces approches simultanées de coloration multiplexe permettent la détection de marqueurs multiples, les coûts impliqués pour conjuguer l’ADN, les haptens ou les métaux aux anticorps, la perte de tissu due à l’ablation, et le traitement d’image étendu pour le semage ne peut pas être sous-estimé. En outre, les kits et les protocoles de coloration ne sont actuellement disponibles que pour les tissus FFPE et le développement de panneaux personnalisés implique plus de temps et de dépenses.
La méthode séquentielle de coloration multiplex, en revanche, comprend l’étiquetage du tissu avec un anticorps à un marqueur, le décapage pour enlever l’anticorps, suivi par des répétitions séquentielles de ce processus pour étiqueter plusieurs marqueurs12. L’amplification du signal de tyramide (TSA) est la méthode de multiplexe séquentielle la plus fréquemment utilisée. Deux autres technologies de multiplexage utilisent une combinaison de méthodes de coloration simultanées et séquentielles. La plate-forme CODEX13 utilise un cocktail d’anticorps conjugués à des séquences uniques d’oligonucléotide d’ADN qui sont finalement étiquetés avec un fluorophore à l’aide d’une étape de polymérisation indexée suivie de l’imagerie, le décapage et la répétition du processus pour détecter jusqu’à 50 marqueurs. L’approche de coloration multiplexe MultiOmyx14 est une itération de colorant avec un cocktail de trois à quatre anticorps fluorophore-conjugués, imagerie, étanchéité des fluorophores, et répétant ce cycle pour détecter jusqu’à 60 marqueurs sur une seule section. Semblable à la méthode simultanée de coloration multiplex, tandis qu’un large éventail de marqueurs peuvent être détectés, le temps impliqué dans la coloration, l’acquisition d’image, le traitement, et l’analyse est étendu. L’étape de décapage/étanchéité consiste à chauffer et/ou à blanchir l’échantillon de tissu et, par conséquent, l’approche séquentielle de coloration multiplexe est couramment pratiquée sur les tissus ffPE qui maintiennent l’intégrité des tissus lors du chauffage ou du blanchiment.
La fixation de formaline et l’intégration subséquente de paraffine sont facilement exécutées dans un arrangement clinique, les blocs de tissu sont faciles à stocker, et plusieurs protocoles de coloration de multiplexe sont disponibles. Cependant, le traitement, l’intégration et la deparaffinisation des tissus FFPE, ainsi que la récupération d’antigène15, un processus par lequel les anticorps peuvent mieux accéder aux épitopes, prend beaucoup de temps. En outre, le traitement impliqué dans les tissus FFPE contribue à l’autofluorescence16 et les masques ciblent les épitopes, résultant en la variabilité et le manque de clone d’anticorps disponibles pour détecter les antigènes dans les tissus FFPE17,18,19. Un exemple est l’antigène leucocyte humain (HLA) classe I allèles20. En revanche, la congélation rapide des tissus n’implique pas d’étapes de traitement étendues avant ou après la fixation, contournant le besoin de récupération d’antigène21,22, et le rendant bénéfique pour détecter un plus large éventail de cibles. Par conséquent, l’utilisation de tissus congelés pour l’imagerie multispectrale de fluorescence peut être utile pour détecter des cibles pour des études précliniques et cliniques.
Étant donné les limites mentionnées ci-dessus lors de l’utilisation des tissus FFPE, nous avons demandé si l’imagerie multispectrale de fluorescence peut être effectuée sur les tissus congelés. Pour répondre à cette question, nous avons testé une méthode simultanée de coloration multiplexe à l’aide d’un panel d’anticorps fluorophore-conjugués pour détecter de multiples antigènes et analysé la coloration à l’aide d’un système d’imagerie multispectral semi-automatique. Nous avons pu tacher simultanément jusqu’à six marqueurs dans une seule section tissulaire dans un rayon de 90 min.
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Protocol
La rate de souris et les tissus de tumeur de souris de HLF1623 ont été obtenus de notre laboratoire. Des tissus d’amygdale humaine ont été achetés auprès d’un vendeur commercial. Les détails sont fournis dans la Table des Matériaux.
1. Embedding tissu
- Intégrer le tissu frais dans la solution OCT (température de coupe optimale) et geler les cheveux à l’aide de glace sèche ou d’azote liquide.
- Conserver les tissus à -80 oC.
2. Cryosection
- Couper les sections de 8 m dans un cryostat avec des températures fixées à -25 oC.
REMARQUE: L’épaisseur de la section préférée peut être ajustée pour générer des images plus nettes. - Placez les sections sur des glissières en verre chargées.
- Sécher les sections pendant 1 h à température ambiante (RT) avant de fixer dans l’acétone glacée de qualité histologie pendant 10 min.
REMARQUE: L’acétone provoque la coagulation des protéines solubles dans l’eau et extrait des lipides, mais n’a pas d’impact sur les composants contenant des glucides. En revanche, la formaline préserve la plupart des lipides et a peu d’impact sur les glucides24. Le choix du fixatif est important en fonction du choix du marqueur détecté. - Conservez les toboggans à -20 oC.
3. Sélection d’anticorps et de fluorophores
REMARQUE: Avant la coloration des tissus, les clones d’anticorps qui tacheront robustement et spécifiquement leurs antigènes d’intérêt dans les sections séquentielles du tissu fixe d’acétone doivent être validés. Certains anticorps peuvent nécessiter un fixatif différent, et leur compatibilité avec d’autres anticorps dans le panneau devra également être déterminé empiriquement. L’objectif est également d’identifier les fluorophores avec un chevauchement minimal qui peut être détecté avec les filtres d’épifluorescence pour DAPI, FITC, Cy3, Texas Red, et Cy5.
- Confirmer la coloration par détection conventionnelle de l’IHC ou de l’immunofluorescence (IF) dans les sections tissulaires avec l’antigène cible d’expression connu.
- À l’aide des ensembles de filtres d’excitation et d’émission disponibles sur le système d’imagerie semi-automatique et après avoir testé diverses combinaisons d’anticorps primaires conjugués au fluorophore, préparez des fluorophores à utiliser qui ont un chevauchement spectral minimal (p. ex., voir le tableau 1).
4. Staining
REMARQUE: La réhydratation de tissu et les lavages de glissière ont été exécutés dans un pot de Coplin. Les étapes de blocage et d’incubation d’anticorps ont été exécutées dans une boîte à glissière humidifiée.
- Laisser les toboggans se réchauffer à RT pendant 5 à 10 min.
- Réhydratez en saline tamponnée de phosphate (PBS) pendant 5 min.
- Effectuez une étape de blocage avant de colorer les tissus avec des anticorps. Pour les sections de souris, utilisez une solution de blocage spécialisée (voir Tableau des matériaux)pendant 10 min à RT. Pour les sections humaines, utilisez 10% normal sérum humain mis en commun (NHS) dilué dans PBS pendant 15 min à RT.
REMARQUE: Différents tampons de blocage peuvent être testés au besoin pour préserver les propriétés spécifiques des sections en fonction des procédures de suivi à utiliser. - Laver les diapositives pendant 5 minutes dans PBS après blocage.
- Pour la coloration multiplexe, préparer un cocktail d’anticorps avec des fluorophores compatibles lors de dilutions optimales prédéterminées.
- Ajouter le cocktail d’anticorps fluorophore-conjugués aux diapositives. Pour la coloration à un seul marqueur, ajouter uniquement l’anticorps conjugué primaire à la glissière.
- Inclure une glissière non contenue de contrôle qui subit la même procédure de coloration sans l’ajout d’un anticorps conjugué primaire.
- Incuber les diapositives pendant 1 h à RT dans l’obscurité, puis laver les diapositives 2x avec PBS pendant 5 minutes chacun. À partir de maintenant, la diapositive qui en résulte est appelée multiplexe teintée.
- Pour contrer, ajoutez daPI à la glissière tachée de multiplexe, incuber pendant 7 minutes dans l’obscurité à RT, et laver les diapositives 2x avec PBS pendant 5 minutes chacun. Ne pas contrebaler les toboggans à coloration unique et nontachés.
- Pour couvrir, ajouter une goutte du milieu de montage, et placer délicatement le housse en verre sur le tissu.
5. Préparation d’une bibliothèque spectrale
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Acquisition d’images
- Réglez la puissance de la lampe à 100%. Habituellement, la puissance est réglée à 10% parce que la détection de fluorescence sur les tissus FFPE comprend une étape d’amplification du signal.
- Commencez par ouvrir le logiciel d’exploitation du microscope (voir Tableau des matériaux).
- Sélectionnez Le protocole d’édition, puis le nouveau protocole.
- Fournir un « nom de protocole » et sélectionnez la fluorescence en mode imagerieet fournissez un « nom d’étude ».
- Placez les toboggans à une seule téale sur la scène et examinez chaque marqueur dans son canal de fluorescence correspondant pour assurer la coloration. Choisissez une région sur le tissu exprimant le signal le plus fort pour le marqueur.
- Ajustez les temps d’exposition à l’aide des options Autofocus et Autoexpose.
- Acquérez des instantanés pour les diapositives à coloration unique et non contenues et enregistrez le protocole.
REMARQUE: Les étapes suivantes sont effectuées dans un logiciel d’apprentissage automatique (voir tableau des matériaux),en utilisant les diapositives non tachées et nontachées simples pour vérifier la coloration spécifique ainsi que pour déterminer les discours croisés d’anticorps. - Sous l’onglet Build Libraries dans le logiciel, chargez chaque image de diapositives à une seule tache, choisissez le fluor approprié et cliquez sur Extrait. Le logiciel extraira automatiquement le signal de fluorescence choisi dans le Fluor.
- Pour enregistrer la couleur extraite, cliquez sur Enregistrer pour stocker. Un "nouveau groupe" peut être créé ou la couleur extraite peut être stockée à un groupe existant.
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Vérification de la bibliothèque spectrale
- Vérifiez la fenêtre de courbe spectrale d’émission, située à droite de l’image extraite, pour chaque ensemble de filtre.
REMARQUE: Le signal extrait est correct si la courbe spectrale n’est observée que dans les ensembles de filtre où le fluorophore est détecté. Si une courbe spectrale est observée dans le mauvais ensemble de filtre, cela peut signifier que soit le signal principal attendu dans l’ensemble de filtre n’est pas assez fort, ou le logiciel détecte un autre signal qui est trop élevé, peut-être en raison du chevauchement spectral. Dans ce cas, essayez d’abord d’utiliser l’outil Draw Processing Regions pour dessiner des régions autour des zones exprimant le marqueur fluorescent et l’autofluorescence dans l’image. Cela forme le logiciel pour détecter le signal réel et supprimer les signaux d’interférence. Si cela ne fonctionne pas, répétez le processus de coloration pour la glissière à une seule téale pour tester différentes titrations d’anticorps.
- Vérifiez la fenêtre de courbe spectrale d’émission, située à droite de l’image extraite, pour chaque ensemble de filtre.
6. Imagerie multispectrale
REMARQUE: Une fois la bibliothèque spectrale créée et vérifiée, effectuez les étapes suivantes pour la glissière tachée de multiplexe.
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Balayage de diapositives entières
- Ajuster les temps de mise au point et d’exposition sur la glissière tachée de multiplexe comme mentionné en vertu de la section 5.1.
- Sous Scan Slides, créez une nouvelle tâche et choisissez le protocole enregistré ci-dessus.
- Effectuez un balayage complet de la diapositive sur la glissière tachée de multiplexe.
- À l’aide de l’ensemble du logiciel de balayage de diapositives, ouvrez toute l’image de balayage de diapositives. Cette image n’a pas été spectralement intacte.
- Sélectionnez les régions d’intérêt (ROI) sur l’ensemble de l’image de balayage de diapositives à l’aide de l’outil Timbre ou RETOUR sur investissement. Ces ROI seront numérisés à l’aide des temps d’exposition fixés en 6.1.1 pour être utilisés pour le mélange spectral et l’analyse.
- Click Process Slide pour acquérir des IPP à 20x grossissement
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Le non-mélange spectral
- Une fois que les ROI ont été acquis, dans le logiciel d’apprentissage automatique, sous l’onglet Analyse manuelle, charger les images tachées de multiplex en cliquant sur Open under File.
- Dans le menu Spectral Library Source dropdown cliquez sur Select Fluors.
- Une nouvelle fenêtre s’ouvrira. Ici, choisissez la bibliothèque spectrale ou le groupe créé ci-dessus.
- Chargez l’image de diapositive non contenue. Cliquez sur l’icône du marqueur d’encre AF située au-dessus de la bibliothèque spectrale sélectionnée et tracez une ligne ou une région sur la glissière non contenue pour identifier l’autofluorescence dans le tissu.
- Sous l’onglet Marqueurs et couleurs d’édition, attribuez des noms pour chaque marqueur. Les pseudo-couleurs peuvent être attribuées à cette étape.
REMARQUE: La couleur de l’image Autofluorescence par défaut à DarkSlateGray. Changez ça en noir. - Cliquez sur Préparer tous.
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Vérification des images spectralement non mélangées
REMARQUE : Lorsque l’étape de mélange spectrale est terminée, une image composite composée de toutes les couleurs est créée.- Cliquez sur l’icône Modifier l’œil View. Ici, chaque couleur dans le "Component Display" peut être désactivée ou allumée pour afficher la coloration de chaque marqueur individuel.
- Inspecter visuellement la coloration et la morphologie des cellules pour s’assurer qu’il n’y a pas de chevauchement du marqueur, à moins qu’il ne soit biologiquement pertinent. Un pathologiste peut aider à vérifier la coloration ainsi.
REMARQUE: La coloration sur la glissière multiplexée doit être validée en laissant de côté un fluorophore à la fois et en examinant le motif de coloration. En outre, la validation aidera également à identifier les fluorophores forts qui apparaissent dans les spectres adjacents en raison de la parole croisée des anticorps ou le saignement. - Pour Pathology Views, qui simulent des images de champ lumineux pour chaque marqueur fluorescent, cliquez sur le bouton Sélectionnez une image de composant. Ici, choisissez un marqueur pour afficher une image simulée de champ lumineux.
7. Analyser les images multispectrales via la segmentation cellulaire et le phénotypage
REMARQUE: Après vérification de l’image spectralement non mélangée, la segmentation cellulaire peut être effectuée à l’aide du logiciel d’apprentissage automatique, qui fournira des instructions étape par étape. La segmentation de tissu n’a pas été exécutée ici. Si le panneau comprend un ou plusieurs marqueurs spécifiques aux tissus et surtout si le tissu est désordonné, la segmentation des tissus doit être effectuée.
- Sélectionnez "Cytoplasm" et "Membrane" sous l’option 'Segment'.
REMARQUE: "Nuclei" est choisi par défaut. - Sélectionnez un marqueur à partir du panneau. Configurer le marqueur pour détecter les noyaux, le cytoplasme ou la membrane. Par exemple, DAPI peut être sélectionné pour détecter les noyaux et le CD3 pour la membrane.
- Cliquez sur le bouton ellipsis ('...') pour sélectionner une option sous "utiliser ce signal pour trouver". Par exemple, 'nuclei' pour DAPI. Plusieurs marqueurs du panneau peuvent être sélectionnés pour la segmentation.
REMARQUE: Pour les marqueurs cytoplasmiques ou membranaires, sélectionnez l’option «Utilisez ce signal pour aider à la segmentation nucléaire». - Le logiciel détecte et crée automatiquement un masque chacun pour le noyau, le cytoplasme et la membrane de l’image.
- Assurez-vous que toutes les cellules sont « masquées » pour la segmentation. Pour vous ajuster, passez à la vue de pathologie pour le marqueur spécifique choisi en 7.3. et utiliser les options de configuration dans le logiciel.
- Cliquez sur "Segment All" pour segmenter les cellules.
- Après la segmentation cellulaire, procéder avec des cellules de phénotypage. Dans cette étape, choisissez les marqueurs nécessaires pour le phénotypage et sélectionnez manuellement au moins cinq cellules qui sont brillamment tachées avec le marqueur choisi. Cela forme le logiciel pour ensuite détecter automatiquement toutes les cellules tachées avec le marqueur choisi dans l’image.
- Une carte de phénotype est créée. Analyser pour s’assurer que la cellule tachée avec le marqueur est correctement phénotyped.
REMARQUE: Le phénotypage cellulaire peut être un processus itératif. Si le logiciel est incapable de phénotyper les cellules correctement, cela signifie que la formation est inadéquate ou incorrecte. Dans ce cas, l’utilisateur doit sélectionner manuellement plus de cellules et recycler le logiciel et répéter cette étape jusqu’à ce que l’utilisateur soit satisfait de la formation. - Créez un groupe nommé « Autres » et incluez des cellules qui ne sont pas tachées pour l’un des marqueurs.
REMARQUE: Cette étape est importante pour former le logiciel à exclure toutes les cellules non contaminées du phénotypage.
8. Exportation d’images et de tableaux d’analyse
- Cliquez sur le bouton Exportation pour afficher le panneau Paramètres d’exportation.
- Dans le «Répertoire d’exportation», cliquez sur Parcourir pour sélectionner un emplacement pour exporter les images.
- Dans les « options d’exportation d’images », choisissez le format de sortie d’image.
- Dans la liste "Images à exporter", sélectionnez les images à exporter. "Image composite" est l’image pseudocolored finale non mélangée. "Pathology Views" sont les images individuelles simulées de champ lumineux et les "Images composant (multi-image TIFF)" est un fichier multi-image TIFF de données de composants qui peuvent être utilisés par un logiciel d’analyse tiers.
- Cliquez sur le bouton «Exportation pour tous» pour exporter les images.
REMARQUE: Les tableaux de l’analyse peuvent également être sélectionnés et exportés à cette étape.
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Representative Results
Détection de marqueurs à une seule téale sur des sections de rate congelées
Comme le système d’imagerie semi-automatique utilise un système de filtre à thon en cristal liquide (LCTF) qui permet une plus large gamme de détection de longueur d’onde25, et parce qu’aucune étape d’amplification du signal n’a été effectuée ici, nous avons d’abord optimisé la détection de nos anticorps conjugués primaires pour chaque marqueur au microscope. Un exemple est montré dans la figure 1, où chaque marqueur à une seule couleur est de couleur pseudo-couleur rouge. Les anticorps conjugués Alexa Fluor utilisés ici ont été validés par les entreprises pour l’immunofluorescence et la cytométrie des débits. Cependant, le fluorophore Per-CP-Cy5.5 n’est validé que pour la cytométrie des débits. Nous avons pu détecter cette couleur dans nos diapositives à une seule téale, en soutenant la pertinence de la cytométrie d’écoulement validé anticorps pour une utilisation dans l’imagerie multispectrale et en fournissant l’avantage d’utiliser de tels anticorps pour valider les observations en utilisant deux techniques différentes (c.-à-d., cytométrie de flux et imagerie multispectrale). Nous avons ensuite procédé à effectuer l’imagerie multispectrale sur les tissus congelés.
Détection de fluorescence multicolore sur la rate congelée de souris
Pour tester la méthode de coloration multiplexe et l’imagerie spectrale, nous avons utilisé des tissus de rate congelés par la souris, qui a une abondance de cellules immunitaires. La figure 2 montre une image spectralement non mélangée de différents marqueurs dans une section de rate de souris congelée. Les anticorps, les clones et les concentrations utilisés pour la coloration sont décrits dans le tableau 2. L’image capturée montre une partie de la zone de lymphocytes T identifiée par la présence de marqueurs CD3, CD4 et CD8, entourés de cellules myéloïdes exprimant CD11b principalement observée dans la zone marginale. Des régions de cellules proliférantes exprimant Ki67 sont observées principalement dans les centres germinaux. L’option « Vues de pathologie » pour chaque marqueur a montré son modèle individuel de coloration dans le tissu. Des modèles distincts de coloration pour les marqueurs CD11b, Ki67 et CD3, CD4 et CD8 ont été observés ensemble, ce qui suggère que la méthode de coloration multiplexe et l’imagerie spectrale ont fonctionné sur le tissu congelé.
Détection de fluorescence multicolore sur l’amygdale humaine congelée
Après avoir testé un panneau de coloration adapté au tissu de souris, nous avons ensuite évalué un panneau séparé pour le tissu d’amygdale humain congelé. La figure 3 montre une image spectralement non mélangée des différents marqueurs utilisés. Les anticorps, les clones et les concentrations utilisés pour la coloration sont décrits dans le tableau 2. L’image capturée montre un centre germinal folliculaire26 exprimant des cellules B identifiées par le marqueur CD20. Des cellules proliférantes dans le centre germinal folliculaire ont été identifiées par Ki67. Certaines de ces cellules proliférantes costained avec CD20 et peuvent être des centroblastes27, naïfs B-cellules qui subissent une hypermutation somatique active. Les centres germinaux folliculaires ont été entourés par la région interfollicular de cellule T identifiée par l’expression de CD3, CD4, et CD8. Encore une fois, des motifs de coloration distincts ont été observés ici, confirmant que la méthodologie a fonctionné sur un tissu congelé.
Application de l’imagerie multispectrale de fluorescence sur le tissu congelé de tumeur de souris
La formation image multispectrale est un outil utile pour surveiller l’infiltration de cellules immunitaires dans les tumeurs comme pronostic pour les immunothérapies. À cette fin, nous avons entrepris de tacher un échantillon de tissu tumoral de souris congelée et de détecter les infiltrations de cellules immunitaires. La lignée cellulaire HLF16 est utilisée comme un virus du papillome humain (VPH)- modèle tumoral du cancer du col de l’utérus chez les souris transgéniques HLA-A-020128. La lignée cellulaire transgénique a été développée par des fibroblastes pulmonaires cardiaques transfectants de HLA-A-0201 avec des oncogènes de HPV16 E6 et d’E7 et des V1228de H-Ras. Les lymphocytes T et les macrophages associés à la tumeur sont les infiltrés immunitaires les plus courants présents dans les tumeurs29. La figure 4 montre une image spectralement non mélangée sur une section congelée de tumeur de HLF16 avec les vues de pathologie ; les motifs de coloration individuels sont indiqués dans la figure supplémentaire 1. Les anticorps, les clones et les concentrations utilisés pour la coloration sont décrits dans le tableau 2. L’image capturée montre des régions de lymphocytes T s’infiltrant dans les tumeurs identifiées par les marqueurs CD3 et CD8 ainsi que la présence d’autres lignées de cellules myéloïdes identifiées par le marqueur CD11b. La région capturée montre également les macrophages associés à la tumeur (TAM), peut-être du phénotype M2, détecté par le marqueur CD20630, qui est étroitement associé à plusieurs cellules proliférantes détectées comme Ki67.
Le logiciel d’apprentissage automatique2 est livré avec des fonctionnalités comme les analyses de tissus et de cellules. Ces analyses sont couramment effectuées sur les tissus FFPE tachés d’amplification du signal. Comme notre méthodologie n’utilise pas l’amplification du signal, nous voulions tester si le logiciel pouvait être utilisé pour analyser la coloration sur les tissus congelés. En utilisant la fonction adaptative du logiciel, nous avons pu segmenter les cellules à partir d’un marqueur nucléaire et membranaire et des cellules phénotypes basées sur les marqueurs utilisés pour la coloration. La figure 5 montre les cartes de segmentation et de phénotype des cellules et le nombre de cellules tachées pour chaque marqueur analysé par le logiciel, démontrant que le logiciel peut être utilisé pour la quantification des taches multispectrales sur les tissus congelés.
Figure 1 : Détection d’anticorps conjugués primaires à l’aide d’un microscope filtre à cristaux liquides. Les anticorps conjugués primaires aux marqueurs indiqués ont été tachés sur une rate de souris congelée et détectés à l’aide du système d’imagerie multispectral Vectra 3.0 selon les objectifs de 20x. CD3 sur Alexa Fluor 488, CD8 sur Alexa Fluor 594, CD11b sur Per-CP Cy5.5, CD206 sur Alexa Fluor 647, et Ki67 sur Alexa Fluor 555 ont été utilisés. Chaque marqueur est de couleur pseudo-couleur rouge. Aucun contre-vente n’a été utilisé sur ces diapositives. Barre d’échelle à 20 m. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Imagerie multispectrale sur une rate de souris congelée. (A) Balayage complet de la diapositive tachée multiplexée prise sous les objectifs 4x. Un timbre de 2 x 2 dans différentes régions du tissu a été choisi pour l’imagerie multispectrale. Barre d’échelle à 100 m. (B) Image composite prise sous un objectif 20x après un mélange spectral. Les marqueurs pseudo-colorés sont indiqués et une image agrandie dans la boîte rouge est montrée à côté de l’image. Barre d’échelle à 20 m. (C) Vues de pathologie pour chaque marqueur individuel. Une image agrandie pour chaque marqueur dans la boîte rouge est affichée à côté de l’image. Barre d’échelle à 20 m. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Imagerie multispectrale sur une amygdale humaine congelée. (A) Balayage complet de la diapositive tachée multiplexée prise sous un objectif 4x. Un timbre de 1 x 1 (669 m x 500 m) dans différentes régions du tissu a été choisi pour l’imagerie multispectrale. Barre d’échelle à 100 m. (B) Image composite après un mélange spectral pris sous un objectif de 20x. Les marqueurs pseudo-colorés sont indiqués et une image agrandie dans la boîte rouge est montrée à côté de l’image. Barre d’échelle à 20 m. (C) Vues de pathologie pour chaque marqueur individuel. Une image agrandie pour chaque marqueur dans la boîte rouge est affichée à côté de l’image. Barre d’échelle à 20 m. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Imagerie multispectrale sur une tumeur de souris congelée. La formation image multispectrale a été exécutée sur une région de 1 x 1 d’une tumeur congelée de HLF16 de souris prise sous un objectif de 20x. L’image composite (ci-dessus). Les marqueurs pseudo-colorés sont indiqués et les vues de pathologie (ci-dessous) pour chaque marqueur individuel sont représentées. Une image agrandie pour chaque marqueur dans la boîte rouge est affichée à côté de l’image originale. Barre d’échelle de 20 m S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : Analyse d’une section de tumeur de souris congelée. (A) Carte de segmentation cellulaire. La segmentation adaptative de cellules utilisant inForm a été exécutée. Le logiciel a été formé pour identifier les noyaux (vert) et la membrane (rouge). (B) Cartes phénotype pour chaque marqueur taché. Le logiciel a été formé pour identifier les phénotypes basés sur la coloration. Le point coloré représente le marqueur indiqué. «Autres» (noir) se réfère à des cellules qui n’ont pas été tachés pour le marqueur indiqué. (C) Parcelle de barre (moyenne - STDEV) représentant le nombre de cellules tachées pour chaque marqueur dans deux images multispectrales. Le nombre indique les cellules phénotyped dans chaque image, mais n’indique pas si les marqueurs sont coexprimés. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Fluorophore | Excitation maximum (nm) | Maximum d’émission (nm) | Détection attendue dans l’ensemble de filtre (nom) |
| Alexa Fluor 488 | 488 | 519 | Fitc |
| Fluor Alexa 555 | 555 | 580 | Cy3 et Texas Red |
| Alexa Fluor 594 | 590 | 617 | Rouge du Texas |
| Alexa Fluor 647 | 650 | 668 | Rouge du Texas et Cy5 |
| Dapi | 350 | 470 | Dapi |
| PerCP-Cy 5,5 | 482 | 690 | Cy3, Rouge du Texas et Cy5 |
Tableau 1 : Liste des fluorophores avec leurs longueurs d’onde maximales d’excitation et d’émission et détection prévue dans les ensembles de filtres appropriés.
| La rate de souris congelée | |||
| Anticorps/Dye | Clone | Concentration (g/mL) | |
| Alexa Fluor 594 CD8a anti-souris | 53-6.7 | 10 | |
| Alexa Fluor 488 CD3 anti-souris | 17A2 | 20 | |
| Alexa Fluor 647 CD4 anti-souris | GK1.5 | 10 | |
| PerCP-Cy 5.5 Rat Anti-CD11b | M1/70 | 2 | |
| Alexa Fluor 555 Souris anti-Ki-67 | B56 B56 | 10 | |
| Dapi | 0.1 | ||
| Tumeur de souris congelée | |||
| Anticorps/Dye | Clone | Concentration (g/mL) | |
| Alexa Fluor 594 CD8a anti-souris | 53-6.7 | 20 | |
| Alexa Fluor 488 CD3 anti-souris | 17A2 | 20 | |
| Alexa Fluor 647 anti-souris CD206 (ROR) | C068C2 | 5 | |
| PerCP-Cy5.5 Rat Anti-CD11b | M1/70 | 1 | |
| Alexa Fluor 555 Souris anti-Ki-67 | B56 B56 | 0.25 | |
| Dapi | 0.1 | ||
| Amygdale humaine congelée | |||
| Anticorps/Dye | Clone | Concentration (g/mL) | |
| Alexa Fluor 594 CD3 anti-humain | UCHT1 (en) | 10 | |
| PerCP/Cyanine5.5 CD4 anti-humain | RPA-T4 | 4 | |
| Alexa Fluor 647 CD8a anti-humain | C8/144B | 10 | |
| Alexa Fluor 488, eBioscience anti-humain CD20 | L26 | 10 | |
| Alexa Fluor 555 Souris anti-Ki-67 | B56 B56 | 1 | |
| Dapi | 0.1 | ||
Tableau 2 : Liste des anticorps, clones et concentrations utilisés.
Figure supplémentaire 1 : Modèles individuels de coloration de la tumeur congelée de HLF16 après un mélange spectral. Barre d’échelle de 20 m S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce chiffre.
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Discussion
Les tissus congelés ont été largement utilisés pour l’imagerie mIF pour détecter traditionnellement trois à quatre marqueurs31 sur un tissu en utilisant la méthode directe et indirecte32. Dans la méthode directe, les anticorps sont conjugués aux colorants fluoréscing ou points quantiques33 pour étiqueter le tissu, tandis que dans la méthode indirecte, un anticorps primaire non judiciaire est utilisé pour étiqueter le tissu suivi d’un anticorps secondaire fluorophore-conjugué qui reconnaît spécifiquement l’anticorps primaire. Certaines des récentes approches simultanées de coloration multiplex discutées plus tôt peuvent également être utilisées pour tacher les tissus congelés et détecter plus de quatre marqueurs. Mais le coût des réactifs et le temps pris pour la coloration deviennent intensifs en fonction du nombre de marqueurs détectés. Une autre technique de multiplexe pour les tissus congelés est le multi-epitope-ligand-cartographie (MELC)34. La technique consiste à colorer l’échantillon avec des anticorps fluorophore-conjugués, l’imagerie, et le photoblachage du fluorophore. Une mise en garde majeure de cette technique est qu’un seul champ ou région du tissu peut être multiplexed. Afin de multiplexer d’autres champs ou régions, la technique doit être effectuée manuellement, ce qui prend beaucoup de temps, ou nécessite une automatisation, ce qui est coûteux. Un groupe35 a été en mesure de détecter six couleurs sur les tissus congelés en utilisant une combinaison de colorants directs, indirects et TSA. Cependant, la coloration des tissus a pris 2 jours. En comparaison, notre méthodologie utilise une méthode simultanée de coloration multiplexe impliquant l’application d’un cocktail de cinq anticorps directement conjugués plus DAPI pour tacher les tissus congelés dans les 90 min. En outre, à l’aide d’un système d’imagerie multispectral de fluorescence semi-automatique, nous avons pu séparer et détecter spectralement six marqueurs dans la rate congelée, l’amygdale et les tissus tumoraux à l’aide de cette technique simplifiée de coloration multiplexe. Les ensembles de filtres Cy3, Texas Red et Cy5 disponibles au microscope offrent des possibilités de détecter d’autres fluorophores, ce qui pourrait augmenter le nombre de marqueurs qui peuvent être détectés simultanément dans les tissus congelés.
La coloration multiplexe utilisant l’approche TSA sur les tissus FFPE nécessite une étape de récupération d’antigène suivie d’un étiquetage séquentiel, d’un lavage et de mesures de décapage. L’exécution de la procédure varie de 1 à 2 jours en fonction des temps d’incubation utilisés pour les anticorps6. Récemment, à l’aide d’un processeur de tissu microfluidique, une coloration à quatre plex utilisant l’approche TSA a été effectuée sur les tissus FFPE de moins de 90 min. D’autres techniques de multiplexe pour les tissus FFPE peuvent être effectuées sous 4-5 h à l’aide d’une colorant automatisée. Cependant, les étapes appropriées de récupération d’antigène doivent être optimisées pour assurer la disponibilité d’épitope pour les anticorps36, qui à son tour repose sur l’examen attentif des clones d’anticorps ainsi que l’ordre des marqueurs détectés. Par exemple, certains clones d’anticorps de CD3 ne peuvent pas être utilisés, car par la suite les anticorps CD4 et CD8 ne sont pas détectés37. De même, il y a une variabilité de la détection des antigènes parmi les clones d’anticorps disponibles17,18. Par conséquent, la coloration multiplexe des tissus FFPE nécessite l’optimisation des clones d’anticorps, leurs concentrations, et l’ordre dans lequel ils sont tachés, qui est tout long. En revanche, l’absence de traitement tissulaire étendu des tissus congelés permet l’utilisation de divers clones d’anticorps avec une grande spécificité. En outre, les clones d’anticorps disponibles pour les tissus congelés peuvent également être utilisés dans la cytométrie des flux et ELISA, permettant la validation simultanée à travers divers essais. L’architecture tissulaire est également une préoccupation dans les tissus congelés38. La coloration multiplexe montrée ici sur les tissus congelés est significativement plus rapide que l’approche TSA. Les combinaisons de fluorophore nécessitent une sélection minutieuse de marqueurs pour s’assurer que les anticorps ne s’entravent pas stérilement les uns les autres, surtout lorsque différents antigènes exprimés dans le même emplacement cellulaire sont détectés. Nous avons choisi des marqueurs qui tachent différentes cellules sur des fluorophores qui sont spectralement séparés, permettant une meilleure détection. Les concentrations d’anticorps nécessitent également une optimisation, mais comme le protocole de coloration est rapide, le temps total nécessaire à l’optimisation ne prend pas de temps. Une mise en garde à notre méthode peut être l’incapacité de détecter les marqueurs d’expression faible dans les tissus. Certaines des approches de coloration multiplexe sur les tissus FFPE impliquent une étape d’amplification du signal qui est utile pour détecter les marqueurs à faible expression. Cependant, l’utilisation d’anticorps secondaires et tertiaires peut être utilisée pour stimuler le signal. Dans de tels cas, la réactivité croisée aux anticorps dans le panneau devrait être évitée pour empêcher l’interprétation incorrecte des résultats.
En plus de la rate de souris et des tissus d’amygdale humaine, qui sont riches en cellules immunitaires, nous avons employé le tissu de tumeur comme exemple pour l’imagerie multispectrielle proposée de fluorescence des tissus congelés. L’imagerie multispectrale de fluorescence dans les tumeurs a fourni des informations valables, telles que caractériser le microenvironnement de tumeur (TME)39, prédisant le succès des transferts adoptifs de cellule de T dans le mélanome malin40, et caractérisant des protéines dans les voies de transduction de signal de tumeur41. En utilisant des marqueurs spécifiques aux cellules immunitaires couramment trouvés dans les tumeurs, nous avons pu détecter l’infiltration des lymphocytes T CD8 et DES TAM dans le tissu tumoral HLF16 utilisé dans cette étude. Nous avons utilisé le logiciel d’apprentissage automatique pour segmenter et phénotype avec succès. La coloration multiplexe pour les tissus FFPE utilise une étape d’amplification du signal pour améliorer le rapport signal-bruit (SNR) qui aide au traitement et à la quantification del’image 42,43. Le logiciel d’apprentissage automatique a été utilisé pour des analyses sur les tissus FFPE tachés d’amplification du signal2. La méthodologie présente ici n’utilise pas l’amplification du signal, mais nous avons été en mesure de segmenter et de phénotype avec succès les cellules à l’aide du logiciel. Pour une analyse plus approfondie (p. ex., coexpression de phénotype et relations spatiales) et une interprétation précise de la quantitation, la formation logicielle nécessite une validation à l’aide d’un ensemble de formation, d’un ensemble de tests et d’un ensemble de validation. Dans un processus itératif, un ensemble d’images (c’est-à-dire l’ensemble de formation) est utilisé pour former le logiciel d’apprentissage automatique afin d’identifier les phénotypes jusqu’à ce que les prédictions du modèle pour un ensemble distinct d’images (c.-à-d. l’ensemble de test) soient exactes. Une fois la formation terminée, un dernier lot d’images (c.-à-d. l’ensemble de validation) est analysé pour voir s’il y a eu un sur-ajustement.
En conclusion, la méthodologie présentée ici est une façon rapide d’effectuer l’imagerie multispectrielle de fluorescence utilisant des tissus congelés. La méthode est utile pour détecter les marqueurs auxquels les anticorps ne sont pas disponibles ou ne peuvent pas être détectés dans les tissus ffPE. En conjonction avec le logiciel d’apprentissage automatique, le temps pris pour effectuer des analyses quantitatives peut faciliter de manière significative les diagnostics précliniques et cliniques rapides et peut être appliqué dans le domaine de la transcriptomique spatiale à haute résolution qui utilise des tissus congelés44.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Acknowledgments
Des conseils en imagerie et en analyse ont été fournis par le Research Resources Center - Research Histology and Tissue Imaging Core de l’Université de l’Illinois à Chicago, établi avec le soutien du bureau du vice-chancelier de la recherche. Les travaux ont été soutenus par NIH/NCI RO1CA191317 à CLP, par NIH/NIAMS (subvention du CRST 1P30AR075049-01) au Dr A. Paller, et par le soutien du Centre complet du cancer Robert H. Lurie au centre d’évaluation de l’immunothérapie de l’Université Northwestern.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone (histological grade) | Fisher Scientific | A16F-1GAL | Fixing tissues |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse CD3 | BioLegend | 100212 | Clone - 17A2; primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 488, eBioscience anti-human CD20 | ThermoFisher Scientific | 53-0202-82 | Clone - L26; primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 555 Mouse anti-Ki-67 | BD Biosciences | 558617 | Primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 594 anti-human CD3 | BioLegend | 300446 | Clone - UCHT1; primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 594 anti-mouse CD8a | BioLegend | 100758 | Clone - 53-6.7; primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 647 anti-human CD8a | BioLegend | 372906 | Clone - C8/144B; primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 647 anti-mouse CD206 (MMR) | BioLegend | 141711 | Clone - C068C2; primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 647 anti-mouse CD4 Antibody | BioLegend | 100426 | Clone - GK1.5; primary conjugated antibody |
| C57BL/6 Mouse | Charles River Laboratories | 27 | Mouse frozen tissues used for multispectral training |
| Coplin Jar | Sigma Aldrich | S6016-6EA | Rehydrating and washing slides |
| DAPI Solution | BD Biosciences | 564907 | Nucleic Acid stain |
| Diamond White Glass Charged Slides | DOT Scientific | DW7590W | Adhering tissue sections |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1x (without Ca and Mg) | Fisher Scientific | MT21031CV | Washing and diluent |
| Gold Seal Cover Slips | ThermoFisher Scientific | 3306 | Protecting stained tissues |
| Human Normal Tonsil OCT frozen tissue block | AMSBio | AMS6023 | Human frozen tissue used for multispectral staining |
| Human Serum 1x | Gemini Bio-Products | 100-512 | Blocking and diluent for human tissues |
| inForm | Akoya Biosciences | Version 2.4.1 | Machine learning software |
| PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD4 | BioLegend | 300529 | Clone - RPA-T4; primary conjugated antibody |
| PerCP-Cy 5.5 Rat Anti-CD11b | BD Biosciences | 550993 | Clone - M1/70; primary conjugated antibody |
| Phenochart | Akoya Biosciences | Version 1.0.8 | Whole slide scan software |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36965 | Mounting medium |
| Research Cryostat | Leica Biosystems | CM3050 S | Sectioning tissues |
| Superblock 1x | ThermoFisher Scientific | 37515 | Blocking mouse tissues |
| Tissue-Tek O.C.T Solution | Sakura Finetek | 4583 | Embedding tissues |
| Vectra 3.0 Automated Quantitative Pathology Imaging System, 6 Slide | Akoya Biosciences | CLS142568 | Semi-automated multispectral imaging system |
| Vectra Software | Akoya Biosciences | Version 3.0.5 | Software to operate microscope |
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