In Vitro rettet utviklingen av en restriksjon endonuclease med strengere spesifisitet

Summary

Begrensning endonucleases med ny sekvens spesifisitet kan utvikles fra enzymer gjenkjenne en delvis degenerert sekvens. Her gir vi en detaljert protokoll som vi med hell brukte til å endre sekvensspesifisiteten til NlaIV-enzymet. Viktige ingredienser i protokollen er in vitro compartmentalization av transkripsjon / oversettelse reaksjon og valg av varianter med nye sekvens spesifisiteter.

Abstract

Begrensning endonuclease (REase) spesifisitet engineering er ekstremt vanskelig. Her beskriver vi en flertrinnsprotokoll som bidrar til å produsere REase-varianter som har strengere spesifisitet enn foreldreenzymet. Protokollen krever opprettelse av et bibliotek med uttrykksvalgkassetter (EsCer) for varianter av REase, ideelt sett med variabilitet i posisjoner som sannsynligvis vil påvirke DNA-binding. ESC er flankert på den ene siden av en sekvens for begrensning ser nettstedet aktivitet ønsket og en biotin tag og på den andre siden av en begrensning nettsted for uønsket aktivitet og en primer gløding området. EsCene transkribert og oversatt i en vann-i-olje emulsjon, under forhold som gjør tilstedeværelsen av mer enn ett DNA molekyl per dråpe usannsynlig. Derfor blir DNA i hvert kassettmolekyl bare utsatt for aktiviteten til det oversatte, kodede enzymet. REase varianter av ønsket spesifisitet fjerne biotin tag, men ikke primer annealing området. Etter å ha brutt emulsjonen, blir DNA-molekylene utsatt for en biotinpulldown, og bare de i supernatanten beholdes. Dette trinnet sikrer at bare ESCer for varianter som ikke har mistet ønsket aktivitet, beholdes. Disse DNA-molekylene blir deretter utsatt for en første PCR-reaksjon. Cleavage i uønsket rekkefølge kutter av primer bindende området for en av primere. PCR forsterker derfor bare ESCer fra dråper uten uønsket aktivitet. En annen PCR-reaksjon utføres deretter for å gjeninnføre begrensningsstedet for ønsket spesifisitet og biotinkoden, slik at valgtrinnet kan gjentas. Utvalgte åpne leserammer kan overuttrykkes i bakterielle celler som også uttrykker den cognate metyltransferase av foreldrene SEase, fordi den nyutviklede REase bare retter seg mot et undersett av metyltransferasemålsstedene.

Introduction

Sekvensspesifisitetsteknikk er ekstremt utfordrende for klasse II REases. I denne klassen av endonukleases, sekvens anerkjennelse og katalyser er tett sammenvevd, mest sannsynlig som en evolusjonær beskyttelse mot etableringen av en endonuclease av bredere spesifisitet enn sin cognate metyltransferase, som ville skade verten DNA. Rettet utvikling av nye spesifisiteter i celler er ytterligere komplisert av behovet for å beskytte verten DNA mot den nylig konstruerte endonuclease aktivitet. Derfor er det bare noen få vellykkede forsøk på REase engineering rapportert og alle av dem utnytte de unike funksjonene til et bestemt enzym^{1,2,3,4,5,6,7}.

Her gir vi en detaljert protokoll for spesifisitetsteknikk som kan brukes til å generere endonuclease-varianter som har smalere spesifisitet enn et foreldreenzym som er basert på vår vellykkede prosjektering av en NlaIV endonuclease⁸. For et slikt enzym med en vilkårlig gjenkjenningssekvens kan ekstra spesifisitet innføres for baser i flankene. For foreldreenzymer som gjenkjenner delvis degenererte sekvenser (for eksempel NlaIV med GGNNCC-målet), kan ytterligere spesifisitet også innføres i gjenkjenningssekvensen. Som ekstra spesifisitet vil trolig kreve protein-DNA-kontakter, bør de nylig anerkjente basene ligge innenfor fotavtrykket til foreldrenes endonuclease på DNA. I prinsippet kan valgordninger defineres for ønsket spesialisering av gjenkjenningssekvensen. Imidlertid er de fleste reases som gjenkjenner palindromic og nesten palindromic målsekvenser funksjonelle dimers som gjenkjenner bare et halvt sted av palindrome. Derfor er det lite sannsynlig at valg av nye spesifiteter som bryter symmetrien av proteinnukleærinteraksjoner, vil fungere. For den dimeric NlaIV, for eksempel, kan GGNNCC-sekvensen teoretisk begrenses til GGATCC, men innsnevring av spesifisiteten ned til GGAACC forventes å være vanskeligere. Vår ordning innebærer både positivt og negativt utvalg.

Prosessen er mer effektiv når negativt utvalg også brukes til å fjerne spesifisitetene som kan holde alle andre sekvenser enn den foretrukne smalere spesifisiteten. Valg for GGATCC kan for eksempel kombineres med antivalg mot GGBVCC (der B er en annen base enn A, og V er en annen base enn T). Når noen av de mulige målsekvensene ikke dekkes, avhenger utfallet av utvalgseksperimentet av effektiviteten av positivt og negativt utvalg. I vårt NlaIV-arbeid valgte vi for GGATCC, og mot GGSSCC (hvor S er G eller C), og fikk en spesifisitet som, ignorerer symmetribrytende mål, kan beskrives som GGWWCC (hvor W er A eller T), noe som tyder på at i dette spesielle tilfellet var negativt utvalg mer viktig enn positivt utvalg.

Vår tilnærming starter med opprettelsen av en uttrykksvalgkassett (ESC). ESC er strukturert i seksjoner. På innsiden kjernen delen, det er varianter av den åpne leserammen (ORF) av REase, under T7 arrangør kontroll. Denne kjernedelen av ESC kan ikke inneholde noe cognate-område for den konstruerte REase. Kjernen er klemt mellom to cognate nettsteder for vill type REase: en cleavage nettsted for uønsket aktivitet (counter valgt sekvens, GGSSCC i dette eksemplet) og en cleavage nettsted for ønsket aktivitet (valgt sekvens, GGATCC i eksemplet). Det siste trinnet i utarbeidelsen av ESC i PCR legger biotin nær ønsket aktivitet på 5'slutten og skaper en rekke teller utvalgte sekvenser (GGSSCC i eksemplet). Valgstrategien er avhengig av bruk av nøye utformede primere ved ESC-reampliiseringsprotokollen etter en in vitro transkripsjon/oversettelses-/utvelgelsesprotokoll (figur 1A). ESC-biblioteket uttrykkes i en in vitro compartmentalized transkripsjon oversettelse vann-i-olje emulsjon^9,,10,11. Innenfor hver dråpe påvirker spesifisiteten til det uttrykte enzymet tilstanden til ESC(Figur 1B, trinn I). For den beskrevne ordningen fjerner ønsket spaltingsaktivitet av det oversatte proteinet DNA-ets biotinmerke, men påvirker ikke den andre ESC-enden med tellerenvalgt sekvens. Når emulsjonen er ødelagt, fjernes biotinylated fragmenter ved streptavidin affinitetspulldown, slik at bare fragmenter fra dråper med ønsket aktivitet forblir (Figur 1B, trinn II). Dette trinnet fjerner inaktive REase-varianter. Den supernatante fraksjonen av nedtrekkstrinnet forsterkes deretter av PCR. I den første PCR reaksjon primers F2 og R1 brukes (Figur 1A, B, trinn III). Primer F2 bindes til ESC-delen mellom den valgte telleren og molekyletden. Derfor er ESCs som uttrykker varianter som er i stand til å cleaving telleren valgt sekvens (og derfor skille bindingsstedene for primere F2 og R1 i to forskjellige DNA molekyler) ikke forsterkes og blir dermed fjernet fra biblioteket. Primer R1 binder seg mellom det valgte området og kjernen i ESC slik at det ikke påvirkes av spaltningsstatusen til det valgte området og gjenoppretter spaltningsstedet for ønsket aktivitet (GGATCC). Syklusen er lukket av en annen PCR (med primere F1 og R2) som legger biotin på 5'slutten nær det valgte området og gjenoppretter designet variasjon på telleren valgt sted nær motsatt ende av ESC(Figur 1B, trinn IV). Den resulterende DNA-blandingen er klar for en ny runde med valg.

Suksessen til utvelgelsesprotokollen avhenger sterkt av riktig valg av den nye, strengere målgjenkjenningssekvensen og forsiktig utforming av mutagenesisstrategien og den effektive implementeringen. Fordi det er mye lettere å forbedre på små eksisterende preferanser av REase enn å overvinne dem, anbefaler vi å starte med en kinetisk studie av eventuelle eksisterende preferanser. Nødvendigheten av forsiktig mutagenesis design skyldes den begrensede størrelsen på et mutert bibliotek som kan behandles av den presenterte protokollen (10⁹ kloner i et enkelt eksperiment). Derfor kan alle 20 mulige aminosyresubstitusjoner effektivt testes i bare noen få stillinger (se Diskusjon). Tilfeldig mutagenesis, for eksempel feilutsatt PCR (EP-PCR) presentert som en alternativ metode, vil føre til dyp undersampling av eksisterende kompleksitet. Hvis informasjon om potensielle aminosyrestillinger involvert i kontakter med DNA (eller til og med ligger i nærheten av degenererte nukleotider i en cognate sekvens) er tilgjengelig, bør det absolutt brukes til å velge noen aminosyrer for oligonucleotide guidet metningmutagenesis (protokolltrinn 1.6-3.10).

Protocol

1. Utarbeidelse av ESCer

1. Klonemetyltransferase av restrifiseringssystemet som skal konstrueres i et lavt kopinummer plasmid (f.eks. pACYC184 eller pACYC174 eller deres derivater).
   MERK: Bakterievertsstammen må kunne tolerere metylering introdusert av det klonet enzym og gi uforsonlig uttrykk for T7 RNA-polymerase. Bruk av ER2566-stammen (med McrA, McrBC og Mrr mutasjoner) anbefales.
2. Bekreft at det rekombinante plasmid-DNA-et er beskyttet mot spalting av cognate endonuklease ved å behandle 0,5 μg plasmid DNA med 10 enheter cognate rease i buffer og temperatur anbefalt av enzymleverandøren i 2 timer.
3. Forbered kompetente celler av denne belastningen.
   MERK: Enhver metode kan brukes. NlaIV ingeniørprosjektet brukte en enkel kalsiumkloridmetode¹².
4. Konstruer rekombinant plasmid med ORF for REase under kontroll av T7-arrangøren fra en annen ekskluderingsgruppe og med en annen utvalgsmarkør enn det som inneholder metyltrasferasegenet i trinn 1.1. Vektorer pET28 og pET30 kan brukes.
5. Fjern alle gjenkjenningssteder for det konstruerte enzymet fra den delen av rekombinantplasmiden mellom T7-arrangøren og stoppkodonen til enzymet ORF ved å innføre stille mutasjoner (figur 2, tabell 1A).
   MERK: Hvis mer enn ett slikt nettsted må fjernes, vil det være nødvendig med flere mutasjonsrunder (trinn 1.5.1–1.5.7).
   1. Bruk en pcr-reaksjon som forsterker den fulle plasmiden med konstruerte variasjoner introdusert i 5's endene av primere (tabell 2A).
   2. Fjern malen DNA ved å legge til 10 U dpni endonuclease til 50 μL av PCR-reaksjonen, og inkuber for 2 timer ved 37 °C.
   3. Løs produktene ved agarose gelelektroforese. Klipp ut båndet som tilsvarer den fulle plasmid og rense det med et kommersielt sett.
   4. Legg til 10x ligation buffer (til en 1x konsentrasjon) og supplement med ATP (til 1 mM). Tilsett 10 E av T4 polynucleotid kinase og inkubator i 20 min ved 37 °C. Inaktiver enzymet ved oppvarming ved 70 °C i 10 min.
   5. Legg til PEG 4000 til 5%, supplere igjen med ATP (til 1 mM), og legg til 5 U av T4 DNA ligase. Inkuber for 2 timer ved romtemperatur (RT).
   6. Forvandles til en kompetent bakteriell stamme som bærer cognate metyltransferase (trinn 1.1).
   7. Isoler plasmid DNA i liten skala og bekrefte innføringen av sekvensendringer ved dideoxy sekvensering.
6. Innføre unike restriksjonssteder nær sekvensen(e) som er målrettet av oligonucleotid guidet mutagenesis (Figur 2, Tabell 1B). Følg trinn 1.5.1–1.5.7 for hvert nettsted.
   MERK: Dette trinnet utføres bare når en målrettet mutagenesis brukes. Hvis du gjør tilfeldig mutagenesis, hopp over trinn 2-3 og fortsett til seksjon 3 i stedet. I det presenterte eksemplet ble alle nettsteder introdusert oppstrøms av de målrettede områdene, men de kan også innføres nedstrøms.
7. Design primere for forsterkning av ESC (tabell 1C).
   1. Design en omvendt primerbinding nedstrøms av endonuclease ORF som vil introdusere det valgte gjenkjenningsstedet (R1) og den sytter (R2) som binder seg utenfor den valgte NlaIV-sekvensen og inneholder biotin på 5's end (se figur 1).
   2. Design en fremover primer (F1) binding til ESC oppstrøms av T7 arrangør. Denne primeren bør også introdusere motvalgte varianter av den opprinnelige gjenkjenningssekvensen (dvs. maksimalt sekvensvariasjoner som gjenkjennes av det opprinnelige enzymet med unntak av den valgte omvendte sekvensen).
      MERK: En kortere versjon av denne primeren (F2) som dekker sekvensen distal til den motvalgte sekvensen vil bli brukt senere i selektiv PCR (trinn 5.9).

2. Split-og-bland syntese av mutagne primerer

MERK: Dette trinnet brukes bare for prosjekter som krever subsaturation mutagenesis på mer enn ett sted. En synthesizer med flere syntesekolonner er nødvendig. Tilordne kolonner for syntese av randomiserte NNS codon trillinger og vill type codon trillinger i henhold til mutagenesis frekvenser. For eksempel, hvis syv like volumsyntese kolonner er tilgjengelige, og en mutagenesis rate på 0,3 er ønskelig på et gitt sted, legg randomized NNS codons i ~ 0,3 x 7 eller to kolonner, og vill type codons i ~ 0,7 x 7 eller fem kolonner (Figur 3).

1. Bestem deg for steder for subsaturasjon mutagenesis. Velg mutagenesisfrekvenser i henhold til den hypotetiske betydningen av nettstedene (dvs. jo viktigere nettstedet, jo høyere frekvens), holde grenser for den generelle bibliotekkompleksiteten i tankene (se Diskusjon).
2. Syntetiser eukleotider i alle kolonner, opp til trillingen umiddelbart før det andre subsaturasjonsmutagenesisstedet teller fra 3'-slutten. Ikke fjern 5'-tritylbeskyttende gruppen ved siste syntesesyklus (bruk trityl-on-alternativet på synthesizeren). Beskyttende gruppe vil bli fjernet i begynnelsen av neste syntese syklus (trinn 1 i figur 3).
3. Åpne syntesekolonnene. Samle kontrollert poreglass (CPG) syntese støtte i et tørt 1,5 ml rør og bland ved virvlende. Partisjonere den blandede CPG-harpiksen i nye syntesekolonner. Unngå å innføre fuktighet, fordi det vil redusere den totale avkastningen (trinn 2 og 4 i figur 3).
4. Fortsett syntese, fra subsaturation mutagenesis området triplet. Tilordne kolonner til randomiserte NNS trillinger eller wild type trillinger i henhold til ønsket mutagenesis frekvens (se merknad ovenfor). Hvis flere subsaturasjonssteder er til stede, fortsett bare til trillingen foran neste subsaturation mutagenesis-område. Igjen, la en 5'-trityl gruppe på på slutten (5'-trityl-on alternativ på synthesizer) (trinn 3 i figur 3). Fortsett deretter med trinn 2.3.
5. Hvis det ikke finnes flere subsaturasjonssteder nedstrøms, fullfører du syntesen, og etterlater en 5'-tritylgruppe på slutten (5'-trityl-on-alternativ på synthesizer) (trinn 5 i figur 3).
6. Avdekk og rense oligonucleotide biblioteket i henhold til rensekassettprodusentens instruksjoner.
   MERK: Oligonucleotides utgitt av deprotection fra CPG kan også renses i omvendt fase høy ytelse flytende kromatografi (HPLC) med trityl-on etterfulgt av en manuell trityl gruppe fjerning (1 t behandling med 80% eddiksyre ved RT) og en annen HPLC rensing.
7. Kontroller kvaliteten på oligonucleotide-biblioteket i en urea-PAGE gel.

3. Generere variantbiblioteker

MERK: Bruk rekombinantplasmid fra trinn 1.6.

1. Generer bibliotekene ved oligonucleotide rettet mutagenesis.
   MERK: Du kan også bruke EP-PCR-protokollen (trinn 3.2).
   1. Forsterke en seksjon fra T7-arrangøren til det unike begrensningsenzymet som flankerer sekvensen som er rettet mot mutagenese (i tilfelle NlaIV: SalI, EcoRI eller Eco52I) (Tabell 1B-C, tabell 2B, Figur 4). Forsterke den andre delen fra det unike begrensningenzymstedet til 3's slutten av ESC.
   2. Bland separat 5 μL av PCR-reaksjonene (fra trinn 3.1.1) med 8 μL vann, 1,5 μL 10x begrensningenzymbuffer og 5 enheter av de aktuelle begrensningsenzymene (SalI, EcoRI eller Eco52I) og inkuber ved riktig temperatur i 2 timer.
   3. Løs produktene av begge reaksjonene ved hjelp av agarose gelelektroforese. Klipp ut de forventede størrelsesbåndene og rens med et kommersielt sett.
   4. Kjør opptil 1/3 av de rensede produktene i en agarosegel og mål konsentrasjonen av hvert renset bånd ved densitometri.
   5. Sett opp ligation av to deler av ESCer i en 1:1 molar ratio med 1x ligase buffer og 1 U av T4 DNA ligase og inkubere for 2 h på RT.
   6. Løs reaksjonsproduktene i agarosegelen. Klipp ut produkter av forventet størrelse og rens med et kommersielt sett.
   7. Forsterke rensede ligasjonsprodukter i en PCR-reaksjon med primere F1 og R2 (tabell 1C og tabell 2A). Ikke kjør mer enn 20 forsterkningssykluser.
   8. Fraksjoner eI PCR-reaksjonene i en agarosegel. Klipp ut produktene og rens med et kommersielt sett.
   9. Kjør en 5 μL aliquot av renset biblioteket fra forrige trinn i agarose gel og måle konsentrasjonen ved densitometri.
   10. Klone en liten prøve av biblioteket (opptil 5 μL) og sekvens > 15 kloner for å kontrollere mutasjonsfrekvensen og distribusjonen (tabell 3). Fortsett til trinn 4.
       MERK: Alternativt kan høy gjennomstrømningssekvensering av den lille prøven av EsCene brukes.
2. Utfør EP-PCR.
   1. Forsterke ESC fra plasmid oppnådd i trinn 1.5.7 med primere F1 og R1. Kjør 20 sykluser med Taq I polymerase (Tabell 1B).
   2. Gel renser PCR-produktet.
   3. Sett opp EP-PCR med 2 ng av renset PCR-produkt fra forrige trinn og kjør 15 sykluser med EP-PCR(tabell 1C)med F1 og R1-primere.
   4. Gel renser produktet og kvantifiser det ved geldensitometri.
      MERK: På grunn av den lave konsentrasjonen av det rensede EP-PCR-produktet, bruk ca. 1/3 for kvantifisering.
   5. Klone et lite utvalg av biblioteket (opptil 1/5) og sekvens > 15 kloner for å kontrollere mutasjonsfrekvens og -distribusjon (tabell 4).
      MERK: Alternativt kan du utføre sekvensering av den lille prøven av EsCene.

4. Utføre compartmentalized in vitro transkripsjon-oversettelse reaksjon

1. Test endonuclease uttrykk og enzymatisk aktivitet i in vitro transkripsjon-oversettelse.
   1. Forbered et kort (200–500 bp) substrat med ett enkelt gjenkjenningssted for endonuklease som ligger nær midten av molekylet, slik at spaltningsreaksjonen lett kan oppdages.
      MERK: Den enkleste måten å forberede underlaget er ved PCR forsterkning av et passende fragment av et hvilket som helst DNA-molekyl. Underlaget kan radiomerkes eller fluorescerende merkes for å forenkle spaltingsdeteksjon.
   2. Sett opp 50 μL av en transkripsjon-oversettelse reaksjon med 0,5 μg av vill type ESC i henhold til produsentens anbefalinger. Tilsett magnesiumsalt (MgCl₂, MgSO₄og magnesiumacetat kan testes) til 1,5 mM og riktig mengde substrat fra forrige trinn (minst 0,5 μg ved umerket DNA).
      MERK: Enhver transkripsjon / oversettelse kit som ikke inneholder nuclease aktivert av magnesium kan brukes. Noen kit leverandører bruker nucleases for å fjerne DNA-forurensning under produksjonen og deretter legge chelators som nukleoskehemmere. Slike sett er ikke kompatible med denne metoden.
   3. Inkuber transkripsjonsoversettelsesreaksjonen i henhold til produsentens instruksjoner. Overfør deretter reaksjonsblandingen til optimal temperatur for begrensningsenzymet i 2 timer.
   4. Analyser spaltning av substratet i en agarosegel etterfulgt av riktig deteksjon (f.eks. DNA-farging, fluorescensvisualisering eller autoradiografi) (figur 5).
      MERK: Minst delvis spalting av underlaget er nødvendig før du fortsetter med compartmentalization. Hvis dette ikke oppnås, er ytterligere optimalisering av magnesiumkjemisk form eller konsentrasjon nødvendig.
2. Forbered en oljeoverflateaktivt blanding ved å tilsett 225 μL span 80 og 25 μL Tween 80 til 5 ml mineralolje i et 15 ml konisk rør. Bland grundig ved å snu røret 15x.
3. For hvert bibliotek overføre 950 μL av olje-overflateaktivt middel blanding til en 2 ml rund bunn kryogen ampulle, etikett med et bibliotek navn, og overføre til is. Sett en liten sylindrisk rørestang (5 x 2 mm²) i hvert hetteglass.
4. Forbered en in vitro transkripsjon-oversettelse reaksjonblanding (50 μL for hvert bibliotek) i henhold til produsentens forslag. Supplere blandingen med magnesiumklorid til en endelig konsentrasjon på 1,5 mM (se trinn 4.1.4).
5. Dispenser 50 μL aliquots i 1,5 ml rør på is.
6. Tilsett 1,7 fmole av biblioteket (fra avsnitt 3) til reaksjonsblandingen på is.
   MERK: Ikke bruk en høyere mengde uttrykksbibliotek for valgeffektivitet. Det er avgjørende å minimere frekvensen av vandige dråper som inneholder mer enn ett DNA-molekyl.
7. Forbered vann-i-olje emulsjon fortløpende for hvert bibliotek.
   1. Sett et lite beger (eller stor flaskekopp) fylt med is på en magnetisk omrører med rørehastigheten satt til 1150 rpm.
   2. Overfør et kryogent hetteglass med 950 μL oljeoverflateaktivt middel blanding og en liten rørebar fra trinn 4.3 til et iskaldt beger på magnetisk rører. Kontroller at røringsstangen spinner.
   3. Tilsett fem 10 μL aliquots av in vitro bibliotek-transkripsjon-oversettelse blanding over en 2 min periode i 30 s intervaller og fortsett å røre i et ekstra minutt. Overfør hetteglasset med emulsjonen til en isbeholder. Fortsett med neste bibliotek som starter med trinn 4.7.2.
   4. Etter at alle bibliotekene er behandlet starte inkubasjon av alle bibliotekene i henhold til kit produsentens anbefalinger.
8. Overfør hetteglassene til temperaturen optimal for den konstruerte endonuclease for ytterligere 2 timer og deretter sette dem på is i minst 10 min.

5. Fortsatt behandling av biblioteker og valg

1. Overfør emulsjonene fra kryogene hetteglassene til kalde 1,5 ml rør, tilsett 1 μL på 0,5 M EDTA og sentrifuger dem på 13 000 x g i 5 min ved romtemperatur.
2. Fjern den øvre oljefasen med en pipette. Hvis en olje-vann interphase ikke er synlig, inkuberrøret i minst 5 min ved -20 °C for å fryse vandig fase, deretter umiddelbart rør ut den flytende oljefasen.
3. Tilsett 100 μL av 10 mM Tris HCl pH 8.0 og utfør umiddelbart ekstraksjon med 150 μL fenol:kloroform (1:1 v/v) ved kort virvlende etterfulgt av faseseparasjon med 30 sentrifugering ved 13 000 x g. Samle den øvre vandige fasen.
4. Utfell DNA ved å tilsette 0,1 vol (15 μL) av 3 M natriumacetat (pH = 5,2), 2,5–5 μg glykogen og 2,5 vol (375 μL) etanol. Inkuber ved -20 °C i 1 t og sentrifuge i 15 min ved 13 000 x g,4 °C. Kast supernatanten og vask pelleten kort med 1 ml kald 70% etanol.
5. Tørk DNA/glykogenpelleten i en speedvac eller lufttørr i > 5 min.
6. Løs opp pelleten i 50 μL av 10 mM Tris-HCl (pH = 7,5). Tilsett 5 μL streptavidin magnetiske perler utarbeidet i henhold til produsentens instruksjoner og bland for 1 h ved RT, helst i en karusellmikser eller ved mild virvlende.
7. Skill perlene på et magnetisk stativ og samle væsken beriket i DNA uten biotin.
8. Konsentrmer DNA ved etanolnedbør (trinn 5.4–5.5).
9. Oppløs konsentrert DNA fra forrige trinn i 5 μL vann og bruk som en mal i en PCR-reaksjon med F2- og R1-primere (tabell 1A).
   MERK: For å unngå problemer med malkontaminering og minimere PCR-artefakter, bruk Taq polymerase (ikke Pfu eller Phusion) og kjør 18–20 sykluser med forlengelsestiden proporsjonal med malstørrelsen (1 kb = 1 min) (se tabell 2B).
10. Fraksjoner PCR-produktet i en agarosegel og kutt ut produktet med forventet størrelse. Noe smøring indikerer at det finnes produkter av forskjellige størrelser (se figur 6). Rense DNA fra gelskiven med et kommersielt sett.
11. Kjør en annen PCR-reaksjon med opptil 50 ng av DNA fra trinn 5.10 og primers F1 og R2 ved hjelp av samme protokoll som i trinn 5.9. Fortsett med produktrensing som beskrevet i 5.10. Renset DNA etter kvantifisering av agarose gel densitometri (ikke UV spektroskopi) kan brukes i neste runde av in vitro utvalg (trinn 4.6).

6. Skjermvarianter for endret sekvensspesifitet

1. Klone utvalgte varianter.
   1. Fordøye produktet fra trinn 5.10 for 2 timer med 10 U av begrensningsenzymer som passer for kloning av ORF i uttrykksvektoren (for NlaIV: NcoI og XhoI) i temperaturen og bufferen anbefalt av enzymleverandøren. Løs produktene med agarose gelelektroforese og isolere det forventede størrelsesfragmentet.
   2. Forbered plasmidvektoren (f.eks. pET28) ved dobbel spalting med de samme enzymene som i trinn 6.1.1 og gel renser produktet med et kommersielt DNA gelrensesett.
   3. Estimer konsentrasjonene av vektor og sett inn ved densitometri med agarose gelelektroforese.
   4. Sett opp en ligation med 1–5 U av T4 DNA ligase og vektor:sett inn molar ratio 1:3-1:5 i 1x ligase buffer anbefalt av enzymleverandøren. Inkuber for 2 timer på RT og innføre i passende vertsbakterier (fra trinn 1.3) ved transformasjon eller elektroporasjon¹².
   5. Velg extransformants på LB plater som inneholder riktig antibiotika (50 μg / ml kanamycin for pET28 eller pET30 vektorer) og 1% glukose.
2. Ekspressproteinvarianter.
   1. Inokulere enkeltkolonier fra transformasjonen (opptil 24 kloner kan lett behandles i en enkelt kjøring) til 2 ml LB med kanamycin (50 μg/ml) og 1% glukose og vokse over natten ved 37 °C med risting.
   2. Inokuler15 ml varm (37 °C) LB som inneholder 100 μg kanamycin og ingen glukose med 0,75 ml av overnattingskulturen og inkubering ved 37 °C med kraftig risting.
      MERK: Enten 50 ml sentrifugerør eller 100 ml Erlenmayer kolber kan brukes.
   3. Tilsett 176 μL glyserol til 1 ml over nattens kultur (endelig konsentrasjon av glyserol = 15 %) bland godt og frys ved -70 °C.
   4. Etter 2–3 timer tilsuplik 15 ml av kulturen (fra trinn 6.2.1) med IPTG til 1 mM og kultur for ytterligere 5 timer.
   5. Samle bakteriell pellet ved sentrifugering (10.000 x g,4 °C, 10 min) og fryse ved -70 °C.
3. Rense proteinvariantene.
   1. Overfør 20 μL nikkelaffinitetshuleig suspensjon til 200 μL B1 buffer i et 1,5 ml rør med en bred kjedepipettespiss, bland forsiktig og sentrifuge (5000 x g,30 s, 4 °C). Fjern supernatanten ved å røre og la røret stå på isen.
   2. Resuspender bakteriepelleten fra trinn 6,2,5 i 300 μL B1 ved kraftig virvlende. Overfør suspensjonen til et 1,5 ml rør.
   3. Tilsett 3 μL av 100x proteasehemmercocktail og lysosom oppløsning i B1 (endelig konsentrasjon på 1 mg/ml). Avslutt cellene ved sonikering med en spiss utstyrt sonde. Bruk seks 10 s bursts per prøve med > 15 s tips kjøletid i is i mellom. Hold cellesuspensjoner på is hele tiden.
   4. Pelletcellerester ved sentrifugering (2 min, 12 000 x g,4 °C) og overfør 250 μL supernatant til harpiksaliquot fra trinn 6.3.1.
   5. Bland i 15 minutter i et kaldt rom, helst i en karusellmikser eller ved mild virvlende.
   6. Sentrifuge (5000 x g,30 s, 4 °C) og aspirere supernatanten med en pipette.
   7. Tilsett 500 μL W buffer og resuspend erten forsiktig. Sentrifuge (5000 x g,30 s, 4 °C) og aspirere supernatanten med en pipette.
   8. Gjenta trinn 6.3.7.
   9. Tilsett 20 μL buffer E, resuspend eren forsiktig, og la prøven stå på is i 2–5 min. Sentrifuge (5000 x g,30 s, 4 °C) og samle supernatanten.
   10. Gjenta trinn 6.3.9. Basseng supernatants.
   11. Analyser proteinprøver ved hjelp av SDS-PAGE (5–10 μL) (figur 7).
4. Skjerm for varianter med endret spesifisitet.
   1. Analyse spalting aktivitet på bakteriofhage lambda DNA. Proteinprøven kan utgjøre opptil 10% av det endelige reaksjonsvolumet. Totalt 2 μL proteinprøve per 0,5 μg DNA og 2 timer reaksjonstid er et godt utgangspunkt.
   2. Analyser reaksjonsproduktene ved agarose gelelektroforese sammen med produktene som genereres av villtypeenzymet. Velg klonene som genererer spaltningsmønstre som tydelig skiller seg fra det som genereres av villtypeenzymet for videre analyse (figur 8).

Representative Results

Denne protokollen er bare et verktøy for å øke frekvensen av ønskede varianter av en konstruert rease ved å tømme (men ikke eliminere) to uønskede klasser: inaktive enzymer og endonucleases med uendret vill type sekvens spesifisitet. På den annen side, fordi endring av REase spesifisitet er ekstremt vanskelig, finne enda en slik variant produsere en cleavage mønster som er forskjellig fra vill type enzymet i en enkelt screening av 24 kloner bør betraktes som en suksess. I våre hender kunne de beste skjermene identifisere opptil 20% av lovende varianter (Figur 8A).

Det positive resultatet avhenger sterkt av en bibliotekkvalitet (dvs. begrenset hyppighet av substitusjoner og deres tilfeldige distribusjon) og effektiv fangst av den biotinylated befolkningen av bibliotekmedlemmer (trinn 3.6-3.7). Begge problemene kan oppdages. Bibliotekkvaliteten bør kontrolleres før valget ved sekvensering av så mange kloner som mulig (>15) eller ved direkte sekvensering av biblioteket ved sekvensering med høy gjennomstrømning (trinn 3.10, tabell 3). Hvis et flertall av de valgte klonene ikke er aktive, er dette en klar indikasjon på svikt i streptavidin-fangstvalget. En lignende effekt observeres i tilfelle av biblioteker som gjennomgår mange utvalgssykluser, fordi slike biblioteker mest sannsynlig domineres av inaktive varianter som unnslapp streptavidin fangst utvalg trinn (Figur 8B). Derfor er det tilrådelig å kjøre screening etter hver utvelgelsessyklus og videreutvikle manuelt utvalgte lovende varianter i stedet for å stole på valgitering.

Figur 1: In vitro valg av en ny sekvens spesifisitet basert på NlaIV engineering. (A) Organiseringen av uttrykket/valgkassetten (ESC) inkluderer to gjenkjenningssteder for REase, 1) den valgte sekvensen (GGATCC) nær høyre ende og 2) den motvalgte sekvensen (GGSSCC) nær venstre ende, samt T7p og T7t-T7-arrangøren og T7-terminatoren. Primerbindingsstedene vises nedenfor. Cleavage etter vill type og utvalgte NlaIV varianter vises som røde og grønne trekanter henholdsvis. (B) Trinn for valgsyklus: I) Emulgering av transkripsjons-oversettelse-cleavage reaksjon blander med ESC biblioteket; II) Alt biotinylated DNA fanges på magnetiske partikler belagt med streptavidin og fjernet, og dermed fjerne koding inaktive varianter; III) ESCer koding REases med vill type aktivitet (dvs. de som er i stand til å holde GGSSCC sekvens) elimineres fordi cleavage av sekvensen skiller bindingnettsteder for fremover og revers primers. Derfor oppstår ingen forsterkning av disse EsCene; IV) Inngang til neste valgrunde opprettes ved tillegg av biotin i høyre ende og gjeninnføre variasjon av tellervalgte sekvenser i venstre ende. Gjengitt fra Czapinska et al.⁸ med tillatelse fra Elsevier. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2: Utarbeidelse av ESC. Fragment avledet fra den opprinnelige konstruksjonen i en uttrykksvektor som inneholder NlaIV ORF under kontroll av T7-arrangøren ble endret for å være egnet for uttrykk/valg. NlaIV-området nedstrøms fra NlaIV ORF ble fjernet og unike steder (SalI, EcoRI og Eco52I) som ble brukt til å dempe utvalgte posisjoner ble introdusert i NlaIV ORF som stille mutasjoner. Den endelige konstruksjonen ble forsterket med flankerte primere som introduserte to flankerte NlaIV-områder: Den valgte tellersekvensen (GGSSCC) til venstre og valgt sekvens (GGATCC) til høyre. Den omvendte primeren introduserte også biotin. Primere som brukes til å lage muterte ECS vises som blå piler og merket nedenfor (se tabell 1B,C). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 3: Ordning for splitt og bland syntese. Eksemplet refererer til MutB primer syntese der en NNS sekvens ble introdusert på 0,8 frekvens på fire posisjoner (se også tabell 3). Merk at kjemisk syntese utføres fra 3 til 5', men alle sekvenser er vist i kanonisk 5'-3 'orientering (dvs. det fortsetter fra høyre til venstre i denne ordningen). Wild type sekvenser på mutagenized posisjoner vises i grønt mens NNS mutagne sekvenser er i rødt. SalI-gjenkjenningsstedet som senere brukes til å introdusere mutasjoner i ESCer, understrekes. Punkter for blanding og splitting trinn (2 og 4) er angitt. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 4: Bruk av unike restriksjonenzymsteder i oligonucleotid målrettet mutagenesis. Strategien for mutasjonsintroduksjon er vist på et eksempel på bygging av bibliotekene A-C (se trinn 3.1–3.7). Gjengitt fra Czapinska et al.⁸ med tillatelse fra Elsevier. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 5: Endonucleolytic cleavage in in vitro transcription-translation. (A) Spalting av et testsubstrat i optimal REase-buffer: 1) Substrat, 612 bp PCR-produkt med et enkelt NlaIV-gjenkjenningsnettsted; 2) Cleavage produkter, 355 bp og 257 bp. (B) Cleavage i en in vitro transkripsjon-oversettelse reaksjon (inneholder 0,5 μg av ESC): 1–2) 15 μL aliquots av in vitro transkripsjon oversettelse uten substrat (linje 2: reaksjon supplert med 1,5 mM MgCl₂); 3–4) 15 μL aliquots av in vitro transkripsjon-oversettelse med 1 μg testsubstrat; (linje 4: reaksjon supplert med 1,5 mM MgCl₂). S-DNA størrelse markør (pBR322 fordøyd med MspI). Eksempler ble løst i 6% opprinnelig SIDE. DNA ble farget med ethidiumbromid. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 6: Produkter av den første PCR i valgsyklusen. Se figur 1B, trinn III; protokolltrinn 5.10. Kolonnesett 1 og 2 er aliquots av to forskjellige biblioteker lastet i triplicate. S-DNA størrelse standard (lambda DNA fordøyd med HindIII og EcoRI). Pilen angir posisjonen til ESC i full lengde (1050 bp). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 7: NlaIV-varianter renset for videre screening i miniskala. Se trinn 6.3.11. Hver linje inneholder en 10 μL aliquot av en annen variant. S-protein molekylvekt standard. Molekylær masse av NaIV REase underenhet er 29,9 kDa. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 8: Eksempler på screening av NlaIV-varianter for sekvensspesifisitetsendring. Se trinn 6.4.2. (A) Vellykket screening med høy frekvens av lovende varianter. S = DNA størrelse markør, lambda DNA spaltet med HindIII og EcoRI; vill type (wt) = lambda DNA spaltet med vill type NlaIV; λ = lambda DNA substrat, ikke spaltet; andre kolonner=varianter med svært lav aktivitet. Varianter er merket ! = lovende varianter som produserer et spaltingsmønster forskjellig fra villtypeenzymet; ? = varianter som også kan ha endret sekvenspreferanse. (B) Mislykket screening, med et flertall av varianter inaktive og en variant med tilsynelatende uendret spalting mønster. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 9: Alternativt utvalg etter ligation. Dette alternativet kan brukes til alle REases generere klissete ender. Her presenterer vi en eksempelprotokoll for et utvalgsskjema for MwoI-enzym (upublisert). I) Valgt sekvens (plassert til høyre på ESC) med definerte rester vist i rødt og valgt variasjon av den kognatsekvensen vist i blått. I parenteser under den valgte tellersekvensen som skal plasseres i venstre ende av ESC vises. II) Produkt av MwoI cleavage; III) Etter terminering in vitro transkripsjon/oversettelse blir produktene renset og ligation utføres med overflødig adapter. Bare spaltingsproduktene som ble spaltet i den valgte sekvensen kan delta i ligation. Derfor elimineres inaktive varianter, og pulldown-trinnet er unødvendig. Spaltningsproduktet i den valgte tellersekvensen (på venstre side av ESC, ikke vist) kan ikke delta i denne ligasjonen fordi den utstående enden av adapteren ikke er komplementære til den valgte telleren; IV) Selektiv PCR bruker samme strategi som i hovedprotokollen for å eliminere varianter med villtype degenerere sekvens spesifisitet (F1 primer binding distal til telleren valgt sted) mens inaktive varianter elimineres av selektiv omvendt primer som ikke kan binde til onkelaved (og derfor ikke endret av adapter ligation) høyre ende. I neste syklus kan prosessen gjentas ved hjelp av adapter som er identisk med spaltningsproduktet for det foregående trinnet (dvs. den "spaltede kassetten" i panel III), og en passende selektiv omvendt primer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tabell 1: Primerer som brukes i NlaIV engineering. Sekvenser av begrensningsstedene som er nevnt i kommentarene, understrekes. Små bokstaver indikerer sekvenser som ikke har komplementer i DNA-malene. Vennligst klikk her for å se denne tabellen (Høyreklikk for å laste ned).

Tabell 2: Betingelser for PCR-reaksjoner som skal brukes i protokollen. T_m = primer smeltetemperatur (hvis T_m er forskjellig for primere, bør den nedre T_m brukes). Vennligst klikk her for å se denne tabellen (Høyreklikk for å laste ned).

Tabell 3: Resultater av kvalitetskontroll av to mutogene primere syntetisert med split-and-mix strategi. Mutageniserte kodoner er angitt med [XXX]. Et lavere indekstall indikerer posisjonen til en kodet aminosyre. Tilpasset fra Czapinska et al.⁸ med tillatelse fra Elsevier. Vennligst klikk her for å se denne tabellen (Høyreklikk for å laste ned).

Tabell 4: Resultater fra EP-PCR. Hovedparametere avledet fra sekvensanalyse av 22 kloner av ECS. Vennligst klikk her for å se denne tabellen (Høyreklikk for å laste ned).

Discussion

Utvalgsprotokollen som er beskrevet her ble testet for NlaIV⁸, en dimeric PD-(D/E)XK fold anerkjennelse sekvens som gjenkjenner en palindromisk målområde med sentrale NN baser og katalyserer en stump ende kuttet mellom NN baser. NlaIV ble plukket fordi spalting mellom NN-basene tyder på at disse basene er nær proteinet i komplekset. I prinsippet kan protokollen brukes til enhver sekvens spesifikk begrensning endonuclease, monomeric eller dimeric, av en fold gruppe, katalysere dobbel tråd pauser av noen forskjøvet, uavhengig av om katalytiske og spesifisitet domener faller sammen (som i NlaIV eksempel) eller er separate (f.eks FokI). Videre er protokollen i prinsippet nyttig ikke bare for generering av nye, smalere enzymspesifisitet, men kan også brukes til å eliminere stjerneaktiviteter, eller for å skape high fidelity endonucleases. Alt dette er imidlertid ikke testet ennå. Spesielt kan målrettet eliminering av stjerneaktivitet være komplisert, fordi de samme aminosyrerester kan være involvert i binding til de ønskede og uønskede basene. In vitro trinnene som er beskrevet i denne protokollen er ikke begrenset til valg av innsnevrede spesifisiteter, men kan også brukes til å velge ellers endrede spesifisiteter. Det er imidlertid da et problem med variant endonucleases: hvis spekteret av substrater inkluderer nye mål som ikke spaltes av foreldrenes endonuclease, er det generelt ingen god måte å beskytte celler mot de skadelige effektene av denne aktiviteten. I motsetning, hvis endonuclease spesifisitet bare er innsnevret, målene er et delsett av vill type mål, og dermed den allerede tilgjengelige cognate metyltransferase bør være fullt beskyttende.

Vår protokoll skiller seg på flere måter fra mange regisserte evolusjonsprotokoller. Åpne leserammemangfold genereres en gang i begynnelsen av eksperimentet, ikke i hver iterasjon. Videre er det skapt av split-and-mix syntese, snarere enn av EP-PCR. For NNS-erstatninger av codons, som brukt i dette arbeidet, er det (4 x 4 x 2)⁶ ~ 1,07 x 10⁹ kombinasjoner for seks posisjoner. Derfor er en gitt variant til stede i gjennomsnitt en gang i 1,7 fmoles av ESC. Denne kapasiteten kan økes til syv posisjoner ved hjelp av syntese med en blanding av 20 trinucleotide forløpere som tilbys av Glen Research eller ved å redusere mutasjonsfrekvens i mindre lovende posisjoner med split-and-mix oligonucleotide syntese. Hvis det er mulig, anbefales det å begrense omfanget av variasjon til seks stillinger. Selvfølgelig krever slik mutagenesis målretting noen eksisterende kunnskap om minst regionene i REase involvert i substratbinding. Split-and-mix-protokollen for å generere mangfold har klare fordeler i forhold til EP-PCR. Ved hjelp av EP-PCR fikk vi uendret varianter og sekvenser med åtte erstatninger for NlaIV-ESCer i samme EP-PCR (tabell 4). Biblioteket fra EP-PCR inneholder en betydelig brøkdel av kloner som bør unngås (vill type sekvenser, flere substitusjoner, frameshift og tull mutasjoner, og mutasjoner på steder usannsynlig å påvirke sekvensspesifisitet).

Vår protokoll skiller seg også fra mange andre anrettede evolusjonsprotokoller ved tilstedeværelsen av to sekvensielle utvalgstrinn. Positivt valg sørger for at ønsket aktivitet beholdes, ellers fjernes ikke biotinkoden, og kodesekvensen kan fjernes ved å trekke ned. Det er teknisk mulig at den falske fremveksten av en roman, ikke-overlappende spesifisitet (f.eks GCATGC) kan føre til utsslutt av biotinkoden også, hvis et passende spaltingssted er til stede i nærheten av ønsket spalting, men ikke andre steder. Dette bør imidlertid være svært usannsynlig. Negativt utvalg fjerner åpne leserammer som kode for enzymer som fortsatt har uønsket aktivitet. Dette trinnet er ikke strengt obligatorisk, fordi protokollen fortsatt vil berike utdatabiblioteket med varianter som er i stand til å holde utvalgssekvensen, men ikke i stand til å holde seg andre steder i ESC, og dermed gjøre den uegnet for PCR forsterkning. Imidlertid forventes utvalgseffektiviteten å være lavere fordi enzymer med den opprinnelige sekvensspesifisiteten ikke vil bli fjernet fra utgangen og vil konkurrere lovende varianter med endret spesifisitet, men også redusert enzymatisk aktivitet. Vær oppmerksom på at på befolkningsnivå kan både ønskede og uønskede målsekvenser, men trenger ikke være, degenerere. I NlaIV-eksemplet ble antimålet degenerert og målet ikke-degenerert. Selv når det er degeneracy på befolkningsnivå, i en enkelt dråpe bare ett (ikke-degenerert) mål eller anti-mål er til stede. I vår protokoll gjeninnføres mål- og antimålsekvenser ved hver repetisjon av valgtrinnene. Derfor må en åpen leseramme kode et enzym som er i stand til å holde alle mulige mål, og ute av stand til å holde noen av antimålene, for å overleve flere valgrunder. Legg merke til at behovet for å gjeninnføre antiselection målet ved hver iterasjon av protokollen håndhever to sekvensielle PCRs. Den første PCR bruker en primer som anneals utenfor anti-målet, slik at cleavage av anti-målet hindrer PCR reaksjon. Den andre PCR krever en primer som når utover anti-målet, og gjeninnfører anti-mål, for å sikre at hver åpen avlesningsramme testes mot alle varianter av antimålet under flere runder med valg.

For enzymer som genererer klebrig ender, kan en relatert alternativ protokoll basert på en tidligere beskrevet metode for isolering av REase ORF¹⁰ brukes. Uttømming av inaktive varianter av biotinfangst som brukes i våre eksperimenter, erstattes i den alternative protokollen ved å ligation av den kompatible adapteren med en sekvens som brukes som et primerbindingssted i en selektiv PCR (figur 9). Bare ESCer som produserer enzymer med den valgte spesifisiteten genererer ligation-kompatible ender og vil derfor bli valgt. Sekvensen av den klissete enden av telleren som ikke er valgt, må utformes på en slik måte at den ikke kan delta i ligation med adaptere. Iterasjon av utvelgelsesprosessen kan enkelt oppnås ved å bytte mellom to forskjellige adaptere og dermed to forskjellige omvendte primere i selektiv PCR.

Selv med nye protokoller er oppgaven med å konstruere nye spesifisiteter in vitro fortsatt svært utfordrende. For typisk type II REases er sekvensspesifisitet og endonucleolytic aktivitet avhengig av de samme proteinområdene. Det er derfor vanskelig å endre den ene uten å påvirke den andre. Suksess er gjort mer sannsynlig av en strategi som tar hensyn til fotavtrykket til enzymet, respekterer symmetrien av protein-DNA interaksjoner, og bygger på eksisterende enzymatiske preferanser, som bør bestemmes på forhånd i biokjemiske eksperimenter, som ble gjort for NlaIV eksempel⁸.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1000Å CPG Support (dA, dT, dC, dG)	Biosset	45-1000-050	Other vendors can be used as well
ASM-800 DNA/RNA	Biosset	800-001-000
GeneJET Gel Extraction Kit	Thermo Scientific	K0691	Any other kit can be used
Glen-Pak DNA purification cartridge	Glen Research	60-5200
HIS-Select Nickel Affinity Gel	Sigma	P6611
pET 28a vector			Any other vector with T7 promoter upstream of plycloning site can be used instead
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	Thermo Scientific	F530S	Any other high fidelity and highly processive thermophilic polymearse can be used instead
Porous steel foil	Biosset	40-063
Rapid Translation System RTS 100, E.coli HY Kit	Roche	3 186 148
Restriction endonucleases	Thermo Scientific		Obviously other vendors, enzymes can be used
Streptavidin Magnetic Beads	New England Biolabs	S1420S	Other vendors can be used as well. We have positively tested beds form Sigma
Synthesis chemicals including phosphoramidities	Carl Roth		Other vendors can be used as well
Synthesis columns (different sizes)	Biosset
T4 DNA ligase	Thermo Scientific	EL0011	Any other ligase can be used