In Vitro Riktad Evolution av en begränsning Endonuclease med strängare specificitet

Summary

Begränsning endonucleases med nytt ordnar specificitet kan framkallas från enzym som känner igen ett delvist degenererat ordnar. Här tillhandahåller vi ett detaljerat protokoll som vi framgångsrikt använde för att ändra sekvenss specificitet nlaIV enzym. Viktiga ingredienser i protokollet är in vitro-uppdelning av transkriptions-/översättningsreaktionen och valet av varianter med nya sekvenssub specificiteter.

Abstract

Begränsning endonuclease (REase) specificitet teknik är extremt svårt. Här beskriver vi ett flerstegsprotokoll som hjälper till att producera REase-varianter som har strängare specificitet än föräldraenzymet. Protokollet kräver att ett bibliotek med uttrycksvalskassetter (ESCs) skapas för varianter av REase, helst med variationer i positioner som kan påverka DNA-bindning. ESK flankeras på ena sidan av en sekvens för den önskade begränsningsplatsens aktivitet och en biotintagg och på andra sidan av en begränsningsplats för oönskad aktivitet och en grundsatsglödplats. ESCs transkriberas och översätts i en vatten-i-olja emulsion, under förhållanden som gör förekomsten av mer än en DNA-molekyl per droppe osannolikt. Därför utsätts DNA i varje kassettmolekyl endast för aktiviteten hos det översatta, kodade enzymet. REase varianter av önskad specificitet ta bort biotin taggen men inte primer glödgning webbplats. Efter att ha brutit emulsionen utsätts DNA-molekylerna för en biotin pulldown, och endast de i supernatanten behålls. Det här steget säkerställer att endast ESC för varianter som inte har förlorat önskad aktivitet behålls. Dessa DNA-molekyler utsätts sedan för en första PCR-reaktion. Klyvning i den oönskade sekvensen skär av primerbindningsstället för en av grundfärgerna. Därför förstärkare PCR endast ESCs från droppar utan oönskad aktivitet. En andra PCR-reaktion utförs sedan för att återinföra begränsningsplatsen för önskad specificitet och biotintaggen, så att urvalssteget kan upprepas. Valda öppna läsramar kan överuttryckas i bakterieceller som också uttrycker cognate metyltransferas av föräldrarnas REase, eftersom den nyligen utvecklade REase riktar endast en delmängd av metyltransferas målplatser.

Introduction

Sekvens specificitetsteknik är extremt utmanande för klass II REases. I denna klass av endonucleases, sekvens erkännande och katalys är nära sammanflätade, troligen som en evolutionär skydd mot skapandet av en endonuclease av bredare specificitet än dess konjak metyltransferas, vilket skulle skada värd DNA. Riktad utveckling av nya särdrag i celler kompliceras ytterligare av behovet av att skydda värd-DNA mot den nykonstruerade endonucleaseaktiviteten. Därför finns det bara ett fåtal framgångsrika försök av REase teknik rapporterade och alla av dem utnyttja de unika egenskaperna hos ett visst enzym^{1,2,3,4,5,6,7}.

Här tillhandahåller vi ett detaljerat protokoll för specificitetsteknik som kan användas för att generera endonuclease varianter som har smalare specificitet än ett föräldraenzym som bygger på vår framgångsrika teknik för en NlaIV endonuclease⁸. För ett sådant enzym med en godtycklig igenkänningssekvens kan extra specificitet införas för baser i flankerna. För föräldraenzymer som känner igen delvis degenererade sekvenser (såsom NlaIV med sitt GGNNCC-mål), kan ytterligare specificitet också införas inom igenkänningssekvensen. Eftersom extra specificitet sannolikt kommer att kräva protein-DNA-kontakter, bör de nyligen erkända baserna ligga inom fotavtryck av föräldrarnas endonuclease på DNA. I princip kan urvalsscheman ställas in för önskad specialisering av igenkänningssekvensen. Men de flesta REases som känner igen palindromic och nästan palindromic målsekvenser är funktionella dimers som känner igen endast en halv-plats av palindrorome. Därför är det osannolikt att valet av nya specificiteter som bryter mot symmetrin hos proteinkärna interaktioner kommer att fungera. För dimeric NlaIV, till exempel, ggnncc-sekvensen kan teoretiskt begränsas till GGATCC men att minska specificiteten ner till GGAACC förväntas bli svårare. Vårt system innebär både positivt och negativt urval.

Processen är effektivare när negativt urval också används för att ta bort de särdrag som kan klyva alla sekvenser än den föredragna smalare specificiteten. Val för GGATCC kan till exempel kombineras med antiselection mot GGBVCC (där B är någon annan bas än A och V är någon annan bas än T). När några av de möjliga målsekvenserna inte täcks beror resultatet av urvalsexperimentet på effektiviteten av ett positivt och negativt urval. I vårt NlaIV-arbete valde vi för GGATCC, och mot GGSSCC (där S är G eller C), och fick en specificitet som, ignorera symmetri bryta mål, kan beskrivas som GGWWCC (där W är A eller T), vilket tyder på att i detta fall, negativt urval var mer viktigt än positivt urval.

Vår strategi börjar med att skapa en uttrycksvalskassett (ESC). ESK är uppbyggd i sektioner. På insidan av kärnan avsnitt finns varianter av den öppna avläsningsramen (ORF) av REase, under T7 promotorn kontroll. Den här kärndelen av ESC kan inte innehålla någon cognate-plats för den konstruerade REase. Kärnan är inklämd mellan två cognate platser för vild typ REase: en klyvning plats för oönskad aktivitet (counter vald sekvens, GGSSCC i detta exempel) och en klyvning plats för önskad aktivitet (vald sekvens, GGATCC i exemplet). Det sista steget i beredningen av ESC i PCR lägger till biotin nära önskad aktivitet vid 5's och skapar en mängd olika counter valda sekvenser (GGSSCC i exemplet). Urvalsstrategin bygger på användning av noggrant utformade grundfärger vid ESC:s omförstärkningsprotokoll efter ett in vitro-protokoll för transkription/översättning/urval (figur 1A). Esc-biblioteket uttrycks i en in vitro-uppdelad transkriptionsöversättning vatten-i-olja emulsion^9,,10,11. Inom varje droppe påverkar det uttryckta enzymets specificitet ESK:s tillstånd (figur 1B, steg I). För det beskrivna arrangemanget tar den önskade klyvningsaktiviteten hos det översatta proteinet bort DNA:s biotintagg men påverkar inte den andra ESC-änden med den valda räknarsekvensen. När emulsionen bryts avlägsnas biotinylerade fragment genom streptavidin affinitets pulldown, så att endast fragment från droppar med önskad aktivitet kvarstår (figur 1B, steg II). Det här steget tar bort inaktiva REase-varianter. Den supernatant fraktionen av pull-down-steget förstärks sedan av PCR. I de första PCR-reaktionsprimrarna används F2 och R1 (figur 1A, B, steg III). Primer F2 binder till ESC-sektionen mellan den valda räknarsekvensen och molekyländen. Därför förstärks inte ESCs som uttrycker varianter som kan klyva den valda räknarsekvensen (och därför separera bindningsställena för grundfärgerna F2 och R1 i två olika DNA-molekyler) och tas därmed bort från biblioteket. Primern R1 binder mellan den valda platsen och kärnan i ESC så att den inte påverkas av klyvningsstatusen för det valda området och återställer klyvningsplatsen för önskad aktivitet (GGATCC). Cykeln stängs av en andra PCR (med grundfärger F1 och R2) som lägger till biotin i 5'-änden nära den valda platsen och återställer den utformade variationen vid den disk valda platsen nära den motsatta änden av ESC(figur 1B, steg IV). Den resulterande DNA-blandningen är klar för en ny urvalsrunda.

Framgången för urvalsprotokollet beror starkt på det korrekta valet av den nya, strängare måligenkänningssekvensen och på noggrann utformning av mutagenesis-strategin och dess effektiva genomförande. Eftersom det är mycket lättare att förbättra på små befintliga preferenser REase än att övervinna dem, rekommenderar vi att börja med en kinetisk studie av eventuella befintliga preferenser. Nödvändigheten av noggrann mutagenesis design resultat från den begränsade storleken på en mutant bibliotek som kan behandlas av det presenterade protokollet (10⁹ kloner i ett enda experiment). Därför kan alla 20 möjliga aminosyrasubstitutioner testas effektivt i endast ett fåtal positioner (se Diskussion). Slumpmässig mutagenesis, såsom felbenägna PCR (EP-PCR) presenteras som en alternativ metod, kommer att leda till djupgående undersampling av befintliga komplexitet. Om någon information om potentiella aminosyra positioner som deltar i kontakter med DNA (eller ens ligger i närheten av degenererade nukleotider i en cognate sekvens) är tillgänglig, det säkert bör användas för att välja några aminosyror för oligonukleotid guidad mättnad mutagenesis (protokoll steg 1.6-3.10).

Protocol

1. Beredning av de ESC

1. Klona metyltransferas av det begränsningsmodifieringssystem som ska konstrueras i ett lågt kopieringsnummer plasmid (t.ex. pACYC184 eller pACYC174 eller deras derivat).
   OBS: Bakterievärdens stam måste kunna tolerera metylering som introduceras av det klonade enzymet och ge inducibel uttryck för T7 RNA-polymeras. Användning av ER2566-stammen (som transporterar McrA-, McrBC- och Mrr-mutationer) rekommenderas.
2. Bekräfta att det rekombinanta plasmid-DNA:t skyddas mot klyvning av konjaksdonuklease genom behandling av 0,5 μg plasmid-DNA med 10 enheter cognate REase i buffert och temperatur som rekommenderas av enzymleverantören för 2 h.
3. Förbered kompetenta celler av denna stam.
   OBS: Vilken metod som helst kan användas. Det tekniska projektet NlaIV använde en enkel kalciumkloridmetod¹².
4. Konstruera rekombinant plasmid med ORF för REase under kontroll av T7-promotorn från en annan undantagsgrupp och med en annan urvalsmarkör än den som innehåller metyltrasferasgenen i steg 1.1. Vektorer pET28 och pET30 kan användas.
5. Avlägsna alla igenkänningsplatser för det konstruerade enzymet från den del av rekombinanta plasmid mellan T7-promotorn och stoppkodonet av enzymet ORF genom att införa tysta mutationer (figur 2, tabell 1A).
   OBS: Om mer än ett sådant ställe måste tas bort, kommer flera mutationsrundor att vara nödvändiga (steg 1.5.1–1.5.7).
   1. Använd en utvändig PCR-reaktion som förstärker fullängdsplasman med utformade variationer som introduceras vid 5'-ändarna av grundfärgerna (tabell 2A).
   2. Ta bort mall-DNA:t genom att tillsätta 10 U dpnI-endonuclease till PCR-reaktionens 50 μl och inkubera i 2 timmar vid 37 °C.
   3. Lös produkterna genom agarose gel elektrofores. Klipp ut bandet som motsvarar fullängdsplasman och rena det med ett kommersiellt kit.
   4. Tillsätt 10x ligering buffert (till en 1x koncentration) och komplettera med ATP (till 1 mM). Tillsätt 10 U av T4 polynukleotidkinas och inkubera i 20 min vid 37 °C. Inaktivera enzymet genom uppvärmning vid 70 °C i 10 min.
   5. Tillsätt PEG 4000 till 5%, komplettera igen med ATP (till 1 mM), och tillsätt 5 U av T4 DNA-ligase. Inkubera i 2 timmar vid rumstemperatur (RT).
   6. Förvandlas till en kompetent bakteriestam som transporterar konjakmetmetyltransferas (steg 1.1).
   7. Isolera plasmid DNA i liten skala och bekräfta införandet av sekvensförändringar genom dideoxy sekvensering.
6. Införa unika begränsningsplatser nära den eller de sekvenser som omfattas av oligonukleotidstyrd mutagenesis (figur 2, tabell 1B). Följ steg 1.5.1–1.5.7 för varje plats.
   OBS: Detta steg utförs endast när en riktad mutagenesis används. Om du gör slumpmässig mutagenesis, hoppa över steg 2-3 och gå vidare till avsnitt 3 istället. I det presenterade exemplet introducerades alla platser uppströms de berörda regionerna, men de kan också införas nedströms.
7. Designprimer för förstärkning av ESC (tabell 1C).
   1. Utforma en omvänd primerbindning nedströms endonuclease ORF som kommer att introducera den valda igenkänningsplatsen (R1) och dess kortare version (R2) som binder utanför den valda NlaIV-sekvensen och innehåller biotin vid 5'-änden (se figur 1).
   2. Utforma en framåt primer (F1) bindning till ESC uppströms T7 promotorn. Denna primer bör också införa räknare valda varianter av den ursprungliga igenkänningssekvensen (dvs. den maximala sekvensvariationer som känns igen av det ursprungliga enzymet med undantag för den valda omvända sekvensen).
      OBS: En kortare version av denna primer (F2) som täcker sekvensen distala till counterselected sekvens kommer att användas senare i selektiv PCR (steg 5.9).

2. Split-and-mix Syntes av mutagena primers

OBS: Det här steget används endast för projekt som kräver subsaturation mutagenesis på mer än en plats. En synthesizer med flera synteskolumner krävs. Tilldela kolumner för syntes av randomiserade NNS kododont trillingar och vilda typ kodon trillingar enligt mutagenesis frekvenser. Om till exempel sju kolumner med samma volymsyntes finns tillgängliga och en mutageneshastighet på 0,3 är önskvärd på en viss plats, lägger du till randomiserade NNS-kodon i ~0,3 x 7 eller två kolumner och kodon av vild typ i ~0,7 x 7 eller fem kolumner (figur 3).

1. Bestäm om platser för subsaturation mutagenesis. Välj mutagenesis frekvenser enligt den hypotetiska betydelsen av platserna (dvs. desto viktigare platsen, desto högre frekvens), hålla gränser för det övergripande biblioteket komplexitet i åtanke (se Diskussion).
2. Syntetisera oligonukleotider i alla kolumner, upp till triplet omedelbart före den andra subsaturation mutagenesis plats räknar från 3'-end. Ta inte bort 5'-tritylskyddande gruppen vid den sista syntescykeln (använd alternativet trityl-on på synthesizern). Skyddsgruppen kommer att tas bort i början av nästa syntescykel (steg 1 i figur 3).
3. Öppna synteskolumnerna. Samla kontrollerat porglas (CPG) syntesstöd i ett torrt 1,5 ml-rör och blanda genom att virvla. Partitionera om den blandade CPG-hartsen i nya synteskolumner. Undvik att införa fukt, eftersom det kommer att minska den totala avkastningen (steg 2 och 4 i figur 3).
4. Fortsätt syntes, med början från subsaturation mutagenesis webbplats triplet. Tilldela kolumner till randomiserade NNS trillingar eller vilda trillingar typ enligt önskad mutagenesis frekvens (se anmärkning ovan). Om ytterligare subsaturation platser är närvarande, fortsätt endast till tripletten före nästa subsaturation mutagenesis webbplats. Återigen, lämna en 5'-trityl grupp på i slutet (5'-trityl-on alternativ på synthesizer) (steg 3 i figur 3). Fortsätt sedan med steg 2.3.
5. Om det inte finns några fler undermätningsplatser nedströms, slutför syntesen och lämnar en 5'-tritylgrupp i slutet (5'-trityl-on-alternativ på synthesizern) (steg 5 i figur 3).
6. Deprotect och rena oligonukleotidbiblioteket enligt reningspatronstillverkarens anvisningar.
   OBS: Oligonukleotider som frigörs genom deprotektion från CPG kan också renas i omvänd fas högpresterande vätskekromatografi (HPLC) med trityl-on följt av en manuell tritylgruppborttagning (1 h behandling med 80% ättiksyra vid RT) och en andra HPLC-rening.
7. Kontrollera oligonukleotidbibliotekets kvalitet i en urea-PAGE gel.

3. Generera variantbibliotek

OBS: Använd rekombinant plasmid från steg 1.6.

1. Generera biblioteken genom oligonukleotid riktad mutagenesis.
   Obs!
   1. Förstärk ett avsnitt från T7-promotorn till det unika begränsningsenzymstället som flankerar den sekvens som är riktad med mutagenesis (vid NlaIV: SalI, EcoRI eller Eco52I) (tabell 1B-C, tabell 2B, figur 4). Förstärk den andra delen från den unika begränsningsenzymplatsen till 3'-änden av ESK.
   2. Blanda separat 5 μL av PCR-reaktionerna (från steg 3.1.1) med 8 μl vatten, 1,5 μl 10x begränsningsenzymbuffert och 5 enheter av lämpliga restriktionsenzymer (SalI, EcoRI eller Eco52I) och inkubera vid lämplig temperatur i 2 timmar.
   3. Lös produkterna från båda reaktionerna med agarose gel elektrofores. Klipp ut de förväntade storleksbanden och rena med ett kommersiellt kit.
   4. Kör upp till 1/3 av de renade produkterna i en agarosgel och mät koncentrationen av varje renat band med densitometri.
   5. Ställ in ligering av två delar av ESC i en 1:1 molar förhållande med 1x ligase buffert och 1 U av T4 DNA-ligase och inkubera för 2 h på RT.
   6. Lös reaktionsprodukterna i agarosgelen. Klipp ut de förväntade storleksprodukterna och rena med ett kommersiellt kit.
   7. Förstärk de renade ligeringsprodukterna i en PCR-reaktion med grundfärgerna F1 och R2(tabell 1C och tabell 2A). Kör inte mer än 20 förstärkningscykler.
   8. Fraktionera PCR-reaktionerna i en agarose gel. Klipp ut produkterna och rena med ett kommersiellt kit.
   9. Kör en 5 μL alikvot av det renade biblioteket från föregående steg i agarosgelen och mät koncentrationen genom densitometri.
   10. Klona ett litet prov av biblioteket (upp till 5 μL) och sekvens >15 kloner för att kontrollera mutationsfrekvensen och fördelningen (tabell 3). Fortsätt till steg 4.
       OBS: Alternativt kan hög genomströmningssekvensering av det lilla provet av ESC användas.
2. Utför EP-PCR.
   1. Förstärk ESK från plasmid erhålls i steg 1.5.7 med primers F1 och R1. Kör 20 cykler med Taq I-polymeras (tabell 1B).
   2. Gel renar PCR-produkten.
   3. Ställ in EP-PCR med 2 ng av renade PCR-produkter från föregående steg och kör 15 cykler av EP-PCR(Tabell 1C)med F1- och R1-grundfärger.
   4. Gel rena produkten och kvantifiera den genom gel densitometri.
      OBS: På grund av den låga koncentrationen av den renade EP-PCR-produkten använd ca 1/3 för kvantifiering.
   5. Klona ett litet prov av biblioteket (upp till 1/5) och sekvens >15 kloner för att kontrollera mutationsfrekvens och fördelning (tabell 4).
      OBS: Alternativt kan du utföra sekvensering med hög genomströmning av det lilla provet i ESC.Alternatively, perform high-throughput sequencing of the small sample of the ESCs.

4. Utföra uppdelad in vitro transkription-översättning Reaktion

1. Testa endonuclease uttryck och enzymatisk aktivitet i in vitro transkription-översättning.
   1. Förbered ett substrat (200–500 bp) med ett enda igenkänningsställe för endonuclease som ligger nära molekylens centrum så att klyvningsreaktionen lätt kan detekteras.
      OBS: Det enklaste sättet att förbereda substratet är genom PCR förstärkning av ett lämpligt fragment av någon DNA-molekyl. Substratet kan radiolabels eller fluorescerande märkas för att förenkla klyvning upptäckt.
   2. Ställ in 50 μL av en transkriptionsöversättningsreaktion med 0,5 μg av vild typ ESC enligt tillverkarens rekommendationer. Tillsätt magnesiumsalt (MgCl_2,MgSO₄och magnesiumacetat kan testas) till 1,5 mM och lämplig mängd substrat från föregående steg (minst 0,5 μg vid omärkt DNA).
      OBS: Alla transkriptions-/översättningssatser som inte innehåller nukleas som aktiveras av magnesium kan användas. Vissa kit leverantörer använder nukleaser för att ta bort DNA-kontaminering under produktionen och sedan lägga kelatorer som nukleashämmare. Sådana kit är inte kompatibla med denna metod.
   3. Inkubera transkriptionsöversättningsreaktionen enligt tillverkarens anvisningar. Överför sedan reaktionsblandningen till den optimala temperaturen för restriktionsenzymet i 2 h.
   4. Analysera klyvning av substratet i en agarosgel följt av lämplig detektion (t.ex. DNA-färgning, fluorescensvisualisering eller autoradiografi) (figur 5).
      OBS: Åtminstone partiell klyvning av substratet är nödvändigt innan du fortsätter med uppdelningen. Om detta inte uppnås, ytterligare optimering av magnesium kemisk form eller dess koncentration är nödvändig.
2. Förbered en olje-ytaktiv blandning genom att tillsätta 225 μL Span 80 och 25 μL Tween 80 till 5 ml mineralolja i ett koniskt rör på 15 ml. Blanda noggrant genom att försiktigt vända röret 15x.
3. För varje biblioteksöverföring 950 μL av olje-ytaktiva blandningen till en 2 ml rund botten kryogen injektionsflaska, etikett med ett biblioteksnamn, och överföring till is. Lägg en liten cylindrisk omrörningsstång (5 x 2 mm²) i varje injektionsflaska.
4. Förbered en in vitro-transkriptions-översättningsreaktionsblandning (50 μL för varje bibliotek) enligt tillverkarens förslag. Komplettera blandningen med magnesiumklorid till en slutlig koncentration på 1,5 mM (se steg 4.1.4).
5. Fördela 50 μL alikvoter i 1,5 ml-rör på is.
6. Tillsätt 1,7 fmole av biblioteket (från avsnitt 3) till reaktionsblandningen på is.
   OBS: Använd inte en högre mängd uttrycksbibliotek för urvalseffektivitet. Det är viktigt att minimera frekvensen av vattendroppar som innehåller mer än en DNA-molekyl.
7. Förbered vatten-i-olja emulsion i följd för varje bibliotek.
   1. Sätt en liten bägare (eller stor flaskkopp) fylld med is på en magnetisk omrörare med omrörningshastighet inställd på 1.150 rpm.
   2. Överför en kryogen injektionsflaska med 950 μL oljesysteri blandning och en liten omrörningsstång från steg 4.3 till en iskall bägare på magnetomröraren. Kontrollera att omrörningsstången snurrar.
   3. Tillsätt fem μl alikvoter av in vitro-biblioteket-transkriptions-översättning blandningen under en 2 min period i 30 s intervall och fortsätt omrörning i ytterligare en minut. Överför injektionsflaskan med emulsionen till en isbehållare. Fortsätt med nästa bibliotek som börjar med steg 4.7.2.
   4. När alla bibliotek bearbetas starta inkubationen av alla bibliotek enligt kit tillverkarens rekommendationer.
8. Överför injektionsflaskarna till den optimala temperaturen för den konstruerade endonuclease för ytterligare 2 timmar och lägg dem sedan på is i minst 10 minuter.

5. Fortsatt behandling av bibliotek och urval

1. Överför emulsionerna från kryogena injektionsflaskan till kalla 1,5 ml-rör, tillsätt 1 μl 0,5 M EDTA och centrifugera dem vid 13 000 x g i 5 min vid rumstemperatur.
2. Ta bort den övre oljefasen med en pipett. Om en oljevatteninterfas inte syns, inkubera röret i minst 5 minuter vid -20 °C för att frysa vattenfasen och rör omedelbart ut den flytande oljefasen.
3. Tillsätt 100 μL 10 mM Tris HCl pH 8.0 och utför omedelbart extraktion med 150 μl fenol:kloroform (1:1 v/v) genom kort virvelning följt av fasseparation med 30 centrifugering vid 13 000 x g. Samla den övre vattenfasen.
4. Fäll ut DNA genom att tillsätta 0,1 vol (15 μL) av 3 M natriumacetat (pH = 5,2), 2,5–5 μg glykogen och 2,5 volym (375 μL) etanol. Inkubera vid -20 °C i 1 h och centrifug i 15 min vid 13 000 x g, 4 °C. Kasta supernatanten och tvätta pelleten med 1 ml kall 70% etanol.
5. Torka DNA/glykogenpellet i speedvac eller lufttorka i >5 min.
6. Lös upp pelleten på 50 μL av 10 mM Tris-HCl (pH = 7,5). Tillsätt 5 μL streptavidin magnetiska pärlor beredda enligt tillverkarens anvisningar och blanda i 1 h vid RT, helst i en karusellblandare eller genom skonsam virvelning.
7. Separera pärlorna på ett magnetiskt stativ och samla vätskan berikad i DNA utan biotin.
8. Koncentrera DNA:t efter etanolnedfällning (steg 5.4–5.5).
9. Lös upp det koncentrerade DNA:t från föregående steg i 5 μl vatten och använd som mall i en PCR-reaktion med F2- och R1-grundfärger (tabell 1A).
   OBS: För att undvika problem med mallkontaminering och minimera PCR-artefakter använder Taq-polymeras (inte Pfu eller Phusion) och kör 18–20 cykler med förlängningstiden proportionell mot mallstorleken (1 kb = 1 min) (se tabell 2B).
10. Dela upp PCR-produkten i en agarosgel och skär ut den förväntade storleksprodukten. Vissa utstryk tyder på att det finns produkter av olika storlekar (se figur 6). Rena DNA från gelplattan med ett kommersiellt kit.
11. Kör en andra PCR-reaktion med upp till 50 ng DNA från steg 5.10 och primers F1 och R2 med samma protokoll som i steg 5.9. Fortsätt med produktrening enligt beskrivningen i 5.10. Renat DNA efter kvantifiering genom agaros gel densitometri (inte UV spektroskopi) kan användas i nästa omgång av in vitro-val (steg 4.6).

6. Skärmvarianter för förändrad sekvenss specificitet

1. Klona valda varianter.
   1. Smält produkten från steg 5.10 för 2 h med 10 U restriktionsenzymer som är lämpliga för kloning av ORF i uttrycksvektorn (för NlaIV: NcoI och XhoI) i den temperatur och buffert som rekommenderas av enzymleverantören. Lös produkterna med agaros gelelektrofores och isolera det förväntade storleksfragmentet.
   2. Förbered plasmidvektorn (t.ex. pET28) genom dubbel klyvning med samma enzymer som i steg 6.1.1 och gelrensa produkten med ett kommersiellt DNA-gelreningssats.
   3. Uppskatta koncentrationerna av vektor och infoga genom densitometri med agaros gel elektrofores.
   4. Ställ in en ligering med 1–5 U av T4 DNA-ligase och vektor:infoga molarförhållandet 1:3–1:5 i 1x ligasebuffert som rekommenderas av enzymleverantören. Inkubera i 2 timmar vid RT och föra in lämpliga värdbakterier (från steg 1.3) genom omvandling eller elektroporation¹².
   5. Välj extransformanter på LB-plattor som innehåller lämpligt antibiotikum (50 μg/ml kanamycin för pET28 eller pET30 vektorer) och 1% glukos.
2. Express proteinvarianter.
   1. Inokulera enstaka kolonier från omvandlingen (upp till 24 kloner kan enkelt bearbetas i en enda körning) till 2 ml LB med kanamycin (50 μg/ml) och 1% glukos och växa över natten vid 37 °C med skakning.
   2. Inokulera 15 ml varmt (37 °C) LB innehållande 100 μg kanamycin och inget glukos med 0,75 ml övernattningskultur och inkubera vid 37 °C med kraftig skakning.
      OBS: Antingen 50 ml centrifugrör eller 100 ml Erlenmayerkolvar kan användas.
   3. Tillsätt 176 μL glycerol till 1 ml nattkultur (slutlig koncentration av glycerol = 15%) blanda noggrant och frysa vid -70 °C.
   4. Efter 2–3 h tillägg 15 ml av kulturen (från steg 6.2.1) med IPTG till 1 mM och kultur för ytterligare 5 h.
   5. Samla upp bakteriepelleten genom centrifugering (10 000 x g,4 °C, 10 min) och frys vid -70 °C.
3. Rena proteinvarianterna.
   1. Överför 20 μl nickelaffinitethartsfjädring till 200 μL B1-buffert i ett 1,5 ml-rör med en bred rörledningsspets, blanda försiktigt och centrifug (5 000 x g,30 s, 4 °C). Ta bort supernatanten genom pipettering och lämna röret på is.
   2. Resuspend bakteriepellet från steg 6.2.5 i 300 μL B1 genom kraftig virvelring. Överför suspensionen till ett 1,5 ml-rör.
   3. Tillsätt 3 μL 100x proteashämmarecocktail och lyssomlösning i B1 (slutlig koncentration på 1 mg/ml). Sönderfalla cellerna genom ultraljudsbehandling med en spets utrustad sond. Använd sex 10 s skurar per prov med >15 s spetskyltid i is däremellan. Håll cellfjädring på is hela tiden.
   4. Pelletcellskräp genom centrifugering (2 min, 12 000 x g,4 °C) och överför 250 μL supernatant till harts alikvoten från steg 6.3.1.
   5. Blanda i 15 min i ett kallt rum, helst i en karusellblandare eller genom skonsam virvelning.
   6. Centrifug (5 000 x g,30 s, 4 °C) och aspirera supernatanten med en pipett.
   7. Tillsätt 500 μl W-buffert och sätt försiktigt tillbaka hartset. Centrifug (5 000 x g,30 s, 4 °C) och aspirera supernatanten med en pipett.
   8. Upprepa steg 6.3.7.
   9. Tillsätt 20 μl buffert E, sätt försiktigt tillbaka hartset och lämna provet på is i 2–5 min. Centrifug (5 000 x g,30 s, 4 °C) och samla upp supernatanten.
   10. Upprepa steg 6.3.9. Pool supernatants.
   11. Analysera proteinprover med SDS-PAGE (5–10 μL) (figur 7).
4. Skärm för varianter med den förändrade specificiteten.
   1. Analys klyvning aktivitet på bakteriofage lambda DNA. Proteinprovet kan utgöra upp till 10% av den slutliga reaktionsvolymen. Totalt 2 μl proteinprov per 0,5 μg DNA och 2 h reaktionstid är en bra utgångspunkt.
   2. Analysera reaktionsprodukterna genom agarose gel electrophoresis tillsammans med de produkter som genereras av vildtypsenzymet. Välj de kloner som genererar klyvningsmönster som tydligt kan skiljas från det som genereras av enzymet av vildtyp för vidare analys (figur 8).

Representative Results

Detta protokoll är bara ett verktyg för att öka frekvensen av önskade varianter av en konstruerad REase genom att tömma (men inte eliminera) två oönskade klasser: inaktiva enzymer och endonucleases med oförändrad vild typ sekvens specificitet. Å andra sidan, eftersom ändra REase specificitet är extremt svårt, att hitta även en sådan variant producerar en klyvning mönster som skiljer sig från den vilda typ enzym i en enda screening av 24 kloner bör betraktas som en framgång. I våra händer de bästa skärmarna kunde identifiera upp till 20% av lovande varianter (Figur 8A).

Det positiva resultatet beror i hög grad på bibliotekets kvalitet (dvs. begränsad frekvens av substitutioner och deras slumpmässiga spridning) och en effektiv fångst av biblioteksmedlemmarnas biotinylerade population (steg 3.6–3.7). Båda problemen kan upptäckas. Bibliotekets kvalitet bör kontrolleras före valet genom sekvensering av så många kloner som möjligt (>15) eller genom direkt sekvensering av biblioteket genom sekvensering av högt genomflöde (steg 3.10, tabell 3). Om en majoritet av de valda klonerna inte är aktiva är detta en tydlig indikation på fel på streptavidin-fångstvalet. En liknande effekt observeras när det gäller bibliotek som genomgår många urvalscykler, eftersom sådana bibliotek troligen domineras av inaktiva varianter som undgått streptavidin fånga urvalssteg (Figur 8B). Därför är det lämpligt att köra screening efter varje urvalscykel och vidareutveckla manuellt utvalda lovande varianter snarare än att vara beroende av urvalsiteration.

Figur 1: In vitro-urval av en ny sekvenssubsitet baserad på NlaIV-teknik. (A)Organisationen av uttrycket / val kassett (ESC) omfattar två erkännande platser för REase, 1) den valda sekvensen (GGATCC) nära den högra änden och 2) räknaren vald sekvens (GGSSCC) nära den vänstra änden, samt T7p och T7t-T7 promotorn och T7 terminator. Primerbindningsplatserna visas nedan. Klyvning av vild typ och valda NlaIV-varianter visas som röda respektive gröna trianglar. B)Urvalscykelsteg: I) Emulgering av transkriptions-översättning-klyvningsreaktion blandas med ESC-biblioteket. II) Allt biotinylerat DNA fångas upp på magnetiska partiklar belagda med streptavidin och avlägsnas, vilket avlägsnar kodning av inaktiva varianter. III) ESC-kodning REases med vild typ aktivitet (dvs. de som kan klyva GGSSCC sekvens) elimineras eftersom klyvning av sekvensen skiljer bindning platser för framåt och omvänd primers. Därför sker ingen förstärkning av dessa ekonomiska och ekonomiska och medelstora företag. IV) Indata för nästa urvalsrunda skapas genom tillägg av biotin i den högra änden och återinföra variationen av de räknare valda sekvenserna i den vänstra änden. Omtryckt från Czapinska et al.⁸ med tillstånd från Elsevier. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2: Förberedelse av ESK. Fragment som härrör från den ursprungliga konstruktionen i en uttrycksvektor som innehåller NlaIV ORF under kontroll av T7-promotorn ändrades för att vara lämplig för uttryck/urval. NlaIV-platsen nedströms från NlaIV ORF togs bort och unika platser (SalI, EcoRI och Eco52I) som användes för att mutagenisera utvalda positioner introducerades i NlaIV ORF som tysta mutationer. Den slutliga konstruktionen förstärktes med flankerande primers som introducerade två flankerande NlaIV-platser: Den räknare som valts sekvens (GGSSCC) till vänster och vald sekvens (GGATCC) till höger. Den omvända primern introducerade också biotin. Grundfärger som används för att skapa muterade ECS visas som blå pilar och märkta nedan (se tabell 1B,C). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3: System för split och blandningssyntes. Exemplet avser MutB primer syntes där en NNS sekvens infördes vid 0,8 frekvens vid fyra positioner (se även tabell 3). Observera att kemisk syntes utförs från 3'till 5' men alla sekvenser visas i kanonisk 5'-3' orientering (dvs. det utgår från höger till vänster i detta schema). Wild typ sekvenser på mutagenized positioner visas i grönt medan NNS mutagena sekvenser är i rött. SalI erkännande webbplats som senare används för att införa mutationer i ESCs är understruken. Blandnings- och delningssteg (2 och 4) anges. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4: Användning av unika restriktionsenzymplatser i oligonukleotid riktade mutagenesis. Strategin för mutation introduktion visas på ett exempel på byggandet av bibliotek A-C (se steg 3.1-3.7). Omtryckt från Czapinska et al.⁸ med tillstånd från Elsevier. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5: Endonucleolytisk klyvning i in vitro-transkriptionsöversättning. (A)Klyvning av ett testsubstrat i optimal REase-buffert: 1) Substrat, 612 bp PCR-produkt med ett enda NlaIV-igenkänningsställe. 2) Klyvningsprodukter, 355 bp och 257 bp.(B)Klyvning i en in vitro-transkriptionsöversättningsreaktion (innehållande 0,5 μg ESC): 1–2) 15 μL alikvoter av översättning av in vitro-transkription utan substrat (linje 2: reaktion kompletterad med 1,5 mM MgCl₂). 3–4) 15 μL alikvoter av in vitro-transkriptionsöversättning med 1 μg testsubstrat; (linje 4: reaktion kompletterad med 1,5 mM MgCl₂). S-DNA storlek markör (pBR322 röt med MspI). Prover löstes i 6% native PAGE. DNA var fläckat med ethidiumbromid. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 6: Produkter från den första PCR i urvalscykeln. Se figur 1B, steg III. protokoll steg 5.10. Kolumnuppsättningar 1 och 2 är alikvoter av två olika bibliotek som laddas i tre exemplar. S-DNA storlek standard (lambda DNA rötas med HindIII och EcoRI). Pilen anger positionen för eSK för fullängd (1 050 bp). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 7: NlaIV-varianter renas för vidare screening i miniskala. Se steg 6.3.11. Varje rad innehåller en 10 μL alikvot av en annan variant. S-proteinmolekylvikt standard. Molekylmassan av NaIV REase underavdelning är 29,9 kDa. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 8: Exempel på screening av NlaIV-varianter för sekvensspecifikitetsändring. Se steg 6.4.2. (A) Framgångsrik screening med hög frekvens av lovande varianter. S = DNA-storleksmarkör, lambda DNA klyvs med HindIII och EcoRI; Vild typ (wt) = lambda DNA klyvs med vild typ NlaIV; λ = lambda DNA substrat, inte klyvs; andra kolumner=varianter med mycket låg aktivitet. Varianter är märkta ! = lovande varianter som producerar ett klyvningsmönster som skiljer sig från det vilda typenzymet; ? = varianter som också kan ha ändrat sekvensinställning. (B)Misslyckad screening, med en majoritet av varianter inaktiva och en variant med till synes oförändrad klyvning mönster. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 9: Alternativt val efter ligering. Detta alternativ kan användas för alla REases generera klibbiga ändar. Här presenterar vi ett exempel protokoll för ett urvalssystem för MwoI enzym (opublicerade). I) Vald sekvens (placerad i den högra änden av ESK) med definierade rester som visas i rött och valt varianter av konjakssekvensen som visas i blått. Inom parenteser under den markerade räknarsekvensen som ska placeras i den vänstra änden av ESK visas. II) Produkt av MwoI klyvning; III) Efter avslutad in vitro-transkription/översättning renas produkterna och ligering utförs med överflödig adapter. Endast klyvningsprodukter som klyvs i den valda sekvensen kan delta i ligering. Därför elimineras inaktiva varianter och pulldown-steget är onödigt. Klyvningsprodukten i den valda räknarsekvensen (till vänster i esc,inte visas) kan inte delta i denna ligering eftersom den utskjutande änden av adaptern inte kompletterar den valda räknarsekvensen. IV) Selektiv PCR använder samma strategi som i huvudprotokollet för att eliminera varianter med wild type degenererad sekvenss specificitet (F1 primer bindning distala till den counter valda platsen) medan inaktiva varianter elimineras av den selektiva omvänd primer som inte kan binda till uncleaved (och därför inte ändras av adapter ligering) högra änden. I nästa cykel kan processen itereras med hjälp av adapter som är identisk med klyvningsprodukten i föregående steg (dvs. den "klyvade kassetten" i panel III) och en lämplig selektiv omvänd primer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Tabell 1: Grundfärger som används i NlaIV-teknik. Sekvenser av de begränsningsplatser som nämns i kommentarerna är understrukna. Små bokstäver indikerar sekvenser som inte har komplement i DNA-mallarna. Klicka här för att se den här tabellen (Högerklicka för att ladda ner).

Tabell 2: Villkor för PCR-reaktioner som skall användas i protokollet. T_m = primersmältningstemperatur (om T_m är annorlunda för grundfärgerna bör den nedre T_m användas). Klicka här för att se den här tabellen (Högerklicka för att ladda ner).

Tabell 3: Resultat av kvalitetskontrollen av två mutagena grundfärger syntetiseras med split-and-mix strategi. Mutagenized kodon indikeras med [XXX]. Ett lägre indexnummer anger positionen för en kodad aminosyra. Anpassad från Czapinska et al.⁸ med tillstånd från Elsevier. Klicka här för att se den här tabellen (Högerklicka för att ladda ner).

Tabell 4: Resultat från EP-PCR. Huvudsakliga parametrar som härleds från sekvensanalys av 22 kloner av ECS. Klicka här för att se den här tabellen (Högerklicka för att ladda ner).

Discussion

Urvalsprotokollet som beskrivs här testades för NlaIV⁸, en dimeric PD-(D/E)XK fold recognition sekvens som känner igen en palindromic målplats med centrala NN baser och katalyserar en trubbig ände skära mellan NN baser. NlaIV plockades eftersom klyvning mellan NN baser tyder på att dessa baser är nära proteinet i komplexet. I princip kan protokollet användas för alla sekvensspecifika begränsningardonuclease, monomeric eller dimeric, av någon vikgrupp, katalyserande dubbla strängbrytningar av någon förskjutning, oavsett om katalytiska och specificitetsdomäner sammanfaller (som i NlaIV-exemplet) eller är separata (t.ex. FokI). Dessutom är protokollet i princip användbart inte bara för generering av nya, mer smala enzym specificitet, men kan också användas för att eliminera stjärnaktiviteter, eller för att skapa high fidelity endonucleases. Allt detta har dock inte testats ännu. I synnerhet kan riktad eliminering av stjärnaktivitet vara komplicerat, eftersom samma aminosyrarester kan vara inblandade i att binda till de önskade och oönskade baserna. De in vitro-steg som beskrivs i detta protokoll är inte begränsade till valet av begränsade specificiteter, men kan också användas för att välja annars ändrade särdrag. Det finns dock då ett problem med variant endonucleases: om spektrumet av substrat innehåller nya mål som inte klyvs av föräldrarnas endonuclease, det finns i allmänhet inget bra sätt att skydda celler från de skadliga effekterna av denna verksamhet. Om endonucleases specificitet endast begränsas är målen däremot en delmängd av målen av vildtyp, och därför bör den redan tillgängliga konjaksmetyltransferas vara helt skyddande.

Vårt protokoll skiljer sig i flera avseenden från många riktade evolutionsprotokoll. Öppen läsram mångfald genereras en gång i början av experimentet, inte i varje iteration. Dessutom är det skapat genom split-and-mix syntes, snarare än av EP-PCR. För NNS substitutioner av kodon, som används i detta arbete, det finns (4 x 4 x 2)⁶ ~ 1,07 x 10⁹ kombinationer för sex positioner. Därför finns en viss variant i genomsnitt en gång i 1,7 fmoler av ESC. Denna kapacitet kan ökas till sju positioner med hjälp av syntes med en blandning av 20 trinukleotid prekursorer som erbjuds av Glen Research eller genom att minska mutation frekvens i mindre lovande positioner med split-and-mix oligonukleotid syntes. Om möjligt rekommenderas att man begränsar variationens omfattning till sex positioner. Uppenbarligen kräver sådan mutagenesis inriktning viss befintlig kunskap om åtminstone de regioner i REase som deltar i substrat bindande. Split-and-mix-protokollet för att skapa mångfald har tydliga fördelar jämfört med EP-PCR. Med EP-PCR erhöll vi oförändrade varianter och sekvenser med åtta substitutioner för NlaIV ESC i samma EP-PCR (tabell 4). Biblioteket från EP-PCR innehåller en betydande del av kloner som bör undvikas (vilda sekvenser, flera substitutioner, frameshift och nonsens mutationer och mutationer på platser som sannolikt inte påverkar sekvens specificitet).

Vårt protokoll skiljer sig också från många andra riktade evolution protokoll genom förekomsten av två sekventiella urval steg. Positiv markering säkerställer att önskad aktivitet behålls, annars tas inte biotintaggen bort och kodningssekvensen kan tas bort genom dragningskraft. Det är tekniskt möjligt att den slumpartade uppkomsten av en ny, icke-överlappande specificitet (t.ex. GCATGC) kan leda till avskiljande av biotintaggen också, om en lämplig klyvningsplats finns nära den önskade klyvningen, men inte någon annanstans. Detta bör dock vara högst osannolikt. Negativ markering tar bort öppna läsramar som kodar för enzymer som fortfarande har oönskad aktivitet. Det här steget är inte strikt obligatoriskt, eftersom protokollet fortfarande kommer att berika utdatabiblioteket med varianter som kan klyva urvalssekvensen men inte kan klyva någon annanstans i ESC, vilket gör det olämpligt för PCR-förstärkning. Urvalseffektiviteten förväntas dock vara lägre eftersom enzymer med den ursprungliga sekvenss specificiteten inte kommer att tas bort från produktionen och kommer att konkurrera ut lovande varianter med förändrad specificitet men också minskad enzymatiska aktivitet. Observera att på befolkningsnivå kan både önskade och oönskade målsekvenser, men behöver inte vara, urarta. I NlaIV-exemplet urartade antimålet och målet icke-degenererat. Även när det finns degenererad på befolkningsnivå, i en enda droppe endast ett (icke-degenererat) mål eller anti-mål är närvarande. I vårt protokoll återinförs mål- och målsekvenser vid varje upprepning av urvalsstegen. Därför måste en öppen läsram koda ett enzym som kan klyva alla möjliga mål, och inte kan klyva någon av anti-mål, för att överleva flera urval rundor. Observera att behovet av att återinföra antiselection-målet vid varje iteration av protokollet upprätthåller två sekventiella PCRs. Den första PCR använder en primer som glödar utanför anti-målet, så att klyvning av anti-målet förhindrar PCR-reaktionen. Den andra PCR kräver en primer som når bortom anti-målet, och återinför anti-mål, för att se till att under flera omgångar av urval, varje öppen läsram testas mot alla varianter av anti-målet.

För enzymer som genererar klibbiga ändar kan ett relaterat alternativt protokoll baserat på en tidigare beskriven metod för isolering av REase ORF¹⁰ användas. Utarmningen av inaktiva varianter genom biotinfångst som används i våra experiment ersätts i det alternativa protokollet genom ligering av den kompatibla adaptern med en sekvens som används som en primerbindningsplats i en selektiv PCR (figur 9). Endast ESC som producerar enzymer med den valda specificiteten genererar ligeringskompatibla ändar och kommer därför att väljas ut. Sekvensen av den klibbiga änden av den valda räknarsekvensen måste utformas på ett sådant sätt att den inte kan delta i ligering med adaptrar. Iteration av urvalsprocessen kan enkelt uppnås genom att växla mellan två olika adaptrar och därmed två olika omvända primers i selektiv PCR.

Även med nya protokoll, uppgiften att ingenjörskonst nya särdrag in vitro är fortfarande mycket utmanande. För typiska typ II REases beror sekvenss specificitet och endonucleolytisk aktivitet på samma proteinregioner. Det är därför svårt att ändra det ena utan att påverka den andra. Framgång görs mer sannolikt genom en strategi som tar hänsyn till fotavtryck av enzymet, respekterar symmetrin i protein-DNA interaktioner, och bygger på befintliga enzymatiska preferenser, som bör fastställas i förväg i biokemiska experiment, som gjordes för NlaIV exempel⁸.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1000Å CPG Support (dA, dT, dC, dG)	Biosset	45-1000-050	Other vendors can be used as well
ASM-800 DNA/RNA	Biosset	800-001-000
GeneJET Gel Extraction Kit	Thermo Scientific	K0691	Any other kit can be used
Glen-Pak DNA purification cartridge	Glen Research	60-5200
HIS-Select Nickel Affinity Gel	Sigma	P6611
pET 28a vector			Any other vector with T7 promoter upstream of plycloning site can be used instead
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	Thermo Scientific	F530S	Any other high fidelity and highly processive thermophilic polymearse can be used instead
Porous steel foil	Biosset	40-063
Rapid Translation System RTS 100, E.coli HY Kit	Roche	3 186 148
Restriction endonucleases	Thermo Scientific		Obviously other vendors, enzymes can be used
Streptavidin Magnetic Beads	New England Biolabs	S1420S	Other vendors can be used as well. We have positively tested beds form Sigma
Synthesis chemicals including phosphoramidities	Carl Roth		Other vendors can be used as well
Synthesis columns (different sizes)	Biosset
T4 DNA ligase	Thermo Scientific	EL0011	Any other ligase can be used