Summary
Vi beskriver en rask fargingsmetode for å utføre multispektral avbildning på frosne vev.
Abstract
Multispektral fluorescensavbildning på formalin-fast parafin-innebygd (FFPE) vev gjør det mulig å oppdage flere markører i en enkelt vevsprøve som kan gi informasjon om antigenkouttrykk og romlig fordeling av markørene. Imidlertid kan mangel på egnede antistoffer for formalin-fikset vev begrense arten av markører som kan oppdages. I tillegg er fargemetoden tidkrevende. Her beskriver vi en rask metode for å utføre multispektral fluorescensavbildning på frosne vev. Metoden inkluderer fluoroforen kombinasjoner som brukes, detaljerte trinn for farging av mus og menneskelig frosset vev, og skanning, oppkjøp og analyse prosedyrer. For fargingsanalyse brukes et kommersielt tilgjengelig semiautomatisert multispektralt fluorescensbildesystem. Gjennom denne metoden ble opptil seks forskjellige markører farget og oppdaget i en enkelt frossen vevsseksjon. Maskinlæringsanalyseprogramvaren kan fenotypeceller som kan brukes til kvantitativ analyse. Metoden som er beskrevet her for frosne vev er nyttig for påvisning av markører som ikke kan oppdages i FFPE vev eller som antistoffer ikke er tilgjengelige for FFPE vev.
Introduction
Nylige fremskritt innen mikroskopiske bildeteknikker har betydelig forbedret vår kunnskap og forståelse av biologiske prosesser og sykdomstilstander. Ved situ påvisning av proteiner i vev via kromogen immunohistochemistry (IHC) utføres rutinemessig i patologi. Imidlertid er påvisning av flere markører ved hjelp av kromogen IHC farging utfordrende1 og nyere metoder for å bruke multipleks immunofluorescens (mIF) farging tilnærminger, karakterisert ved at flere biologiske markører er merket på en enkelt vevsprøve, blir utviklet. Påvisning av flere biologiske markører er nyttig, fordi informasjon relatert til vevsarkitektur, romlig fordeling av celler og antigenkouttrykk er alle fanget i en enkelt vevsprøve2. Bruken av multispektral fluorescensbildeteknologi har gjort påvisning av flere biologiske markører mulig. I denne teknologien, ved hjelp av spesifikk optikk fluorescensspektra av hver enkelt fluoroforfor kan skilles eller "ublandet", slik at påvisning av flere markører uten spektral crosstalk3. Multispektral fluorescensavbildning blir en kritisk tilnærming i cellebiologi, preklinisk legemiddelutvikling, klinisk patologi og tumorimmunprofilering4,5,6. Viktigere, spacial fordeling av immunceller (spesielt CD8 T celler) kan tjene som en prognostisk faktor for pasienter med eksisterende svulster7.
Ulike tilnærminger til multipleks fluorescens farging er utviklet og kan utføres enten samtidig eller sekvensielt. I den samtidige fargemetoden legges alle antistoffene sammen som en cocktail i et enkelt trinn for å merke vevet. UltraPlex-teknologi bruker en cocktail av hapten-konjugerte primære antistoffer etterfulgt av en cocktail av fluorofofan-konjugerte anti-hapten sekundære antistoffer. InSituPlex-teknologi8 bruker en cocktail av unike DNA-konjugerte primære antistoffer som samtidig legges til vevet etterfulgt av et forsterkningstrinn og til slutt fluoroforiske konjugerte sonder som er komplementære til hver unike DNA-sekvens på det primære antistoffet. Begge disse teknologiene gjør det mulig å oppdage fire markører pluss 4',6-diamino-2-fenylindzol (DAPI) for kjernefysisk farging. To andre tilnærminger for samtidig multipleksfarging er basert på sekundær ionmassespektrometri9. Hyperion Imaging System bruker bildemasse cytometri10 for å oppdage opptil 37 markører. Denne teknologien bruker en cocktail av metall-konjugerte antistoffer for å flekke vevet, og bestemte områder av vevet er ablated av en laser og overføres til et massecytometer hvor metallionene oppdages. En annen lignende teknologi er IONPath, som bruker multipleksert ion strålebildeteknologi11. Denne teknologien bruker et modifisert massespektrometriinstrument og en oksygenionkilde i stedet for laser for å ablate metallkonjugerte antistoffer. Mens alle disse samtidige multipleksfargingsmetodene muliggjør påvisning av flere markører, kan kostnadene som er involvert for å konjugere DNA, haptens eller metaller til antistoffer, tap av vev på grunn av ablasjon og omfattende bildebehandling for unmixing ikke undervurderes. Videre er sett og fargingprotokoller for tiden bare tilgjengelige for FFPE-vev, og utvikling av tilpassede paneler innebærer ekstra tid og utgifter.
Den sekvensielle multipleksfarfargingsmetoden, derimot, inkluderer merking av vevet med et antistoff mot en markør, stripping for å fjerne antistoffet, etterfulgt av sekvensielle gjentakelser av denne prosessen for å merke flere markører12. Tyramidsignalforsterkningen (TSA) er den mest brukte sekvensielle multipleksjonsmetoden. To andre multipleksingsteknologier bruker en kombinasjon av samtidige og sekvensielle fargingsmetoder. CODEX-plattformen13 benytter en cocktail av antistoffer som er konjugert til unike DNA oligonucleotide sekvenser som til slutt er merket med en fluorofor i bruk av et indeksert polymeriseringstrinn etterfulgt av avbildning, stripping og gjentaprosessen for å oppdage opptil 50 markører. MultiOmyx multiplex farging tilnærming14 er en iterasjon av farging med en cocktail av tre til fire fluorofor-konjugerte antistoffer, bildebehandling, slukke fluoroforer, og gjenta denne syklusen for å oppdage opptil 60 markører på en enkelt seksjon. I likhet med den samtidige multipleksfargingsmetoden, mens et bredt spekter av markører kan oppdages, er tiden som er involvert i farging, bildeoppkjøp, behandling og analyse omfattende. Stripping / slukking trinn innebærer oppvarming og / eller bleking vevprøven og dermed den sekvensielle multipleks farging tilnærming er ofte utført på FFPE vev som opprettholder vev integritet ved oppvarming eller bleking.
Formalin fiksering og påfølgende parafin innebygging utføres lett i en klinisk setting, vev blokker er lett å lagre, og flere multipleks farging protokoller er tilgjengelig. Imidlertid er behandlingen, innebygging og deparaffinisering av FFPE vev, samt antigen gjenfinning15, en prosess der antistoffer bedre kan få tilgang til epitoper, tidkrevende. Videre bidrar behandlingen involvert i FFPE vev til autofluorescens16 og masker mål epitoper, noe som resulterer i variabilitet og mangel på antistoff klone tilgjengelig for å oppdage antigener i FFPE vev17,18,19. Et eksempel er humant leukocytter antigen (HLA) klasse jeg alleles20. I motsetning innebærer snap frysing av vev ikke omfattende behandlingstrinn før eller etter fiksering, omgå behovet for antigen henting21,22, og gjør det gunstig for å oppdage et bredere spekter av mål. Derfor kan bruk av frosne vev for multispektral fluorescensavbildning være verdifullt for å oppdage mål for prekliniske og kliniske studier.
Gitt de ovennevnte begrensningene ved bruk av FFPE vev, spurte vi om multispektral fluorescensavbildning kan utføres på frosne vev. For å løse dette spørsmålet testet vi en samtidig multipleksfargingsmetode ved hjelp av et panel av fluorofor-konjugerte antistoffer for å oppdage flere antigener og analyserte farging ved hjelp av et halvautomatisert multispektralt bildesystem. Vi var i stand til å samtidig farge opp til seks markører i en enkelt vev seksjon innen 90 min.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Mus milt og HLF16 mus tumor vev23 ble hentet fra vårt laboratorium. Menneskelig mandlene vev ble kjøpt fra en kommersiell leverandør. Detaljer er gitt i materialtabellen.
1. Vevsinnebygging
- Bygg inn friskt vev i OCT (optimal skjæretemperatur) løsning og snap fryse ved hjelp av enten tørris eller flytende nitrogen.
- Oppbevar vevet ved -80 °C.
2. Kryoseksjon
- Skjær 8 μm seksjoner i en kryostat med temperaturer satt til -25 °C.
MERK: Den foretrukne seksjonstykkelsen kan justeres for å generere skarpere bilder. - Plasser inndelinger på ladet glasslysbilder.
- Lufttørk seksjonene i 1 t ved romtemperatur (RT) før de festes i histologigrad iskald aceton i 10 min.
MERK: Aceton forårsaker koagulasjon av vannløselige proteiner og trekker ut lipider, men påvirker ikke karbohydratholdige komponenter. I motsetning, formalin bevarer de fleste lipider og har liten innvirkning på karbohydrater24. Valget av fikseringsmiddel er viktig avhengig av valg av markør som oppdages. - Oppbevar lysbildene ved -20 °C.
3. Valg av antistoffer og fluoroforer
MERK: Før vevfarging må antistoffkloner som robust og spesifikt vil flekke deres antigener av interesse innenfor sekvensielle seksjoner fra aceton fast vev valideres. Noen antistoffer kan kreve en annen fikseringsmiddel, og deres kompatibilitet med andre antistoffer i panelet må også bestemmes empirisk. Målet er også å identifisere fluoroforer med minimal overlapping som kan oppdages med epifluorescensfiltre for DAPI, FITC, Cy3, Texas Red og Cy5.
- Bekreft farging ved konvensjonell IHC eller immunfluorescens (IF) deteksjon i vevsseksjoner med kjent uttrykksmålantigen.
- Bruk av eksitasjons- og utslippsfiltersettene som er tilgjengelige på det halvautomatiske bildesystemet og etter testing av ulike kombinasjoner av fluorofofan-konjugerte primære antistoffer, forberede fluoroforer som skal brukes som har minimal spektral overlapping (f.eks. se tabell 1).
4. Befaring
MERK: Vevrehydrering og glidevasker ble utført i en Coplin krukke. Blokkerings- og antistoffinkubasjonstrinnene ble utført i en fuktet skyveboks.
- La lysbildene varmes opp til RT i 5–10 min.
- Rehydrere i fosfatbufret saltvann (PBS) i 5 min.
- Utfør et blokkeringstrinn før du ser vev med antistoffer. For museseksjoner bruker du spesialisert blokkeringsløsning (se Materialtabellen) i 10 min ved RT. For menneskelige seksjoner, bruk 10% normalt samlet humant serum (NHS) fortynnet i PBS i 15 min ved RT.
MERK: Ulike blokkeringsbuffere kan testes etter behov for å bevare de spesifikke egenskapene til seksjonene, avhengig av oppfølgingsprosedyrene som skal brukes. - Vask lysbildene i 5 min i PBS etter blokkering.
- For multipleksfarging, lag en cocktail av antistoffer med kompatible fluoroforer ved forhåndsbestemte optimale fortynninger.
- Tilsett cocktail av fluorofor-konjugerte antistoffer til lysbildene. For farging med én markør, legg bare det primære konjugerte antistoffet til lysbildet.
- Inkluder et ukontrollert styre som gjennomgår samme fargingsprosedyre uten tillegg av et primært konjugert antistoff.
- Inkuber lysbildene i 1 h ved RT i mørket og vask deretter lysbildene 2x med PBS i 5 min hver. Herfra kalles det resulterende lysbildet som multipleksfarget.
- For å motvirke flekken, legg DAPI til multipleksfarget lysbilde, rug i 7 min i mørket på RT, og vask lysbildene 2x med PBS i 5 min hver. Ikke motflekk enfargede og ufargede lysbilder.
- For å dekkeslip, legg til en dråpe av monteringsmediet, og plasser forsiktig glassdekselet over vevet.
5. Forberede et spektralbibliotek
-
Bildeoppkjøp
- Sett lampestrømmen til 100 %. Vanligvis er strømmen satt til 10% fordi fluorescensdeteksjon på FFPE vev inneholder et signalforsterkningstrinn.
- Begynn med å åpne operativsystemet mikroskopet (se Materialtabellen).
- Velg Rediger protokoll og deretter Ny protokoll.
- Oppgi et "Protokollnavn", og velg Fluorescence under Bildemodus, og gi et "studienavn".
- Plasser de enfargede lysbildene på scenen og undersøk hver markør i den tilsvarende fluorescenskanalen for å sikre farging. Velg en region på vevet som uttrykker det sterkeste signalet for markøren.
- Juster eksponeringstidene ved hjelp av alternativene Autofokus og Autoeksponer.
- Få øyeblikksbilder for enkeltfargede og ufargede lysbilder og lagre protokollen.
MERK: Følgende trinn utføres i maskinlæringsprogramvare (se Materialtabellen), ved hjelp av de enkle beisede og ufargede lysbildene for å verifisere spesifikk farging, samt å bestemme antistoffkrysssnakk. - Last inn hvert enkeltbeiset lysbildebilde under kategorien Bygg biblioteker i programvaren, velg riktig Fluor og klikk Pakk ut. Programvaren vil automatisk trekke ut fluorescenssignalet som er valgt i Fluor.
- Hvis du vil lagre den utpakkede fargen, klikker du på Lagre i butikken. En "Ny gruppe" kan opprettes, eller den utpakkede fargen kan lagres i en eksisterende gruppe.
-
Verifisere spektralbiblioteket
- Kontroller vinduet for utslippsspektralkurve, som er plassert til høyre for det utpakkede bildet, for hvert filtersett.
MERK: Det ekstraherte signalet er riktig hvis spektralkurven bare observeres i filtersettene der fluoroforforen oppdages. Hvis en spektralkurve observeres i feil filtersett, kan det bety at enten det primære signalet som forventes i filtersettet ikke er sterkt nok, eller programvaren oppdager et annet signal som er for høyt, muligens på grunn av spektral overlapping. I dette tilfellet må du først prøve å bruke verktøyet Tegne behandlingsområder til å tegne områder rundt områder som uttrykker den fluorescerende markøren og autofluorescensen i bildet. Dette trener programvaren for å oppdage det sanne signalet og fjerne eventuelle forstyrrende signaler. Hvis dette ikke virker, gjentar du fargingsprosessen for det enfargede lysbildet for å teste forskjellige antistofftitreringer.
- Kontroller vinduet for utslippsspektralkurve, som er plassert til høyre for det utpakkede bildet, for hvert filtersett.
6. Multispektral Bildebehandling
MERK: Når spektralbiblioteket er opprettet og verifisert, utfører du følgende trinn for multipleksfarget lysbilde.
-
Skanning av hele lysbilde
- Juster fokus- og eksponeringstiden på multipleksfarget lysbilde som nevnt under i avsnitt 5.1.
- Opprett en ny oppgave under Skanne lysbilder,og velg protokollen som er lagret ovenfor.
- Utfør en hel lysbildeskanning på det multipleksfargede lysbildet.
- Bruk hele lysbildeskanneprogramvaren til å åpne hele lysbildeskannebildet. Dette bildet har ikke blitt spektralt ublandet.
- Velg områder av interesse (AVKASTNING) på tvers av hele lysbildeskannebildet ved hjelp av stempel- eller avkastningsverktøyet. Disse ROIene vil bli skannet ved hjelp av eksponeringstiden satt i 6.1.1 som skal brukes til spektral unmixing og analyse.
- Klikk prosesslysbilde for å hente ROIer ved 20x forstørrelse
-
Spektral unmixing
- Når ROIene er anskaffet, laster du inn multipleksfargede bilder under kategorien Manuell analyse under kategorien Manuell analyse ved å klikke Åpne under Fil.
- Klikk Velg fluoreri rullegardinmenyen Spektralbibliotekkilde .
- Et nytt vindu åpnes. Her velger du spektralbiblioteket eller gruppen som er opprettet ovenfor.
- Last inn det ufargede lysbildebildet. Klikk på IKONET FOR AF-blekkmarkør over det valgte spektralbiblioteket, og tegn en linje eller region på det ufargede lysbildet for å identifisere autofluorescens i vevet.
- Tilordne navn for hver markør under kategorien Rediger indikatorer og farger. Pseudo farger kan tilordnes på dette trinnet.
MERK: Fargen for Autofluorescence-bildet er som standard til DarkSlateGray. Endre dette til Svart. - Klikk Klargjør alle.
-
Kontrollere spektralt ublandede bilder
MERK: Når spektral unmixing trinnet er fullført, opprettes et sammensatt bilde som består av alle fargene.- Klikk på Ikonet Rediger vis øye. Her kan hver farge i "Komponentvisning" slås av eller på for å vise farging av hver enkelt markør.
- Kontroller visuelt flekker og morfologien til cellene for å sikre at det ikke er noen overlapping av markør, med mindre det er biologisk relevant. En patolog kan også bidra til å verifisere farging.
MERK: Farging på multipleksed lysbildet bør valideres ved å utelate en fluorophore om gangen og gjennomgå fargemønsteret. I tillegg vil valideringen også bidra til å identifisere sterke fluoroforer som vises i tilstøtende spektra på grunn av antistoffkrysssnakk eller utfallende. - For patologivisninger, som simulerer brightfield-bilder for hver fluorescerende markør, klikker du på Velg et komponentbilde-knappen. Her velger du en markør for å vise et simulert brightfield-bilde.
7. Analysere multispektrale bilder via cellesegmentering og fenotyping
MERK: Når du har bekreftet det spektrale ublandede bildet, kan cellesegmentering utføres ved hjelp av maskinlæringsprogramvaren, som vil gi trinnvise instruksjoner. Vevssegmentering ble ikke utført her. Hvis panelet inneholder en eller flere vevsspesifikk markør, og spesielt hvis vevet er rotete, bør vevssegmentering utføres.
- Velg "Cytoplasma" og "Membrane" under "Segment" alternativet.
MERK: "Nuclei"er valgt som standard. - Velg en markør fra panelet. Konfigurer markøren for å oppdage enten kjerner, cytoplasma eller membran. DAPI kan for eksempel velges for å oppdage kjerner og CD3 for membran.
- Klikk på ellipseknappen ('...') for å velge et alternativ under "bruk dette signalet for å finne". For eksempel 'kjerner' for DAPI. Flere markører fra panelet kan velges for segmentering.
MERK: For cytoplasmatiske eller membranmarkører velger du alternativet Brukdette signalet til å hjelpe til med kjernefysisk segmentering. - Programvaren oppdager og oppretter automatisk en maske hver for kjernen, cytoplasma og membran i bildet.
- Sørg for at alle cellene er "maskert" for segmentering. For å justere, bytt til patologivisningen for den spesifikke markøren valgt i 7.3. og bruke konfigurasjonsalternativene i programvaren.
- Klikk på"Segment alle"for å segmentere celler.
- Etter cellesegmentering, fortsett med fenotypingceller. I dette trinnet velger du markørene som trengs for fenotyping og velger manuelt minst fem celler som er sterkt farget med den valgte markøren. Dette trener programvaren for deretter å automatisk oppdage alle celler farget med den valgte markøren i bildet.
- Det opprettes et fenotypekart. Analyser for å sikre at cellen farget med markøren er riktig fenoskrevet.
MERK: Cell fenotyping kan være en iterativ prosess. Hvis programvaren ikke er i stand til å fenotype cellene riktig, betyr det at treningen er utilstrekkelig eller feil. I dette tilfellet må brukeren manuelt velge flere celler og omskolere programvaren og gjenta dette trinnet til brukeren er fornøyd med opplæringen. - Opprett en gruppe kalt "Andre" og inkluder celler som ikke er farget for noen av markørene.
MERK: Dette trinnet er viktig å trene programvaren for å utelukke alle de ufargede cellene fra fenotyping.
8. Eksportere bilder og analysetabeller
- Klikk Eksporter-knappen for å vise Eksporter innstillinger-panelet.
- I "Eksporter katalog", klikk Bla gjennom for å velge en plassering for å eksportere bildene.
- I "Alternativer for bildeeksport", velger du bildeutdataformatet.
- Velg bildene som skal eksporteres, i «Bilder som skal eksporteres»-listen. "Sammensatt bilde" er det endelige pseudofargede ublandede bildet. "Patologi visninger" er den enkelte simulerte brightfield bilder og "Komponent bilder (multi-image TIFF)" er en multi-image TIFF fil av komponentdata som kan brukes av tredjeparts analyseprogramvare.
- Klikk på"Eksporter for alle"-knappen for å eksportere bildene.
MERK: Tabeller fra analyse kan også velges og eksporteres på dette trinnet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Påvisning av enkeltfargede markører på frosne miltseksjoner
Som det halvautomatiske bildebehandlingssystemet bruker et flytende krystalltunablefilter (LCTF) system som gjør det mulig for et bredere spekter av bølgelengdedeteksjon25, og fordi ingen signalforsterkningstrinn ble utført her, optimaliserte vi først påvisning av våre primære konjugerte antistoffer for hver markør på mikroskopet. Et eksempel vises i figur 1, der hver enkeltfarget markør er pseudofarget rød. Alexa Fluor konjugerte antistoffer som brukes her har blitt validert av selskapene for immunofluorescens og flyt cytometri. Per-CP-Cy5.5 fluoroforfor er imidlertid bare validert for flow cytometri. Vi var i stand til å oppdage denne fargen i våre enkeltfargede lysbilder, som støtter egnetheten av flow cytometri validerte antistoffer for bruk i multispektral avbildning og gir fordelen av å bruke slike antistoffer for å validere observasjoner ved hjelp av to forskjellige teknikker (dvs. flow cytometri og multispektral avbildning). Vi fortsatte deretter å utføre multispektral avbildning på frosne vev.
Flerfarget fluorescensdeteksjon på frossen musemilt
For å teste multipleksfargingsmetoden og spektralavbildning, brukte vi musfrosset miltvev, som har en overflod av immunceller. Figur 2 viser et spektralt ublandet bilde av forskjellige markører i en del av frossen musemilt. Antistoffene, klonene og konsentrasjonene som brukes til farging er beskrevet i tabell 2. Det fangede bildet viser en del av T-cellesonen identifisert ved tilstedeværelse av CD3-, CD4- og CD8-markører, omgitt av myeloide celler som uttrykker CD11b som for det meste observeres i marginalsonen. Regioner av sprekende celler som uttrykker Ki67 observeres hovedsakelig i spiringsentre. Alternativet "Patologivisninger" for hver markør viste sitt individuelle fargemønster i vevet. Distinkte fargemønstre for CD11b, Ki67 og CD3-, CD4- og CD8-markørene sammen ble observert, noe som tyder på at multipleksfargemetoden og spektralavbildningen fungerte på det frosne vevet.
Multi-farge fluorescens deteksjon på frosne menneskelige mandler
Etter å ha testet et fargepanel egnet for musevev, vurderte vi neste et eget panel for frosset humant mandlervev. Figur 3 viser et spektralt ublandet bilde av de forskjellige markørene som brukes. Antistoffene, klonene og konsentrasjonene som brukes til farging er beskrevet i tabell 2. Det fangede bildet viser et follikulært bakteriesenter26 som uttrykker B-celler identifisert av CD20-markøren. Prolifererende celler i follikulære spiresenter ble identifisert av Ki67. Noen av disse sprede cellene costained med CD20 og kan være centroblasts27, naive B-celler som gjennomgår aktiv somatiske hypermutasjon. Follikulære spiringsentre var omgitt av interfollikulær T celle regionen identifisert av uttrykket av CD3, CD4, og CD8. Igjen ble det observert tydelige flekkermønstre her, noe som bekrefter at metodikken fungerte på et frosset vev.
Anvendelse av multispektral fluorescens avbildning på frossen mus tumor vev
Multispektral avbildning er et nyttig verktøy for overvåking av immuncelleinfiltrasjon i svulster som en prognose for immunterapier. For dette formål, vi satt ut for å farge en frossen mus tumor vev prøve og oppdage immuncelle infiltrater. HLF16 cellelinjen brukes som et humant papillomavirus (HPV)+ tumormodell for livmorhalskreft i HLA-A*0201 transgene mus28. Den transgene cellelinjen ble utviklet ved å transfecting hjerte lunge fibroblaster fra HLA-A * 0201 med HPV16 E6 og E7 onkogener og H-Ras V1228. T celler og tumor assosierte makrofager er de vanligste immuninfiltratene som finnes i svulster29. Figur 4 viser et spektralt ublandet bilde på en frossen HLF16 tumorseksjon sammen med patologivisningene; de enkelte fargemønstrene er vist i tilleggsfigur 1. Antistoffene, klonene og konsentrasjonene som brukes til farging er beskrevet i tabell 2. Det fangede bildet viser regioner av tumorinfiltrerende T-celler identifisert av CD3- og CD8-markørene sammen med tilstedeværelsen av andre myeloide cellelinjer identifisert av CD11b-markøren. Den fangede regionen viser også tumor assosierte makrofager (TAMs), muligens av M2 fenotype, oppdaget av CD206 markør30, som er nært knyttet til flere prolifererende celler oppdaget som Ki67+.
Maskinlæringsprogramvaren2 leveres med funksjoner som vev og celleanalyser. Disse analysene utføres vanligvis på FFPE vev farget med signalforsterkning. Siden vår metodikk ikke bruker signalforsterkning, ønsket vi å teste om programvaren kunne brukes til å analysere farging på frosne vev. Ved hjelp av den adaptive funksjonen i programvaren, var vi i stand til å segmentere celler basert på en kjernefysisk og membran markør og å fenotype celler basert på markørene som brukes til farging. Figur 5 viser cellesegmentering og fenotypekart og antall fargede celler for hver markør analysert av programvaren, noe som viser at programvaren kan brukes til kvantifisering av multispektral farging på frosne vev.
Figur 1: Oppdage primære konjugerte antistoffer ved hjelp av et flytende krystalltunable filtermikroskop. Primære konjugerte antistoffer mot de angitte markørene ble farget på en frossen musemilt og oppdaget ved hjelp av Vectra 3.0 multispektralbildesystem under 20x mål. CD3 på Alexa Fluor 488, CD8 på Alexa Fluor 594, CD11b på Per-CP Cy5.5, CD206 på Alexa Fluor 647 og Ki67 på Alexa Fluor 555 ble brukt. Hver markør er pseudofarget rød. Ingen motflekk ble brukt på disse lysbildene. Skalabar = 20 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Multispektral avbildning på en frossen musemilt. (A) Hele lysbildeskanning av multipleksert farget lysbilde tatt under 4x mål. Et 2 x 2 stempel på tvers av ulike områder av vevet ble valgt for multispektral avbildning. Skalabar = 100 μm. (B) Sammensatt bilde tatt under et 20x mål etter spektral unmixing. Pseudofargede markører angis og et forstørret bilde i den røde boksen vises ved siden av bildet. Skalabar = 20 μm. (C) Patologi visninger for hver enkelt markør. Et forstørret bilde for hver markør i den røde boksen vises ved siden av bildet. Skalabar = 20 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Multispektral avbildning på en frossen menneskelig mandlene. (A) Hele lysbildeskanning av multipleksert farget lysbilde tatt under en 4x mål. Et 1 x 1 stempel (669 μm x 500 μm) på tvers av forskjellige områder av vevet ble valgt for multispektral avbildning. Skalabar = 100 μm. (B) Komposittbilde etter spektral unmixing tatt under et 20x mål. Pseudofargede markører angis og et forstørret bilde i den røde boksen vises ved siden av bildet. Skalabar = 20 μm. (C) Patologi visninger for hver enkelt markør. Et forstørret bilde for hver markør i den røde boksen vises ved siden av bildet. Skalabar = 20 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Multispektral avbildning på en frossen musesvulst. Multispektral avbildning ble utført på en 1 x 1 region av en frossen mus HLF16 svulst tatt under en 20x mål. Det sammensatte bildet (ovenfor). De pseudofargede markørene er angitt og patologivisningene (nedenfor) for hver enkelt markør er avbildet. Et forstørret bilde for hver markør i den røde boksen vises ved siden av det opprinnelige bildet. Skala bar = 20 μm Vennligst klikk her for å vise en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Analyse av en frossen mustumorseksjon. (A) Cellesegmenteringskart. Adaptiv cellesegmentering ved hjelp av inForm ble utført. Programvaren ble opplært til å identifisere kjerner (grønn) og membran (rød). (B) Fenotype kart for hver farget markør. Programvaren ble opplært til å identifisere fenotyper basert på farging. Farget prikk representerer den angitte markøren. "Annet" (svart) refererer til celler som ikke var farget for den angitte markøren. (C) Bar plot (gjennomsnitt ± STDEV) som viser antall fargede celler for hver markør i to multispektrale bilder. Tallet indikerer celler fenoskrevet i hvert bilde, men indikerer ikke om markørene er coexpressed. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Fluorofor | Eksitasjon maksimum (nm) | Maksimum utslipp (nm) | Forventet gjenkjenning i filtersett (navn) |
| Alexa Fluor 488 | 488 | 519 | FITC (andre er i seg selv |
| Alexa Fluor 555 | 555 | 580 | Cy3 og Texas Red |
| Alexa Fluor 594 | 590 | 617 | Texas Rød |
| Alexa Fluor 647 | 650 | 668 | Texas Red og Cy5 |
| DAPI (ANDRE) | 350 | 470 | DAPI (ANDRE) |
| PerCP-Cy 5,5 | 482 | 690 | Cy3, Texas Red og Cy5 |
Tabell 1: Liste over fluoroforer med maksimal eksitasjon og utslippsbølgelengder og forventet deteksjon i passende filtersett.
| Frossen mus milt | |||
| Antistoff/dye | Klone | Konsentrasjon (μg/ml) | |
| Alexa Fluor 594 anti-mus CD8a | 53-6.7 | 10 | |
| Alexa Fluor 488 anti-mus CD3 | 17A2 (andre kan være på denne siden) | 20 | |
| Alexa Fluor 647 anti-mus CD4 | GK1.5 (Andre) | 10 | |
| PerCP-Cy 5,5 Rotte Anti-CD11b | M1/70 (Andre) | 2 | |
| Alexa Fluor 555 Mus anti-Ki-67 | B56 (andre er i seg selv) | 10 | |
| DAPI (ANDRE) | 0.1 | ||
| Frossen mus svulst | |||
| Antistoff/dye | Klone | Konsentrasjon (μg/ml) | |
| Alexa Fluor 594 anti-mus CD8a | 53-6.7 | 20 | |
| Alexa Fluor 488 anti-mus CD3 | 17A2 (andre kan være på denne siden) | 20 | |
| Alexa Fluor 647 anti-mus CD206 (MMR) | C068C2 (andre kan være på denne siden) | 5 | |
| PerCP-Cy5.5 Rotte Anti-CD11b | M1/70 (Andre) | 1 | |
| Alexa Fluor 555 Mus anti-Ki-67 | B56 (andre er i seg selv) | 0.25 | |
| DAPI (ANDRE) | 0.1 | ||
| Frosset menneskelig mandlene | |||
| Antistoff/dye | Klone | Konsentrasjon (μg/ml) | |
| Alexa Fluor 594 anti-menneskelig CD3 | 100 000 000 00 | 10 | |
| PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD4 | RPA-T4 (Andre) | 4 | |
| Alexa Fluor 647 anti-menneskelig CD8a | C8/144B (andre kan være på norsk) | 10 | |
| Alexa Fluor 488, eBioscience anti-human CD20 | L26 (andre er i seg selv) | 10 | |
| Alexa Fluor 555 Mus anti-Ki-67 | B56 (andre er i seg selv) | 1 | |
| DAPI (ANDRE) | 0.1 | ||
Tabell 2: Liste over antistoffer, kloner og konsentrasjoner som brukes.
Supplerende figur 1: Individuelle fargemønstre av den frosne HLF16-svulsten etter spektral unmixing. Scale bar = 20 μm Vennligst klikk her for å laste ned denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Frosne vev har i stor grad blitt brukt til mIF-avbildning for tradisjonelt å oppdage tre til fire markører31 på et vev ved hjelp av den direkte og indirekte metoden32. I den direkte metoden blir antistoffer konjugert til fluorescerende fargestoffer eller kvanteprikker33 for å merke vevet, mens i den indirekte metoden brukes et ukonjugert primært antistoff til å merke vevet etterfulgt av et fluorofhore-konjugert sekundært antistoff som spesifikt gjenkjenner det primære antistoffet. Noen av de siste samtidige multipleks farging tilnærminger diskutert tidligere kan også brukes til å flekke frosne vev og oppdage mer enn fire markører. Men kostnaden for reagensene og tiden det tar for farging blir intensiv avhengig av antall markører som oppdages. En annen multipleks teknikk for frosne vev er multi-epitop-ligand-kartografi (MELC)34. Teknikken innebærer farging av prøven med fluorofori-konjugerte antistoffer, avbildning og fotobleking av fluoroforforen. En stor påminnelse om denne teknikken er at bare ett felt eller region av vevet kan multiplexed. For å multipleks er andre felt eller regioner teknikken må utføres manuelt, noe som er tidkrevende, eller krever automatisering, noe som er kostbart. En gruppe35 var i stand til å oppdage seks farger på frosne vev ved hjelp av en kombinasjon av direkte, indirekte og TSA farging. Imidlertid tok vevflekker 2 dager. Til sammenligning bruker vår metodikk en samtidig multipleksfargingsmetode som involverer bruk av en cocktail av fem direkte konjugerte antistoffer pluss DAPI for å flekke frosne vev innen 90 minutter. Videre, ved hjelp av en halvautomatisert multispektral fluorescensbildesystem, var vi i stand til å skille og oppdage seks markører i frossen milt, mandler og tumorvev ved hjelp av denne forenklede multipleksfargingsteknikken. Cy3, Texas Red og Cy5-filtersettene som er tilgjengelige på mikroskopet, gir muligheter for å oppdage flere fluoroforer, og dermed potensielt øke antall markører som kan oppdages samtidig i frosne vev.
Multiplex farging ved hjelp av TSA tilnærming på FFPE vev krever en antigen gjenfinning trinn etterfulgt av sekvensielle merking, vasking, og stripping trinn. Utføre prosedyren varierer fra 1-2 dager avhengig av inkubasjonstidene som brukes for antistoffene6. Nylig, ved hjelp av en mikrofluidisk vevprosessor, ble det utført en fire-plex farging ved hjelp av TSA-tilnærmingen på FFPE vev under 90 min. Andre multipleksteknikker for FFPE vev kan utføres under 4–5 timer ved hjelp av en automatisert flekker. De riktige trinnene for restavhenting av antigen må imidlertid optimaliseres for å sikre at epitoptilgjengeligheten for antistoffene36– som igjen er avhengig av nøye vurdering av antistoffklonene, samt rekkefølgen på markører som oppdages. Noen antistoffkloner av CD3 kan for eksempel ikke brukes, fordi cd4- og CD8-antistoffer ikke oppdages37. På samme måte er det variasjon av antigendeteksjon blant de tilgjengelige antistoffklonene17,18. Derfor krever multipleksfarging av FFPE vev optimalisering av antistoffkloner, deres konsentrasjoner og rekkefølgen de er farget, som alle er tidkrevende. Derimot tillater mangelen på omfattende vevbehandling av frosne vev bruk av ulike antistoffkloner med høy spesifisitet. Videre kan antistoffkloner tilgjengelig for frosne vev også brukes i flow cytometri og ELISA, slik at samtidig validering på tvers av ulike analyser. Vevarkitektur er også en bekymring i frosne vev38. Multipleksfarging vist her på frosne vev er betydelig raskere enn TSA-tilnærmingen. Fluoroforkombinasjonene krever et nøye utvalg av markører for å sikre at antistoffer ikke sterically hindrer hverandre, spesielt når forskjellige antigener uttrykt på samme cellulære plassering oppdages. Vi valgte markører som flekker forskjellige celler på fluoroforer som er spektralt separate, noe som muliggjør bedre deteksjon. Antistoffkonsentrasjonene krever også optimalisering, men fordi fargingsprotokollen er rask, er den totale tiden det tar for optimalisering ikke tidkrevende. En påminnelse til vår metode kan være manglende evne til å oppdage lave uttrykksmarkører i vev. Noen av multipleks farging tilnærminger på FFPE vev innebære et signal forsterkning trinn som er nyttig for å oppdage lav uttrykksmarkører. Bruk av sekundære og tertiære antistoffer kan imidlertid brukes for å øke signalet. I slike tilfeller bør kryssreaktivitet til antistoffer i panelet unngås for å forhindre feil tolkning av resultatene.
I tillegg til musemilt og humant mandler vev, som er rike på immunceller, har vi brukt tumorvev som et eksempel for den foreslåtte multispektrale fluorescensavbildningen av frosne vev. Multispektral fluorescensavbildning i svulster har gitt verdifull informasjon, for eksempel å karakterisere tumormikromiljøet (TME)39, forutsi suksessen til adoptiv-T-celleoverføringer i malignt melanom40, og karakterisere proteiner i tumorsignaltransduksjonsveier41. Ved hjelp av markører som er spesifikke for immunceller som vanligvis finnes i svulster, kunne vi oppdage infiltrere NDE CD8 T-celler og TAMs i HLF16 tumorvev som brukes i denne studien. Vi brukte maskinlæringsprogramvaren til å segmentere og fenotypeceller. Multiplex farging for FFPE vev benytter et signalforsterkningtrinn for å forbedre signal-til-støy (SNR)-forhold som hjelper bildebehandling og kvantifisering42,43. Maskinlæringsprogramvaren har blitt brukt til analyser på FFPE vev farget med signalforsterkning2. Metodikken som finnes her bruker ikke signalforsterkning, men vi var i stand til å segmentere og fenotypeceller ved hjelp av programvaren. For videre analyse (f.eks. fenotypekouttrykk og romlige relasjoner) og nøyaktig tolkning av kvantiteten, krever programvareopplæring validering ved hjelp av et treningssett, testsett og valideringssett. I en iterativ prosess brukes ett sett med bilder (dvs. treningssettet) til å trene maskinlæringsprogramvaren til å identifisere fenotypene til modellens spådommer for et eget sett med bilder (dvs. testsettet) er nøyaktige. Etter at treningen er fullført, analyseres en endelig sett-til-gruppe bilder (dvs. valideringssettet) for å se om det har vært overmontering.
Til slutt er metodikken som presenteres her en rask måte å utføre multispektral fluorescensavbildning ved hjelp av frosset vev. Metoden er nyttig for å oppdage markører som enten antistoffer ikke er tilgjengelige eller ikke kan oppdages i FFPE-vev. I forbindelse med maskinlæringsprogramvaren kan tiden det tar å utføre kvantitative analyser betydelig legge til rette for raske prekliniske og kliniske diagnoser og kan brukes innen høyoppløseligromlige transkripsjoner som benytter frosne vev44.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å avsløre.
Acknowledgments
Imaging og analyse veiledning ble gitt av Research Resources Center – Research Histology og Tissue Imaging Core ved University of Illinois i Chicago etablert med støtte fra kontoret til visekansler for forskning. Arbeidet ble støttet av NIH/NCI RO1CA191317 til CLP, av NIH/NIAMS (SBDRC grant 1P30AR075049-01) til Dr. A. Paller, og ved støtte fra Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center til Immunotherapy Assessment Core ved Northwestern University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone (histological grade) | Fisher Scientific | A16F-1GAL | Fixing tissues |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse CD3 | BioLegend | 100212 | Clone - 17A2; primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 488, eBioscience anti-human CD20 | ThermoFisher Scientific | 53-0202-82 | Clone - L26; primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 555 Mouse anti-Ki-67 | BD Biosciences | 558617 | Primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 594 anti-human CD3 | BioLegend | 300446 | Clone - UCHT1; primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 594 anti-mouse CD8a | BioLegend | 100758 | Clone - 53-6.7; primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 647 anti-human CD8a | BioLegend | 372906 | Clone - C8/144B; primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 647 anti-mouse CD206 (MMR) | BioLegend | 141711 | Clone - C068C2; primary conjugated antibody |
| Alexa Fluor 647 anti-mouse CD4 Antibody | BioLegend | 100426 | Clone - GK1.5; primary conjugated antibody |
| C57BL/6 Mouse | Charles River Laboratories | 27 | Mouse frozen tissues used for multispectral training |
| Coplin Jar | Sigma Aldrich | S6016-6EA | Rehydrating and washing slides |
| DAPI Solution | BD Biosciences | 564907 | Nucleic Acid stain |
| Diamond White Glass Charged Slides | DOT Scientific | DW7590W | Adhering tissue sections |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1x (without Ca and Mg) | Fisher Scientific | MT21031CV | Washing and diluent |
| Gold Seal Cover Slips | ThermoFisher Scientific | 3306 | Protecting stained tissues |
| Human Normal Tonsil OCT frozen tissue block | AMSBio | AMS6023 | Human frozen tissue used for multispectral staining |
| Human Serum 1x | Gemini Bio-Products | 100-512 | Blocking and diluent for human tissues |
| inForm | Akoya Biosciences | Version 2.4.1 | Machine learning software |
| PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD4 | BioLegend | 300529 | Clone - RPA-T4; primary conjugated antibody |
| PerCP-Cy 5.5 Rat Anti-CD11b | BD Biosciences | 550993 | Clone - M1/70; primary conjugated antibody |
| Phenochart | Akoya Biosciences | Version 1.0.8 | Whole slide scan software |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36965 | Mounting medium |
| Research Cryostat | Leica Biosystems | CM3050 S | Sectioning tissues |
| Superblock 1x | ThermoFisher Scientific | 37515 | Blocking mouse tissues |
| Tissue-Tek O.C.T Solution | Sakura Finetek | 4583 | Embedding tissues |
| Vectra 3.0 Automated Quantitative Pathology Imaging System, 6 Slide | Akoya Biosciences | CLS142568 | Semi-automated multispectral imaging system |
| Vectra Software | Akoya Biosciences | Version 3.0.5 | Software to operate microscope |
References
- van der Loos, C. M. Chromogens in Multiple Immunohistochemical Staining Used for Visual Assessment and Spectral Imaging: The Colorful Future. Journal of Histotechnology. 33 (1), 31-40 (2010).
- Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: A review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
- Bian, L., et al. Multispectral imaging using a single bucket detector. Scientific Reports. 6, 24752 (2016).
- Zhou, L., El-Deiry, W. S. Multispectral fluorescence imaging. Journal of Nuclear Medicine. 50 (10), 1563-1566 (2009).
- Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).
- Wickenhauser, C., et al. Immune Checkpoint Blockade: Methods and Protocols. Pico de Coaña, Y. , Springer. New York. 13-31 (2019).
- Feng, Z., et al. Multispectral imaging of formalin-fixed tissue predicts ability to generate tumor-infiltrating lymphocytes from melanoma. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 3 (1), 47 (2015).
- Manesse, M., Patel, K. K., Bobrow, M., Downing, S. R. The InSituPlex((R)) Staining Method for Multiplexed Immunofluorescence Cell Phenotyping and Spatial Profiling of Tumor FFPE Samples. Methods in Molecular Biology. 2055, 585-592 (2020).
- Gamble, L. J., Anderton, C. R. Secondary Ion Mass Spectrometry Imaging of Tissues, Cells, and Microbial Systems. Microscopy Today. 24 (2), 24-31 (2016).
- Giesen, C., et al. Highly multiplexed imaging of tumor tissues with subcellular resolution by mass cytometry. Nature Methods. 11 (4), 417-422 (2014).
- Angelo, M., et al. Multiplexed ion beam imaging of human breast tumors. Nature Medicine. 20 (4), 436-442 (2014).
- Tsujikawa, T., et al. Quantitative Multiplex Immunohistochemistry Reveals Myeloid-Inflamed Tumor-Immune Complexity Associated with Poor Prognosis. Cell Reports. 19 (1), 203-217 (2017).
- Goltsev, Y., et al. Deep Profiling of Mouse Splenic Architecture with CODEX Multiplexed Imaging. Cell. 174 (4), 968-981 (2018).
- Gerdes, M. J., et al. Highly multiplexed single-cell analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 11982-11987 (2013).
- Shi, S. R., Key, M. E., Kalra, K. L. Antigen retrieval in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: an enhancement method for immunohistochemical staining based on microwave oven heating of tissue sections. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 39 (6), 741-748 (1991).
- Viegas, M. S., Martins, T. C., Seco, F., do Carmo, A. An improved and cost-effective methodology for the reduction of autofluorescence in direct immunofluorescence studies on formalin-fixed paraffin-embedded tissues. European Journal of Histochemistry. 51 (1), 59-66 (2007).
- Sorensen, I. V., et al. Characterization of anti-TIMP-1 monoclonal antibodies for immunohistochemical localization in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 54 (10), 1075-1086 (2006).
- Parra, E. R., Villalobos, P., Mino, B., Rodriguez-Canales, J. Comparison of Different Antibody Clones for Immunohistochemistry Detection of Programmed Cell Death Ligand 1 (PD-L1) on Non-Small Cell Lung Carcinoma. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 26 (2), 83-93 (2018).
- Boger, C., Kalthoff, H., Goodman, S. L., Rocken, C. Validation and comparison of anti-alphavbeta3 and anti-alphavbeta5 rabbit monoclonal versus murine monoclonal antibodies in four different tumor entities. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 21 (6), 553-560 (2013).
- Torigoe, T., et al. Establishment of a monoclonal anti-pan HLA class I antibody suitable for immunostaining of formalin-fixed tissue: unusually high frequency of down-regulation in breast cancer tissues. Pathology International. 62 (5), 303-308 (2012).
- Dapson, R. W. Macromolecular changes caused by formalin fixation and antigen retrieval. Biotechnic & Histochemistry. 82 (3), 133-140 (2007).
- Sompuram, S. R., Vani, K., Hafer, L. J., Bogen, S. A. Antibodies Immunoreactive With Formalin-Fixed Tissue Antigens Recognize Linear Protein Epitopes. American Journal of Clinical Pathology. 125 (1), 82-90 (2006).
- Cassetti, M. C., et al. Antitumor efficacy of Venezuelan equine encephalitis virus replicon particles encoding mutated HPV16 E6 and E7 genes. Vaccine. 22 (3-4), 520-527 (2004).
- Kiernan, J. A. Histological and Histochemical Methods: Theory and Practice, 3rd Edition. Shock. 12 (6), 479 (1999).
- Favreau, P., et al. Thin-film tunable filters for hyperspectral fluorescence microscopy. Journal of Biomedical Optics. 19 (1), 011017 (2014).
- van Kempen, M. J., Rijkers, G. T., Van Cauwenberge, P. B. The immune response in adenoids and tonsils. International Archives of Allergy and Immunology. 122 (1), 8-19 (2000).
- Klein, U., Dalla-Favera, R. Germinal centres: role in B-cell physiology and malignancy. Nature Reviews Immunology. 8 (1), 22-33 (2008).
- Eiben, G. L., et al. Establishment of an HLA-A*0201 Human Papillomavirus Type 16 Tumor Model to Determine the Efficacy of Vaccination Strategies in HLA-A*0201 Transgenic Mice. Cancer Research. 62, 5792-5799 (2002).
- Gonzalez, H., Hagerling, C., Werb, Z. Roles of the immune system in cancer: from tumor initiation to metastatic progression. Genes & Development. 32 (19-20), 1267-1284 (2018).
- Sica, A., Schioppa, T., Mantovani, A., Allavena, P. Tumour-associated macrophages are a distinct M2 polarised population promoting tumour progression: potential targets of anti-cancer therapy. European Jorunal of Cancer. 42 (6), 717-727 (2006).
- Au-Granier, C., et al. Multiplexed Immunofluorescence Analysis and Quantification of Intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T Cells. Journal of Visualized Experiments. (132), e56606 (2018).
- Odell, I. D., Cook, D. Immunofluorescence Techniques. Journal of Investigative Dermatology. 133 (1), 1-4 (2013).
- Xing, Y., et al. Bioconjugated quantum dots for multiplexed and quantitative immunohistochemistry. Nature Protocols. 2 (5), 1152-1165 (2007).
- Schubert, W., et al. Analyzing proteome topology and function by automated multidimensional fluorescence microscopy. Nature Biotechnology. 24 (10), 1270-1278 (2006).
- de Vries, N. L., et al. High-dimensional cytometric analysis of colorectal cancer reveals novel mediators of antitumour immunity. Gut. , 03 (2019).
- Scalia, C. R., et al. Antigen Masking During Fixation and Embedding, Dissected. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry : Official Journal of the Histochemistry Society. 65 (1), 5-20 (2017).
- Sorrelle, N., et al. Improved Multiplex Immunohistochemistry for Immune Microenvironment Evaluation of Mouse Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Tissues. Journal of Immunology. 202 (1), 292-299 (2019).
- Ackerman, L. V., Ramirez, G. A. The indications for and limitations of frozen section diagnosis; a review of 1269 consecutive frozen section diagnoses. British Journal of Surgery. 46 (198), 336-350 (1959).
- Mezheyeuski, A., et al. Multispectral imaging for quantitative and compartment-specific immune infiltrates reveals distinct immune profiles that classify lung cancer patients. The Journal of Pathology. 244 (4), 421-431 (2018).
- Feng, Z., et al. Multiparametric immune profiling in HPV- oral squamous cell cancer. JCI insight. 2 (14), 93652 (2017).
- Yang, L., Liu, Z., Tan, J., Dong, H., Zhang, X. Multispectral imaging reveals hyper active TGF-β signaling in colorectal cancer. Cancer Biology & Therapy. 19 (2), 105-112 (2018).
- Blom, S., et al. Systems pathology by multiplexed immunohistochemistry and whole-slide digital image analysis. Scientific Reports. 7 (1), 15580-15580 (2017).
- Roy, S., Axelrod, H. D., Valkenburg, K. C., Amend, S., Pienta, K. J. Optimization of prostate cancer cell detection using multiplex tyramide signal amplification. Journal of Cellular Biochemistry. 120 (4), 4804-4812 (2019).
- Vickovic, S., et al. High-density spatial transcriptomics arrays for in situ tissue profiling. bioRxiv. , 563338 (2019).
