In Vitro Instrueret Udviklingen af en begrænsning Endonuclease med strengere specificitet

Summary

Restriktionen endonucleases med ny sekvens specificitet kan udvikles fra enzymer, der genkender en delvist degenereret sekvens. Her giver vi en detaljeret protokol, som vi med succes har brugt til at ændre sekvensspecificiteten af NlaIV-enzymet. De vigtigste ingredienser i protokollen er in vitro-opdelingen af transskriptions-/oversættelsesreaktionen og udvælgelsen af varianter med nye sekvensspecificiteter.

Abstract

Begrænsning endonuclease (REase) specificitet engineering er yderst vanskeligt. Her beskriver vi en multitrinsprotokol, der hjælper med at producere REase-varianter, der har strengere specificitet end forældreenzymet. Protokollen kræver oprettelse af et bibliotek af udtryk saetter (ESC'er) for varianter af REase, ideelt med variabilitet i positioner, der kan påvirke DNA-binding. ESC er flankeret på den ene side af en sekvens for den ønskede begrænsningsaktivitet og et biotinmærke og på den anden side af et restriktionssted for den uønskede aktivitet og et grundstykke. ECC'erne transskriberes og oversættes i en vand-i-olie-emulsion under forhold, der gør tilstedeværelsen af mere end ét DNA-molekyle pr. dråbe usandsynlig. Derfor udsættes DNA'et i hvert kassettemolekyle kun for aktiviteten af det oversatte, kodede enzym. REase varianter af den ønskede specificitet fjerne biotin tag, men ikke primer glødning site. Efter at have brudt emulsionen udsættes DNA-molekylerne for en biotinnedtagning, og kun dem i supernatanten bevares. Dette trin sikrer, at kun økonomiske og regionale rådgivende råd for varianter, der ikke har mistet den ønskede aktivitet, bevares. Disse DNA-molekyler udsættes derefter for en første PCR-reaktion. Spaltning i den uønskede sekvens afskærer primer binding site for en af de primere. Derfor forstærker PCR kun økonomiske og små økonomiske og små økonomiske og små økonomiske og små, Der udføres derefter endnu en PCR-reaktion for at genindføre begrænsningsstedet for den ønskede specificitet og biotinmærket, således at udvælgelsestrinnet kan gentages. Udvalgte åbne læserammer kan overudtrykkes i bakterieceller, der også udtrykker den bevidste methyltransferase af forældreneS REase, fordi den nyudviklede REase kun er rettet mod en delmængde af methyltransferase målwebstederne.

Introduction

Sekvens specificitet engineering er ekstremt udfordrende for klasse II REases. I denne klasse af endonucleases er sekvensgenkendelse og katalyse tæt forbundet, sandsynligvis som en evolutionær sikkerhedsforanstaltning mod oprettelsen af en endonuclease af bredere specificitet end dets cognate methyltransferase, hvilket ville skade værts-DNA'et. Direkte udvikling af nye særlige forhold i celler kompliceres yderligere af behovet for at beskytte værts-DNA mod den nyudviklede endonuclease aktivitet. Derfor er der kun et par vellykkede forsøg på REase engineering rapporteret, og alle af dem udnytte de unikke funktioner i et bestemt enzym^{1,2,3,4,5,6,7}.

Her giver vi en detaljeret protokol for specificitet engineering, der kan bruges til at generere endonuclease varianter, der har smallere specificitet end en forældrenes enzym, der er baseret på vores succesfulde konstruktion af en NlaIV endonuclease⁸. For ethvert sådant enzym med en vilkårlig genkendelsessekvens kan der indføres ekstra specificitet for baser i flankerne. For forældreenzymer, der genkender delvist degenererede sekvenser (såsom NlaIV med sit GGNNCC-mål), kan yderligere specificitet også indføres inden for genkendelsessekvensen. Da ekstra specificitet sandsynligvis vil kræve protein-DNA-kontakter, bør de nyligt anerkendte baser ligge inden for fodaftryk af forældrenes endonuclease på DNA. I princippet kan der oprettes udvælgelsesordninger for enhver ønsket specialisering af anerkendelsessekvensen. Men de fleste REases, der genkender palindromiske og næsten palindromiske målsekvenser er funktionelle dimers, der genkender kun et halvt sted af palindrome. Derfor er det usandsynligt, at udvælgelsen af nye specificiteter, der krænker symmetrien i proteinnukleininteraktioner, vil virke. For dimeric NlaIV, for eksempel, ggnNCC sekvens kan teoretisk indsnævres til GGATCC men indsnævring specificitetned til GGAACC forventes at være vanskeligere. Vores ordning indebærer både positiv og negativ udvælgelse.

Processen er mere effektiv, når negativ udvælgelse også bruges til at fjerne de særlige forhold, der kan kløve alle andre sekvenser end den foretrukne snævrere specificitet. F.eks. kan valg af GGATCC kombineres med antiselection mod GGBVCC (hvor B er en anden base end A, og V er en anden base end T). Når nogle af de mulige målsekvenser ikke er dækket, afhænger resultatet af udvælgelseseksperimentet af effektiviteten af positiv og negativ udvælgelse. I vores NlaIV arbejde, valgte vi for GGATCC, og mod GGSSCC (hvor S er G eller C), og opnåede en specificitet, at ignorere symmetri bryde mål, kunne beskrives som GGWWCC (hvor W er A eller T), hvilket tyder på, at i dette særlige tilfælde, negativ udvælgelse var mere vigtigt end positiv udvælgelse.

Vores tilgang starter med oprettelsen af et udtryk udvælgelse kassette (ESC). ØSU er struktureret i sektioner. På den indvendige kerne sektion, er der varianter af den åbne læseramme (ORF) af REase, under T7 promotor kontrol. Denne kernesektion af ESC må ikke indeholde noget cognate-sted for den udviklede REase. Kernen er klemt inde mellem to cognate steder for vilde type REase: en spaltning site for den uønskede aktivitet (counter valgt sekvens, GGSSCC i dette eksempel) og en spaltning site for den ønskede aktivitet (valgt sekvens, GGATCC i eksemplet). Det sidste trin i udarbejdelsen af ØSU i PCR tilføjer biotin tæt på den ønskede aktivitet i 5's ende og skaber en række forskellige modudvalgte sekvenser (GGSSCC i eksemplet). Udvælgelsesstrategien bygger på anvendelse af omhyggeligt designede primere i ESC's reamplificationprotokol efter en in vitro-transskriptions-/oversættelses-/udvælgelsesprotokol (figur 1A). ESC-biblioteket udtrykkes i en in vitro-opdelt transskriptionsoversættelse , som er vand-i-olie-emulsion^9,10,11. Inden for hvert dråbe påvirker det udtrykte enzyms specificitet ESC 'ets tilstand (figur 1B,trin I). For det beskrevne arrangement fjerner den ønskede spaltningsaktivitet af det oversatte protein DNA's biotinmærke, men påvirker ikke den anden ESC-ende med den valgte tæller. Når emulsionen er brudt, fjernes biotinylatere fragmenter ved streptavidin affinitetspulldown, således at der kun er fragmenter fra dråber med den ønskede aktivitet tilbage(figur 1B, trin II). Dette trin fjerner inaktive REase-varianter. Den supernatant fraktion af pull-down trin forstærkes derefter af PCR. I de første PCR-reaktionsprimere anvendes F2 og R1(figur 1A,B, trin III). Primer F2 binder sig til ESC-sektionen mellem den valgte tællersekvens og molekyleenden. Derfor forstærkes økonomiske og økonomiske råd, der udtrykker varianter, der er i stand til at kløve den valgte tællersekvens (og derfor adskiller bindingsstederne for primer F2 og R1 i to forskellige DNA-molekyler) ikke og fjernes derfor fra biblioteket. Primer R1 binder sig mellem det valgte sted og kernen i ESC, så det ikke påvirkes af spaltningsstatus for det valgte sted og gendanner spaltningsstedet for den ønskede aktivitet (GGATCC). Cyklussen lukkes med en anden PCR (med primer F1 og R2), der tilføjer biotin i 5's ende tæt på det valgte sted og genskaber designet variation ved det valgte tællersted tæt på den modsatte ende af ESC (Figur 1B, trin IV). Den resulterende DNA-blanding er klar til endnu en valgrunde.

Udvælgelsesprotokollens succes afhænger i høj grad af, at den nye og strengere målgenkendelsessekvens bliver et korrekt valg, og at mutagenesestrategien og dens effektive gennemførelse er udformet omhyggeligt. Fordi det er meget lettere at forbedre på mindre allerede eksisterende præferencer REase end at overvinde dem, anbefaler vi at starte med en kinetisk undersøgelse af eventuelle allerede eksisterende præferencer. Nødvendigheden af omhyggelig mutagenese design skyldes den begrænsede størrelse af en mutant bibliotek, der kan behandles af den præsenterede protokol (10⁹ kloner i et enkelt eksperiment). Derfor kan alle 20 mulige aminosyresubstitutioner testes effektivt i få positioner (se Diskussion). Tilfældig mutagenese, såsom fejlbehæftet PCR (EP-PCR), der præsenteres som en alternativ metode, vil føre til en dybtgående undersampling af eksisterende kompleksitet. Hvis der foreligger oplysninger om potentielle aminosyrepositioner, der er involveret i kontakt med DNA (eller endda placeret i nærheden af de degenererede nukleotider i en cognatesekvens), bør de helt sikkert anvendes til at vælge nogle få aminosyrer til oligonukleotid styret mætningmutagenese (protokoltrin 1.6-3.10).

Protocol

1. Forberedelse af De SC'er

1. Klon methyltransferase af det begrænsningsændringssystem, der skal konstrueres i et lavt antal eksemplar plasmid (f.eks. pACYC184 eller pACYC174 eller derivater heraf).
   BEMÆRK: Den bakterielle værtsstamme skal kunne tåle methylering, der indføres af det klonede enzym, og give et uanvendeligt udtryk for T7 RNA-polymerase. Brug af ER2566-stammen (der bærer McrA, McrBC og Mrr-mutationer) anbefales.
2. Bekræft, at det rekombinant plasmid-DNA er beskyttet mod kavalergang ved cognate endonuclease ved behandling af 0,5 μg plasmid-DNA med 10 enheder cognate REase i buffer og temperatur, der anbefales af enzymleverandøren i 2 timer.
3. Forbered kompetente celler af denne stamme.
   BEMÆRK: Enhver metode kan bruges. NlaIV-ingeniørprojektet anvendte en simpel calciumchloridmetode¹².
4. Byg rekombinant plasmid med ORF for REase under T7-promotorfra en anden udelukkelsesgruppe og med en anden udvælgelsesmarkør end den, der indeholder methyltrasferase-genet i trin 1.1. Vektorer pET28 og pET30 kan anvendes.
5. Alle genkendelsessteder for det manipulerede enzym fjernes fra den del af rekombinantplasmiden mellem T7-promotoren og stopcodon af enzymet ORF ved at indføre tavse mutationer (Figur 2, tabel 1A).
   BEMÆRK: Hvis mere end ét sådant sted skal fjernes, vil flere mutationsrunder være nødvendige (trin 1.5.1-1.5.7).
   1. Brug en pcr-reaktion med vrangen ud, der forstærker plasmid i fuld længde med designede variationer, der introduceres i 5' enderne af primerne (tabel 2A).
   2. Skabelon-DNA'et fjernes ved at tilsætte 10 U DpnI endonuclease til 50 μL af PCR-reaktionen, og inkuberi i 2 timer ved 37 °C.
   3. Produkterne omarbejdes ved agarosegelelektroforese. Skær båndet ud, der svarer til plasmid i fuld længde, og rens det med et kommercielt kit.
   4. Der tilsættes 10x ligationsbuffer (til en koncentration på 1x) og suppleres med ATP (til 1 mM). Der tilsættes 10 U af T4 polynukleotid kinase og inkuberes i 20 min ved 37 °C. Inaktiver enzymet ved opvarmning ved 70 °C i 10 min.
   5. Tilføj PEG 4000 til 5%, supplere igen med ATP (til 1 mM), og tilføje 5 U af T4 DNA ligase. Inkuber i 2 timer ved stuetemperatur (RT).
   6. Omdannes til en kompetent bakteriestamme, der bærer cognate methyltransferase (trin 1.1).
   7. Isoler plasmid-DNA'et i lille skala, og bekræft indførelsen af sekvensændringer ved dideoxysekventering.
6. Indføre unikke restriktionssteder tæt på den eller de sekvenser, der er omfattet af oligonukleotid, der er styret til mutagenese (figur 2, tabel 1B). Følg trin 1.5.1-1.5.7 for hvert websted.
   BEMÆRK: Dette trin udføres kun, når en målrettet mutagenese bruges. Hvis du gør tilfældige mutagenese, springe trin 2-3 og gå videre til afsnit 3 i stedet. I det fremlagte eksempel blev alle lokaliteter indført opstrøms for målregionerne, men de kan også indføres i de efterfølgende led.
7. Design primere til forstærkning af ESC (tabel 1C).
   1. Design en omvendt primerbinding neden for den endonuclease ORF, der introducerer det valgte genkendelsessted (R1) og dets kortere version (R2), der binder uden for den valgte NlaIV-sekvens og indeholder biotin i 5' enden (se figur 1).
   2. Design en fremadrettet primer (F1), der binder sig til ESC opstrøms for T7-initiativtageren. Denne primer bør også indføre modudvalgte varianter af den oprindelige genkendelsessekvens (dvs. det maksimale sekvensvariationer, der genkendes af det oprindelige enzym med undtagelse af den valgte omvendte sekvens).
      BEMÆRK: En kortere version af denne primer (F2), der dækker sekvensen distalt til den modvalgte sekvens, vil blive brugt senere i den selektive PCR (trin 5.9).

2. Split-and-mix syntese af mutagene Primere

BEMÆRK: Dette trin bruges kun til projekter, der kræver undervandsmutagenese på mere end ét sted. En synthesizer med flere syntese kolonner er påkrævet. Tildel kolonner til syntese af randomiserede NNS codon trillinger og vilde type codon trillinger i henhold til mutagenese frekvenser. For eksempel, hvis syv lige volumen syntese kolonner er tilgængelige, og en mutagenese sats på 0,3 er ønskeligt på et givet sted, tilføje randomiserede NNS codons i ~ 0,3 x 7 eller to kolonner, og vilde type codons i ~ 0,7 x 7 eller fem kolonner (Figur 3).

1. Beslut om steder for undergravning mutagenese. Vælg mutagenesis frekvenser i henhold til den hypotetiske betydning af de steder (dvs. jo vigtigere stedet, jo højere frekvens), holde grænser for den samlede bibliotek kompleksitet i tankerne (se Diskussion).
2. Synthesize oligonukleotider i alle kolonner, op til den tredobbelte umiddelbart forud for den anden subsaturation mutagenesis site tælle fra 3'-ende. Fjern ikke 5'-tritylbeskyttelsesgruppen ved den sidste syntesecyklus (brug trityl-on-indstillingen på synthesizeren). Beskyttelsesgruppen vil blive fjernet i begyndelsen af den næste syntesecyklus (trin 1 i figur 3).
3. Åbn syntesekolonnerne. Saml kontrolleret pore glas (CPG) syntese støtte i en tør 1,5 ml rør og blandes ved vortexing. Ompartitioner den blandede CPG-harpiks til nye syntesekolonner. Undgå at indføre fugtighed, da det vil reducere det samlede udbytte (trin 2 og 4 i figur 3).
4. Fortsæt syntese, startende fra underindstning mutagenesis site triplet. Tildel kolonner til randomiserede NNS trillinger eller vilde type trillinger i henhold til den ønskede mutagenesefrekvens (se note ovenfor). Hvis der findes yderligere subsatuationssteder, skal du kun fortsætte til den tredobbelte forud for det næste sted for underlag. Igen, lad en 5'-trityl gruppe på i slutningen (5'-trityl-on mulighed på synthesizer) (trin 3 i figur 3). Fortsæt derefter med trin 2.3.
5. Hvis der ikke findes flere underlagssteder nedenfor, skal syntesen afsluttes, så der efterlades en 5'-tritylgruppe i slutningen (5'-trityl-on-muligheden på synthesizeren) (trin 5 i figur 3).
6. Debeskyt og rens oligonukleotidbiblioteket i henhold til producentens anvisninger.
   BEMÆRK: Oligonukleotider, der frigives ved deprotection from the CPG, kan også renses i den omvendte fase højtydende væskekromatografi (HPLC) med trityl-on efterfulgt af en manuel tritylgruppefjernelse (1 h behandling med 80% eddikesyre på RT) og en anden HPLC-rensning.
7. Tjek oligonukleotid bibliotekets kvalitet i en urea-PAGE gel.

3. Generering af variantbiblioteker

BEMÆRK: Brug den rekombinante plasmid fra trin 1.6.

1. Generer bibliotekerne ved oligonukleotid rettet mutagenesis.
   BEMÆRK: Du kan også bruge EP-PCR-protokollen (trin 3.2).
   1. Forstærke et afsnit fra T7-initiativtageren til det unikke restriktionsenzymsted, der flankerer den sekvens, der er målrettet med mutagenese (i tilfælde af NlaIV: SalI, EcoRI eller Eco52I) (tabel 1B-C, tabel 2B, figur 4). Forstærke den anden del fra det unikke restriktionsenzymsted til 3' slutningen af ØSU.
   2. 5 μL af PCR-reaktionerne (fra trin 3.1.1) blandes separat med 8 μL vand, 1,5 μL 10x restriktionsenzymbuffer og 5 enheder af de relevante restriktionsenzymer (SalI, EcoRI eller Eco52I) og inkuberes ved den relevante temperatur i 2 timer.
   3. Begge reaktioner afløses ved hjælp af agarose gel elektroforese. Skær de forventede størrelsebands ud og rengør med et kommercielt kit.
   4. Der løbes op til 1/3 af de rensede produkter i en agarosegel, og koncentrationen af hvert renset bånd måles ved densitometri.
   5. Opsætning af ligation af to dele af eSCs i en 1:1 molar forhold med 1x ligase buffer og 1 U af T4 DNA ligase og inkubere i 2 timer på RT.
   6. Reaktionsprodukterne omarbejdes i agarosegelen. Skær de forventede størrelse produkter og rense med en kommerciel kit.
   7. Forstærke de rensede ligationsprodukter i en PCR-reaktion med primer F1 og R2 (tabel 1C og tabel 2A). Kør ikke mere end 20 forstærkningscyklusser.
   8. Brøk PCR-reaktionerne i en agarosegel. Skær produkterne ud og rens med et kommercielt kit.
   9. Der køres en 5 μL aliquot af det rensede bibliotek fra det foregående trin i agarosegelen, og koncentrationen måles ved densitometri.
   10. Klon en lille prøve af biblioteket (op til 5 μL) og sekvens >15 kloner for at kontrollere mutationsfrekvensen og -fordelingen (tabel 3). Fortsæt til trin 4.
       BEMÆRK: Alternativt kan der anvendes sekvensering af et højt gennemløb af den lille stikprøve af de europæiske erhvervs- og østeuropæiske lande.
2. Udfør EP-PCR.
   1. Esc forstærkes af plasmid opnået i trin 1.5.7 med primer F1 og R1. Kør 20 cyklusser med Taq I polymerase (Tabel 1B).
   2. Gel renser PCR-produktet.
   3. Konfigurer EP-PCR med 2 ng renset PCR-produkt fra det foregående trin, og kør 15 cyklusser af EP-PCR (Tabel 1C) med F1- og R1-primere.
   4. Gel rense produktet og kvantificere det ved gel densitometri.
      BEMÆRK: På grund af den lave koncentration af det rensede EP-PCR-produkt anvendes ca. 1/3 til kvantificering.
   5. Klon en lille prøve af biblioteket (op til 1/5) og sekvens >15 kloner for at kontrollere mutationsfrekvens og -fordeling (tabel 4).
      BEMÆRK: Alternativt kan du foretage sekvensering med høj gennemløb af den lille stikprøve af e-pc'erne.

4. Udførelse af opdelt in vitro transskription-oversættelse reaktion

1. Test endonuclease udtryk og enzymatisk aktivitet i in vitro transskription-oversættelse.
   1. Forbered en kort (200-500 bp) substrat med en enkelt anerkendelse site for endonuclease placeret tæt på midten af molekylet, så spaltning reaktion let kan detekteres.
      BEMÆRK: Den nemmeste måde at forberede substratet er ved PCR forstærkning af en passende fragment af enhver DNA molekyle. Underlaget kan være radioaktivt mærket eller fluorescerende mærket for at forenkle kavalergang detektion.
   2. Der opsættes 50 μL transskriptionsoversættelsesreaktion med 0,5 μg vild type ESC i overensstemmelse med fabrikantens anbefalinger. Magnesiumsalt (MgCl₂, MgSO₄og magnesiumacetat kan testes) til 1,5 mM og den passende mængde substrat fra det foregående trin (mindst 0,5 μg i tilfælde af umærket DNA).
      BEMÆRK: Enhver transskription / oversættelse kit, der ikke indeholder nuclease aktiveret af magnesium kan bruges. Nogle kit leverandører bruger nucleases at fjerne DNA-forurening under produktionen og derefter tilføje chelatorer som nuclease hæmmere. Sådanne sæt er ikke kompatible med denne metode.
   3. Inkubere transskriptionsoversættelsesreaktionen i henhold til fabrikantens anvisninger. Derefter overføres reaktionsblandingen til den optimale temperatur for restriktionsenzymet i 2 timer.
   4. Analysér spaltningen af substratet i en agarosegel efterfulgt af passende påvisning (f.eks. DNA-farvning, fluorescensvisualisering eller autoradiografi) (figur 5).
      BEMÆRK: I det mindste delvis spaltning af substratet er nødvendig, før du fortsætter med opdelingen. Hvis dette ikke opnås, er yderligere optimering af magnesiumkemiske form eller dens koncentration nødvendig.
2. Der fremstilles en olieoverfladeaktivt blanding ved tilsætning af 225 μL spændvidde 80 og 25 μL Tween 80 til 5 ml mineralsk olie i et konisetisk 15 ml rør. Bland grundigt ved skånsom vende røret 15x.
3. For hvert bibliotek overføres 950 μL af den olie-overfladeaktive blanding til et 2 ml rundt bundkryogent hætteglas, etiket med biblioteksnavn og overførsel til is. Sæt en lille cylindrisk omrøringbar (5 x 2 mm²) i hvert hætteglas.
4. Der fremstilles en in vitro-transskriptionsoversættelsesreaktionsblanding (50 μL for hvert bibliotek) i overensstemmelse med fabrikantens forslag. Blandingen suppleres med magnesiumchlorid til en endelig koncentration på 1,5 mM (se trin 4.1.4).
5. Hæld 50 μL aliquots i 1,5 ml rør på is.
6. Der tilsættes 1,7 fmole af biblioteket (fra afsnit 3) til reaktionsblandingen på is.
   BEMÆRK: Brug ikke et højere udtryksbibliotek til valgeffektivitet. Det er afgørende at minimere hyppigheden af vandige dråber, der indeholder mere end ét DNA-molekyle.
7. Forbered vand-i-olie emulsion fortløbende for hvert bibliotek.
   1. Sæt et lille bægerglas (eller stor flaskekop) fyldt med is på en magnetisk omrører med omrøringshastigheden indstillet til 1.150 omdrejninger i minuttet.
   2. Der overføres et kryogent hætteglas med 950 μL olieoverfladeaktivt stof og en lille omrøringsstang fra trin 4.3 til et iskoldt bægerglas på magnetomrøreren. Kontroller, at omrøringsstangen roterer.
   3. Der tilsættes fem 10 μL aliquots af blandingen af in vitro-biblioteks-transskriptionsoversættelse over en periode på 2 minutter med 30 s intervaller, og omrøringen fortsættes i yderligere minutter. Hætteglasset overføres med emulsionen til en isbeholder. Fortsæt med det næste bibliotek, der starter med trin 4.7.2.
   4. Efter alle bibliotekerne er behandlet starte inkubation af alle biblioteker i henhold til kit producentens anbefalinger.
8. Hætteglas til den optimale temperatur for den konstruerede endonuclease i yderligere 2 timer og læg dem derefter på is i mindst 10 min.

5. Fortsat behandling af biblioteker og udvælgelse

1. Emulsionerne overføres fra de kryogene hætteglas til kolde 1,5 ml rør, der tilsættes 1 μL 0,5 M EDTA og centrifugeres ved 13.000 x g i 5 min ved stuetemperatur.
2. Fjern den øverste oliefase med en pipette. Hvis en indfaset olievandsfase ikke er synlig, inkuberes røret i mindst 5 minutter ved -20 °C for at fastfryse den vandige fase, hvorefter væskeoliefasen straks ledes ud.
3. Der tilsættes 100 μL 10 mM Tris HCl pH 8.0 og udsugning straks med 150 μL phenol:chloroform (1:1 v/v) ved kort vortexing efterfulgt af faseadskillelse ved 30 s centrifugering ved 13.000 x g. Saml den øverste vandige fase.
4. Udfældes DNA'et ved tilsætning af 0,1 vol. (15 μL) af 3 M natriumacetat (pH = 5,2), 2,5-5 μg g glykogen og 2,5 vol. (375 μL) ethanol. Inkuber ved -20 °C i 1 time og centrifuger i 15 minutter ved 13.000 x g, 4 °C. Supernatanten kasseres, og pelleten vaskes kortvarigt med 1 ml kold 70% ethanol.
5. Dna/glykogenpellet tørres i en speedvac eller lufttørre i >5 min.
6. Pellet'en opløses i 50 μL på 10 mM Tris-HCl (pH = 7,5). Der tilsættes 5 μL streptavidinmagnetiske perler, der er fremstillet i henhold til fabrikantens anvisninger, og der blandes i 1 time ved RT, helst i en karruselmixer eller ved forsigtig vortexing.
7. Adskil perlerne på et magnetisk stativ og opsaml væsken beriget med DNA uden biotin.
8. DNA'et koncentreres ved ethanoludfældning (trin 5.4-5.5).
9. Det koncentrerede DNA opløses fra det foregående trin i 5 μL vand og anvendes som skabelon i en PCR-reaktion med F2- og R1-primere (tabel 1A).
   BEMÆRK: For at undgå problemer med skabelonforurening og minimere PCR-artefakter skal du bruge Taq polymerase (ikke Pfu eller Phusion) og køre 18-20 cyklusser med forlængelsestiden proportional med skabelonstørrelsen (1 kb = 1 min) (se tabel 2B).
10. Brøk PCR-produktet i en agarosegel og skær det forventede størrelsesprodukt ud. Nogle udtværing indikerer, at der er produkter af forskellig størrelse (se figur 6). Rens DNA'et fra gelpladen med et kommercielt kit.
11. Kør en anden PCR-reaktion med op til 50 NG DNA fra trin 5.10 og primere F1 og R2 ved hjælp af samme protokol som i trin 5.9. Fortsæt med produktrensning som beskrevet i 5.10. Renset DNA efter kvantificering ved agarose gel densitometri (ikke UV-spektroskopi) kan anvendes i den næste runde af in vitro udvælgelse (trin 4.6).

6. Skærmvarianter for ændret sekvensspecificitet

1. Klon udvalgte varianter.
   1. Produktet indvier fra trin 5.10 i 2 timer med 10 U restriktionsenzymer, der er egnede til kloning af ORF,til ekspressionsvektoren (for NlaIV: NcoI og XhoI) i den temperatur og buffer, der anbefales af enzymleverandøren. Produkterne løss med agarose gelelektroforese, og det forventede størrelsesfragment isoleres.
   2. Plasmidvektoren (f.eks. pET28) fremstilles ved dobbelt kavalergang med de samme enzymer som i trin 6.1.1, og gel renses produktet med et kommercielt DNA-gelrensningssæt.
   3. Koncentrationerne af vektor og indsæt ved densitometri med agarose gel elektroforese.
   4. Opret en ligation med 1-5 U af T4 DNA ligase og vektor:indsæt molar ratio 1:3-1:5 i 1x ligase buffer anbefalet af enzymleverandøren. Inkuber i 2 timer ved RT og indfør i passende værtsbakterier (fra trin 1.3) ved omdannelse eller elektroporation¹².
   5. Der vælges extransformere på LB-plader, der indeholder det relevante antibiotikum (50 μg/ml kanamycin til pET28- eller pET30-vektorer) og 1 % glukose.
2. Ekspresproteinvarianter.
   1. Inokuler enkelte kolonier fra omdannelsen (op til 24 kloner kan let forarbejdes i et enkelt løb) til 2 ml LB med kanamycin (50 μg/ml) og 1% glukose og voksnatten ved 37 °C ved omrystning.
   2. Inokulere 15 ml varm (37 °C) LB indeholdende 100 μg kanamycin og ingen glukose med 0,75 ml af nattens kultur og inkuberes ved 37 °C med kraftig omrystning.
      BEMÆRK: Der kan anvendes enten 50 ml centrifugerør eller 100 ml Erlenmayer-kolber.
   3. Der tilsættes 176 μL glycerol til 1 ml nattens kultur natten over (endelig koncentration af glycerol = 15 %) blandes grundigt og fryses ved -70 °C.
   4. Efter 2-3 timers tillæg 15 ml af kulturen (fra trin 6.2.1) med IPTG til 1 mM og kultur i yderligere 5 timer.
   5. Bakteriepellet ender ved centrifugering (10.000 x g, 4 °C, 10 min. og fryses ved -70 °C.
3. Rens proteinvarianterne.
   1. 20 μL nikkelaffinitetharpiksophængning overføres til 200 μL B1-buffer i et 1,5 ml rør med en bred borepipettespids, blandes forsigtigt og centrifugeres (5.000 x g, 30 s, 4 °C). Fjern supernatanten ved pipettering og lad røret stå på is.
   2. Resuspender bakteriepelleten fra trin 6.2.5 i 300 μL B1 ved kraftig vortexing. Ophængdet overføres til et 1,5 ml rør.
   3. Der tilsættes 3 μL 100x proteasehæmmercocktail og lysovisopløsning i B1 (endelig koncentration på 1 mg/ml). Smuldre cellerne ved sonikering med en spids udstyret sonde. Brug seks 10 s byger pr prøve med > 15 s tip køletid i is i mellem. Hold cellesuspensioner på is hele tiden.
   4. Pelletcelleaffald ved centrifugering (2 min, 12.000 x g, 4 °C) og overføres 250 μL supernatant til harpiksalien fra trin 6.3.1.
   5. Blandes i 15 minutter i et koldt rum, helst i en karruselmixer eller ved blid vortexing.
   6. Der centrifugeres (5.000 x g, 30 s, 4 °C) og aspireres af supernatanten med en pipette.
   7. Der tilsættes 500 μL W-buffer, og harpiksen omslælres forsigtigt. Der centrifugeres (5.000 x g, 30 s, 4 °C) og aspireres af supernatanten med en pipette.
   8. Gentag trin 6.3.7.
   9. Der tilsættes 20 μL buffer E, reskogl harpiksen forsigtigt, og prøven efterlades på is i 2-5 min. Centrifuge (5.000 x g, 30 s, 4 °C) og supernatanten opsamles.
   10. Gentag trin 6.3.9. Pool supernatants.
   11. Analysér proteinprøver i ved SDS-PAGE (5-10 μL) (Figur 7).
4. Skærm til varianter med den ændrede specificitet.
   1. Assay spaltning aktivitet på bakteriofage lambda DNA. Proteinprøven kan udgøre op til 10 % af det endelige reaktionsvolumen. I alt 2 μL proteinprøve pr. 0,5 μg DNA og 2 timers reaktionstid er et godt udgangspunkt.
   2. Analysér reaktionsprodukterne ved agarose gel elektroforese sammen med de produkter, der genereres af den vilde type enzym. Vælg de kloner, der genererer spaltningsmønstre, der klart kan skelnes fra det, der genereres af det vilde typeenzym til yderligere analyse (figur 8).

Representative Results

Denne protokol er blot et værktøj til at øge hyppigheden af ønskede varianter af en manipuleret REase ved at nedbryde (men ikke fjerne) to uønskede klasser: inaktive enzymer og endonucleases med uændret vild type sekvens specificitet. På den anden side, fordi skiftende REase specificitet er yderst vanskeligt, at finde endnu en sådan variant producerer en spaltning mønster, der er forskellig fra den vilde type enzym i en enkelt screening af 24 kloner bør betragtes som en succes. I vores hænder de bedste skærme kunne identificere op til 20% af lovende varianter (Figur 8A).

Det positive resultat afhænger i høj grad af bibliotekets kvalitet (dvs. begrænset hyppighed af udskiftninger og deres tilfældige fordeling) og effektiv indfangning af den biotititerede population af biblioteksmedlemmer (trin 3.6-3.7). Begge problemer kan registreres. Bibliotekets kvalitet skal kontrolleres, før der vælges, ved at sekventere så mange kloner som muligt (>15) eller ved direkte sekvensering af biblioteket ved høj gennemløbsrækkefølge (trin 3.10, tabel 3). Hvis et flertal af de valgte kloner ikke er aktive, er dette en klar indikation af svigt af valget af streptavidin-fangst. En lignende effekt er observeret i tilfælde af biblioteker, der gennemgår mange udvælgelse cykler, fordi sådanne biblioteker er sandsynligvis domineret af inaktive varianter, der undslap streptavidin fange udvælgelse trin (Figur 8B). Derfor er det tilrådeligt at køre screening efter hver udvælgelsecyklus og videreudvikle manuelt udvalgte lovende varianter i stedet for at afhænge af udvælgelsesiteration.

Figur 1: In vitro-valg af en ny sekvensspecificitet baseret på NlaIV-teknik. (A) Organiseringen af udtrykket / udvælgelse kassette (ESC) omfatter to anerkendelse steder for REase, 1) den valgte sekvens (GGATCC) tæt på højre ende og 2) tælleren valgte sekvens (GGSSCC) tæt på venstre ende, samt T7p og T7t-T7 promotor og T7 terminator. De primer binding steder er vist nedenfor. Spaltning efter vild type og udvalgte NlaIV varianter er vist som henholdsvis røde og grønne trekanter. bB) Udvælgelsestrin: I) Emulgering af reaktionsblandinger af transskription-oversættelse og kavalergang med ESC-biblioteket II) Alle biotinylated DNA er fanget på magnetiske partikler belagt med streptavidin og fjernet, og dermed fjerne kodning inaktive varianter; III) Escs kodning REases med vilde type aktivitet (dvs. dem i stand til at kløve GGSSCC sekvens) er elimineret, fordi spaltning af sekvensen adskiller bindende steder for de forreste og omvendte primere. Der forekommer derfor ingen forstærkning af disse e-pc'er. IV) Input til den næste udvælgelsesrunde skabes ved tilsætning af biotin i højre ende og genindførelse af variation af de valgte tællersekvenser i venstre ende. Genoptrykt fra Czapinska et al.⁸ med tilladelse fra Elsevier. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: Forberedelse af ØSU. Fragment, der er afledt af den oprindelige konstruktion i en udtryksvektor, der indeholder NlaIV ORF under T7-promotors kontrol, blev ændret, så det er egnet til udtryk/udvælgelse. NlaIV-anlægget nedstrøms fra NlaIV ORF blev fjernet, og unikke steder (SalI, EcoRI og Eco52I), der blev brugt til at mutagenisere udvalgte positioner, blev indført i NlaIV ORF som tavse mutationer. Den endelige konstruktion blev forstærket med flankerende primere, der introducerede to flankerende NlaIV steder: Tælleren valgte sekvens (GGSSCC) til venstre og valgte sekvens (GGATCC) til højre. Den omvendte primer også indført biotin. Primere, der anvendes til oprettelse af muteret ECS, vises som blå pile og mærket nedenfor (se tabel 1B,C). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3: Ordning for opdeling og blandingssyntese. Eksemplet henviser til MutB-syntese, hvor en NNS-sekvens blev introduceret med 0,8 frekvens ved fire positioner (se også tabel 3). Bemærk, at den kemiske syntese udføres fra 3' til 5', men alle sekvenser er vist i kanonisk 5'-3'-retning (dvs. den stammer fra højre mod venstre i denne ordning). Wild type sekvenser på mutageniserede positioner er vist med grønt, mens NNS mutagene sekvenser er i rødt. Sali-genkendelseswebstedet, der senere bruges til at indføre mutationer i eCC'er, understreges. Punkter for blanding og opdeling trin (2 og 4) er angivet. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4: Anvendelse af unikke restriktionsenzymsteder i oligonukleotid målrettet mutagenese. Strategien for mutationsintroduktion er vist på et eksempel på opførelsen af biblioteker A-C (se trin 3.1-3.7). Genoptrykt fra Czapinska et al.⁸ med tilladelse fra Elsevier. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5: Endonucleolytisk spaltning i in vitro transskription-oversættelse. (A) Spaltning af et testsubstrat i optimal REase buffer: 1) Substrat, 612 bp PCR produkt med en enkelt NlaIV anerkendelse site; 2) Spaltningsprodukter, 355 bp og 257 bp. (B) Spaltning i en in vitro transskriptionsoversættelsesreaktion (indeholdende 0,5 μg ESC): 1-2) 15 μL aliquots af in vitro transskriptionsoversættelse uden substrat (linje 2: reaktion suppleret med 1,5 mM MgCl_2); 3-4) 15 μL aliquots af in vitro transskriptionsoversættelse med 1 μg testsubstrat (linje 4: reaktion suppleret med 1,5 mM MgCl₂). S-DNA størrelse markør (pBR322 fordøjet med MspI). Prøver blev løst i 6% indfødte SIDE. DNA blev plettet med ethidium bromid. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 6: Produkter af den første PCR i udvælgelsescyklussen. Se figur 1B, trin III; protokoltrin 5.10. Kolonnesæt 1 og 2 er aliquots af to forskellige biblioteker indlæst i tre eksemplarer. S-DNA størrelse standard (lambda DNA fordøjet med HindIII og EcoRI). Pilen angiver placeringen af ESC i fuld længde (1.050 bp). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 7: NlaIV varianter renset for yderligere screening i mini skala. Se trin 6.3.11. Hver linje indeholder en 10 μL aliquot af en anden variant. S-protein molekylvægt standard. Molekylmassen af NaIV REase-underenheden er 29,9 kDa. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 8: Eksempler på screening af NlaIV-varianter for sekvensspecificitetsændring. Se trin 6.4.2. (A) Vellykket screening med høj frekvens af lovende varianter. S = DNA størrelse markør, lambda DNA kløvet med HindIII og EcoRI; vild type (wt) = lambda DNA kløvet med vild type NlaIV λ = lambda DNA-substrat, ikke kløvet andre kolonner=varianter med meget lav aktivitet. Varianter er mærket ! = lovende varianter, der producerer et spaltningsmønster, der adskiller sig fra det vilde typeenzym; ? = varianter, der også kan have ændret sekvenspræferencen. (B) Mislykket screening, med et flertal af varianter inaktive og en variant med tilsyneladende uændret spaltning mønster. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 9: Alternativ valg ved ligation. Dette alternativ kan bruges til alle REases generere klæbrige ender. Her præsenterer vi et eksempel protokol for en udvælgelse ordning for MwoI enzym (ikke offentliggjort). I) Valgt sekvens (placeret i højre ende af ESC) med definerede restkoncentrationer vist med rødt og udvalgt variation af den cognate sekvens vist med blåt. I parentes under den tæller vises den valgte sekvens, der skal placeres i venstre ende af ESC. II) Produkt af MwoI spaltning; III) Efter afslutning in vitro transskription / oversættelse, er produkter renset og ligation udføres med overskydende adapter. Kun spaltningsprodukter, der blev kløvet i den valgte sekvens, kan deltage i ligation. Derfor elimineres inaktive varianter, og rullegardintrinnet er unødvendigt. Spaltningsproduktet i den valgte tællersekvens (i venstre ende af ØSU, som ikke er vist) kan ikke deltage i denne ligation, fordi den fremspringende ende af adapteren ikke supplerer den valgte tæller. IV) Selektiv PCR bruger den samme strategi som i hovedprotokollen til at eliminere varianter med den vilde type degenererede sekvens specificitet (F1 primer binding distalt til tælleren valgte websted), mens inaktive varianter elimineres af den selektive omvendt primer, der ikke kan binde sig til onkel (og derfor ikke ændret ved adapter ligation) højre ende. I den næste cyklus kan processen gentages ved hjælp af adapter, der er identisk med spaltningsproduktet af det foregående trin (dvs. "kløvet kassette" i panel III) og en passende selektiv omvendt primer. Klik her for at se en større version af dette tal.

Tabel 1: Primere, der anvendes i NlaIV-teknik. Sekvenser af de begrænsningswebsteder, der er nævnt i kommentarerne, understreges. Små bogstaver angiver sekvenser, der ikke har komplementer i DNA-skabelonerne. Klik her for at se denne tabel (Højreklik for at downloade).

Tabel 2: Betingelser for PCR-reaktioner, der skal anvendes i protokollen. T_m = smeltetemperatur for primer (hvis T_m er forskellig for primerne, skal den nederste T_m anvendes). Klik her for at se denne tabel (Højreklik for at downloade).

Tabel 3: Resultater af kvalitetskontrol af to mutagene primere syntetiseret med split-and-mix strategi. Mutageniserede codons er angivet med [XXX]. Et lavere indekstal angiver placeringen af en kodet aminosyre. Tilpasset fra Czapinska et al.⁸ med tilladelse fra Elsevier. Klik her for at se denne tabel (Højreklik for at downloade).

Tabel 4: Resultater af EP-PCR. Hovedparametre udledt af sekvensanalyse af 22 kloner af ECS. Klik her for at se denne tabel (Højreklik for at downloade).

Discussion

Den udvælgelsesprotokol, der er beskrevet her, blev testet for NlaIV⁸, en dimeric PD-(D/E)XK-foldegenkendelsessekvens, der genkender et palindromisk målsted med centrale NN-baser og katalyserer et stumpt endesnit mellem NN-baserne. NlaIV blev plukket, fordi spaltning mellem NN baser tyder på, at disse baser er tæt på proteinet i komplekset. I princippet kan protokollen anvendes til enhver sekvensspecifik begrænsning endonuclease, monomerisk eller dimeric, af enhver fold gruppe, katalysere dobbelt streng pauser af enhver vakle, uanset om katalytiske og specificitet domæner falder sammen (som i NlaIV eksempel) eller er separate (f.eks FokI). Desuden er protokollen i princippet nyttig ikke kun for generering af nye, mere snævre enzym specificitet, men kan også bruges til at fjerne stjerne aktiviteter, eller at skabe high fidelity endonucleases. Men alt dette er ikke blevet testet endnu. Især kan målrettet eliminering af stjerneaktivitet være kompliceret, fordi de samme aminosyrerester kan være involveret i binding til de ønskede og uønskede baser. De in vitro-trin, der er beskrevet i denne protokol, er ikke begrænset til udvælgelsen af indsnævrede særtræk, men kan også bruges til at vælge ellers ændrede specificiteter. Men der er så et problem med variant endonucleases: hvis spektret af substrater omfatter nye mål ikke kløvet af forældrenes endonuclease, er der generelt ingen god måde at beskytte celler mod de skadelige virkninger af denne aktivitet. Hvis endonuclease-specificiteten derimod kun indsnævres, er målene en delmængde af wild type-målene, og derfor bør det allerede tilgængelige cognate methyltransferase være fuldt beskyttende.

Vores protokol adskiller sig i flere henseender fra mange styrede evolutionsprotokoller. Åben læseramme mangfoldighed genereres én gang i begyndelsen af eksperimentet, ikke i hver iteration. Desuden er det skabt ved split-and-mix syntese, snarere end af EP-PCR. For NNS udskiftninger af codons, som anvendes i dette arbejde, er der (4 x 4 x 2)⁶ ~ 1,07 x 10⁹ kombinationer for seks positioner. Derfor er en given variant til stede i gennemsnit en gang i 1,7 fmoles af ESC. Denne kapacitet kan øges til syv positioner ved hjælp af syntese med en blanding af 20 trinucleotid prækursorer, der tilbydes af Glen Research eller ved faldende mutationfrekvens i mindre lovende positioner med split-and-mix oligonukleotid syntese. Hvis det er muligt, anbefales det at begrænse omfanget af variation til seks positioner. Det er klart, at en sådan mutagenese målretning kræver en vis allerede eksisterende viden om i det mindste de regioner i REase involveret i substrat bindende. Split-and-mix-protokollen for at skabe mangfoldighed har klare fordele i forhold til EP-PCR. Ved hjælp af EP-PCR opnåede vi uændrede varianter og sekvenser, der medfører otte erstatninger for NlaIV ESCs i samme EP-PCR (tabel 4). Biblioteket fra EP-PCR indeholder en betydelig brøkdel af kloner, der bør undgås (vilde type sekvenser, flere udskiftninger, frameshift og nonsens mutationer, og mutationer på steder, der sandsynligvis ikke vil påvirke sekvens specificitet).

Vores protokol adskiller sig også fra mange andre styrede evolutionsprotokoller ved tilstedeværelsen af to sekventielle udvælgelsestrin. Positiv udvælgelse sikrer, at den ønskede aktivitet bevares, ellers fjernes biotinmærket ikke, og kodningssekvensen kan fjernes ved pull-down. Det er teknisk muligt, at den tilfældige fremkomst af en ny, ikke-overlappende specificitet (f.eks. Dette bør dog være højst usandsynligt. Negativ udvælgelse fjerner åbne læserammer, der koder for enzymer, der stadig har den uønskede aktivitet. Dette trin er ikke strengt obligatorisk, fordi protokollen stadig vil berige outputbiblioteket med varianter, der er i stand til at kløve udvælgelsessekvensen, men ikke er i stand til at kløve andre steder i ØSU, hvilket gør det uegnet til PCR-forstærkning. Udvælgelseseffektiviteten forventes dog at være lavere, fordi enzymer med den oprindelige sekvensspecificitet ikke vil blive fjernet fra outputtet og vil udkonkurrere lovende varianter med ændret specificitet, men også nedsat enzymatisk aktivitet. Bemærk, at på befolkningsniveau, både ønskede og uønskede mål sekvenser kan, men behøver ikke at være, degenerere. I NlaIV-eksemplet var antimålet degenereret, og målet var ikke-degenereret. Selv når der er degeneracy på befolkningsniveau, i en enkelt dråbe kun én (ikke-degenereret) mål eller anti-target er til stede. I vores protokol genindsættes mål- og antimålsekvenser ved hver gentagelse af udvælgelsestrinnene. Derfor skal en åben læseramme indkode et enzym, der kan kløve alle mulige mål, og ude af stand til at kløve nogen af antimålene, for at overleve flere udvælgelsesrunder. Bemærk, at behovet for at genindføre antiselection-målet ved hver gentagelse af protokollen håndhæver to sekventielle PCR'er. Den første PCR bruger en primer, der anneals uden for anti-målet, således at spaltning af anti-målet forhindrer PCR reaktion. Den anden PCR kræver en primer, der rækker ud over anti-målet, og genindfører anti-mål, for at sikre, at under flere runder af udvælgelse, hver åben læseramme er testet mod alle varianter af anti-target.

For enzymer, der genererer klæbrige ender, kan der anvendes en relateret alternativ protokol baseret på en tidligere beskrevet metode til isolering af REase ORF^10. Udtømningen af inaktive varianter ved biotinindfangst, der anvendes i vores eksperimenter, erstattes i den alternative protokol ved at gøre den kompatible adapter med en sekvens, der bruges som primerbindingssted i en selektiv PCR (figur 9). Kun økonomiske og økonomiske og økonomiske og økonomiske og økonomiske og økonomiske og økonomiske og økonomiske og økonomiske og økonomiske og økonomiske og økonomiske og økonomiske og økonomiske og økonomiske og økonomiske Sekvensen af den klistrede ende af den afvalgte tæller skal være konstrueret således, at den ikke kan deltage i ligation med adaptere. Iteration af udvælgelsesprocessen kan nemt opnås ved at skifte mellem to forskellige adaptere og dermed to forskellige omvendte primere i selektiv PCR.

Selv med nye protokoller, opgaven med engineering nye særlige forhold in vitro er stadig meget udfordrende. For typiske type II REases afhænger sekvensspecificitet og endonukleolytisk aktivitet af de samme proteinområder. Det er derfor vanskeligt at ændre det ene uden at påvirke det andet. Succes er gjort mere sandsynligt ved en strategi, der tager hensyn til fodaftryk af enzymet, respekterer symmetrien i protein-DNA interaktioner, og bygger på allerede eksisterende enzymatiske præferencer, som bør bestemmes på forhånd i biokemiske eksperimenter, som det blev gjort for NlaIV eksempel⁸.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1000Å CPG Support (dA, dT, dC, dG)	Biosset	45-1000-050	Other vendors can be used as well
ASM-800 DNA/RNA	Biosset	800-001-000
GeneJET Gel Extraction Kit	Thermo Scientific	K0691	Any other kit can be used
Glen-Pak DNA purification cartridge	Glen Research	60-5200
HIS-Select Nickel Affinity Gel	Sigma	P6611
pET 28a vector			Any other vector with T7 promoter upstream of plycloning site can be used instead
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	Thermo Scientific	F530S	Any other high fidelity and highly processive thermophilic polymearse can be used instead
Porous steel foil	Biosset	40-063
Rapid Translation System RTS 100, E.coli HY Kit	Roche	3 186 148
Restriction endonucleases	Thermo Scientific		Obviously other vendors, enzymes can be used
Streptavidin Magnetic Beads	New England Biolabs	S1420S	Other vendors can be used as well. We have positively tested beds form Sigma
Synthesis chemicals including phosphoramidities	Carl Roth		Other vendors can be used as well
Synthesis columns (different sizes)	Biosset
T4 DNA ligase	Thermo Scientific	EL0011	Any other ligase can be used