Summary
Aqui, apresentamos um método modificado para criopreservação de embriões unicelulares, bem como um protocolo que acoplar o uso de embriões congelados e eletroporação para a geração eficiente de camundongos geneticamente modificados.
Abstract
O uso de camundongos geneticamente modificados (GM) tornou-se crucial para entender a função genética e decifrar os mecanismos subjacentes das doenças humanas. O sistema CRISPR/Cas9 permite que os pesquisadores modifiquem o genoma com eficiência, fidelidade e simplicidade sem precedentes. Aproveitando essa tecnologia, os pesquisadores estão buscando um protocolo rápido, eficiente e fácil para a geração de ratos GM. Aqui introduzimos um método aprimorado para criopreservação de embriões unicelulares que leva a uma maior taxa de desenvolvimento dos embriões congelados. Ao combiná-lo com condições de eletroporação otimizadas, este protocolo permite a geração de ratos nocaute e knock-in com alta eficiência e baixas taxas de mosaico em um curto espaço de tempo. Além disso, mostramos uma explicação passo a passo do nosso protocolo otimizado, abrangendo preparação de reagente CRISPR, fertilização in vitro, criopreservação e descongelamento de embriões unicelulares, eletroporização de reagentes CRISPR, geração de mouses e genotipagem dos fundadores. Usando este protocolo, os pesquisadores devem ser capazes de preparar ratos GM com facilidade, velocidade e eficiência incomparáveis.
Introduction
O sistema de repetições palindrômicas curtas interespaçadas regularmente interespaçadas (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9) é um avanço científico que proporciona uma modificação direcionada sem precedentes no genoma1. O sistema CRISPR/Cas9 é composto por proteína Cas9 e rna guia (gRNA) com dois componentes moleculares: um RNA CRISPR específico para alvo (crRNA) e um RNA CRISPR transativador (tracrNA)2 . Um gRNA direciona a proteína Cas9 para o lócus específico no genoma, 20 nucleotídeos complementares ao crRNA, e adjacentes ao protoespaço adjacente (PAM). A proteína Cas9 liga-se à seqüência de destino e induz quebras de fios duplos (DSBs) que são reparadas por uma junção final não homologo (NHEJ) propensa a erros ou reparação dirigida à homologia de alta fidelidade (HDR)3,,4,5. O NHEJ leva a inserções ou/e exclusões (indels) e, portanto, à perda genética da função quando uma seqüência de codificação é direcionada. O HDR leva à edição precisa do genoma na presença de um modelo de reparo contendo seqüências de homologia3,4,5. O NHEJ e o HDR foram aproveitados para gerar nocaute e knock-in, respectivamente.
Embora o sistema CRISPR/Cas9 tenha acelerado significativamente a geração de ratos GM com excelente eficácia e fidelidade, cientistas que aplicam esses métodos frequentemente encontram desafios técnicos. Em primeiro lugar, os protocolos convencionais requerem microinjeção para introduzir as ferramentas de edição CRISPR no pronúcleo de ovos fertilizados6,7. Essa técnica é demorada e geralmente requer treinamento extensivo. Assim, vários grupos substituíram a microinjeção por eletroporação88,9,10,,11,12,13. No entanto, nos primeiros protocolos de eletroporação foram utilizados embriões frescos para eletroporação. Isso causou outro problema, pois preparar embriões frescos antes de cada experimento é difícil14.
Recentemente, nós e outros combinamos o uso de embriões congelados e eletroporação para edição de genomas, o que facilita a geração de camundongos GM15,16. Este protocolo permite que pesquisadores sem habilidades avançadas de manipulação de embriões gerem rapidamente modelos animais de doenças humanas com alta eficiência. O protocolo também reduz significativamente os desafios práticos na geração de camundongos GM, como a heterogeneidade genética nos fundadores16. Para superar o mosaico, realizamos a eletroporação dos reagentes CRISPR dentro de 1h após o descongelamento do embrião para garantir que a edição ocorra antes da primeira replicação do genoma. Outra melhoria inclui o uso da proteína Cas9 em vez de Cas9 mRNA para reduzir o mosaico indesejável17. Além disso, desenvolvemos um método ideal para criopreservação de embriões unicelulares que aumenta a taxa de desenvolvimento para o estágio16de duas células : o uso de soro bovino fetal (FBS) melhora drasticamente a sobrevivência de oócitos congelados após a fertilização, talvez pelo mesmo mecanismo que torna os oócitos não fertilizados congelados mais resistentes18.
Aqui apresentamos um protocolo abrangente para a geração de camundongos GM usando embriões congelados, incluindo o método modificado para criopreservação de embriões C57BL/6J de células únicas. Inclui 1) design gRNA, preparação e montagem de reagentes CRISPR; 2) FIV, criopreservação e descongelamento de embriões unicelulares; 3) Eletroporização dos reagentes CRISPR em embriões congelados; 4) Transferência de embriões para o oviduto de camundongos pseudogestantes; e 5) Genotipagem e análise de seqüência dos animais fundadores do F0.
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Protocol
Todos os cuidados e procedimentos realizados neste estudo foram realizados de acordo com as regras e regulamentos do Guia de Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. O protocolo experimental foi aprovado pelo Comitê de Cuidados Animais de Laboratório da Universidade de Toyama, Universidade de Tóquio, Universidade de Jichi e Instituto Max Planck de Neurociências da Flórida. As informações sobre todos os reagentes são mostradas na Tabela de Materiais.
1. Design de reagentes CRISPR
- design de crRNA
- Visite o CRISPR direct19 (https://crispr.dbcls.jp/) para projetar crRNAs específicos com locais fora do alvo reduzidos.
NOTA: Existem muitas outras ferramentas úteis para projetar o crRNA20 (https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/wereview/crisprtools/). - Insira a seqüência de nucleotídeos de destino e faça as seguintes alterações:
Requisito de seqüência PAM = NGG
Verificação de especificidade = Genoma do mouse (Mus musculus), GRCm38/mm10 (Dez, 2011)
NOTA: Como exemplo, para gerar ratos nocauteadores tyrosinase (Tyr), exon 2 (seqüência de nucleotídeos de 9476-9692) foi alvo. - Clique em Designe, para obter hits altamente específicos, marque Somente mostrar alvo altamente específico.
- Para reduzir potenciais efeitos fora do alvo, escolha a seqüência de destino com o menor valor nas colunas de "12 mer+PAM" e "8 mer+PAM".
NOTA: Nestas colunas, ("1") indica que a seqüência tem apenas uma combinação perfeita com o local de destino pretendido e números maiores que um indicam a presença de potenciais locais fora do alvo. - Encomendar os oligonucleotídeos resultantes das empresas de síntese de CRRNA(Tabela Supplimentary 1).
NOTA: Para o gene exon 2 Tyr, utilizou-se a seguinte seqüência de destino: GGACCACTATTACAATCC, com +TGG como a seqüência PAM(Figura 2A).
- Visite o CRISPR direct19 (https://crispr.dbcls.jp/) para projetar crRNAs específicos com locais fora do alvo reduzidos.
- Design de oligodeoxinucleotídeo de uma única vertente (ssODN) para experimentos de edição mediados por HDR (ou seja, geração de ratos knock-in).
- Projete o comprimento do ssODN em torno de 80-180 bp, incluindo 30-60 braços de homologia nucleotídeos (nt) em ambos os lados.
NOTA: Um ssODN de comprimento de 75-85 nt, incluindo um braço de homologia de 30-35 nt e complementar ao gRNA, mostrou alta eficiência de edição knock-in21. - Insira a modificação pretendida e a mutação silenciosa na seqüência PAM ou, se não possível, na base vizinha de 5′ do PAM para bloquear o recorte após a edição do genoma.
NOTA: O crRNA e o ssODN utilizados neste estudo estão listados na Tabela Suplementar 1.
- Projete o comprimento do ssODN em torno de 80-180 bp, incluindo 30-60 braços de homologia nucleotídeos (nt) em ambos os lados.
2. Fertilização in vitro, criopreservação de embriões e congelamento
- Fertilização in vitro
- Superovulate C57BL/6J camundongos fêmeas (4 ou 8 semanas de idade) por injeção ip com gonadotropina de soro de égua grávida (PMSG) seguido de injeção com gonadotropina coriônica humana de 7,5 UI (hCG) após 48 h.
NOTA: O número de oócitos ovulados pode ser aumentado em cerca de 3x usando ultra-superovulação22. - Remova os epidéios cauda de camundongos machos c57BL/6J sexualmente maduros (3-5 meses de idade).
NOTA: É possível coletar espermatozoides sem sacrificar os ratos machos. - Extrair coágulos de espermatozoides com uma agulha dissecante e incuba-los em uma gota de 200 μL de fluido tubal humano (HTF) na incubadora de CO2 por 1,5 h para capacitação.
- Coletar complexos cumulus-oócitos (COCs) dos ovidutos 16-18 h após a injeção de hCG e incuba-los em uma nova gota de 200 μL de médio HTF coberto com líquido de parafina em uma incubadora de CO2 (5% CO2, 37 °C) para não mais de 2 h.
NOTA: É preferível sacrificar os camundongos por luxação cervical anestesia, pois a eutanásia via inalação de CO2 afeta a FIV e o desenvolvimento de embriões23. - Adicione 1-5 μL de suspensão de esperma do limite do meio de incubação à gota de 200 μL do meio HTF contendo COCs e incuba-os em uma incubadora de CO2 por 3 h.
- Lave os oócitos com o meio de otimização simplex (KSOM) 3x suplementado por potássio para remover as células remanescentes de espermatozoides e cumulus.
- Verifique a formação pronuclear e o grau de embriões de uma célula usando um microscópio invertido.
- Superovulate C57BL/6J camundongos fêmeas (4 ou 8 semanas de idade) por injeção ip com gonadotropina de soro de égua grávida (PMSG) seguido de injeção com gonadotropina coriônica humana de 7,5 UI (hCG) após 48 h.
- Criopreservação de embriões unicelulares
- Incubar embriões de uma célula em uma gota de 200 μL de HTF contendo 20% de FBS (não coberto com líquido de parafina) por 10 min em uma incubadora de CO2.
- Transferir 20-100 embriões para 50 μL de 1 M de solução de sulfóxido de dimetila (DMSO)24.
- Transfira 5 μL de uma solução contendo 100 embriões para o fundo de um criotubo e esfrie por 5 min a 0 °C usando um refrigerador ou no gelo.
- Adicione 45 μL de dap213 (2 M dimetil sulfóxido, 1 M acetamide e 3 M propilenoglicol) lentamente ao longo da parede do tubo, tampe os tubos e mantenha por 5 min em um refrigerador ou no gelo a 0 °C.
NOTA: Não aperte as tampas com muita força para removê-las facilmente durante o descongelamento da amostra. - Armazene tubos rapidamente em nitrogênio líquido.
- Descongelamento de embriões
- Abra a tampa do criotubo, descarte o nitrogênio líquido restante e adicione 900 μL de solução de sacarose de 0,25 M pré-aquecida a 37 °C.
NOTA: A solução de sacarose de 0,25 M deve ser aquecida com 37 °C de antecedência porque o uso de solução a frio diminui a viabilidade do embrião após o descongelamento. - Pipet rapidamente por 10x e transfira o conteúdo do criotubo para um prato de plástico.
NOTA: A pipetação deve ser realizada com cuidado, para que não sejam geradas bolhas e danifiquem os embriões. - Lave os oócitos fertilizados morfologicamente normais 2x no meio KSOM coberto com líquido de parafina e mantenha-os em uma incubadora de CO2 até a eletroporação.
- Abra a tampa do criotubo, descarte o nitrogênio líquido restante e adicione 900 μL de solução de sacarose de 0,25 M pré-aquecida a 37 °C.
3. Montagem e eletroporação de reagentes CRISPR
NOTA: Para a eletroporação, utilizou-se um eletrodo de placa de platina (altura: 0,5 mm, comprimento: 10 mm, largura: 3 mm, abertura: 1 mm) e um eletroporatipo de uma etapa que foram descritos anteriormente8 (Tabela de Materiais). Um eletroporador de duas etapas também pode ser usado(Tabela de Materiais).
- Preparação e montagem de reagentes CRISPR
- Peça reagentes CRISPR (ou seja, crRNA, tracrNa e proteína Cas9) e ssODN se realizarem experimentos de edição mediados por HDR(Tabela de Materiais e Tabela Suplementar 1).
- Prepare a solução de recozimento da seguinte forma.
- Prepare 1 μg/μL crRNA e 1 μg/μL tracrRNA em solução de meio essencial mínimo de soro reduzido(Tabela de Materiais),e adicione 6 μL de cada solução a 42 μL do buffer sem nuclease.
- Incubar a mistura no aquecedor seco a 95 °C por 3 min e esfriar em RT por 5 min.
- Prepare 1 μg/μL de proteína HiFi Cas9 diluída em Opti-MEM I e adicione 6 μL à mistura anterior para um volume total de 60 μL.
- Ao realizar experimentos de edição mediados por HDR, adicione 6 μL de 1 μg/μL ssODN. Como o volume final deve ser de 60 μL, use 36 μL de água sem nuclease na etapa 3.1.2.1.
NOTA: A concentração final de crRNA, tracrRNA, proteína Cas9 e ssODN será de 100 ng/μL. - Transfira até 100 embriões para 25 μL da mistura final (complexo RNP) em um único orifício e incuba-os a 37 °C por 10 min.
- Electroporation
- Preencha a lacuna do eletrodo com 6 μL da nova mistura de reagentes CRISPR e adicione 20-25 embriões à mistura.
NOTA: É importante evitar qualquer contato entre os embriões e o eletrodo de eletroporação, que pode danificar embriões durante pulsos elétricos. - Realize a eletroporação nas seguintes condições para um eletroporador tipo uma etapa:
Tensão: 25 V, direção de pulso (Pd) +
ON: 3 ms, OFF: 97 ms
Repetições: 5x
NOTA: A eletroporação não deve ser realizada mais do que 1 h após o descongelamento para garantir que a edição do genoma ocorra antes da primeira replicação do DNA para evitar o mosaico. - Para um eletroporador tipo duas etapas, defina as condições da seguinte forma:
Pulso de Poring = 40V, Pd +
ON = 1 ou 2,5 ms; Intervalo de pulso = 50 ms
Repetições: 4x, Decadência 10%
Pulso de transferência = 5 ou 7V; Pd +/-.
ON: 50 ms; Intervalo de pulso = 50 ms.
Repetições = 5x; Decadência = 40%.
NOTA: É importante ajustar o volume para manter a impedância dentro da faixa específica especificada pelo fabricante. - Lave os embriões 3x com o tampão bicarbonato krebs-ringer modificado 2 (M2) seguido por duas lavantes com uma gota de ksom médio coberto com líquido de parafina.
- Incubar os embriões lavados (em meio KSOM) em uma incubadora de CO2 durante a noite para posterior transplante.
- Preencha a lacuna do eletrodo com 6 μL da nova mistura de reagentes CRISPR e adicione 20-25 embriões à mistura.
4. Transferência de embriões
- Prepare ratos pseudogestantes. Camundongos fêmeas Mate ICR (3-6 meses) com camundongos machos vasectomizados 1 dia antes da transferência do embrião (ET).
NOTA: Os ratos devem ser verificados na manhã seguinte para um plugue copulatório. Os ratos com um plugue são considerados pseudográvidas e podem ser usados para ET. - Ar aspirado e KSOM (sem líquido de parafina) em intervalos alternativos de 2-3 mm em um capilar de vidro como marcador para implantação bem sucedida.
- Introduza 20-24 embriões em uma gota de 200 μL de KSOM (sem líquido de parafina) e desenhe 10-12 embriões no capilar de vidro para implantação em cada oviduto.
- Anestesiar os camundongos fêmeas por isoflurano (inalação) ou uma injeção ip de uma solução que combina medetomidina/midazolam/butorphanol (0,3 mg/kg, 4,0 mg/kg e 5,0 mg/kg, respectivamente). Posicione o mouse anestesiado em seu lado ventral em uma almofada de aquecimento. Proteja os olhos do rato anestesiado com um gel hidratante.
- Raspe ao longo da parte inferior da linha média dorsal e desinfete a área com iodo povidone seguido com 70% de etanol.
- Faça uma incisão longa de ~1 cm paralela à linha média dorsal.
- Tire o oviduto e coloque em uma cortina de plástico estéril. Mantenha-o úmido usando soro quente estéril.
- Coloque o oviduto o microscópio estereoscópico.
- Faça um buraco na parede do oviduto entre o infundibulum e a ampulla alguns milímetros a montante da ampulla por uma tesoura de micromola.
- Insira a ponta do capilar de vidro contendo os embriões no orifício e sopre suavemente no porta-voz do suporte capilar para expelir os embriões até que uma bolha de ar seja visível na ampola.
NOTA: Transferência entre 10 a 12 embriões por oviduto. - Retire o capilar de vidro da parede do oviduto e empurre o órgão reprodutor suavemente de volta para a cavidade corporal.
- Repita o processo anterior para introduzir os embriões no outro oviduto.
- Ao completar o procedimento ET, sutura o peritôono com um padrão de sutura simples interrompido (50, absorvíveis, suturas sintéticas trançadas) e, em seguida, a pele com um padrão simples interrompido ou um padrão de ponto subcuticular enterrado (60 suturas monossintéticas não absorvíveis).
- Mantenha o rato aquecido em uma placa de aquecimento de 37 °C até que se recupere da anestesia.
- Monitore a saúde do animal diariamente durante 7 dias após a cirurgia.
5. Genotipagem e análise de seqüência
- Extração de DNA genômico
NOTA: Usamos kits de extração de DNA de tecido NucleoSpin para extrair o DNA genômico do tecido auditivo dos camundongos seguindo as recomendações do fabricante.- Adicione 180 μL de tampão T1 e 25 μL de solução Proteinase K à amostra e misture por vórticagem para 10 s.
- Incubar a 56 °C por 2h ou até obter a lólise completa. Vórtice para 10 s a cada 30 min da incubação.
- Adicione 200 μL de Tampão B3, vórtice vigorosamente para 30 s e incubar a 70 °C por 10 min.
- Adicione 210 μL de 100% de etanol à amostra e vórtice vigorosamente.
- Para cada amostra, coloque uma coluna de tecido em um tubo de coleta e aplique a amostra na coluna.
- Centrifugação por 1 min a 11.000 x g,descarte o fluxo e coloque a coluna de volta no tubo de coleta.
- Adicione 500 μL de Tampão BW para lavar a amostra (1ª lavagem), centrífuga por 1 min a 11.000 x g,descarte o fluxo e coloque a coluna de volta no tubo de coleta.
- Adicione 600 μL de Tampão B5 à coluna (2ª lavagem), centrífuga por 1 min a 11.000 x g,descarte o fluxo e coloque a coluna de volta no tubo de coleta.
- Centrifugar a coluna por 1 min a 11.000 x g para secar a membrana de sílica e colocar a coluna de tecido NucleoSpin em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
- Adicione 100 μL de Buffer BE, incubar à temperatura ambiente por 1 min, depois centrífuga 1 min a 11.000 x g.
- Amplificação e purificação de PCR
- Projete os primers usando o site primer3 plus (https://primer3plus.com/) a fim de amplificar uma seqüência de 400-500 bp em torno do lócus alvo.
- Projete um novo protocolo PCR e teste-o empiricamente.
- Purifique o produto PCR para remover as enzimas indesejadas, nucleotídeos, primers e componentes tampão. Um método padrão de purificação pode ser usado da seguinte forma.
- Adicione 50 μL de fenol a 50 μL dos produtos PCR e misture por vórtice.
- Centrifugar por 1 min a 11.000 x g e transferir a camada superior transparente para um novo tubo.
- Adicione 120 μL de 99,5% de etanol e 20 μL de acetato de amônio de 5 M e vórtice para 30 s.
- Mantenha em RT por 10 min e centrífuga a 11.000 x g por 10 min.
- Descarte o sobrenadante e lave a pelota de DNA com 1 mL de 70% de etanol.
- Seque a pelota em RT por 10 min e dissolva em 10 μL de água livre de RNase.
NOTA: Os kits de purificação baseados em colunas PCR são recomentados porque o fenol é tóxico para os seres humanos.
- Sequenciamento de Sanger
- Executar a análise de quantificação de DNA (ver Tabela de Materiais) para quantificar o amplicon PCR purificado.
- Envie produtos PCR e primer seqüenciamento para um provedor de serviços de seqüenciamento.
- Analise a sequência usando os sites online disponíveis.
NOTA: Neste estudo, o CRISP-ID25 (http:/crispid.gbiomed.kuleuven.be/) foi utilizado para análise de seqüência.
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Representative Results
Nosso método modificado para criopreservação de embriões unicelulares, incluindo a incubação em HTF contendo 20% de FBS por 10 min seguido de criopreservação em 1 M DMSO e da solução DAP213, melhorou a taxa de desenvolvimento dos embriões congelados no estágio de duas células (Figura 1, p = 0,009, teste t do aluno). Os embriões congelados foram utilizados para a produção de camundongos GM e as condições de eletroporação foram otimizadas: cinco repetições de 25 V com pulsos de 3 ms e intervalos de 97 ms utilizando um eletroporador conforme descrito na seção Protocolo. A aplicabilidade do protocolo foi verificada pela geração de camundongos nocauteadores do gene albino Tyrosinase (Tyr)(Figura 2). Para isso, foram projetados os reagentes de gRNA(Figura 2A)e os reagentes CRISPR, conforme descrito na seção Protocolo. As ferramentas de edição foram eletroporadas dentro de 1h de descongelamento de embriões para garantir que a edição do genoma ocorresse antes da primeira replicação do genoma e, assim, impedisse o mosaico nos fundadores(Figura 2B). Todos os ratos gerados eram albinos, e apenas um rato era mosaico, com um casaco com manchas brancas e pretas (Figura 2C). Todos os camundongos albinos que abrigam dois alelos mutantes diferentes (mutação heterozigosa), exceto um rato que abriga apenas um alelo (mutação homozigosa) são mostrados na Figura 2E. Pode-se concluir que nosso método pode fornecer uma eficiência de edição de quase 100% com uma baixa taxa de mosaico confirmada pela análise de seqüenciamento, bem como a cor do casaco (Figura 2C–E).
Em seguida, a reprodutibilidade do protocolo foi verificada pela geração de várias linhas de nocaute e knock-in mice. Como mostrado na Tabela 1,o protocolo pode gerar ratos nocaute e knock-in com alta eficiência e baixas taxas de mosaico. A maioria dos camundongos F0 gerados foram acasalados com camundongos do tipo selvagem C57BL/6J para confirmar a transmissão germinal de alelos mutantes para as gerações de F1. Como previsto, todos os descendentes de F1 dos ratos homozigos F0 eram heterozigosos, contendo um alelo mutante e um alelo selvagem. Não foram observadas mutações diferentes entre a genotipagem dos fundadores e suas gerações. O protocolo descrito gerou ratos GM em um curto espaço de tempo (ou seja, ~4 semanas) como mostrado no fluxo de trabalho do protocolo na Figura 3.
Figura 1: O soro bovino fetal (FBS) melhorou a taxa de desenvolvimento do estágio de duas células dos embriões congelados. O número de embriões FBS+ foi de 286 (o experimento foi repetido 3x), e o número de fs-embriões foi de 272 (o experimento foi repetido 3x). Os dados são apresentados como média ± SEM. Este número é reproduzido de Darwish M et al.16 com permissão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Geração de ratos nocauteadores Tyr com alta eficiência e baixa taxa de mosaico. Esta figura é modificada de Darwish M et al.16 com permissão. (A)Ilustração esquemática mostrando o design do gRNA. A seqüência PAM é mostrada em vermelho. (B) Ilustração mostrando o tempo de eletroporação dos embriões congelados, o símbolo amarelo representa o tempo de eletroporação. (C) Imagens representativas dos ratos tyr satisfazem gerados. (D) Análise seqüencial de diferentes alelos dos ratos nocaute atyr. A seqüência de destino é rotulada em vermelho e traços indicam a exclusão de nucleotídeos nos alelos mutantes. WT = tipo selvagem M = alelo mutante. (E) Uma parte representativa do cromatograma do rato albino contendo o alelo M1 é mostrada em D. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Fluxo de trabalho do protocolo para a geração de ratos GM. O primeiro passo foi a preparação de embriões criopreservados. Os camundongos C57BL/6J femininos foram superovulados, primeiro por injeção pmsg, depois 48 h depois por injeção de hCG. Os COCs foram coletados 16h depois e submetidos à FIV com espermatozoides coletados de camundongos C57BL/6J masculinos. Os oócitos fertilizados eram criopreservados e armazenados em nitrogênio líquido até que fosse necessário. A segunda etapa incluiu o descongelamento dos embriões e a eletroporação. Embriões criopreservados foram descongelados e reagentes CRISPR (ou seja, tracrRNA, crRNA e proteína Cas9) foram montados e eletroporados dentro de 1h após o descongelamento dos embriões. A terceira etapa incluiu a transferência de embriões e o nascimento de camundongos. No dia seguinte à eletroporação, embriões de duas células foram transferidos para o oviduto de camundongos pseudogestantes para gerar camundongos geneticamente modificados que foram mais tarde genotipados usando sequenciamento de Sanger para confirmar a eficiência de edição. O tempo e esforço necessários para a preparação de oócitos fertilizados antes de cada experimento (passo 1) pode ser encurtado se um grande número de embriões criopreservados for preparado com antecedência. Esta figura é adaptada de Darwish M et al.16Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Ratos mutantes | Embriões eletroporados | Embriões de 2 células | Embriões transferidos | Filhotes (%) | Camundongos mutantes(%) | Não de ratos de mosaico |
| Tyr KO | 124 | 84 | 48 | 12 (25) | 100 | 1 |
| Glrb KO | 151 | 94 | 40 | 6 (15) | 100 | 0 |
| Slc39a6 KO | 48 | 25 | 25 | 5 (20) | 100 | 0 |
| Bag3 KI | 233 | 84 | 20 | 3 (15) | 50 | 1 |
| Camk2a KI | 124 | 70 | 70 | 14 (20) | 64.3 | 0 |
Tabela 1: Produção de várias linhas de camundongos GM utilizando embriões congelados de fundo C57BL/6J.
Tabela suplementar 1. Clique aqui para baixar esta tabela.
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Discussion
O protocolo descrito permite a geração de camundongos GM com alta eficiência e baixas taxas de mosaico(Tabela 1). Ele permite que pesquisadores sem habilidades avançadas de manipulação de embriões criem camundongos mutantes facilmente porque ele aproveita os mais recentes e mais úteis avanços em tecnologias de engenharia reprodutiva e edição de genomas: CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein (RNP) e eletroporção em embriões congelados. Esses avanços facilitaram e aceleraram a geração dos ratos GM. Como descrito na Figura 3,leva ~4 semanas para gerar os ratos GM. Comparado a outros protocolos usando abordagens semelhantes26, nosso método é superior em termos de eficiência, taxa de natalidade e mosaicismo.
A incubação de embriões unicelulares na FBS antes da criopreservação é fundamental para melhorar a taxa de desenvolvimento dos embriões. As condições de eletroporação dos embriões criopreservados, descritas no Protocolo, permitem um comprometimento entre a eficiência de edição dos reagentes CRISPR e a sobrevivência dos embriões. De fato, condições mais duras ou mais brandas podem afetar a taxa de desenvolvimento dos embriões e a eficiência de edição, respectivamente16. O tempo da eletroporação (Figura 2B) é fundamental para superar o mosaico nos fundadores e garantir que a modificação do genoma ocorra na presença de apenas dois alelos. Isso é consistente com relatórios anteriores mostrando que a eletroporação em estágio inicial poderia produzir mutantes não-mosaicos17. Além disso, o uso de RNP em vez de gRNA/mRNA diminui a taxa de mosaico e melhora a eficiência de edição17.
O protocolo descrito apresenta várias vantagens. Primeiro, ele gera os camundongos mutantes em um curto espaço de tempo (~4 semanas). Em segundo lugar, é um protocolo altamente eficiente e robusto; várias linhas de camundongos knockout (KO) e knock-in (KI) foram geradas com altas taxas de mutação (KO = 100%, KI = 50 a 64,3%). Terceiro, é conveniente e econômico. O uso de crRNA sintético completo, tracrRNA, ssODN e proteína Cas9 elimina a necessidade de preparação tediosa dos vetores Cas9 e transcrição in vitro. Em vez disso, permite que os pesquisadores simplesmente usem reagentes comerciais e equipamentos padrão. Em quarto lugar, não usa microinjeção, o que requer altas habilidades técnicas. Em quinto lugar, reduz o mosaico nos fundadores, e assim leva a uma transmissão germinal mais eficiente dos alelos editados, superando a complicada análise genotípica dos ratos de mosaico. Finalmente, este protocolo é eficiente com a cepa c57BL/6J, que evita o uso de híbridos F1, e, portanto, a necessidade de realizar inúmeros backcrosses para se livrar da complexidade genética. A genotipagem das gerações de F1 confirmou a transmissão precisa da germinação. No entanto, não é recomendado estudar os fenótipos dos camundongos F0 devido à complexidade do alelo e à previsão enganosa da genotipagem da geração subseqüente extrapolada da genotipagem dos fundadores do F014,27.
É de grande importância aproveitar o uso dos embriões congelados na edição do genoma de primatas não humanos e animais de grande porte, como porcos e ovelhas, que nem sempre estão prontamente disponíveis. Os métodos de congelamento de embriões diferem muito dependendo da espécie animal. Portanto, achamos que nosso protocolo de criopreservação pode ser aplicável apenas aos camundongos. Por outro lado, nosso protocolo é potencialmente aplicável ao uso de nucleases de engenharia que não o Cas9 para a geração de camundongos GM, pois a eletroporação foi previamente relatada para introduzir outras nucleases como cas12a no embrião eficientemente28,29.
Uma limitação do protocolo é a integração precisa de um longo transgene no genoma, que é considerado difícil em protocolos baseados em eletroporação. No entanto, uma solução em potencial foi relatada: a integração de transgenes até 4,9 Kb no genoma do camundongo foi realizada com sucesso pela combinação da eletroporação com um sistema de entrega mediado por hdr mediado por adeno (AAV)30, confirmando uma publicação anterior31. Além disso, a potencial ocorrência de efeitos colaterais fora do alvo é uma grande preocupação com o uso da tecnologia CRISPR/Cas9. Não realizamos o sequenciamento do genoma inteiro dos camundongos editados para excluir o potencial efeito fora do alvo. No entanto, usamos ferramentas CRISPR que foram relatadas para reduzir o efeito fora do alvo, como a RNP32. Além disso, usamos uma variante Cas9 de alta fidelidade que reduz significativamente a edição fora do alvo sem sacrificar o desempenho no alvo33. Além disso, projetamos gRNAs usando o software CRISPRdirect (https://crispr.dbcls.jp), o que deve resultar em seqüências de destino com locais fora do alvo minimizados19. Para confirmar a causalidade do genótipo-fenótipo e aliviar as preocupações sobre efeitos fora do alvo, os pesquisadores devem gerar vários camundongos editados do mesmo genótipo usando gRNAs diferentes ou realizar backcrossing dos camundongos gerados por várias gerações.
Os camundongos eliminados gerados usando o mecanismo NHEJ e mutações frameshift têm sido amplamente utilizados e mostram fenótipos relevantes. No entanto, a proteína residual truncada pode existir devido à reiniciação da tradução ou ao salto do exon editado34,35. Portanto, para interpretar com precisão os fenótipos, é necessária a caracterização da função ou expressão da proteína residual. A geração de camundongos completos usando mais de um gRNA seria uma boa alternativa. No entanto, deve-se prestar especial atenção para confirmar que o gene não contém regiões intrônicas transcritas para RNAs não codificadas, que podem ter funções regulatórias e, portanto, complicar a análise phenotípica.
Neste estudo, mostramos um protocolo simples pelo qual muitos pesquisadores podem gerar camundongos geneticamente modificados em 4 semanas ou menos. Combinando o uso de embriões congelados e eletroporação, tornamos a preparação de modelos de camundongos de doenças humanas fácil, rápida e eficiente.
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Disclosures
Os autores não têm divulgações financeiras relevantes.
Acknowledgments
Queremos agradecer hitomi Sawada e Elizabeth Garcia pelo cuidado com os animais. Este trabalho foi apoiado por KAKENHI (15K20134, 17K11222, 16H06276 e 16K01946) e Hokugin Research Grant (para H.N.), e Jichi Medical University Young Investigator Award (para H.U.). A Fundação de Bolsas Otsuka Toshimi apoiou o M.D.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25 M Sucrose | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) | SUCROSE | |
| 1 M DMSO | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) | 1M DMSO | |
| Butorphanol | Meiji Seika Pharma Co., Ltd. (Tokyo, Japan) | Vetorphale 5mg | |
| Cas9 protein: Alt-R® S.p. HiFi Cas9 Nuclease 3NLS | Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA) | 1081060 | |
| C57BL/6J mice | Japan SLC (Hamamatsu, Japan) | N/A | |
| DAP213 | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) | DAP213 | |
| FBS | Sigma-Aldrich, Inc. (St. Louis, MO) | ES-009-C | |
| hCG | MOCHIDA PHARMACEUTICAL CO., LTD (Tokyo, Japan) | HCG Mochida 3000 | |
| HTF | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) | HTF | |
| ICR mice | Japan SLC (Hamamatsu, Japan) | N/A | |
| Isoflurane | Petterson Vet Supply, Inc. (Greeley, CO) | 07-893-1389 | |
| KSOM | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) | KSOM | |
| LN2 Tank | Chart Industries (Ball Ground, GA) | XC 34/18 | |
| M2 | ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) | M2 | |
| Medetomidine | Nippon Zenyaku Kogyo Co.,Ltd. (Koriyama, Japan) | 1124401A1060 | |
| Microscope | Nikon Co. (Tokyo, Japan) | SMZ745T | |
| Midazolam | Sandoz K.K. (Tokyo, Japan) | 1124401A1060 | |
| Nuclease free buffer | Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA) | 1072570 | |
| Nucleospin DNA extraction kit | Takara Bio Inc (Kusatsu, Japan) | 740952 .5 | |
| One-hole slide glass | Matsunami Glass Ind., Ltd. (Kishiwada, Japan) | S339929 | |
| One-step type Electroporator | BEX Co., Ltd. (Tokyo, Japan) | CUY21EDIT II | |
| Paraffin Liquid | NACALAI TESQUE Inc. (Kyoto, Japan) | SP 26137-85 | |
| Platinum plate electrode | BEX Co., Ltd. (Tokyo, Japan) | LF501PT1-10, GE-101 | |
| PMSG | ASKA Animal Health Co., Ltd (Tokyo, Japan) | SEROTROPIN 1000 | |
| Povidone iodide | Professional Disposables International, Inc. (Orangeburg, NY) | C12400 | |
| Reduced-Serum Minimal Essential Medium: OptiMEM I | Sigma-Aldrich, Inc. (St. Louis, MO) | 22600134 | |
| Two-step type Electroporator | Nepa Gene Co., Ltd. (Ichikawa, Japan) | NEPA21 |
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