Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

في المختبر إخراج تطور Endonuclease تقييد مع خصوصية أكثر صرامة

Published: March 25, 2020 doi: 10.3791/60807
Automatic Translation
1, 1
1International Institute of Molecular and Cell Biology, Warsaw (IIMCB)

Summary

يمكن تطوير الإندونوكليس التقييد مع خصوصية تسلسل جديدة من الإنزيمات التي تعترف بتسلسل منحط جزئيًا. هنا نقدم بروتوكول مفصل استخدمناه بنجاح لتغيير خصوصية تسلسل إنزيم NlaIV. المكونات الرئيسية للبروتوكول هي تجزئة المختبر من رد فعل النسخ / الترجمة واختيار المتغيرات مع خصائص تسلسل جديدة.

Abstract

تقييد endonuclease (REase) هندسة التحديد من الصعب للغاية. هنا نحن وصف بروتوكول متعدد الخطوات التي تساعد على إنتاج المتغيرات REase التي لها خصوصية أكثر صرامة من الإنزيم الأبوي. يتطلب البروتوكول إنشاء مكتبة لأشرطة اختيار التعبير (ESCs) للمتغيرات من REase ، من الناحية المثالية مع تباين في المواقف التي من المرجح أن تؤثر على ربط الحمض النووي. ويحيط ESC على جانب واحد من قبل تسلسل لنشاط موقع تقييد المطلوب وعلامة البيوتين وعلى الجانب الآخر من قبل موقع تقييد للنشاط غير المرغوب فيه وموقع تدليل الصلب. يتم نسخ اللجان الاقتصادية والاجتماعية وترجمتها في مستحلب الماء في الزيت، في الظروف التي تجعل وجود أكثر من جزيء الحمض النووي واحد لكل قطرة من غير المرجح. لذلك ، يخضع الحمض النووي في كل جزيء كاسيت فقط لنشاط الإنزيم المترجم والمشفر. REase المتغيرات من خصوصية المطلوب إزالة العلامة البيوتين ولكن ليس موقع الصلب التمهيدي. بعد كسر مستحلب، تخضع جزيئات الحمض النووي إلى سحب البيوتين، ويتم الاحتفاظ فقط تلك الموجودة في supernatant. تضمن هذه الخطوة الاحتفاظ فقط بـ ESCs للمتغيرات التي لم تفقد النشاط المطلوب. ثم تخضع جزيئات الحمض النووي هذه لتفاعل أول PCR. الانقسام في تسلسل غير مرغوب فيه يقطع موقع الربط التمهيدي لأحد التمهيديات. ولذلك، PCR تضخيم ESCs فقط من قطرات دون النشاط غير المرغوب فيه. ثم يتم إجراء رد فعل ثاني PCR لإعادة إدخال موقع التقييد للخصوصية المطلوبة وعلامة الكائنات الحية ، بحيث يمكن تكرار خطوة الاختيار. يمكن التعبير عن إطارات القراءة المفتوحة المختارة بشكل مفرط في الخلايا البكتيرية التي تعبر أيضًا عن ميثيل ترانسفيلاز cognate من REase الأبوية ، لأن REase المتطورة حديثًا لا تستهدف سوى مجموعة فرعية من المواقع المستهدفة لميثيل ترانسلاز.

Introduction

تسلسل هندسة خصوصية تحديا للغاية للفئة الثانية REases. في هذه الفئة من endonucleases ، يتم الربط بشكل وثيق الاعتراف بالتسلسل والحفز ، على الأرجح كضمان تطوري ضد إنشاء endonuclease من خصوصية أوسع من ميثيل ترانسهاز cognate ، والتي من شأنها أن تلحق الضرر الحمض النووي المضيف. التطور الموجه للخصائص الجديدة في الخلايا يزداد تعقيدًا بسبب الحاجة إلى حماية الحمض النووي المضيف من نشاط endonuclease المهندس حديثًا. لذلك ، لا يوجد سوى عدد قليل من المحاولات الناجحة للهندسة REase المبلغ عنها وكلها تستغل الميزات الفريدة لإنزيم معين1،2،3،4،5،6،7.

هنا نقدم بروتوكول مفصل لهندسة التحديد التي يمكن استخدامها لتوليد المتغيرات endonuclease التي لها خصوصية أضيق من إنزيم الوالدين الذي يقوم على الهندسة الناجحة لدينا من endonuclease NlaIV8. لأي إنزيم من هذا القبيل مع تسلسل الاعتراف التعسفي، يمكن إدخال خصوصية إضافية للقواعد في الجناحين. بالنسبة للإنزيمات الأبوية التي تتعرف على التسلسلات المنحطة جزئيًا (مثل NlaIV مع هدفGGNNCC) ، يمكن أيضًا إدخال خصوصية إضافية ضمن تسلسل الاعتراف. وبما أن التحديد الإضافي من المرجح أن يتطلب اتصالات بين البروتين والحمض النووي، فإن القواعد المعترف بها حديثاً ينبغي أن تقع ضمن بصمة الإندونوسلي الأبوي على الحمض النووي. ومن حيث المبدأ، يمكن وضع مخططات اختيار لأي تخصص مرغوب فيه لتسلسل الاعتراف. ومع ذلك ، فإن معظم REases التي تعترف palindromic وتسلسل الهدف palindromic تقريبا هي dimers الوظيفية التي تعترف فقط نصف موقع palindrome. وبالتالي، فإن اختيار الخصائص الجديدة التي تنتهك التماثل بين التفاعلات النووية البروتينية من غير المرجح أن ينجح. بالنسبة لـ NlaIV الباهت ، على سبيل المثال ، يمكن نظرياً تضييق تسلسل GGNNCC إلى GGATCC ولكن من المتوقع أن يكون تضييق التحديد وصولاً إلى GGAACC أكثر صعوبة. يتضمن مخططنا الاختيار الإيجابي والسلبي على حد سواء.

تكون العملية أكثر كفاءة عندما يتم استخدام التحديد السلبي أيضًا لإزالة الخصائص القادرة على تَصُل كافة التسلسلات بخلاف التحديد الأضيق المفضل. على سبيل المثال، يمكن الجمع بين تحديد GGATCC مع التحديد المضاد ضد GGBVCC (حيث B هو أي قاعدة أخرى غير A، وV هو أي قاعدة أخرى غير T). عندما لا يتم تغطية بعض التسلسلات المستهدفة المحتملة، تعتمد نتيجة تجربة الاختيار على فعالية الاختيار الإيجابي والسلبي. في عملنا NlaIV، اخترنا لGGATCC، وضد GGSSCC (حيث S هو G أو C)، وحصلنا على خصوصية أن، تجاهل التماثل كسر الأهداف، يمكن وصفها بأنها GGWWCC (حيث W هو A أو T)، مما يشير إلى أنه في هذه الحالة بالذات، كان الاختيار السلبي أكثر مهم من الاختيار الإيجابي.

نهجنا يبدأ مع إنشاء كاسيت اختيار التعبير (ESC). واللجنة في إطار أقسام. في القسم الأساسي الداخلي ، هناك متغيرات من إطار القراءة المفتوح (ORF) من REase ، تحت سيطرة T7 المروج. لا يمكن أن يحتوي هذا القسم الأساسي من ESC على أي موقع cognate لـ REase المهندسة. يقع النواة بين موقعين cognate لنوع البرية REase: موقع انشقاق للنشاط غير المرغوب فيه (تسلسل محدد مضاد ، GGSSCC في هذا المثال) وموقع انشقاق للنشاط المطلوب (تسلسل محدد ، GGATCC في المثال). الخطوة الأخيرة من إعداد ESC في PCR يضيف البيوتين قريبة من النشاط المطلوب في نهاية 5 ' ويخلق مجموعة متنوعة من تسلسل اتّصال مضادة (GGSSCC في المثال). تعتمد استراتيجية الاختيار على استخدام التصاميم المصممة بعناية في بروتوكول إعادة التضخيم ESC بعد بروتوكول النسخ /الترجمة/الاختيار في المختبر(الشكل 1A). يتم التعبير عن مكتبة ESC في نسخة مجزأة في المختبر مستحلب المياه في الزيت9،10،11. داخل كل قطرة، خصوصية الإنزيم أعرب يؤثر على حالة ESC(الشكل 1B،الخطوة الأولى). بالنسبة للترتيب الموصوف ، يزيل نشاط الانقسام المطلوب للبروتين المترجم علامة البيوتين في الحمض النووي ولكنه لا يؤثر على نهاية ESC الأخرى مع التسلسل المحدد العداد. عندما يتم كسر مستحلب، تتم إزالة شظايا الحيوية tinylated بواسطة السحب تقارب العقدية، بحيث أجزاء فقط من قطرات مع النشاط المطلوب تبقى(الشكل 1B،الخطوة الثانية). هذه الخطوة يزيل المتغيرات REase غير نشط. ثم يتم تضخيم الجزء الفائق من الخطوة المنسدلة بواسطة PCR. في أول التمهيديات تفاعل PCR F2 و R1 يتم استخدامها(الشكل 1A، B،الخطوة الثالثة). يرتبط التمهيدي F2 بقسم ESC بين التسلسل المحدد العداد ونهاية الجزيء. لذلك، لا يتم تضخيم ESCs التعبير عن المتغيرات التي هي قادرة على cleaving تسلسل العداد المحدد (وبالتالي، فصل المواقع ملزمة لالتمهيديF2 و R1 إلى اثنين من جزيئات الحمض النووي المختلفة) وبالتالي يتم إزالتها من المكتبة. يربط التمهيدي R1 بين الموقع المحدد وجوهر ESC بحيث لا يتأثر بحالة الانقسام للموقع المحدد ويستعيد موقع الانقسام للنشاط المطلوب (GGATCC). يتم إغلاق الدورة بواسطة PCR الثاني (مع التمهيديين F1 و R2) الذي يضيف البيوتين في نهاية 5 'بالقرب من الموقع المحدد ويستعيد الاختلاف المصمم في الموقع المحدد العداد بالقرب من الطرف الآخر من ESC(الشكل 1B، الخطوة الرابعة). خليط الحمض النووي الناتج جاهز لجولة أخرى من الاختيار.

يعتمد نجاح بروتوكول الاختيار بشدة على الاختيار الصحيح لتسلسل التعرف على الهدف الجديد الأكثر صرامة وعلى التصميم الدقيق لاستراتيجية الطفرات وتنفيذها الفعال. لأنه من الأسهل بكثير لتحسين على تفضيلات طفيفة موجودة مسبقا من REase من التغلب عليها، نوصي بدءا من دراسة حركية من أي تفضيلات موجودة مسبقا. وينتج عن ضرورة تصميم الطفرات الدقيقة الحجم المحدود لمكتبة متحولة يمكن معالجتها من خلال البروتوكول المقدم (109 مستنسخات في تجربة واحدة). لذلك يمكن اختبار جميع بدائل الأحماض الأمينية الممكنة 20 بشكل فعال في مواقف قليلة فقط (انظر المناقشة). وسيؤدي الطفرات العشوائية، مثل الـ PCR المعرضللخطأ (EP-PCR) المقدمة كطريقة بديلة، إلى اختزال عميق في التعقيد القائم. إذا كانت أي معلومات تتعلق بمواقع الأحماض الأمينية المحتملة المشاركة في الاتصالات مع الحمض النووي (أو حتى تقع على مقربة من النيوكليوتيدات المنحطة في تسلسل cognate) متاحة ، فمن المؤكد أنه ينبغي استخدامها لتحديد بعض الأحماض الأمينية لتولد التشبع التشبع الموجه أوليغونوكليوتيد (خطوات البروتوكول 1.6-3.10).

Protocol

1- إعداد اللجان القطرية المستدامة

  1. استنساخ ميثيل ترانسفيلاز من نظام تعديل القيود التي سيتم هندستها في عدد نسخة منخفضة plasmid (على سبيل المثال، pACYC184 أو pACYC174 أو مشتقاتها).
    ملاحظة: يجب أن تكون سلالة المضيف البكتيرية قادرة على تحمل الميثيل التي أدخلتها الإنزيم المستنسخة وتوفير تعبير لا يمكن اختزاله من البوليميراز الحمض النووي الريبي T7. ينصح باستخدام سلالة ER2566 (تحمل الطفرات McrA و McrBC و Mrr).
  2. تأكد من أن الحمض النووي البلازميد المؤتلف محمي ضد الانقسام بواسطة endonuclease cognate عن طريق علاج 0.5 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد مع 10 وحدات من reEase cognate في العازلة ودرجة الحرارة الموصى بها من قبل المورد الإنزيم لمدة 2 ساعة.
  3. إعداد الخلايا المختصة من هذه السلالة.
    ملاحظة: يمكن استخدام أي طريقة. استخدم المشروع الهندسي NlaIV طريقة كلوريد الكالسيوم البسيطة12.
  4. بناء بلازميد المؤتلف مع ORF لREase تحت سيطرة المروج T7 من مجموعة استبعاد مختلفة ومع علامة اختيار مختلفة عن تلك التي تحتوي على الجين ميثيل تراسفراز في الخطوة 1.1. يمكن استخدام المتجهات pET28 و pET30.
  5. إزالة جميع مواقع التعرف على الإنزيم المهندسة من قسم plasmid المؤتلف بين المروج T7 وcodon وقف الإنزيم ORF عن طريق إدخال الطفرات الصامتة(الشكل 2، الجدول 1A).
    ملاحظة:     إذا كان يجب إزالة أكثر من موقع واحد من هذا القبيل، سيكون من الضروري جولات طفرة متعددة (الخطوات 1.5.1-1.5.7).
    1. استخدام تفاعل PCR من الداخل إلى الخارج الذي يضخم البلازميد كامل الطول مع الاختلافات المصممة التي أدخلت في نهايات 5' من التمهيديات(الجدول 2A).
    2. إزالة الحمض النووي القالب بإضافة 10 U من endonuclease DpnI إلى 50 ميكرولتر من تفاعل PCR، واحتضان لمدة 2 ساعة في 37 درجة مئوية.
    3. حل المنتجات عن طريق الجيل الكهربي agarose. قطع الفرقة المقابلة لplasmid كامل الطول وتنقية ذلك مع مجموعة تجارية.
    4. إضافة 10x ربط المخزن المؤقت (إلى تركيز 1x) والملحق مع ATP (إلى 1 mM). إضافة 10 U من T4 كيناز البولي كليوموتيد واحتضان لمدة 20 دقيقة في 37 درجة مئوية. تعطيل الإنزيم عن طريق التدفئة في 70 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
    5. إضافة PEG 4000 إلى 5%,الملحق مرة أخرى مع ATP (إلى 1 mM), وإضافة 5 U من T4 رباط الحمض النووي. احتضان لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة (RT).
    6. تحويل إلى سلالة بكتيرية المختصة تحمل كوجنات ميثيل ترانسهاز (الخطوة 1.1).
    7. عزل الحمض النووي البلازميد على نطاق صغير وتأكيد إدخال تغييرات التسلسل عن طريق تسلسل dideoxy.
  6. إدخال مواقع تقييد فريدة قريبة من التسلسل (التعاقب) المستهدفة من قبل oligonucleotide الموجهة الطفرات(الشكل 2، الجدول 1B). اتبع الخطوات 1.5.1-1.5.7 لكل موقع.
    ملاحظة: يتم تنفيذ هذه الخطوة فقط عند استخدام الطفرات المستهدفة. إذا كان القيام بالطفرات العشوائية، تخطي الخطوات 2-3 والمتابعة إلى القسم 3 بدلاً من ذلك. وفي المثال المعروض، أُدخلت جميع المواقع في المنبع من المناطق المستهدفة، ولكن يمكن إدخالها إلى المصب أيضاً.
  7. تصميم التمهيديات لتضخيم ESC (الجدول 1C).
    1. تصميم التمهيدي العكسي ربط المصب من ORF endonuclease التي من شأنها أن أعرض موقع الاعتراف المحدد (R1) ونسخته أقصر (R2) التي تربط خارج تسلسل NlaIV المحدد ويحتوي على البيوتين في نهاية 5 '(انظر الشكل 1).
    2. تصميم التمهيدي إلى الأمام (F1) ملزمة لESC المنبع من المروج T7. يجب أن يقدم هذا التمهيدي أيضًا متغيرًا (متغيرات) مختارة من تسلسل التعرف الأصلي (أي الحد الأقصى لاختلافات التسلسل التي يعترف بها الإنزيم الأصلي باستثناء التسلسل العكسي المحدد).
      ملاحظة: سيتم استخدام إصدار أقصر من هذا التمهيدي (F2) الذي يغطي التسلسل المنتقاة إلى التسلسل المحدد في وقت لاحق في PCR انتقائية (الخطوة 5.9).

2. تقسيم ومزيج توليف التمهيديات موتاجينيك

ملاحظة: يتم استخدام هذه الخطوة فقط للمشاريع التي تتطلب الطفرات تحت التشبع في أكثر من موقع واحد. مطلوب المزج مع أعمدة توليف متعددة. تعيين أعمدة لتوليف عشوائية NNS codon ثلاثة توائم والبرية نوع codon ثلاثة توائم وفقا لترددات mutagenesis. على سبيل المثال، إذا كانت سبعة أعمدة توليف حجم متساوية متوفرة، وكان معدل تكوين طفرات 0.3 مرغوبًا فيه في موقع معين، فأضف codons NNS عشوائية في ~ 0.3 × 7 أو عمودين، وcodons من النوع البري في ~ 0.7 × 7 أو خمسة أعمدة(الشكل 3).

  1. تقرر بشأن مواقع لتولد التشبع الفرعي. اختيار ترددات الطفرات وفقا للأهمية الافتراضية للمواقع (أي أكثر أهمية الموقع، وارتفاع وتيرة)، مع وضع حدود على تعقيد المكتبة عموما في الاعتبار (انظر المناقشة).
  2. توليف oligonucleotides في جميع الأعمدة، تصل إلى الثلاثي تسبق مباشرة موقع الطفرات دون التشبع الثاني العد من نهاية 3'. لا تقم بإزالة مجموعة حماية 5'-trityl في دورة التوليف الأخيرة (استخدم خيار trityl-on على المزج). ستتم إزالة مجموعة الحماية في بداية دورة التوليف التالية (الخطوة 1 في الشكل 3).
  3. افتح أعمدة التوليف. جمع الزجاج المسام الخاضعة للرقابة (CPG) دعم التوليف في أنبوب جاف 1.5 مل ومزيج عن طريق الدوامة. إعادة تقسيم راتنج CPG المختلط إلى أعمدة توليف جديدة. تجنب إدخال الرطوبة ، لأنها ستنخفض الغلة الإجمالية (الخطوتان 2 و 4 في الشكل 3).
  4. مواصلة التوليف، بدءا من موقع الطفرات دون التشبع الثلاثي. تعيين الأعمدة إلى ثلاثة توائم NNS عشوائية أو ثلاثة توائم من النوع البري وفقا لتردد الطفرات المطلوبة (انظر الملاحظة أعلاه). في حالة وجود مواقع تشبع فرعي إضافية، انتقل فقط إلى الثلاثي ة التي تسبق موقع الطفرات الفرعية التشبع التالي. مرة أخرى، اترك مجموعة 5'-trityl في النهاية (خيار 5'-trityl-on على المزج) (الخطوة 3 في الشكل 3). ثم تابع الخطوة 2.3.
  5. إذا لم يكن هناك المزيد من المواقع دون التشبع موجودة المصب، إكمال التوليف، وترك مجموعة 5'-trityl في نهاية (5'-trityl-on الخيار على المزج) (الخطوة 5 في الشكل 3).
  6. Deprotect وتنقية مكتبة oligonucleotide وفقا لتعليمات الشركة المصنعة لخرطوشة تنقية.
    ملاحظة: Oligonucleotides صدر عن طريق deprotection من CPG يمكن أيضا أن تكون تنقية في مرحلة عكس عالية الأداء الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC) مع تريتيل على تليها إزالة مجموعة ثلاثية يدوية (1 ح العلاج مع 80٪ حمض الخليك في RT) وتنقية HPLC الثاني.
  7. تحقق من جودة مكتبة oligonucleotide في هلام اليوريا PAGE.

3. إنشاء مكتبات متغيرة

ملاحظة: استخدام البلازميد المؤتلف من الخطوة 1.6.

  1. إنشاء المكتبات عن طريق oligonucleotide الموجهة mutagenesis.
    ملاحظة:     بدلاً من ذلك، استخدم بروتوكول EP-PCR (الخطوة 3.2).
    1. تضخيم قسم من المروج T7 إلى موقع إنزيم تقييد فريدة تحيط التسلسل المستهدف مع الطفرات (في حالة NlaIV: SalI، EcoRI، أو Eco52I)(الجدول 1B-C، الجدول 2B، الشكل 4). تضخيم الجزء الثاني من موقع إنزيم تقييد فريدة من نوعها إلى نهاية 3 'من ESC.
    2. مزيج منفصل 5 ميكرولتر من تفاعلات PCR (من الخطوة 3.1.1) مع 8 ميكرولتر من الماء، 1.5 ميكرولتر من العازلة إنزيم تقييد 10x، و 5 وحدات من الإنزيمات تقييد المناسبة (SalI، EcoRI، أو Eco52I) واحتضان في درجة الحرارة المناسبة لمدة 2 ساعة.
    3. حل منتجات كل من ردود الفعل باستخدام الجيل الأجاروز electrophoresis. قطع العصابات الحجم المتوقع وتنقية مع مجموعة التجارية.
    4. تشغيل ما يصل إلى 1/3 من المنتجات النقية في هلام agarose وقياس تركيز كل الفرقة النقية عن طريق قياس الكثافة.
    5. إعداد ربط جزأين من ESCs في نسبة ضرس 1:1 مع 1x الرباط الاحتياطي و 1 U من T4 د ناسي واحتضان لمدة 2 ساعة في RT.
    6. حل منتجات التفاعل في هلام agarose. قطع المنتجات الحجم المتوقع وتنقية مع مجموعة تجارية.
    7. تضخيم منتجات الربط النقي في تفاعل PCR مع التمهيديين F1 و R2(الجدول 1C والجدول 2A). لا تقم بتشغيل أكثر من 20 دورات تضخيم.
    8. كسور ردود الفعل PCR في هلام agarose. قطع المنتجات وتنقية مع مجموعة تجارية.
    9. تشغيل 5 μL aliquot من المكتبة المنقى من الخطوة السابقة في هلام agarose وقياس التركيز عن طريق قياس الكثافة.
    10. استنساخ عينة صغيرة من المكتبة (تصل إلى 5 ميكرولتر) وتسلسل > 15 استنساخ للتحقق من تردد الطفرة والتوزيع(الجدول 3). انتقل إلى الخطوة 4.
      ملاحظة: وبدلاً من ذلك، يمكن استخدام تسلسل الإنتاجية العالية للعينة الصغيرة من اللجان القطرية.
  2. تنفيذ EP-PCR.
    1. تضخيم ESC من plasmid التي تم الحصول عليها في الخطوة 1.5.7 مع التمهيديات F1 و R1. تشغيل 20 دورات مع طق الأول polymerase(الجدول 1B).
    2. جل تنقية المنتج PCR.
    3. إعداد EP-PCR مع 2 نانوغرام من منتج PCR تنقية من الخطوة السابقة وتشغيل 15 دورات من EP-PCR(الجدول 1C)مع التمهيديات F1 و R1.
    4. هلام تنقية المنتج وتحديده عن طريق قياس كثافة هلام.
      ملاحظة: نظرا لانخفاض تركيز المنتج EP-PCR تنقية استخدام حوالي 1/3 للقياس الكمي.
    5. استنساخ عينة صغيرة من المكتبة (تصل إلى 1/5) وتسلسل > 15 استنساخ للتحقق من تردد الطفرة والتوزيع(الجدول 4).
      ملاحظة: بدلاً من ذلك، تنفيذ تسلسل الإنتاجية العالية من العينة الصغيرة من ESCs.

4. أداء مجزأة في المختبر النسخ والترجمة رد الفعل

  1. اختبار التعبير endonuclease والنشاط الأنزيمي في المختبر النسخ والترجمة.
    1. قم بإعداد ركيزة قصيرة (200-500 bp) مع موقع اعتراف واحد للإندونوكول تقع بالقرب من مركز الجزيء بحيث يمكن اكتشاف تفاعل الانقسام بسهولة.
      ملاحظة: أسهل طريقة لإعداد الركيزة هي عن طريق تضخيم PCR لجزء مناسب من أي جزيء الحمض النووي. يمكن تسمية الركيزة إشعاعيا أو تسمية فلورية لتبسيط الكشف عن الانقسام.
    2. إعداد 50 ميكرولتر من تفاعل النسخ والترجمة مع 0.5 ميكروغرام من النوع البري ESC وفقًا لتوصيات الشركة المصنعة. إضافة ملح المغنيسيوم (MgCl2، MgSO4، ويمكن اختبار خلات المغنيسيوم) إلى 1.5 mM والكمية المناسبة من الركيزة من الخطوة السابقة (على الأقل 0.5 ميكروغرام في حالة الحمض النووي غير المسمى).
      ملاحظة: يمكن استخدام أي نسخة / مجموعة الترجمة التي لا تحتوي على nuclease تنشيطها من قبل المغنيسيوم. بعض بائعي مجموعة استخدام nucleases لإزالة التلوث الحمض النووي أثناء الإنتاج ومن ثم إضافة chelators كمثبطات nuclease. هذه المجموعات غير متوافقة مع هذا الأسلوب.
    3. احتضان رد فعل النسخ والترجمة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. ثم نقل خليط التفاعل إلى درجة الحرارة المثلى لإنزيم تقييد لمدة 2 ساعة.
    4. تحليل انشقاق الركيزة في هلام agarose متبوعاً بالكشف المناسب (على سبيل المثال، تلطيخ الحمض النووي، التصور الفلوري، أو التصوير الشعاعي الذاتي)(الشكل 5).
      ملاحظة: على الأقل انشقاق جزئي من الركيزة ضروري قبل المضي قدما في التقسيم. إذا لم يتحقق ذلك ، فإن المزيد من التحسين للشكل الكيميائي المغنيسيوم أو تركيزه ضروري.
  2. قم بإعداد خليط من النفط السطحي بإضافة 225 ميكرولتر من سبان 80 و 25 ميكرولتر من Tween 80 إلى 5 مل من الزيت المعدني في أنبوب مخروطي 15 مل. مزيج شامل عن طريق عكس لطيف أنبوب 15x.
  3. لكل مكتبة نقل 950 ميكرولتر من خليط النفط السطحي إلى 2 مل جولة القارورة المبردة السفلية، التسمية مع اسم المكتبة، ونقل إلى الجليد. وضع واحد شريط التحريك أسطواني صغير (5 × 2 مم2)في كل قارورة.
  4. إعداد في المختبر النسخ وترجمة خليط التفاعل (50 ميكرولتر لكل مكتبة) وفقا لاقتراحات الشركة المصنعة. تكملة الخليط مع كلوريد المغنيسيوم إلى تركيز النهائي من 1.5 mM (انظر الخطوة 4.1.4).
  5. الاستغناء عن 50 ميكرولتر aliquots في أنابيب 1.5 مل على الجليد.
  6. إضافة 1.7 fmole من المكتبة (من القسم 3) إلى خليط التفاعل على الجليد.
    ملاحظة: لا تستخدم كمية أكبر من مكتبة التعبير لكفاءة التحديد. من الأهمية بمكان تقليل تكرار قطرات مائي تحتوي على أكثر من جزيء حمض نووي واحد.
  7. إعداد مستحلب المياه في النفط على التوالي لكل مكتبة.
    1. وضع كوب صغير (أو كوب زجاجة كبيرة) مليئة بالجليد على التحريك المغناطيسي مع سرعة التحريك المحددة في 1,150 دورة في الدقيقة.
    2. نقل قارورة التبريد مع 950 ميكرولتر من خليط النفط السطحي وشريط التحريك الصغيرة من الخطوة 4.3 إلى كوب الجليد الباردة على التحريك المغناطيسي. تأكد من أن شريط التحريك يدور.
    3. أضف خمسة 10 ميكرولتر من خليط المكتبة المختبرية النسخ والترجمة على مدى فترة 2 دقيقة في فترات 30 s ومواصلة التحريك لمدة دقيقة إضافية. نقل القارورة مع مستحلب إلى وعاء الجليد. تابع المكتبة التالية بدءًا من الخطوة 4.7.2.
    4. بعد معالجة جميع المكتبات تبدأ حضانة جميع المكتبات وفقا لتوصيات الشركة المصنعة للمجموعة.
  8. نقل القنينات إلى درجة الحرارة المثلى لendonuclease هندسيا ل2 ساعة إضافية ومن ثم وضعها على الجليد لمدة 10 دقيقة على الأقل.

5- مواصلة تجهيز المكتبات واختيارها

  1. نقل المستحلبات من القنينات المبردة إلى أنابيب 1.5 مل باردة، وإضافة 1 ميكرولتر من 0.5 M EDTA والطرد المركزي لهم في 13،000 × غرام لمدة 5 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  2. إزالة مرحلة الزيت العلوي مع ماصة. إذا كانت الطور البينية لمياه الزيت غير مرئي ، فاحتضن الأنبوب لمدة 5 دقيقة على الأقل عند -20 درجة مئوية لتجميد المرحلة المائية ، ثم على الفور خرج من مرحلة الزيت السائل.
  3. إضافة 100 ميكرولتر من 10 mM تريس HCl درجة الحموضة 8.0 وأداء استخراج على الفور مع 150 μL من الفينول: الكلوروفورم (1:1 v/v) عن طريق دوامة قصيرة تليها فصل المرحلة ب30 s الطرد المركزي في 13،000 × ز. جمع المرحلة المائية العليا.
  4. عجل الحمض النووي بإضافة 0.1 فول (15 ميكرولتر) من خلات الصوديوم 3 M (درجة الحموضة = 5.2) ، 2.5-5 ميكروغرام من الجليكوجين و 2.5 فول (375 ميكرولتر) من الإيثانول. احتضان في -20 درجة مئوية لمدة 1 ساعة والطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في 13،000 × ز، 4 درجة مئوية. تخلص من الخارقة واغسل البيليه لفترة وجيزة بـ 1 مل من الإيثانول البارد بنسبة 70٪.
  5. تجفيف الحمض النووي / الجليكوجين بيليه في speedvac أو الهواء الجاف ل > 5 دقيقة.
  6. إذابة بيليه في 50 ميكرولتر من 10 mM Tris-HCl (درجة الحموضة = 7.5). أضف 5 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي العقدية المعدة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة وتخلط لمدة 1 ساعة في RT، ويفضل في خلاط دائري أو عن طريق دوامة لطيف.
  7. فصل الخرز على موقف المغناطيسي وجمع السائل المخصب في الحمض النووي دون البيوتين.
  8. تركيز الحمض النووي عن طريق هطول الإيثانول (الخطوات 5.4-5.5).
  9. حل الحمض النووي المركز من الخطوة السابقة في 5 ميكرولتر من الماء واستخدامه كقالب في تفاعل PCR مع أجهزة تمهيدية F2 و R1(الجدول 1A).
    ملاحظة: لتجنب مشاكل التلوث القالب وتقليل التحف PCR استخدام البوليميراز تق (وليس Pfu أو Phusion) وتشغيل 18-20 دورات مع وقت التمديد يتناسب مع حجم القالب (1 كيلوبايت = 1 دقيقة) (انظر الجدول 2B).
  10. كسر المنتج PCR في هلام agarose وقطع المنتج الحجم المتوقع. يشير بعض تلطيخ أن هناك منتجات من أحجام مختلفة (انظر الشكل 6). تنقية الحمض النووي من لوح هلام مع عدة التجارية.
  11. تشغيل تفاعل PCR الثاني مع ما يصل إلى 50 نانوغرام من الحمض النووي من الخطوة 5.10 والتمهيديين F1 و R2 باستخدام نفس البروتوكول كما هو الحال في الخطوة 5.9. المضي قدما في تنقية المنتجات كما هو موضح في 5.10. يمكن استخدام الحمض النووي النقي بعد القياس الكمي من قبل قياس كثافة هلام الآغاروز (وليس التحليل الطيفي للأشعة فوق البنفسجية) في الجولة التالية من اختيار المختبر (الخطوة 4.6).

6. متغيرات الشاشة لخصوصية التسلسل المعدلة

  1. استنساخ المتغيرات المحددة.
    1. هضم المنتج من الخطوة 5.10 لمدة 2 ساعة مع 10 U من الإنزيمات التقييد المناسبة لاستنساخ ORF في ناقل التعبير (لنافي: NcoI وXhoI) في درجة الحرارة والمخزن المؤقت الموصى بها من قبل بائع الإنزيم. حل المنتجات مع الجيل الكهربي agarose وعزل حجم الجزء المتوقع.
    2. إعداد متجه البلازميد (على سبيل المثال، pET28) عن طريق الانقسام المزدوج مع نفس الإنزيمات كما هو الحال في الخطوة 6.1.1 وهلام تنقية المنتج مع طقم تنقية هلام الحمض النووي التجارية.
    3. تقدير تركيزات المتجه وإدراجها عن طريق قياس الكثافة مع الكهربية هلام الآغاروز.
    4. إعداد ربط مع 1-5 U من T4 رباط الحمض النووي وناقلات: إدراج نسبة المولي 1:3-1:5 في 1x رباط المخزن المؤقت الموصى بها من قبل بائع الإنزيم. احتضان لمدة 2 ساعة في RT وإدخال هاكتريا المضيف المناسب (من الخطوة 1.3) عن طريق التحول أو الكهربية12.
    5. حدد المواد الطاردة على لوحات LB التي تحتوي على المضادات الحيوية المناسبة (50 ميكروغرام/مل من الكاناماشين لناقلات pET28 أو pET30) و1% من الجلوكوز.
  2. التعبير عن متغيرات البروتين.
    1. Inoculate مستعمرات واحدة من التحول (يمكن معالجة ما يصل إلى 24 استنساخ بسهولة في تشغيل واحد) إلى 2 مل من LB مع kanamycin (50 ميكروغرام / مل) و 1 ٪ الجلوكوز وتنمو بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع اهتزاز.
    2. Inoculate 15 مل من الحارة (37 درجة مئوية) LB التي تحتوي على 100 ميكروغرام كانامايزن وليس الجلوكوز مع 0.75 مل من الثقافة بين عشية وضحاها واحتضان في 37 درجة مئوية مع اهتزاز قوي.
      ملاحظة: ويمكن استخدام أنابيب الطرد المركزي إما 50 مل أو 100 مل إرلينماير القارورة.
    3. إضافة 176 ميكرولتر من الجلسرين إلى 1 مل من الثقافة بين عشية وضحاها (التركيز النهائي من الجلسرين = 15%). مزيج شامل وتجميد في -70 درجة مئوية.
    4. بعد 2-3 ساعة ملحق 15 مل من الثقافة (من الخطوة 6.2.1) مع IPTG إلى 1 mM والثقافة لمدة 5 ساعة إضافية.
    5. جمع بيليه البكتيرية عن طريق الطرد المركزي (10،000 × ز،4 درجة مئوية، 10 دقيقة) وتجميد في -70 درجة مئوية.
  3. تنقية المتغيرات البروتين.
    1. نقل 20 ميكرولتر من تعليق الراتنج تقارب النيكل إلى 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت B1 في أنبوب 1.5 مل مع طرف ماصة تحمل واسعة، مزيج بلطف، والطرد المركزي (5000 × ز،30 s، 4 °C). إزالة supernatant عن طريق الأنابيب وترك أنبوب على الجليد.
    2. إعادة تعليق بيليه البكتيري من الخطوة 6.2.5 في 300 ميكرولتر من B1 عن طريق دوامة قوية. نقل التعليق إلى أنبوب 1.5 مل.
    3. إضافة 3 ميكرولتر من 100x كوكتيل مثبطات البروتياز والمحلول الليسوسوم في B1 (التركيز النهائي من 1 ملغ / مل). تفكيك الخلايا عن طريق سونيكيشن مع تلميح التحقيق مجهزة. استخدام ستة 10 ق رشقات نارية لكل عينة مع > 15 ق وقت التبريد تلميح في الجليد بينهما. احتفظ بتعليق الخلايا على الجليد طوال الوقت.
    4. بيليه حطام الخلية عن طريق الطرد المركزي (2 دقيقة، 12،000 × ز،4 درجة مئوية) ونقل 250 ميكرولتر من supernatant إلى الراتنج aliquot من الخطوة 6.3.1.
    5. مزيج لمدة 15 دقيقة في غرفة باردة، ويفضل في خلاط دائري أو عن طريق دوامة لطيف.
    6. الطرد المركزي (5000 × غرام، 30 s ، 4 درجات مئوية) وينتسخ supernatant مع ماصة.
    7. إضافة 500 ميكرولتر من العازلة W وإعادة تعليق بلطف الراتنج. الطرد المركزي (5000 × غرام، 30 s ، 4 درجات مئوية) وينتسخ supernatant مع ماصة.
    8. كرر الخطوة 6.3.7.
    9. أضف 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت E، وإعادة تعليق الراتنج بلطف، واترك العينة على الجليد لمدة g2-5 دقيقة.
    10. كرر الخطوة 6.3.9. تجمع المنثات.
    11. تحليل عينات البروتين في بواسطة SDS-PAGE (5-10 μL)(الشكل 7).
  4. شاشة للمتغيرات مع تغيير التحديد.
    1. اساي نشاط الانقسام على الحمض النووي bacteriophage لامدا. يمكن أن تشكل عينة البروتين ما يصل إلى 10٪ من حجم التفاعل النهائي. إن ما مجموعه 2 ميكرولتر من عينة البروتين لكل 0.5 ميكروغرام من الحمض النووي و2 ساعة وقت رد الفعل هو نقطة انطلاق جيدة.
    2. تحليل منتجات التفاعل من قبل الجيل الكهربي agarose جنبا إلى جنب مع المنتجات التي تم إنشاؤها بواسطة إنزيم نوع البرية. حدد استنساخ توليد أنماط الانقسام يمكن تمييزها بوضوح من تلك التي تم إنشاؤها بواسطة إنزيم نوع البرية لمزيد من التحليل(الشكل 8).

Representative Results

هذا البروتوكول هو مجرد أداة لزيادة وتيرة المتغيرات المطلوبة من REase هندسيا عن طريق استنفاد (ولكن ليس القضاء) فئتين غير المرغوب فيها: الإنزيمات غير النشطة وendonucleases مع خصوصية تسلسل نوع البرية دون تغيير. من ناحية أخرى ، لأن تغيير خصوصية REase أمر صعب للغاية ، فإن العثور على واحد من هذا النوع من البدائل ينتج نمطًا من الانقسام يختلف عن إنزيم النوع البري في فحص واحد لـ 24 استنساخًا يجب اعتباره نجاحًا. في أيدينا أفضل الشاشات يمكن أن تحدد ما يصل إلى 20٪ من المتغيرات الواعدة(الشكل 8A).

تعتمد النتيجة الإيجابية بشدة على جودة المكتبة (أي التردد المحدود للاستبدالات وتوزيعها العشوائي) والالتقاط الفعال للسكان الضئيلين بيولوجيًا من أعضاء المكتبة (الخطوات 3.6-3.7). يمكن الكشف عن كلتا المشكلتين. وينبغي التحقق من جودة المكتبة قبل الاختيار عن طريق تسلسل أكبر عدد ممكن من المستنسخين (>15) أو عن طريق التسلسل المباشر للمكتبة عن طريق تسلسل الإنتاجية العالية (الخطوة 3.10، الجدول 3). إذا كانت غالبية المستنسخين المحددين غير نشطة، فهذا مؤشر واضح على فشل اختيار التقاط العقدتافيرين. ويلاحظ تأثير مماثل في حالة المكتبات التي تخضع للعديد من دورات الاختيار، لأن هذه المكتبات هي الأكثر هيمنة من قبل المتغيرات غير النشطة التي نجا من خطوة اختيار التقاط streptavid(الشكل 8B). لذلك ، من المستحسن تشغيل الفحص بعد كل دورة اختيار ومواصلة تطوير متغيرات واعدة مختارة يدويًا بدلاً من الاعتماد على تكرار التحديد.

Figure 1
الشكل 1: في المختبر اختيار تسلسل جديد محدد على أساس الهندسة NlaIV. (أ)يتضمن تنظيم شريط التعبير/التحديد (ESC) موقعي تقدير لـ REase، 1) التسلسل المحدد (GGATCC) بالقرب من الطرف الأيمن و2) التسلسل المحدد للعداد (GGSSCC) بالقرب من الطرف الأيسر، بالإضافة إلى مروج T7p و T7t-T7 ومحدد T7. وترد أدناه مواقع الربط التمهيدي. ويظهر الانقسام حسب النوع البري ومتغيرات NlaIV المحددة كمثلثات حمراء وخضراء على التوالي. (ب)خطوات دورة الاختيار: I) استحلاب النسخ والترجمة الانقسام التفاعل يمزج مع مكتبة ESC؛ II) يتم التقاط جميع الحمض النووي التضمين الحيوي على الجسيمات المغناطيسية المغلفة بالعقدياتوفيافين وإزالتها ، وبالتالي إزالة المتغيرات غير النشطة الترميز ؛ III) ESCs ترميز REases مع نشاط نوع البرية (أي تلك قادرة على شق تسلسل GGSSCC) يتم القضاء لأن انشقاق التسلسل يفصل بين المواقع ملزمة للالتمهيديات إلى الأمام وعكس. ولذلك، لا يحدث أي تضخيم لهذه اللجان؛ 4) يتم إنشاء الإدخال لجولة الاختيار التالية عن طريق إضافة البيوتين على الطرف الأيمن وإعادة إدخال الاختلاف من تسلسل العداد المحدد على الطرف الأيسر. أعيد طبعها من Czapinska وآخرون8 بإذن من إلسفير. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: إعداد اللجنة. تم تعديل جزء مشتق من البناء الأصلي في متجه تعبير يحتوي على NlaIV ORF تحت سيطرة المروج T7 ليكون مناسبًا للتعبير / التحديد. تمت إزالة موقع NlaIV المصب من NlaIV ORF وتم إدخال المواقع الفريدة (SalI و EcoRI و Eco52I) التي تم استخدامها لتبخير مواقع مختارة في NlaIV ORF كطفرات صامتة. تم تضخيم البناء النهائي مع التمهيديات الجناحة التي أدخلت اثنين من المواقع NlaIV الجناحين: تسلسل العداد المحدد (GGSSCC) على التسلسل الأيسر والمحددة (GGATCC) على اليمين. كما قدم التمهيدي العكسي البيوتين. يتم عرض الالتمهيديات المستخدمة في إنشاء ECS المتحولة كأسهم زرقاء وتسمى أدناه (انظر الجدول 1B، C). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: مخطط التوليف المنقسم والمزيج. يشير المثال إلى توليف التمهيدي MutB حيث تم إدخال تسلسل NNS عند تردد 0.8 عند أربعة مواضع (انظر أيضاالجدول 3). لاحظ أن التوليف الكيميائي يتم من 3 'إلى 5' ولكن يتم عرض جميع التسلسلات في اتجاه 5'-3 الكنسي (أي أنه ينطلق من اليمين إلى اليسار في هذا المخطط). يتم عرض تسلسلات النوع البري في المواضع المطفرة باللون الأخضر بينما تكون تسلسلات NNS المطفرة باللون الأحمر. يتم تسطير موقع التعرف على SALI الذي يستخدم لاحقًا لإدخال طفرات في ESCs. يشار إلى نقاط خلط وتقسيم الخطوات (2 و 4). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: استخدام مواقع إنزيم تقييد فريدة من نوعها في التولد المعتوّر المستهدف من القلة. تظهر استراتيجية مقدمة الطفرات على مثال على بناء المكتبات A-C (انظر الخطوات 3.1-3.7). أعيد طبعها من Czapinska وآخرون8 بإذن من إلسفير. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: انشقاق الإندونكليوليك في المختبر النسخ والترجمة. (أ)انشقاق ركيزة اختبار في العازلة REase الأمثل: 1) الركيزة، 612 BP PCR المنتج مع موقع التعرف NlaIV واحد؛ 2) منتجات الانقسام، 355 bp و 257 bp.(B)الانقسام في تفاعل النسخ والترجمة في المختبر (التي تحتوي على 0.5 ميكروغرام من ESC): 1-2) 15 μL aliquots من في المختبر النسخ الركيزة دون (سطر 2: رد فعل مكملة مع 1.5 mM MgCl2)؛ 3-4) 15 μL aliquots من في المختبر النسخ الترجمة مع 1 ميكروغرام من الركيزة الاختبار؛ (line 4: reaction supplemented with 1.5 mM MgCl2). علامة حجم S-DNA (pBR322 مهضومة مع MspI). تم حل العينات في صفحة 6٪ أصلية. الحمض النووي كان ملطخاً ببروميد الإيتيهيديوم يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: منتجات أول PCR في دورة الاختيار. انظر الشكل 1باء،الخطوة الثالثة؛ بروتوكول الخطوة 5.10. مجموعات الأعمدة 1 و 2 هي aliquots من مكتبتين مختلفتين محملة في triplicate. معيار حجم الحمض النووي S (لامدا الحمض النووي هضمها مع HindIII وEcoRI). يشير السهم إلى موضع ESC كامل الطول (1050 bp). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 7
الشكل 7: المتغيرات NlaIV تنقية لمزيد من الفحص في مقياس صغير. انظر الخطوة 6.3.11. يحتوي كل سطر على 10 ميكرولتر عليوت من متغير مختلف. S-بروتين معيار الوزن الجزيئي. الكتلة الجزيئية للوحدة الفرعية NaIV REase هي 29.9 kDa. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 8
الشكل 8: أمثلة على فحص متغيرات NlaIV لتغيير خصوصية التسلسل. انظر الخطوة 6-4-2. (أ)الفحص الناجح مع ارتفاع وتيرة المتغيرات الواعدة. S = علامة حجم الحمض النووي، لامدا الحمض النووي مورقة مع HindIII وEcoRI؛ نوع البرية (wt) = لامدا الحمض النووي مورقة مع نوع البرية NlaIV; = الركيزة الحمض النووي لامدا، وليس مُكَد؛ أعمدة أخرى = متغيرات ذات نشاط منخفض جداً. يتم تسمية المتغيرات! = المتغيرات الواعدة التي تنتج نمط الانقسام متميزة عن إنزيم نوع البرية; = المتغيرات التي قد تكون قد غيرت أيضًا تفضيل التسلسل. (B)فحص غير ناجح، مع غالبية المتغيرات غير نشط ومتغير واحد مع نمط الانقسام دون تغيير على ما يبدو. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 9
الشكل 9: الاختيار البديل عن طريق الربط. يمكن استخدام هذا البديل لجميع REases توليد نهايات لزجة. نقدم هنا بروتوكول مثال لنظام اختيار إنزيم MwoI (غير منشور). I) تسلسل مختار (يقع في الطرف الأيمن من ESC) مع بقايا محددة تظهر باللون الأحمر والاختلاف المحدد من تسلسل cognate هو مبين باللون الأزرق. ويرد بين قوسين أسفل العداد المحدد التسلسل الذي سيتم وضعه في الطرف الأيسر من ESC؛ II) نتاج الانقسام MwoI؛ III) بعد إنهاء في المختبر النسخ / الترجمة، يتم تنقية المنتجات ويتم تنفيذ الربط مع محول الزائدة. يمكن فقط للمنتجات الانقسام التي تم مجسا في تسلسل المحدد المشاركة في الربط. لذلك، يتم إزالة المتغيرات غير النشطة، والخطوة المنسدلة غير ضرورية. لا يمكن أن يشارك منتج الانقسام في التسلسل المحدد العداد (في الطرف الأيسر من ESC، غير مبين) في هذا الربط لأن النهاية البارزة للمحول ليست مكملة للتسلسل المحدد للعداد؛ 4) يستخدم PCR انتقائي نفس الاستراتيجية كما هو الحال في البروتوكول الرئيسي للقضاء على المتغيرات مع نوع البرية منحط تسلسل خصوصية (F1 التمهيدي ربط distal إلى موقع العداد المحدد) في حين يتم القضاء على المتغيرات غير النشطة من قبل التمهيدي العكسي الانتقائي التي لا يمكن ربط إلى غير المنسحب (وبالتالي لا يتم تعديلها بواسطة ربط محول) نهاية الحق. في الدورة التالية يمكن أن يتم إعادة عرض العملية باستخدام محول مطابق للمنتج الانقسام من الخطوة السابقة (أي "كاسيت مكور" في اللوحة III) ، والتمهيدي العكسي الانتقائي المناسب. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: البرايمرات المستخدمة في هندسة NlaIV. يتم تسطير تسلسل مواقع التقييد المذكورة في التعليقات. تشير الحروف الصغيرة إلى التسلسلات التي لا تحتوي على مكملات في قوالب الحمض النووي. يرجى الضغط هنا لعرض هذا الجدول (انقر على الحق للتحميل).

الجدول 2: شروط ردود فعل تفاعل التفاعل المتعددة الكلور لاستخدامها في البروتوكول. Tm = درجة حرارة ذوبان التمهيدي (إذا كان Tm يختلف عن التمهيديات ، يجب استخدام Tm الأقل). يرجى الضغط هنا لعرض هذا الجدول (انقر على الحق للتحميل).

الجدول 3: نتائج فحص جودة اثنين من البوابتين المطفرة توليفها مع استراتيجية الانقسام والمزيج. يشار إلى الكودونات المطفرة مع [XXX]. يشير انخفاض رقم المؤشر إلى موضع الأحماض الأمينية المشفرة. مقتبس من Czapinska وآخرون8 بإذن من إلسفير. يرجى الضغط هنا لعرض هذا الجدول (انقر على الحق للتحميل).

الجدول 4: نتائج برنامج الشراكة البيئية المتعددة الكلور. المعلمات الرئيسية المستمدة من تحليل تسلسل 22 استنساخ ECS. يرجى الضغط هنا لعرض هذا الجدول (انقر على الحق للتحميل).

Discussion

تم اختبار بروتوكول الاختيار الموصوف هنا لNlaIV8، وهو تسلسل التعرف على أضعاف PD-(D/E) XK خافت يتعرف على موقع هدف palindromic مع قواعد NN المركزية ويحفز قطع نهاية حادة بين قواعد NN. تم اختيار NlaIV لأن الانقسام بين قواعد NN يشير إلى أن هذه القواعد قريبة من البروتين في المجمع. ومن حيث المبدأ، يمكن استخدام البروتوكول لأي تسلسل محدد للنهاية أو المونوميريك أو ديميريك، لأي مجموعة أضعاف، مما يحفز فواصل خصلة مزدوجة من أي متداخل، بغض النظر عما إذا كانت المجالات الحفازة والمحددة تتزامن (كما هو الحال في المثال NlaIV) أو منفصلة (على سبيل المثال، FokI). وعلاوة على ذلك، فإن البروتوكول من حيث المبدأ مفيد ليس فقط لتوليد خصوصية إنزيم جديدة أكثر ضيقا، ولكن يمكن أيضا أن تستخدم للقضاء على أنشطة النجوم، أو لإنشاء endonucleases عالية الدقة. ومع ذلك، لم يتم اختبار كل هذا بعد. على وجه الخصوص، قد يكون القضاء المستهدف على نشاط النجوم معقدًا، لأن نفس بقايا الأحماض الأمينية يمكن أن تشارك في ربط القواعد المرغوبة وغير المرغوب فيها. ولا تقتصر الخطوات المختبرية الموصوفة في هذا البروتوكول على اختيار الخصائص الضيقة، بل يمكن استخدامها أيضاً لتحديد الخصائص التي تم تغييرها بطريقة أخرى. ومع ذلك ، هناك مشكلة مع endonucleases المتغيرة: إذا كان طيف الركائز يتضمن أهدافًا جديدة لا مكورة من قبل endonuclease الأبوية ، فلا توجد بشكل عام طريقة جيدة لحماية الخلايا من الآثار الضارة لهذا النشاط. وعلى النقيض من ذلك، إذا تم تضييق خصوصية endonuclease فقط، فإن الأهداف هي مجموعة فرعية من أهداف النوع البري، وبالتالي ينبغي أن تكون الميثيل ترانسفيلاز المتاحة بالفعل وقائية بالكامل.

يختلف بروتوكولنا من عدة جوانب عن العديد من بروتوكولات التطور الموجهة. يتم إنشاء تنوع إطار القراءة المفتوحة مرة واحدة في بداية التجربة ، وليس في كل تكرار. وعلاوة على ذلك، يتم إنشاؤه عن طريق التوليف الانقسام ومزيج، بدلا من EP-PCR. بالنسبة لبدائل NNS من codons ، كما هو مستخدم في هذا العمل ، هناك (4 × 4 × 2)6 ~ 1.07 × 109 مجموعات لستة وظائف. ولذلك، فإن أي متغير معين موجود في المتوسط مرة واحدة في 1.7 fmoles من ESC. ويمكن زيادة هذه القدرة إلى سبعة مواقع باستخدام التوليف مع خليط من 20 سلائف ترينوكليوتيد التي تقدمها غلين للبحوث أو عن طريق خفض تردد الطفرة في مواقف أقل واعدة مع تخليق oligonucleotide الانقسام ومزيج. إذا كان ذلك ممكنا، فمن المستحسن للحد من مدى الاختلاف إلى ستة وظائف. ومن الواضح أن مثل هذا الاستهداف الطفرات يتطلب بعض المعرفة الموجودة مسبقا حول مناطق REase على الأقل المشاركة في ربط الركيزة. ولبروتوكول التقسيم والمزيج لتوليد التنوع مزايا واضحة بالمقارنة مع EP-PCR. باستخدام EP-PCR، حصلنا على متغيرات وتسلسل اتّصال دون تغيير تحمل ثمانية استبدالات لـ NlaIV ESCs في نفس EP-PCR(الجدول 4). تحتوي المكتبة من EP-PCR على جزء كبير من المستنسخين التي يجب تجنبها (تسلسل اتّحادية نوع، استبدالات متعددة، تحول الإطار والطفرات هراء، والطفرات في الأماكن التي من غير المحتمل أن تؤثر على خصوصية التسلسل).

يختلف بروتوكولنا أيضًا عن العديد من بروتوكولات التطور الموجهة الأخرى من خلال وجود خطوتين اختيار متتاليتين. الاختيار الإيجابي يتأكد من الاحتفاظ بالنشاط المطلوب، وإلا لا تتم إزالة علامة biotin، ويمكن إزالة تسلسل الترميز عن طريق السحب. من الممكن من الناحية الفنية أن يؤدي الظهور الصدفة لخصوصية جديدة غير متداخلة (على سبيل المثال GCATGC) إلى قطع علامة البيوتين أيضًا ، إذا كان موقع الانقسام المناسب موجودًا بالقرب من الانقسام المطلوب ، ولكن ليس في أي مكان آخر. ومع ذلك، ينبغي أن يكون هذا مستبعداً إلى حد كبير. يزيل التحديد السلبي إطارات القراءة المفتوحة التي تعمل على ترميز الإنزيمات التي لا يزال النشاط غير المرغوب فيها. هذه الخطوة ليست إلزامية تماماً، لأن البروتوكول سوف لا يزال إثراء مكتبة الإخراج مع المتغيرات التي هي قادرة على التجانب تسلسل التحديد ولكن غير قادر على التداعي في مكان آخر في ESC، وبالتالي جعلها غير مناسبة لتضخيم PCR. ومع ذلك، من المتوقع أن تكون فعالية الاختيار أقل لأن الإنزيمات ذات خصوصية التسلسل الأصلي لن تتم إزالتها من الإخراج وسوف تتفوق على المتغيرات الواعدة مع تغيير التحديد ولكن أيضًا انخفاض النشاط الأنزيمي. لاحظ أنه على مستوى السكان، يمكن لكل من تسلسل الأهداف المرغوب ة وغير المرغوب فيها، ولكن ليس من الضروري أن تكون، أن تتدهور. وفي المثال NlaIV، كان الهدف المضاد للهدف منحطاً والهدف غير منحط. وحتى عندما يكون هناك انحطاط على مستوى السكان، لا يوجد في قطرة واحدة سوى هدف واحد (غير منحط) أو هدف مضاد. في بروتوكولنا، يتم إعادة إدخال التسلسلات المستهدفة والمضادة للأهداف عند كل تكرار لخطوات الاختيار. لذلك ، يجب أن يقوم إطار القراءة المفتوح بترميز إنزيم قادر على التداعي لجميع الأهداف المحتملة ، وغير قادر على التشعب بأي من الأهداف المضادة ، للبقاء على قيد الحياة في جولات الاختيار المتعددة. لاحظ أن الحاجة إلى إعادة إدخال هدف التحديد المضاد في كل تكرار للبروتوكول يفرض اثنين من PCRs متسلسلة. يستخدم PCR الأول التمهيدي الذي يناز خارج المضادة للهدف، بحيث الانقسام من المضادة للهدف يمنع تفاعل PCR. يتطلب PCR الثاني التمهيدي الذي يتجاوز المضادة للهدف، ويعيد إدخال المضادة للهدف، للتأكد من أنه خلال جولات متعددة من الاختيار، يتم اختبار كل إطار قراءة مفتوحة ضد جميع المتغيرات من المضادة للهدف.

بالنسبة للإنزيمات التي تولد نهايات لزجة ، يمكن استخدام بروتوكول بديل ذي صلة يستند إلى طريقة تم وصفها سابقًا لعزل REase ORF10. يتم استبدال استنفاد المتغيرات غير النشطة بواسطة التقاط البيوتين المستخدم في تجاربنا في البروتوكول البديل بربط المحول المتوافق مع تسلسل يستخدم كموقع ربط التمهيدي في PCR انتقائي(الشكل 9). فقط ESCs التي تنتج الإنزيمات مع التحديد المحدد توليد نهايات قادرة على الربط وبالتالي سيتم اختيارها. يجب تصميم تسلسل النهاية اللاصقة للتسلسل eselected العداد بطريقة لا يمكن المشاركة في الربط مع المحولات. يمكن بسهولة تحقيق تكرار عملية الاختيار عن طريق التبديل بين اثنين من محولات مختلفة وبالتالي اثنين من التمهيديات عكس مختلفة في PCR انتقائية.

حتى مع البروتوكولات الجديدة ، فإن مهمة خصائص الرواية الهندسية في المختبر لا تزال صعبة للغاية. بالنسبة للنوع النموذجي II REases ، تعتمد خصوصية التسلسل والنشاط الأندوكليوليتيك على نفس مناطق البروتين. ولذلك من الصعب تغيير أحدهما دون التأثير على الآخر. يتم تحقيق النجاح على الأرجح من خلال استراتيجية تأخذ في الاعتبار بصمة الإنزيم ، وتحترم التماثل بين تفاعلات البروتين والحمض النووي ، وتبني على التفضيلات الأنزيمية الموجودة مسبقًا ، والتي يجب تحديدها مقدمًا في التجارب الكيميائية الحيوية ، كما تم القيام به للمثال NlaIV8.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

وقد دعم هذا العمل بالمنح المقدمة من وزارة العلوم والتعليم العالي (0295/B/PO1/2008/34 إلى MB وN301 100 31/3043 إلى KS)، من المركز الوطني البولندي للعلوم (UMO-2011/02/A/NZ1/00052، UMO-2014/13/B/NZ1/03991 وUMO-2014/14/M/NZ5/00558 إلى MB) وبزمالة EMBO قصيرة الأجل إلى KS (ATSF 277.00-05).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1000Å CPG Support (dA, dT, dC, dG) Biosset 45-1000-050 Other vendors can be used as well
ASM-800 DNA/RNA Biosset 800-001-000
GeneJET Gel Extraction Kit Thermo Scientific K0691 Any other kit can be used
Glen-Pak DNA purification cartridge Glen Research 60-5200
HIS-Select Nickel Affinity Gel Sigma P6611
pET 28a vector Any other vector with T7 promoter upstream of plycloning site can be used instead
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase Thermo Scientific F530S Any other high fidelity and highly processive thermophilic polymearse can be used instead
Porous steel foil Biosset 40-063
Rapid Translation System
RTS 100, E.coli HY Kit		 Roche 3 186 148
Restriction endonucleases Thermo Scientific Obviously other vendors, enzymes can be used
Streptavidin Magnetic Beads New England Biolabs S1420S Other vendors can be used as well. We have positively tested beds form Sigma
Synthesis chemicals including phosphoramidities Carl Roth Other vendors can be used as well
Synthesis columns (different sizes) Biosset
T4 DNA ligase Thermo Scientific EL0011 Any other ligase can be used

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schöttler, S., Wenz, C., Lanio, T., Jeltsch, A., Pingoud, A. Protein engineering of the restriction endonuclease EcoRV--structure-guided design of enzyme variants that recognize the base pairs flanking the recognition site. European Journal of Biochemistry. 258 (1), 184-191 (1998).
  2. Wenz, C., Hahn, M., Pingoud, A. Engineering of variants of the restriction endonuclease EcoRV that depend in their cleavage activity on the flexibility of sequences flanking the recognition site. Biochemistry. 37 (8), 2234-2242 (1998).
  3. Samuelson, J. C., Xu, S. Y. Directed evolution of restriction endonuclease BstYI to achieve increased substrate specificity. Journal of Molecular Biology. 319 (3), 673-683 (2002).
  4. Samuelson, J. C., et al. Engineering a rare-cutting restriction enzyme: genetic screening and selection of NotI variants. Nucleic Acids Research. 34 (3), 796-805 (2006).
  5. Rimseliene, R., Maneliene, Z., Lubys, A., Janulaitis, A. Engineering of restriction endonucleases: using methylation activity of the bifunctional endonuclease Eco57I to select the mutant with a novel sequence specificity. Journal of Molecular Biology. 327 (2), 383-391 (2003).
  6. Morgan, R. D., Luyten, Y. A. Rational engineering of type II restriction endonuclease DNA binding and cleavage specificity. Nucleic Acids Research. 37 (15), 5222-5233 (2009).
  7. Skowronek, K., Boniecki, M. J., Kluge, B., Bujnicki, J. M. Rational engineering of sequence specificity in R.MwoI restriction endonuclease. Nucleic Acids Research. 40 (17), 8579-8592 (2012).
  8. Czapinska, H., et al. Crystal Structure and Directed Evolution of Specificity of NlaIV Restriction Endonuclease. Journal of Molecular Biology. 431 (11), 2082-2094 (2019).
  9. Miller, O. J., et al. Directed evolution by in vitro compartmentalization. Nature Methods. 3 (7), 561-570 (2006).
  10. Zheng, Y., Roberts, R. J. Selection of restriction endonucleases using artificial cells. Nucleic Acids Research. 35 (11), e83 (2007).
  11. Takeuchi, R., Choi, M., Stoddard, B. L. Redesign of extensive protein-DNA interfaces of meganucleases using iterative cycles of in vitro compartmentalization. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 111 (11), 4061-4066 (2014).
  12. Howland, J. L. Short Protocols in Molecular Biology. Ausubel, F., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K. , Third edition, John Wiley & Sons. New York. (1995).
  13. Wilson, D. S., Keefe, A. D. Chapter 8 Unit 8.3: Random mutagenesis by PCR. Current Protocols in Molecular Biology. , John Wiley & Sons. New York. (2001).

Tags

علم الوراثة، العدد 157، توجيه التطور، في تجزئة المختبر، endonuclease تقييد، خصوصية التسلسل، تقسيم ومزيج تخليق oligonucleotide، في اختيار المختبر
في المختبر إخراج تطور Endonuclease تقييد مع خصوصية أكثر صرامة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Skowronek, K. J., Bochtler, M. In… More

Skowronek, K. J., Bochtler, M. In Vitro Directed Evolution of a Restriction Endonuclease with More Stringent Specificity. J. Vis. Exp. (157), e60807, doi:10.3791/60807 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter