Summary
Descriviamo un metodo di colorazione rapida per eseguire l'imaging multispettrale sui tessuti congelati.
Abstract
L'imaging a fluorescenza multispettrale su tessuti incorporati in paraffina fissata in formalina (FFPE) consente di rilevare più marcatori in un singolo campione di tessuto in grado di fornire informazioni sulla coespressione dell'antigene e sulla distribuzione spaziale dei marcatori. Tuttavia, la mancanza di anticorpi adatti per i tessuti fissati in formalina può limitare la natura dei marcatori che possono essere rilevati. Inoltre, il metodo di colorazione richiede molto tempo. Qui descriviamo un metodo rapido per eseguire l'imaging a fluorescenza multispettrale sui tessuti congelati. Il metodo include le combinazioni di fluoroforo utilizzate, passaggi dettagliati per la colorazione dei tessuti congelati del topo e dell'uomo e le procedure di scansione, acquisizione e analisi. Per l'analisi della colorazione, viene utilizzato un sistema di imaging a fluorescenza multispettrale semiautomatico disponibile in commercio. Attraverso questo metodo, fino a sei diversi marcatori sono stati macchiati e rilevati in una singola sezione di tessuto congelato. Il software di analisi dell'apprendimento automatico può fenotipo le cellule che possono essere utilizzate per l'analisi quantitativa. Il metodo qui descritto per i tessuti congelati è utile per il rilevamento di marcatori che non possono essere rilevati nei tessuti FFPE o per i quali anticorpi non sono disponibili per i tessuti FFPE.
Introduction
I recenti progressi nelle tecniche di imaging microscopico hanno migliorato significativamente le nostre conoscenze e la comprensione dei processi biologici e degli stati della malattia. Il rilevamento in situ delle proteine nei tessuti tramite immunohistochimica cromogenica (IHC) viene regolarmente eseguito in patologia. Tuttavia, il rilevamento di più marcatori che utilizzano la colorazione IHC cromogenica è difficile1 e metodi più recenti per utilizzare approcci di colorazione multifluorescenza (mIF), in cui più marcatori biologici sono etichettati su un singolo campione di tessuto, sono in fase di sviluppo. La rilevazione di più marcatori biologici è utile, perché le informazioni relative all'architettura dei tessuti, alla distribuzione spaziale delle cellule e alla co-espressione dell'antigene sono tutte catturate in un campione di tessuto singolo2. L'uso della tecnologia di imaging a fluorescenza multispettrale ha reso possibile il rilevamento di più marcatori biologici. In questa tecnologia, utilizzando ottiche specifiche, gli spettri di fluorescenza di ogni singolo fluoroforo possono essere separati o "non miscelati", consentendo il rilevamento di più marcatori senza alcun crosstalk spettrale3. L'imaging a fluorescenza multispettrale sta diventando un approccio critico nella biologia cellulare, nello sviluppo di farmaci preclinici, nella patologia clinica e nella profilazione immunitaria del tumore4,5,6. È importante sottolineare che la distribuzione di cellule immunitarie (in particolare le cellule T CD8) può servire come fattore prognostico per i pazienti con tumori esistenti7.
Sono stati sviluppati vari approcci alla colorazione a fluorescenza multiplex che possono essere eseguiti contemporaneamente o in sequenza. Nel metodo di colorazione simultanea, tutti gli anticorpi vengono aggiunti insieme come cocktail in un unico passaggio per etichettare il tessuto. La tecnologia UltraPlex utilizza un cocktail di anticorpi primari coniugati seguiti da un cocktail di anticorpi secondari anti-hapten anti-hapten confluito con fluoroforo. La tecnologia InSituPlex8 utilizza un cocktail di anticorpi primari coniugati in DNA unici che vengono aggiunti contemporaneamente al tessuto seguito da un passo di amplificazione e infine sonde coniugate a fluoroforo che sono complementari a ogni sequenza di DNA unica sull'anticorpo primario. Entrambe queste tecnologie consentono il rilevamento di quattro marcatori più 4',6-diamino-2-fenilindole (DAPI) per la colorazione nucleare. Altri due approcci per la colorazione multiplex simultanea si basano sulla spettrometria di massa iomacisecondaria 9. Hyperion Imaging System utilizza la citometria di massa10 per rilevare fino a 37 marcatori. Questa tecnologia utilizza un cocktail di anticorpi coniugati in metallo per macchiare i tessuti, e specifiche aree dei tessuti sono ablatate da un laser e trasferite in un citometro di massa dove vengono rilevati gli ioni metallici. Un'altra tecnologia simile è l'IONPath, che utilizza la tecnologia di imaging del fascio di ioni multiplexed11. Questa tecnologia utilizza uno strumento di spettrometria di massa modificato e una fonte di ioni di ossigeno invece del laser per ablate gli anticorpi coniugati in metallo. Mentre tutti questi approcci di colorazione multiplex simultanei consentono il rilevamento di più marcatori, i costi per coniugare DNA, apteni o metalli agli anticorpi, la perdita di tessuto a causa dell'ablazione e l'estesa elaborazione delle immagini per lo smistamento non possono essere sottovalutati. Inoltre, i kit e i protocolli di colorazione sono attualmente disponibili solo per i tessuti FFPE e lo sviluppo di pannelli personalizzati comporta tempi e spese aggiuntivi.
Il metodo di colorazione multiplex sequenziale, al contrario, include l'etichettatura del tessuto con un anticorpo a un marcatore, stripping per rimuovere l'anticorpo, seguita da ripetizioni sequenziali di questo processo per etichettare più marcatori12. L'amplificazione del segnale di tirofa (TSA) è il metodo di multiplexing sequenziale più utilizzato. Altre due tecnologie di multiplexing utilizzano una combinazione di metodi di colorazione simultanei e sequenziali. La piattaforma CODEX13 impiega un cocktail di anticorpi coniugati a sequenze uniche di oligonucleotidi di DNA che alla fine vengono etichettate con un fluoroforo utilizzando una fase di polimerizzazione indicizzata seguita dall'imaging, dallo stripping e dalla ripetizione del processo per rilevare fino a 50 marcatori. L'approccio di colorazione multiplex MultiOmyx14 è un'iterazione di colorazione con un cocktail di tre o quattro anticorpi coniugati con fluoroforo, imaging, spegnimento dei fluorofori e ripetizione di questo ciclo per rilevare fino a 60 marcatori su una singola sezione. Simile al metodo di colorazione multiplex simultanea, mentre è possibile rilevare un'ampia gamma di marcatori, il tempo necessario per la colorazione, l'acquisizione dell'immagine, l'elaborazione e l'analisi è ampio. La fase di stripping/spegnimento comporta il riscaldamento e/o lo sbiancamento del campione di tessuto e, pertanto, l'approccio di colorazione multiplex sequenziale viene comunemente eseguito sui tessuti FFPE che mantengono l'integrità dei tessuti al riscaldamento o allo sbiancamento.
La fissazione della formalina e il successivo incorporamento della paraffina vengono prontamente eseguiti in un ambiente clinico, i blocchi di tessuto sono facili da memorizzare e sono disponibili diversi protocolli di colorazione multiplex. Tuttavia, l'elaborazione, l'incorporamento e la deparaffinazione dei tessuti FFPE, così come il recupero dell'antigene15, un processo attraverso il quale gli anticorpi possono accedere meglio agli epitopi, richiede molto tempo. Inoltre, l'elaborazione coinvolta nei tessuti FFPE contribuisce all'autofluorescenza16 e maschera gli epitopi bersaglio, con conseguente variabilità e mancanza di clone di anticorpi disponibili per rilevare gli antigeni nei tessuti FFPE17,18,19. Un esempio è l'antigene di leucocito umano (HLA) di classe I alleli20. Al contrario, lo scatto di congelamento dei tessuti non comporta lunghe fasi di elaborazione prima o dopo il fissaggio, eludendo la necessità di recupero dell'antigene21,22e rendendolo vantaggioso per rilevare una più ampia gamma di obiettivi. Pertanto, l'utilizzo di tessuti congelati per l'imaging a fluorescenza multispettrale può essere utile per rilevare obiettivi per studi preclinici e clinici.
Date le limitazioni di cui sopra quando si utilizzano tessuti FFPE, ci siamo chiesti se l'imaging a fluorescenza multispettrale può essere eseguito su tessuti congelati. Per rispondere a questa domanda, abbiamo testato un metodo di colorazione multiplex simultaneo utilizzando un pannello di anticorpi coniugati a fluoroforo per rilevare più antigeni e analizzato la colorazione utilizzando un sistema di imaging multispettrale semiautomatico. Siamo stati in grado di macchiare simultaneamente fino a sei marcatori in una singola sezione di tessuto entro 90 min.
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Protocol
La milza del topo e i tessuti tumorali del topo HLF1623 sono stati ottenuti dal nostro laboratorio. Il tessuto tonsillare umano è stato acquistato da un fornitore commerciale. I dettagli sono forniti nella Tabella dei Materiali.
1. Incorporamento dei tessuti
- Incorporare tessuti freschi nella soluzione OCT (temperatura di taglio ottimale) e congelare con lo snap utilizzando ghiaccio secco o azoto liquido.
- Conservare i tessuti a -80 gradi centigradi.
2. Criosezione
- Tagliare 8 sezioni in un criostato con temperature fissate a -25 gradi centigradi.
NOT: Lo spessore della sezione preferito può essere regolato per generare immagini più nitide. - Posizionare le sezioni sugli scivoli di vetro caricati.
- Asciugare ad aria le sezioni per 1 h a temperatura ambiente (RT) prima di fissare in acetone ghiacciato di grado istologico per 10 min.
NOT: L'acetone provoca la coagulazione delle proteine solubili in acqua ed estrae i lipidi, ma non influisce sui componenti contenenti carboidrati. Al contrario, la formalina conserva la maggior parte dei lipidi e ha poco impatto sui carboidrati24. La scelta del fissativo è importante a seconda della scelta del marcatore rilevato. - Conservare i vetrini a -20 gradi centigradi.
3. Selezione di anticorpi e fluorofori
NOT: Prima della colorazione dei tessuti, i cloni di anticorpi che macchiano in modo robusto e specifico i loro antigeni di interesse all'interno di sezioni sequenziali dal tessuto fisso di acetone devono essere convalidati. Alcuni anticorpi possono richiedere un fissativo diverso, e la loro compatibilità con altri anticorpi nel pannello dovrà anche essere determinata empiricamente. L'obiettivo è anche quello di identificare i fluorofori con una sovrapposizione minima che può essere rilevata con i filtri di epifluorescenza per DAPI, FITC, Cy3, Texas Red e Cy5.
- Confermare la colorazione mediante rilevamento convenzionale iHC o immunofluorescenza (IF) nelle sezioni tissutali con antigene bersaglio espressione nota.
- Utilizzando i set di filtri di eccitazione e e di emissione disponibili sul sistema di imaging semiautomatico e dopo aver testato varie combinazioni di anticorpi primari coniugati a fluoroforo, preparare i fluorofori da utilizzare che presentano una sovrapposizione spettrale minima (ad esempio, vedi tabella 1).
4. Colorazione
NOT: La reidratazione dei tessuti e i fustici a scivolo sono stati eseguiti in un barattolo di Coplin. I passaggi di blocco e incubazione degli anticorpi sono stati eseguiti in una scatola di scorrimento umidificata.
- Lasciare scaldare i vetrini a RT per 5-10 min.
- Reidratare in fosfato tampone salina (PBS) per 5 min.
- Eseguire una fase di blocco prima di macchiare i tessuti con anticorpi. Per le sezioni del mouse, utilizzare una soluzione di blocco specializzata (vedere Tabella dei materiali) per 10 min in RT. Per le sezioni umane, utilizzare il 10% del siero umano in pool normale (NHS) diluito in PBS per 15 min a RT.
NOT: È possibile testare diversi buffer di blocco in base alle esigenze per mantenere le proprietà specifiche delle sezioni a seconda delle procedure di follow-up da utilizzare. - Lavare i vetrini per 5 min in PBS dopo il blocco.
- Per la colorazione multiplex, preparare un cocktail di anticorpi con fluorofori compatibili con diluizioni ottimali predeterminate.
- Aggiungere il cocktail di anticorpi coniugati con fluoroforo agli scivoli. Per la colorazione a marcatore singolo, aggiungere solo l'anticorpo primario coniugato alla diapositiva.
- Includere un controllo diapositiva incontaminata che subisce la stessa procedura di colorazione senza l'aggiunta di alcun anticorpo coniugato primario.
- Incubare i vetrini per 1 h al RT al buio e poi lavare i vetrini 2x con PBS per 5 min ciascuno. Da qui in poi, la diapositiva risultante viene definita macchiata multiplex.
- Per controstare, aggiungere DAPI allo scivolo colorato multiplex, incubare per 7 min al buio a RT e lavare i vetrini 2x con PBS per 5 min ciascuno. Non contrastare le vetrine monomacchiate e non colorate.
- Per coprire, aggiungere una goccia del supporto di montaggio, e posizionare delicatamente il coperchio di vetro sopra il tessuto.
5. Preparazione di una libreria spettrale
-
Acquisizione di immagini
- Impostare la potenza della lampada al 100%. Di solito la potenza è impostata al 10% perché il rilevamento della fluorescenza sui tessuti FFPE include una fase di amplificazione del segnale.
- Iniziare aprendo il software operativo al microscopio (vedere Tabella dei materiali).
- Selezionare Modifica protocollo , quindi Nuovo protocollo.
- Specificare un "Nome protocollo" e selezionare Fluorescenza in Modalità imaginge specificare un "Nome studio".
- Posizionare i vetrini a macchie singole sullo stage ed esaminare ogni marcatore nel corrispondente canale di fluorescenza per garantire la colorazione. Scegliere una regione sul tessuto esprimendo il segnale più forte per il marcatore.
- Regolare i tempi di esposizione utilizzando le opzioni Messa a fuoco automatica ed Esposizione automatica.
- Acquisire istantanee per le diapositive a macchie singole e non colorate e salvare il protocollo.
NOT: I passaggi seguenti vengono eseguiti nel software di apprendimento automatico (vedere Tabella dei materiali), utilizzando le singole diapositive colorate e non colorate per verificare una colorazione specifica e per determinare il cross talk degli anticorpi. - Nella scheda Crea librerie del software, caricare ogni immagine di diapositiva a colorata singola, scegliere il Fluor appropriato e fare clic su Estrai. Il software estrarrà automaticamente il segnale di fluorescenza scelto nel Fluor.
- Per salvare il colore estratto, fare clic su Salva nel negozio. È possibile creare un "Nuovo gruppo" o il colore estratto può essere memorizzato in un gruppo esistente.
-
Verifica della libreria spettrale
- Controllare la finestra della curva spettrale di emissione, situata a destra dell'immagine estratta, per ogni set di filtri.
NOT: Il segnale estratto è corretto se la curva spettrale viene osservata solo nei set di filtri in cui viene rilevato il fluoroforo. Se una curva spettrale viene osservata nel set di filtri errato, può significare che il segnale primario previsto nel set di filtri non è abbastanza forte o che il software sta rilevando un altro segnale troppo alto, probabilmente a causa della sovrapposizione spettrale. In questo caso, provare innanzitutto a utilizzare lo strumento Disegna regioni di elaborazione per disegnare aree intorno alle aree che esprimono il marcatore fluorescente e l'autofluorescenza nell'immagine. Questo addestra il software per rilevare il segnale vero e rimuovere eventuali segnali interferenti. Se questo non funziona, ripetere il processo di colorazione per la diapositiva singola macchiata per testare diverse titrazioni anticorpali.
- Controllare la finestra della curva spettrale di emissione, situata a destra dell'immagine estratta, per ogni set di filtri.
6. Imaging multispettrale
NOT: Una volta creata e verificata la libreria spettrale, effettuare le seguenti operazioni per la diapositiva color multiplex.
-
Scansione intera delle diapositive
- Regolare i tempi di messa a fuoco e di esposizione sulla diapositiva macchiata multiplex come indicato nella sezione 5.1.
- In Scansione diapositive, creare una nuova attività e scegliere il protocollo salvato in precedenza.
- Eseguire un'intera scansione della diapositiva sulla diapositiva macchiata multiplex.
- Utilizzando l'intero software di scansione delle diapositive, aprire l'intera immagine di scansione delle diapositive. Questa immagine non è stata spettrale senza miscela.
- Selezionare le aree di interesse (ROI) nell'intera immagine di scansione delle diapositive utilizzando lo strumento Timbro o ROI. Queste ROI verranno analizzate utilizzando i tempi di esposizione impostati in 6.1.1 da utilizzare per lo smistare e l'analisi spettrale.
- Fare clic su Elabora diapositiva per acquisire i ROI con ingrandimento 20x
-
Spettrale smescolando
- Una volta acquisite le ROI, nel software di apprendimento automatico, nella scheda Analisi manuale, caricare le immagini colorate multiplex facendo clic su Apri in File.
- Nel menu a discesa Origine libreria spettrale, fare clic su Seleziona fluors.
- Si aprirà una nuova finestra. Qui, scegli la libreria o il gruppo spettrale creato sopra.
- Caricare l'immagine della diapositiva non colorata. Fate clic sull'icona dell'indicatore di inchiostro AF situato sopra la libreria spettrale selezionata e disegnate una linea o un'area sulla diapositiva non colorata per identificare l'autofluorescenza nel tessuto.
- Nella scheda Modifica marcatori e colori, assegnate i nomi a ciascun marcatore. In questa fase è possibile assegnare pseudo colori.
NOT: The color for the Autofluorescence image defaults to DarkSlateGray. Cambia questo in Nero. - Fare clic su Prepara tutto.
-
Verifica di immagini spettrali non mescolate
NOTA: una volta completato il passaggio di dismissione spettrale, viene creata un'immagine composita costituita da tutti i colori.- Fare clic sull'icona Modifica occhio Vista. Qui, ogni colore nel "Visualizzazione componenti" può essere disattivato o acceso per visualizzare la colorazione di ogni singolo marcatore.
- Ispezionare visivamente la colorazione e la morfologia delle cellule per assicurarsi che non vi sia alcuna sovrapposizione di marcatore, a meno che non sia biologicamente rilevante. Un patologo può aiutare a verificare la colorazione pure.
NOT: La colorazione sulla diapositiva multiplexata deve essere convalidata tralasciando un fluoroforo alla volta e rivedendo il modello di colorazione. Inoltre, la convalida aiuterà anche a identificare forti fluorofori che appaiono negli spettri adiacenti a causa del cross talk anticorpale o del sanguinamento. - Per Viste patologiche, che simulano le immagini di campo luminoso per ogni indicatore fluorescente, fare clic sul pulsante Seleziona immagine componente. Qui, scegliete un marcatore per visualizzare un'immagine di campo luminoso simulato.
7. Analisi delle immagini multispettrali tramite segmentazione cellulare e fenotipizzazione
NOT: Dopo aver verificato l'immagine non mista, la segmentazione delle celle può essere eseguita utilizzando il software di apprendimento automatico, che fornirà istruzioni dettagliate. La segmentazione dei tessuti non è stata eseguita qui. Se il pannello include uno o più marcatori specifici del tessuto e soprattutto se il tessuto è disordinato, deve essere eseguita la segmentazione dei tessuti.
- Selezionare "Citoplasma" e "Membrana" sotto l'opzione "Segmento".
NOTA: "Nuclei" è scelto per impostazione predefinita. - Selezionate un marcatore dal pannello. Configurare il marcatore per rilevare nuclei, citoplasma o membrana. Ad esempio, DAPI può essere selezionato per rilevare i nuclei e CD3 per la membrana.
- Fare clic sul pulsante con i lipsia ('...') per selezionare un'opzione in "utilizzare questo segnale per trovare". Ad esempio, "nuclei" per DAPI. È possibile selezionare più marcatori dal pannello per la segmentazione.
NOT: Per i marcatori citoplasmamici o di membrana, selezionare l'opzione " Usa questo segnale per facilitare lasegmentazione nucleare". - Il software rileva e crea automaticamente una maschera ciascuno per il nucleo, il citoplasma e la membrana nell'immagine.
- Assicurarsi che tutte le celle siano "mascherate" per la segmentazione. Per regolare, passare alla vista patologica per il marcatore specifico scelto in 7.3. e utilizzare le opzioni di configurazione nel software.
- Fare clic su "Segmenta tutto" per segmentare le celle.
- Dopo la segmentazione cellulare, procedere con le cellule fenotipiche. In questo passaggio, scegliere i marcatori necessari per la fenotipizzazione e selezionare manualmente almeno cinque celle che sono macchiate con il marcatore scelto. Questo addestra il software a rilevare automaticamente tutte le celle macchiate con il marcatore scelto nell'immagine.
- Viene creata una mappa fenotipo. Analizzare per assicurarsi che la cella macchiata con il marcatore sia correttamente fenotipizzata.
NOT: La fenotipizzazione cellulare può essere un processo iterativo. Se il software non è in grado di fenotipo correttamente delle cellule, significa che la formazione è inadeguata o errata. In questo caso, l'utente deve selezionare manualmente più celle e riaddestrare il software e ripetere questo passaggio fino a quando l'utente non è soddisfatto della formazione. - Creare un gruppo denominato "Altri" e includere le celle non colorate per nessuno dei marcatori.
NOT: Questo passaggio è importante per addestrare il software a escludere tutte le cellule non colorate dalla fenotipizzazione.
8. Esportazione di immagini e tabelle di analisi
- Fate clic sul pulsante Esporta per visualizzare il pannello Impostazioni di esportazione.
- Nella sezione "Esporta directory", fare clic su Sfoglia per selezionare un percorso in cui esportare le immagini.
- In "Opzioni di esportazione immagini", scegliere il Formato di output immagine.
- Nell'elenco "Immagini da esportare", selezionare le immagini da esportare. "Immagine composita" è l'immagine non mista pseudocolorata finale. Le "viste patologiche" sono le singole immagini di brightfield simulate e le "Immagini dei componenti (TIFF multi-immagine)" sono un file TIFF multi-immagine di dati dei componenti che possono essere utilizzati da software di analisi di terze parti.
- Fare clic sul pulsante "Esporta per tutti" per esportare le immagini.
NOT: Le tabelle dall'analisi possono anche essere selezionate ed esportate in questa fase.
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Representative Results
Rilevamento di marcatori a macchia singola su sezioni di milza congelate
Poiché il sistema di imaging semiautomatico utilizza un sistema di filtri regolabili a cristalli liquidi (LCTF) che consente una più ampia gamma di rilevamento della lunghezza d'onda25, e poiché non sono stati eseguiti passaggi di amplificazione del segnale qui, abbiamo prima ottimizzato il rilevamento dei nostri anticorpi coniugati primari per ogni marcatore al microscopio. Un esempio è illustrato nella Figura 1, in cui ogni marcatore a tinta singola è pseudo-colorato rosso. Gli anticorpi coniugati Alexa Fluor utilizzati qui sono stati convalidati dalle aziende per l'immunofluorescenza e la citometria di flusso. Tuttavia, il fluoroforo Per-CP-Cy5.5 viene convalidato solo per la citometria di flusso. Siamo stati in grado di rilevare questo colore nelle nostre diapositive a macchie singole, supportando l'idoneità degli anticorpi convalidati dalla citometria del flusso da utilizzare nell'imaging multispettrale e fornendo il vantaggio di utilizzare tali anticorpi per convalidare le osservazioni utilizzando due diverse tecniche (citometria di flusso e imaging multispettrale). Abbiamo quindi proceduto all'imaging multispettrale sui tessuti congelati.
Rilevamento della fluorescenza multicolore sulla milza di topo congelato
Per testare il metodo di colorazione multiplex e l'imaging spettrale, abbiamo usato il tessuto della milza congelato del topo, che ha un'abbondanza di cellule immunitarie. Figura 2 Mostra un'immagine spettrale non mista di marcatori diversi in una sezione di milza di topo congelato. Gli anticorpi, i cloni e le concentrazioni utilizzati per la colorazione sono descritti nella Tabella 2. L'immagine catturata mostra una parte della zona cellulare T identificata dalla presenza di marcatori CD3, CD4 e CD8, circondati da cellule mieloidi che esprimono CD11b per lo più osservate nella zona marginale. Le regioni di cellule che proliferano che esprimono Ki67 sono osservate principalmente nei centri germinali. L'opzione "Viste patologiche" per ogni marcatore ha mostrato il suo modello di colorazione individuale all'interno del tessuto. Sono stati osservati modelli di colorazione distinti per CD11b, Ki67 e i marcatori CD3, CD4 e CD8 insieme, suggerendo che il metodo di colorazione multiplex e l'imaging spettrale funzionavano sul tessuto congelato.
Rilevamento di fluorescenza multicolore su tonsilla umana congelata
Dopo aver testato un pannello di colorazione adatto al tessuto del topo, abbiamo successivamente valutato un pannello separato per il tessuto tonsille umano congelato. Figura 3 Mostra un'immagine spettrale non mista dei diversi marcatori utilizzati. Gli anticorpi, i cloni e le concentrazioni utilizzati per la colorazione sono descritti nella Tabella 2. L'immagine catturata mostra un centro germinale follicolare26 che esprime cellule B identificate dal marcatore CD20. Le cellule proliferali nel centro germinale follicolare sono state identificate da Ki67. Alcune di queste cellule proliferanti costano con CD20 e possono essere centriblasti27, cellule B ingenue che subiscono ipermutazione somatica attiva. I centri germinali follicolari erano circondati dalla regione delle cellule T interfollicolare identificata dall'espressione di CD3, CD4 e CD8. Anche in questo caso, sono stati osservati modelli di colorazione distinti, confermando che la metodologia ha funzionato su un tessuto congelato.
Applicazione dell'imaging a fluorescenza multispettrale sul tessuto tumorale del topo congelato
L'imaging multispettrale è uno strumento utile per monitorare l'infiltrazione delle cellule immunitarie nei tumori come prognosi per le immunoterapie. A tal fine, abbiamo deciso di macchiare un campione di tessuto tumorale del topo congelato e rilevare gli infiltrati delle cellule immunitarie. La linea cellulare HLF16 è usata come papillomavirus umano (HPV)- modello tumorale del cancro cervicale nei topi transgenici HLA-A-020128. La linea cellulare transgenica è stata sviluppata traducendo i fibroblasti polmonari cardiaci da HLA-A-0201 con HPV16 E6 ed E7 oncogenes e H-Ras V1228. Le cellule T e i macrofagi associati ai tumori sono gli infiltrati immunitari più comuni presenti nei tumori29. La figura 4 mostra un'immagine spettrale non mista su una sezione tumorale HLF16 congelata insieme alle viste patologiche; i singoli modelli di colorazione sono mostrati nella Figura supplementare 1. Gli anticorpi, i cloni e le concentrazioni utilizzati per la colorazione sono descritti nella Tabella 2. L'immagine catturata mostra regioni di cellule T che infiltrano tumorali identificate dai marcatori CD3 e CD8 insieme alla presenza di altri lignaggi cellulari mieloidi identificati dal marcatore CD11b. La regione catturata mostra anche macrofagi associati al tumore (ARM), possibilmente del fenotipo M2, rilevati dal marcatore CD20630, che è strettamente associato a diverse cellule proliferazione rilevate comeKi67.
Il software di apprendimento automatico2 è dotato di funzionalità come l'analisi dei tessuti e delle cellule. Queste analisi sono comunemente eseguite su tessuti FFPE macchiati con amplificazione del segnale. Poiché la nostra metodologia non utilizza l'amplificazione del segnale, abbiamo voluto verificare se il software potesse essere utilizzato per analizzare la colorazione sui tessuti congelati. Utilizzando la caratteristica adattiva del software, siamo stati in grado di segmentare le cellule in base a un marcatore nucleare e di membrana e di fenotipi cellule in base ai marcatori utilizzati per la colorazione. La figura 5 mostra la segmentazione cellulare e le mappe fenotipi che il numero di cellule macchiate per ogni marcatore analizzato dal software, dimostrando che il software può essere utilizzato per la quantificazione della colorazione multispettrale sui tessuti congelati.
Figura 1: Rilevamento di anticorpi coniugati primari utilizzando un microscopio filtrante a cristalli liquidi regolabili. Gli anticorpi primari ai marcatori indicati sono stati macchiati su una milza di topo congelato e rilevati utilizzando il sistema di imaging multispettrale Vectra 3.0 sotto gli obiettivi di 20x. CD3 su Alexa Fluor 488, CD8 su Alexa Fluor 594, CD11b su Per-CP Cy5.5, CD206 su Alexa Fluor 647 e Ki67 su Alexa Fluor 555 sono stati utilizzati. Ogni marcatore è rosso pseudo-colorato. Su queste diapositive non è stata utilizzata alcuna contromacchia. Barra della scala: 20 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Imaging multispettrale su una milza di mouse congelata. (A) Scansione a slitta intera dello scivolo colorato multiplexed presa in base agli obiettivi 4x. Per l'imaging multispettrale è stato scelto un timbro 2 x 2 in diverse regioni del tessuto. Barra della scala: 100 m. (B) Immagine composita scattata nell'ambito di un obiettivo 20x dopo lo smescolando spettrale. I marcatori pseudocolorati sono indicati e un'immagine ingrandita all'interno della casella rossa viene visualizzata accanto all'immagine. Barra della scala: 20 m. (C) Viste patologiche per ogni singolo marcatore. Accanto all'immagine viene visualizzata un'immagine ingrandita per ogni marcatore all'interno della casella rossa. Barra della scala: 20 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Imaging multispettrale su una tonsilla umana congelata. (A) Scansione a slitta intera dello scivolo colorato multiplexed scattata in base a un obiettivo 4x. Per l'imaging multispettrale è stato scelto un francobollo 1 x 1 (669 m x 500 m) in diverse regioni del tessuto. Barra della scala: 100 m. (B) Immagine composita dopo lo sconsione spettrale presa nell'ambito di un obiettivo 20x. I marcatori pseudocolorati sono indicati e un'immagine ingrandita all'interno della casella rossa viene visualizzata accanto all'immagine. Barra della scala: 20 m. (C) Viste patologiche per ogni singolo marcatore. Accanto all'immagine viene visualizzata un'immagine ingrandita per ogni marcatore all'interno della casella rossa. Barra della scala: 20 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Imaging multispettrale su un tumore del topo congelato. L'imaging multispettrale è stato eseguito su una regione 1 x 1 di un tumore HLF16 del topo congelato preso sotto un obiettivo 20x. L'immagine composita (sopra). Sono indicati i marcatori pseudo-colorati e vengono rappresentate le viste patologiche (sotto) per ogni singolo marcatore. Accanto all'immagine originale viene visualizzata un'immagine ingrandita per ogni marcatore all'interno della casella rossa. Barra di scala di 20 m Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Analisi di una sezione tumorale del topo congelato. (A) Mappa di segmentazione delle celle. È stata eseguita la segmentazione adattiva delle celle mediante inForm. Il software è stato addestrato per identificare nuclei (verde) e membrana (rosso). (B) Mappe fenotipi che per ogni marcatore colorato. Il software è stato addestrato per identificare i fenotipi in base alla colorazione. Il punto colorato rappresenta il marcatore indicato. "Altro" (nero) si riferisce alle cellule che non sono state macchiate per il marcatore indicato. (C) Grafico a barre (incerto e STDEV) raffigurante il numero di celle colorate per ciascun marcatore in due immagini multispettrali. Il numero indica le cellule fenotidinate in ogni immagine, ma non indica se i marcatori sono coespressi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Fluoroforo | Massimo eccitazione (nm) | Massimo emissione (nm) | Rilevamento previsto nel set di filtri (nome) |
| Alexa Fluor 488 | 488 | 519 | Fitc |
| Alexa Fluor 555 | 555 | 580 | Cy3 e Texas Red |
| Alexa Fluor 594 | 590 | 617 | Texas Rosso |
| Alexa Fluor 647 | 650 | 668 | Texas Rosso e Cy5 |
| Dapi | 350 | 470 | Dapi |
| PerCP-Cy 5.5 | 482 | 690 | Cy3, Texas Rosso e Cy5 |
Tabella 1: Elenco dei fluorofori con le loro lunghezze d'onda massime di eccitazione ed emissione e rilevamento previsto in set di filtri appropriati.
| Sploen di topo congelato | |||
| Anticorpo/dye | Clone | Concentrazione (g/mL) | |
| Alexa Fluor 594 anti-topo CD8a | 53-6.7 | 10 | |
| Alexa Fluor 488 anti-topo CD3 | 17A2 (in questo stato del 200o) | 20 | |
| Alexa Fluor 647 anti-topo CD4 | GK1.5 | 10 | |
| PerCP-Cy 5.5 Rat Anti-CD11b | M1/70 | 2 | |
| Alexa Fluor 555 Mouse anti-Ki-67 | B56 (in inglese) | 10 | |
| Dapi | 0.1 | ||
| Tumore del topo congelato | |||
| Anticorpo/dye | Clone | Concentrazione (g/mL) | |
| Alexa Fluor 594 anti-topo CD8a | 53-6.7 | 20 | |
| Alexa Fluor 488 anti-topo CD3 | 17A2 (in questo stato del 200o) | 20 | |
| Alexa Fluor 647 anti-topo CD206 (MMR) | C068C2 | 5 | |
| PerCP-Cy5.5 Ratto Anti-CD11b | M1/70 | 1 | |
| Alexa Fluor 555 Mouse anti-Ki-67 | B56 (in inglese) | 0.25 | |
| Dapi | 0.1 | ||
| Tonsil umano congelato | |||
| Anticorpo/dye | Clone | Concentrazione (g/mL) | |
| Alexa Fluor 594 anti-umano CD3 | UCHT1 (in modo non introito | 10 | |
| CD4 anti-uomo PerCP/Cianine5.5 | NUMERO di giochi di posta elettronica | 4 | |
| Alexa Fluor 647 CD8a anti-umano | C8/144B | 10 | |
| Alexa Fluor 488, eBioscience anti-umano CD20 | L26 (in inglese) | 10 | |
| Alexa Fluor 555 Mouse anti-Ki-67 | B56 (in inglese) | 1 | |
| Dapi | 0.1 | ||
Tabella 2: Elenco di anticorpi, cloni e concentrazioni utilizzati.
Supplementare Figura 1: Modelli di colorazione individuale del tumore HLF16 congelato dopo lo scolo spettrale. Barra di scala 20 m Si prega di fare clic qui per scaricare questa figura.
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Discussion
I tessuti congelati sono stati ampiamente utilizzati per l'imaging mIF per rilevare tradizionalmente da tre a quattro marcatori31 su un tessuto utilizzando il metodo diretto e indiretto32. Nel metodo diretto, gli anticorpi sono coniugati a coloranti fluorescenti o punti quantici33 per etichettare il tessuto, mentre nel metodo indiretto, un anticorpo primario non coniugato viene utilizzato per etichettare il tessuto seguito da un anticorpo secondario coniugato al fluoroforo che riconosce specificamente l'anticorpo primario. Alcuni dei recenti approcci di colorazione multiplex simultanei discussi in precedenza possono anche essere utilizzati per macchiare i tessuti congelati e rilevare più di quattro marcatori. Ma il costo per i reagenti e il tempo impiegato per la colorazione diventano intensivi a seconda del numero di marcatori rilevati. Un'altra tecnica multiplex per i tessuti congelati è la cartografia multi-epitope-ligando (MELC)34. La tecnica prevede la colorazione del campione con anticorpi coniugati con fluoroforo, imaging e fotosbiancamento del fluoroforo. Un importante avvertimento di questa tecnica è che solo un campo o regione del tessuto può essere multiplexed. Per multiplare altri campi o regioni la tecnica deve essere eseguita manualmente, il che richiede molto tempo o richiede l'automazione, il che è costoso. Un gruppo35 è stato in grado di rilevare sei colori sui tessuti congelati utilizzando una combinazione di colorazione diretta, indiretta e TSA. Tuttavia, la colorazione del tessuto ha preso 2 giorni. In confronto, la nostra metodologia utilizza un metodo di colorazione multiplex simultaneo che prevede l'applicazione di un cocktail di cinque anticorpi direttamente coniugati più DAPI per macchiare i tessuti congelati entro 90 min. Inoltre, utilizzando un sistema semiautomatico di imaging a fluorescenza multispettrale, siamo stati in grado di separare spettralmente e rilevare sei marcatori nella milza congelata, nella tonsilluna e nei tessuti tumorali utilizzando questa tecnica semplificata di colorazione multiplex. I set di filtri Cy3, Texas Red e Cy5 disponibili al microscopio offrono opportunità per rilevare fluorofori aggiuntivi, aumentando così potenzialmente il numero di marcatori che possono essere rilevati contemporaneamente nei tessuti congelati.
La colorazione Multiplex che utilizza l'approccio TSA sui tessuti FFPE richiede un passaggio di recupero dell'antigene seguito da passaggi sequenziali di etichettatura, lavaggio e stripping. L'esecuzione della procedura varia da 1 a 2 giorni a seconda dei tempi di incubazione utilizzati per gli anticorpi6. Recentemente, utilizzando un processore di tessuto microfluidico, è stata eseguita una colorazione a quattro plessi utilizzando l'approccio TSA su tessuti FFPE inferiori a 90 min. Altre tecniche multiplex per i tessuti FFPE possono essere eseguite sotto 4-5 h utilizzando una scala automatica. Tuttavia, le appropriate fasi di recupero dell'antigene devono essere ottimizzate per garantire la disponibilità dell'epitopo per gli anticorpi36, che a sua volta si basa sull'attenta considerazione dei cloni di anticorpi e sull'ordine dei marcatori rilevati. Ad esempio, alcuni cloni di anticorpi di CD3 non possono essere utilizzati, perché successivamente gli anticorpi CD4 e CD8 non vengono rilevati37. Allo stesso modo, c'è variabilità del rilevamento dell'antigene tra i cloni anticorpi disponibili17,18. Pertanto, la colorazione multiplex dei tessuti FFPE richiede l'ottimizzazione dei cloni di anticorpi, le loro concentrazioni e l'ordine in cui sono macchiati, il che richiede tempo. Al contrario, la mancanza di un'estesa lavorazione dei tessuti congelati consente l'uso di vari cloni di anticorpi con alta specificità. Inoltre, i cloni di anticorpi disponibili per i tessuti congelati possono essere utilizzati anche nella citometria di flusso e in ELISA, consentendo la convalida simultanea attraverso vari saggi. L'architettura dei tessuti è anche una preoccupazione nei tessuti congelati38. La colorazione multiplex mostrata qui sui tessuti congelati è significativamente più veloce rispetto all'approccio TSA. Le combinazioni di fluoroforo richiedono un'attenta selezione di marcatori per garantire che gli anticorpi non si ostacolino di tipo sterically l'un l'altro, soprattutto quando vengono rilevati diversi antigeni espressi nella stessa posizione cellulare. Abbiamo scelto marcatori che macchiano diverse cellule su fluorofori che sono spettralmente separati, consentendo una migliore rilevazione. Le concentrazioni di anticorpi richiedono anche l'ottimizzazione, ma poiché il protocollo di colorazione è veloce, il tempo complessivo impiegato per l'ottimizzazione non richiede molto tempo. Un avvertimento al nostro metodo può essere l'incapacità di rilevare marcatori bassi esprimi nei tessuti. Alcuni degli approcci di colorazione multiplex sui tessuti FFPE comportano una fase di amplificazione del segnale utile per rilevare marcatori a bassa espressione. Tuttavia, l'uso di anticorpi secondari e terziari può essere impiegato per aumentare il segnale. In questi casi, la reattività incrociata agli anticorpi nel pannello dovrebbe essere evitata per evitare un'errata interpretazione dei risultati.
Oltre alla milza di topo e ai tessuti tonsille umani, ricchi di cellule immunitarie, abbiamo usato il tessuto tumorale come esempio per l'imaging a fluorescenza multispettrale proposto di tessuti congelati. L'imaging a fluorescenza multispettrale nei tumori ha fornito informazioni preziose, come la caratterizzazione del microambiente tumorale (TME)39,prevedendo il successo dei trasferimenti di cellule T adottive nel melanoma maligno40e caratterizzando le proteine nelle vie di trasduzione del segnale tumorale41. Utilizzando marcatori specifici per le cellule immunitarie comunemente presenti nei tumori, siamo stati in grado di rilevare le cellule T CD8 infiltranti e i TAM nel tessuto tumorale HLF16 utilizzato in questo studio. Abbiamo usato il software di apprendimento automatico per segmentare e fenotipo le cellule con successo. La colorazione multiplex per i tessuti FFPE utilizza una fase di amplificazione del segnale per migliorare il rapporto segnale-rumore (SNR) che aiuta l'elaborazione e la quantificazione delle immagini42,43. Il software di apprendimento automatico è stato utilizzato per le analisi sui tessuti FFPE macchiati con amplificazione del segnale2. La metodologia qui presente non utilizza l'amplificazione del segnale, ma siamo stati in grado di segmentare e fenotipo le cellule utilizzando il software con successo. Per un'ulteriore analisi (ad esempio, la coespressione del fenotipo e le relazioni spaziali) e l'interpretazione accurata della quantificazione, la formazione del software richiede la convalida utilizzando un set di training, un set di test e un set di convalida. In un processo iterativo, un set di immagini (ovvero il set di training) viene utilizzato per eseguire il training del software di apprendimento automatico per identificare i fenotipi fino a quando le previsioni del modello per un set separato di immagini (ovvero il set di test) non sono accurate. Al termine dell'allenamento, viene analizzato un batch finale di immagini (ad esempio, il set di convalida) per verificare se è stato eseguito un over-fitting.
In conclusione, la metodologia qui presentata è un modo rapido di eseguire l'imaging a fluorescenza multispettrale utilizzando tessuti congelati. Il metodo è utile per rilevare marcatori ai quali entrambi gli anticorpi non sono disponibili o non possono essere rilevati nei tessuti FFPE. In collaborazione con il software di apprendimento automatico, il tempo necessario per eseguire analisi quantitative può facilitare significativamente le rapide diagnosi precliniche e cliniche e può essere applicato nel campo della trascrittomica spaziale ad alta risoluzione che utilizza tessuti congelati44.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.
Acknowledgments
L'imaging e l'analisi sono state fornite dal Research Resources Center – Research Histology and Tissue Imaging Core dell'Università dell'Illinois a Chicago istituito con il supporto dell'ufficio del Vice Cancelliere per la Ricerca. Il lavoro è stato supportato da NIH/NCI RO1CA191317 a CLP, da NIH/NIAMS (SBDRC grant 1P30AR075049-01) al Dr. A. Paller, e dal sostegno del Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center to the Immunotherapy Assessment Core presso la Northwestern University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone (histological grade) | Fisher Scientific | A16F-1GAL | Fixing tissues |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse CD3 | BioLegend | 100212 | Clone - 17A2; primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 488, eBioscience anti-human CD20 | ThermoFisher Scientific | 53-0202-82 | Clone - L26; primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 555 Mouse anti-Ki-67 | BD Biosciences | 558617 | Primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 594 anti-human CD3 | BioLegend | 300446 | Clone - UCHT1; primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 594 anti-mouse CD8a | BioLegend | 100758 | Clone - 53-6.7; primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 647 anti-human CD8a | BioLegend | 372906 | Clone - C8/144B; primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 647 anti-mouse CD206 (MMR) | BioLegend | 141711 | Clone - C068C2; primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 647 anti-mouse CD4 Antibody | BioLegend | 100426 | Clone - GK1.5; primary conjugated antibody |
| C57BL/6 Mouse | Charles River Laboratories | 27 | Mouse frozen tissues used for multispectral training |
| Coplin Jar | Sigma Aldrich | S6016-6EA | Rehydrating and washing slides |
| DAPI Solution | BD Biosciences | 564907 | Nucleic Acid stain |
| Diamond White Glass Charged Slides | DOT Scientific | DW7590W | Adhering tissue sections |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1x (without Ca and Mg) | Fisher Scientific | MT21031CV | Washing and diluent |
| Gold Seal Cover Slips | ThermoFisher Scientific | 3306 | Protecting stained tissues |
| Human Normal Tonsil OCT frozen tissue block | AMSBio | AMS6023 | Human frozen tissue used for multispectral staining |
| Human Serum 1x | Gemini Bio-Products | 100-512 | Blocking and diluent for human tissues |
| inForm | Akoya Biosciences | Version 2.4.1 | Machine learning software |
| PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD4 | BioLegend | 300529 | Clone - RPA-T4; primary conjugated antibody |
| PerCP-Cy 5.5 Rat Anti-CD11b | BD Biosciences | 550993 | Clone - M1/70; primary conjugated antibody |
| Phenochart | Akoya Biosciences | Version 1.0.8 | Whole slide scan software |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36965 | Mounting medium |
| Research Cryostat | Leica Biosystems | CM3050 S | Sectioning tissues |
| Superblock 1x | ThermoFisher Scientific | 37515 | Blocking mouse tissues |
| Tissue-Tek O.C.T Solution | Sakura Finetek | 4583 | Embedding tissues |
| Vectra 3.0 Automated Quantitative Pathology Imaging System, 6 Slide | Akoya Biosciences | CLS142568 | Semi-automated multispectral imaging system |
| Vectra Software | Akoya Biosciences | Version 3.0.5 | Software to operate microscope |
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