새로운 서열 특이성을 가진 제한 endonucleases는 부분적으로 퇴화한 서열을 인식하는 효소로부터 개발될 수 있다. 여기에서 우리는 우리가 성공적으로 NlaIV 효소의 순서 특이성을 바꾸기 위하여 이용된 상세한 프로토콜을 제공합니다. 프로토콜의 주요 성분은 전사/번역 반응의 생체외 구획화 및 새로운 서열 특이성을 가진 변이체의 선택이다.
제한 엔도너첼리스(REase) 특이성 엔지니어링은 매우 어렵습니다. 여기에서 우리는 부모 효소 보다는 더 엄격한 특이성을 가진 REase 이체를 생성하는 것을 돕는 다단계 프로토콜을 기술합니다. 이 프로토콜은 DNA 결합에 영향을 미칠 가능성이 있는 위치의 가변성을 가진 이상적으로 REase의 변이체에 대한 발현 선택 카세트(ESC)의 라이브러리를 생성해야 합니다. ESC는 바람직한 제한 부위 활성 및 비오틴 태그에 대한 서열에 의해 한쪽에 측면되고, 다른 쪽에는 바람직하지 않은 활성 및 프라이머 어닐링 부위에 대한 제한 부위에 의해 서열이 있다. ESCs는 액적 당 하나 이상의 DNA 분자의 존재를 가능성 있게 하는 조건에서 물-인-오일 에멀젼으로 전사되고 번역됩니다. 따라서, 각 카세트 분자의 DNA는 번역된, 인코딩된 효소의 활성에만 적용된다. 원하는 특이성의 REase 변이체는 프라이머 어닐링 부위가 아닌 비오틴 태그를 제거한다. 에멀젼을 파괴 한 후 DNA 분자는 비오틴 풀다운을 받게되며 상류에 있는 분자만 유지됩니다. 이 단계에서는 원하는 활성을 잃지 않은 변형에 대한 ESC만 유지됩니다. 이 DNA 분자는 그 때 첫번째 PCR 반응을 복종됩니다. 바람직하지 않은 시퀀스에서의 절단은 프라이머 중 하나에 대한 프라이머 결합 부위를 차단한다. 따라서 PCR은 원치 않는 활성없이 액적에서 만 ESC를 증폭시다. 제2 PCR 반응은 선택 단계가 반복될 수 있도록 원하는 특이성 및 비오틴 태그에 대한 제한 부위를 재도입하기 위해 수행된다. 선택된 개방 판독 프레임은 또한 부모 REase의 코그네이트 메틸 트랜스퍼라제를 발현하는 세균 세포에서 과발현될 수 있으며, 이는 새로 진화된 REase가 메틸트랜스퍼라제 표적 부위의 서브세트만을 대상으로 하기 때문이다.
시퀀스 특이성 엔지니어링은 클래스 II REases에 매우 까다롭습니다. endonucleases의이 클래스에서, 서열 인식 및 촉매는 밀접하게 얽혀, 가장 아마 그것의 동체 메틸 트랜스퍼 라제보다 더 넓은 특이성의 엔도누글레스의 생성에 대한 진화적 보호로, 이는 호스트 DNA를 손상시킬 것이다. 세포에 있는 새로운 특이성의 지시된 진화는 새로 설계된 endonuclease 활동에 대하여 호스트 DNA를 보호하는 필요에 의해 더 복잡합니다. 따라서 REase 엔지니어링의 몇 가지 성공적인 시도가보고되고 그들 모두는 특정 효소1,2,,3,3,4,,5,,6,,7의독특한 특징을 이용한다.
여기에서 우리는 NlaIV endonuclease8의우리의 성공적인 공학에 근거를 둔 부모 효소 보다는 더 좁은 특이성을 가진 endonuclease 이체를 생성하는 것을 이용될 수 있는 특이성 공학을 위한 상세한 프로토콜을 제공합니다. 임의 인식 서열을 가진 임의의 효소의 경우, 측면에 있는 염기들을 위해 추가 특이성을 도입할 수 있다. 부분적으로 퇴화된 서열을 인식하는 부모 효소(예: GGNNCC 표적을 가진 NlaIV)의 경우, 추가특이성은 또한 인식 서열 내에서 도입될 수 있다. 추가 특이성은 가능성이 단백질 DNA 접촉을 요구할 것이기 때문에, 새로 인식된 기지는 DNA에 부모 endonuclease의 발자국 안에 놓여야 합니다. 원칙적으로, 선택 방식은 인식 시퀀스의 임의의 원하는 전문화에 대해 설정될 수 있다. 그러나, 팔린드로믹 및 거의 팔린드로믹 표적 서열을 인식하는 대부분의 REases는 팔린드롬의 반부위만을 인식하는 기능적 이량체이다. 그러므로, 단백질 핵 상호 작용의 대칭을 위반하는 새로운 특이성의 선택은 작동하기 위하여 확률이 낮습니다. 디메릭 NlaIV의 경우, 예를 들어, GGNNCC 서열은 이론적으로 GGATCC로 좁힐 수 있지만 GGAACC로의 특이성을 좁히는 것은 더 어려울 것으로 예상된다. 우리의 계획은 긍정적이고 부정적인 선택을 모두 포함한다.
이 공정은 음의 선택이 바람직한 좁은 특이성 이외의 모든 서열을 분리할 수 있는 특이성을 제거하는 데 사용될 때 더욱 효율적입니다. 예를 들어 GGATCC에 대한 선택은 GGBVCC에 대한 선택 방지와 결합될 수 있습니다(B는 A 이외의 베이스이고 V는 T 이외의 베이스입니다). 가능한 대상 서열 중 일부가 다루지 않는 경우 선택 실험의 결과는 양수 및 음수 선택의 효과에 따라 달라집니다. NlaIV 작업에서 GGATCC및 GGSSCC(S가 G 또는 C인 경우)를 대상으로 선택하고 대칭 파괴 대상을 무시하고 GGWWCC(W가 A 또는 T인 경우)로 설명할 수 있는 특이성을 얻었으며, 이 경우 부정적인 선택이 더 많다는 것을 시사합니다. 긍정적 인 선택보다 중요합니다.
우리의 접근 방식은 식 선택 카세트 (ESC)의 생성으로 시작됩니다. ESC는 섹션으로 구성됩니다. 내부 코어 섹션에는 T7 프로모터 제어 하에 REase의 개방 판독 프레임(ORF)의 변이체가 있습니다. ESC의 이 핵심 섹션에는 엔지니어링된 REase에 대한 코그네이트 사이트가 포함되어 있지 않습니다. 코어는 야생형 REase에 대한 두 개의 동조 부위 사이에 끼어있다: 바람직하지 않은S활성을 위한 절단 부위(이 예에서 선택된 시퀀스, GGSCC)와 원하는 활성을 위한 절단 부위(예에서 선택된 시퀀스, GGATCC). PCR에서 ESC의 제조의 최종 단계는 5′ 말단에서 원하는 활성에 가까운 비오틴을 추가하고 다양한 카운터 선택 서열을 생성한다(예에서 GGSSCC). 선택 전략은 시험관 내 전사/번역/선택프로토콜(그림 1A)을사용한 후 ESC 재증폭 프로토콜에서 신중하게 설계된 프라이머의 사용에 의존한다. ESC 라이브러리는 체외 구획화된 전사 번역 물-인-오일 에멀젼99,10,,11로표현된다. 각 액적 내에서, 발현된 효소의 특이성은 ESC의 상태에 영향을미친다(도 1B,단계 I). 기재된 배열을 위해, 번역된 단백질의 바람직한 절단 활성은 DNA의 비오틴 태그를 제거하지만, 카운터 선택서열로 다른 ESC 말단에 영향을 미치지 않는다. 에멀젼이 파손되면, 생체 티니글리드 단편은 스트렙타비딘 친화도 풀다운에 의해 제거되어 원하는 활성을 가진 액적으로부터의 단편만 남아 있게된다(그림 1B,단계 II). 이 단계는 비활성 REase 변형을 제거합니다. 풀다운 단계의 상급 분획은 PCR에 의해 증폭됩니다. 제1 PCR 반응 프라이머F2 및 R1이 사용된다(도1A, B,단계 III). 프라이머 F2는 카운터 선택서열과 분자 말단 사이의 ESC 섹션에 결합한다. 따라서, 카운터 선택 서열을 절단할 수 있는 변이체를 발현하는 ESCs(따라서, 프라이머 F2 및 R1에 대한 결합 부위를 두 개의 상이한 DNA 분자로 분리)는 증폭되지 않고 따라서 라이브러리로부터 제거된다. 프라이머 R1은 선택된 부위와 ESC의 코어 사이에 결합하여 선택된 부위의 절단 상태에 영향을 받지 않도록 하고 원하는 활성(GGATCC)에 대한 절단 부위를 복원한다. 사이클은 선택된 부위에 가까운 5′ 끝에 비오틴을 추가하고 ESC의 반대쪽 끝에 가까운 카운터 선택 부위에서 설계 변형을 복원하는 제2 PCR(프라이머 F1 및 R2)에 의해 폐쇄된다(그림1B,단계 IV). 생성된 DNA 혼합물은 또 다른 선택을 위해 준비됩니다.
선택 프로토콜의 성공은 새롭고 더 엄격한 표적 인식 시퀀스의 적절한 선택과 돌연변이 유발 전략및 효과적인 구현의 신중한 설계에 크게 좌우됩니다. REase를 극복하는 것보다 REase의 기존 환경 설정을 약간 개선하는 것이 훨씬 쉽기 때문에 기존의 환경 설정에 대한 역학 연구로 시작하는 것이 좋습니다. 신중한 돌연변이 생성 설계의 필요성은 제시된 프로토콜에 의해 처리될 수 있는 돌연변이 라이브러리의9 제한된 크기로부터 발생한다(단일 실험에서 109클론). 따라서 모든 20 개의 가능한 아미노산 치환은 몇 가지 위치에서효과적으로 테스트 할 수 있습니다 (토론 참조). 대안으로 제시된 오류가 발생하기 쉬운 PCR(EP-PCR)과 같은 무작위 돌연변이 발생은 기존 복잡성의 심오한 하소 샘플링으로 이어질 것입니다. DNA와의 접촉에 관여하는 잠재적 아미노산 위치(또는 코그네이트 서열에서 퇴화된 뉴클레오티드에 근접한 위치)에 관한 정보가 있는 경우, 올리고뉴클레오티드 유도 포화 돌연변이 발생에 대한 몇 가지 아미노산을 선택하는 데 확실히 사용되어야 합니다(프로토콜 단계 1.6-3.10).
여기서 설명된 선택 프로토콜은 NlaIV8,중앙 NN 염기를 가진 팔린드로믹 표적 부위를 인식하고 NN 염기 들 사이의 무딘 단부 절단을 촉매하는 디메릭 PD-(D/E)XK 접힌 인식 서열에 대해 시험되었다. NlaIV는 NN 기지 사이 분열이 이 기지가 복합체에 있는 단백질에 가깝다는 것을 건의하기 때문에 선택되었습니다. 원칙적으로, 프로토콜은 임의의 배그룹 중 임의의 임의의 계열 특이적 제한 엔도누클리스, 단일머티즘 또는 디메릭, 촉매 및 특이성 도메인이 일치하는지 여부(NlaIV 예에서와 같이) 또는 별도의(예를 들어, FokI)에 관계없이 임의의 스태거의 이중 가닥 브레이크를 촉매하는 임의의 서열에 사용될 수 있다. 더욱이, 원칙적으로 프로토콜은 새롭고 더 좁은 효소 특이성의 생성뿐만 아니라, 스타 활동을 제거하거나 높은 충실도 endonucleases를 만드는 데 사용될 수 있습니다. 그러나 이 모든 것은 아직 테스트되지 않았습니다. 특히, 스타 활성의 표적 제거는 동일한 아미노산 잔기가 원하는 및 바람직하지 않은 염기와 결합하는 데 관여할 수 있기 때문에 복잡할 수 있다. 이 프로토콜에 기술된 시험관내 단계는 좁아진 특이성의 선택에 한정되지 않고 달리 변경된 특이성을 선택하는 데 사용될 수 있다. 그러나, 변이체 endonucleases에 문제가 있습니다: 기판의 스펙트럼이 부모 endonuclease에 의해 절제되지 않은 새로운 표적을 포함하는 경우에, 일반적으로 이 활동의 유해한 효력에서 세포를 보호하는 좋은 방법은 없습니다. 대조적으로, endonuclease 특이성이 단지 좁혀지면, 표적은 야생형 표적의 서브세트이고, 따라서 이미 이용 가능한 코그네이트 메틸트랜스퍼라제는 완전히 보호되어야 한다.
우리의 프로토콜은 여러 가지 지향 진화 프로토콜에서 여러 가지 면에서 다릅니다. 개방형 판독 프레임 다양성은 모든 반복이 아니라 실험 시작 시 한 번 생성됩니다. 또한, 그것은 분할 및 혼합 합성에 의해 생성, 보다는 EP-PCR에 의해. 이 작업에서 사용되는 바와 같이, 코돈의 NNS 치환의 경우, 6개의6 위치에 대해 (4 x 4 x 2) 6~1.07 x 109조합이 있다. 따라서, 임의의 주어진 변이체는 ESC의 1.7 fmoles에서 평균적으로 한 번 존재한다. 이 용량은 Glen Research에서 제공하는 20개의 삼중뉴클레오티드 전구체의 혼합물과 합성을 사용하거나 분할 및 혼합 올리고뉴클레오티드 합성을 가진 덜 유망한 위치에서 돌연변이 빈도를 감소시킴으로써 7개의 위치로 증가될 수 있습니다. 가능하면 변형 범위를 6위치로 제한하는 것이 좋습니다. 명백하게, 이러한 돌연변이 유발 표적화는 기질 결합에 관여하는 REase의 적어도 영역에 대한 일부 기존 지식을 필요로 한다. 다양성을 생성하는 분할 및 혼합 프로토콜은 EP-PCR에 비해 분명한 장점이 있습니다. EP-PCR을 사용하여, 우리는 동일한 EP-PCR에서 NlaIV ESC에 대한 8개의 치환을 운반하는 변경되지 않은 변이체 및 시퀀스를얻었다(표 4). EP-PCR의 라이브러리는 피해야 할 클론의 실질적인 분획을 포함합니다(야생 형 서열, 다중 치환, 프레임 시프트 및 넌센스 돌연변이, 및 서열 특이성에 영향을 미치지 않는 장소에서의 돌연변이).
또한 당사의 프로토콜은 두 가지 순차적 선택 단계가 있음에 따라 다른 많은 지향 진화 프로토콜과도 다릅니다. 양수 선택은 원하는 활성이 유지되고, 그렇지 않으면 비오틴 태그가 제거되지 않고, 코딩 시퀀스를 풀다운하여 제거할 수 있는지 확인합니다. 기술적으로 는 소설, 비 중첩 특이성 (예를 들어, GCATGC)의 운이 출현은 적절한 분열 부위가 원하는 분열 근처에 존재하는 경우, 뿐만 아니라 비오틴 태그의 절단으로 이어질 수 있지만, 다른 곳에서는. 그러나, 이것은 매우 가능성이 있을 것 이라고. 음수 선택은 여전히 바람직하지 않은 활성이 있는 효소에 대해 코딩하는 열린 판독 프레임을 제거합니다. 프로토콜은 선택 시퀀스를 절단할 수 있지만 ESC의 다른 곳에서는 절단할 수 없는 변형으로 출력 라이브러리를 보강하므로 PCR 증폭에 적합하지 않기 때문에 이 단계는 엄격하게 필수가 아닙니다. 그러나, 원래 서열 특이성을 가진 효소가 출력에서 제거되지 않고 변경된 특이성을 가진 유망한 변이체를 능가할 것이기 때문에 선택 효과는 더 낮을 것으로 예상되며 또한 효소 활성이 감소할 것이다. 채우기 수준에서 원하는 대상 시퀀스와 원하지 않는 대상 시퀀스는 모두 퇴화될 수 있지만 그렇지 않을 수도 있습니다. NlaIV 예에서, 안티-타겟은 퇴화되고 표적은 퇴화되었다. 인구 수준에서 퇴화가 있더라도, 단일 액적에서 단 하나의 (비퇴화) 표적 또는 반표적이 존재한다. 프로토콜에서 대상 및 안티 대상 시퀀스는 선택 단계의 모든 반복에서 다시 도입됩니다. 따라서 개방 된 판독 프레임은 가능한 모든 대상을 갈라 놓을 수있는 효소를 인코딩해야하며, 여러 선택 라운드에서 살아남기 위해 항 표적 중 어느 것을 갈라 놓을 수 없습니다. 프로토콜의 각 반복에서 선택 취소 대상을 다시 도입해야 할 필요성은 두 개의 순차적 PcR을 적용합니다. 제1 PCR은 안티-타겟 외부의 어닐리마를 사용하는 프라이머를 사용하므로, 반대로 표적의 분열이 PCR 반응을 방지한다. 두 번째 PCR은 안티 타겟을 넘어 도달 프라이머를 필요로하고, 안티 대상을 다시 도입, 선택의 여러 라운드 동안 있는지 확인하기 위해, 각 열린 독서 프레임은 안티 대상의 모든 변종에 대해 테스트됩니다.
끈적끈적한 말단을 생성하는 효소의 경우, REase ORF10의 분리를 위한 앞에서 설명한 방법에 기초한 관련 대체 프로토콜이 사용될 수 있다. 실험에서 사용되는 비오틴 포획에 의한 비활성 변이체의 고갈은 선택적 PCR에서 프라이머 결합 부위로 사용되는 서열과 호환어댑터의 결찰에 의해 대체되는 프로토콜로 대체된다(도9). 선택된 특이성을 가진 효소를 생성하는 ESC만이 결찰 가능 말단을 생성하고 따라서 선택될 것이다. 카운터 e선택 시퀀스의 끈적끈적한 말단의 시퀀스는 어댑터와 결찰에 참여할 수 없는 방식으로 설계되어야 한다. 선택 프로세스의 반복은 선택적 PCR에서 두 개의 서로 다른 어댑터와 결과적으로 두 개의 서로 다른 역프라이머 사이를 전환하여 쉽게 달성할 수 있습니다.
새로운 프로토콜이 있더라도 시험관 내 새로운 특이성을 엔지니어링하는 작업은 여전히 매우 까다롭습니다. 전형적인 타입 II REases를 위해, 서열 특이성 및 내분핵용해 활성은 동일한 단백질 지구에 의존한다. 따라서 다른 하나에 영향을 주지 않고 하나를 변경하기가 어렵습니다. 성공은 효소의 발자국을 고려하고, 단백질-DNA 상호 작용의 대칭을 존중하며, NlaIV 예8에서와 같이 생화학 실험에서 선행으로 결정되어야 하는 기존의 효소 선호도를 기반으로 하는 전략에 의해 더 가능성이 높아집니다.
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 폴란드 국립 과학 센터 (NCN)(UMO-2011/02/A/NZ1/00052)에서 과학 고등 교육부(0295/B/PO1/2008/34~ MB 및 N301 100 31/3043~KS)의 보조금으로 지원되었습니다. UMO-2014/13/B/NZ1/03991 및 UMO-2014/14/M/NZ5/00558- MB) 및 KS에 대한 단기 EMBO 펠로우십(ATSF 277.00-05).
1000Å CPG Support (dA, dT, dC, dG) | Biosset | 45-1000-050 | Other vendors can be used as well |
ASM-800 DNA/RNA | Biosset | 800-001-000 | |
GeneJET Gel Extraction Kit | Thermo Scientific | K0691 | Any other kit can be used |
Glen-Pak DNA purification cartridge | Glen Research | 60-5200 | |
HIS-Select Nickel Affinity Gel | Sigma | P6611 | |
pET 28a vector | Any other vector with T7 promoter upstream of plycloning site can be used instead | ||
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | Thermo Scientific | F530S | Any other high fidelity and highly processive thermophilic polymearse can be used instead |
Porous steel foil | Biosset | 40-063 | |
Rapid Translation System RTS 100, E.coli HY Kit |
Roche | 3 186 148 | |
Restriction endonucleases | Thermo Scientific | Obviously other vendors, enzymes can be used | |
Streptavidin Magnetic Beads | New England Biolabs | S1420S | Other vendors can be used as well. We have positively tested beds form Sigma |
Synthesis chemicals including phosphoramidities | Carl Roth | Other vendors can be used as well | |
Synthesis columns (different sizes) | Biosset | ||
T4 DNA ligase | Thermo Scientific | EL0011 | Any other ligase can be used |