Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Genetics

השימוש של עוברים הקפאת-הפשפה לייצור יעילות גבוהה של עכברים ששונו גנטית

doi: 10.3791/60808 Published: April 2, 2020
* These authors contributed equally

Summary

כאן, אנו מציגים שיטה ששונתה עבור הקפאת הזמנות של עוברי תא אחד, כמו גם פרוטוקול כי זוגות השימוש של עוברים הקפאת להקפיא ואלקטרופורציה עבור הדור היעיל של עכברים מהונדסים גנטית.

Abstract

השימוש בעכברים שעברו שינוי גנטי (GM) הפך לקריטי להבנת תפקוד הגנים ופענוח המנגנונים הבסיסיים של מחלות אנושיות. CRISPR/Cas9 מערכת מאפשרת לחוקרים לשנות את הגנום עם יעילות חסרת תקדים, נאמנות, ופשטות. רתימת טכנולוגיה זו, חוקרים מחפשים פרוטוקול מהיר, יעיל, קל ליצירת עכברים GM. כאן אנו מציגים שיטה משופרת עבור הקפאת הסתייגות של עוברי תא אחד המוביל לשיעור התפתחותי גבוה יותר של העוברים הקפאת ההקפאה. על ידי שילוב זה עם תנאי אלקטרופורציה אופטימיזציה, פרוטוקול זה מאפשר את הדור של הסתרה ועכברים לנקוש עם יעילות גבוהה ושיעורי פסיפס נמוך בתוך זמן קצר. יתר על כן, אנו מראים צעד אחר צעד הסבר על הפרוטוקול הממוטב שלנו, כיסוי CRISPR הכנה מגיב, הפריה חוץ גופית, הקפאה והפשרה של עוברי תא אחד, אלקטרופורציה של ריאגנטים CRISPR, העכבר הדור, ו-הקלדה של המייסדים. באמצעות פרוטוקול זה, החוקרים צריכים להיות מסוגלים להכין עכברים GM עם קלות, מהירות ויעילות ללא תחרות.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

האשכולות מקובצים באופן קבוע במרווחים קצר palindromic חוזר (CRISPR)/קריספר-חלבון משויך 9 (Cas9) מערכת היא פריצת דרך מדעית המספקת שינוי ממוקד חסר תקדים בגנום1. מערכת CRISPR/Cas9 מורכב Cas9 חלבון מדריך RNA (gRNA) עם שני מרכיבים מולקולריים: מטרה ספציפית CRISPR RNA (crRNA) ו-מפעיל הפעלת CRISPR RNA (tracrRNA)2 . GRNA מפנה את חלבון Cas9 למיקום מסוים בגנום, 20 נוקלאוטידים משלימים crRNA, ובצמוד המוטיב הסמוך מוטיב (פאם). חלבון Cas9 נקשר לרצף היעד וגורם הפסקות כפול הגדיל (dsbs) כי הם תוקנו על-ידי מועדים שגיאה שאינם הומוולוגיים סוף הצטרפות (nhej) או בנאמנות גבוהה הומולוגיה תיקון מכוון (HDR)3,4,5. NHEJ מוביל הוספות או/ו מחיקות (indels), ולכן לאובדן גנטי של הפונקציה כאשר רצף קידוד ממוקד. HDR מוביל לעריכת הגנום מדויק בנוכחות תבנית תיקון המכיל רצפים הומולוגיה3,4,5. NHEJ ו HDR כבר לרתום כדי ליצור נוקאאוט ועכברים לנקוש, בהתאמה.

בעוד מערכת CRISPR/Cas9 האיץ במידה ניכרת את הדור של עכברים GM עם יעילות ונאמנות מצטיינים, מדענים המחילים שיטות אלה נתקלים לעתים קרובות אתגרים טכניים. ראשית, פרוטוקולים קונבנציונליים דורשים מיקרוהזרקה להצגת כלי העריכה של crispr לתוך הבאוקלינוס של ביצים מופרות6,7. טכניקה זו גוזלת זמן ובדרך כלל דורש הכשרה נרחבת. כך, מספר קבוצות החליפו מיקרוהזרקה באמצעות אלקטרופורציה8,9,10,11,12,13. עם זאת, בפרוטוקולים אלקטרופורציה מוקדם שימשו עוברים טריים עבור אלקטרופורציה. זה גרם בעיה נוספת, כי הכנת עוברים טריים לפני כל ניסוי הוא קשה14.

לאחרונה אנחנו ואחרים שילבו את השימוש של עוברי הקפאת העוברים ואלקטרופורציה עבור עריכת הגנום, אשר מקל על הדור של GM עכברים15,16. פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים ללא כישורי מניפולציה מתקדמים העובר ליצור במהירות מודלים של בעלי חיים של מחלות אדם עם יעילות גבוהה. הפרוטוקול גם מפחית באופן משמעותי את האתגרים המעשיים ביצירת עכברים GM, כגון טרוגניות גנטית במייסדים16. כדי להתגבר על הפסיפס, אנו מבצעים את אלקטרופורציה של ריאגנטים CRISPR בתוך 1 h לאחר העובר החוצה כדי להבטיח כי העריכה מתרחשת לפני השכפול הראשון של הגנום. שיפור נוסף כולל את השימוש בחלבון Cas9 במקום Cas9 mRNA להפחתת פסיפס בלתי רצוי17. יתר על כן, פיתחנו שיטה אופטימלית עבור החלפת תא אחד העובר באופן המגביר את השיעור ההתפתחותי של שני תאים בשלב16: שימוש בסרום של שור העוברי (fbs) משפרת בצורה דרמטית את ההישרדות של הקפאת הקפאה oocytes לאחר הפריה, אולי על ידי18אותו מנגנון שעושה הקפאה מופרית בלתי מופרות יותר

כאן אנו מציגים פרוטוקול מקיף עבור הדור של עכברי מג באמצעות עוברים הקפאת ההקפאה, כולל שיטה ששונתה עבור הקפאה של עוברי תא אחד C57BL/6J. זה כולל 1) עיצוב gRNA, קריספלאר הכנה מגיב והרכבה; 2) הפריה חוץ גופית, הקפאה, והתרסה של עוברי תא אחד; 3) אלקטרופורציה של הריאגנטים של CRISPR לתוך עוברים המופשרים; 4) העברה העובר לתוך תעלת ההטלה של עכברים pseudopregnant נשיים; ו-5) בדיקות הגנוזות ורצף של חיות מייסד F0.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

כל טיפול בעלי חיים והליכים שבוצעו במחקר זה נעשו על פי הכללים והתקנות של המדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. הפרוטוקול הניסיוני אושר על ידי ועדת הטיפול בעלי חיים של בעלי חיים מעבדה של אוניברסיטת טויאמה, אוניברסיטת טוקיו, אוניברסיטת Jichi, ו מקס פלאנק פלורידה המכון למדעי המוח. מידע על כל הריאגנטים מופיע בטבלה של חומרים.

1. העיצוב הריאגנטים של CRISPR

  1. עיצוב crRNA
    1. בקר CRISPR ישיר19 (https://crispr.dbcls.jp/) כדי לתכנן crRNAs ספציפיים עם מופחת אתרים מחוץ ליעד.
      הערה: ישנם כלים רבים אחרים שימושיים לעצב את crRNA20 (https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/wereview/crisprtools/).
    2. הכנס את רצף נוקלאוטיד היעד ובצע את השינויים הבאים:
      הדרישה לרצף פם = NGG
      בדיקה ספציפיות = הגנום (Mus מוסקולוס), GRCm38/mm10 (דצמבר, 2011)
      הערה: כדוגמה, כדי ליצור עכברים מTyrosinase (Tyr), התמקד ב -2 (ברצף נוקלאוטיד מ-9476-9692).
    3. לחץ על עיצוב, ועל להיטים מסוימים מאוד, סמן את הצג את המטרה הספציפית ביותר בלבד.
    4. כדי להפחית את ההשפעות הפוטנציאליות מחוץ ליעד, בחר את רצף היעד עם הערך הנמוך ביותר בעמודות של "12 מר + פם" ו-"8 מר + פאם".
      הערה: בעמודות אלה, ("1") מציין שלרצף יש התאמה מושלמת אחת בלבד לאתר היעד המיועד ולמספרים הגדולים מאלה המציינים את נוכחותם של אתרים פוטנציאליים מחוץ ליעד.
    5. להזמין את האוקליונודים המתקבלים מחברות סינתזה crRNA (Supplimentary Table 1).
      הערה: עבור הגן של אקסון 2 tyr, נעשה שימוש ברצף היעד הבא: ggaccacטאאכאטק, עם + tgg כרצף פם (איור 2a).
  2. Oligodeoxynucleotide סטרנד יחיד (ssODN) עיצוב לניסויים בעריכת HDR-תיווך (כלומר, להקיש-in הדור עכברים).
    1. עיצוב האורך ssODN להיות סביב 80 – 180 bp כולל 30 – 60 נוקלאוטיד (nt) הומולוגיה זרועות משני הצדדים.
      הערה: ssodn של 75-85 nt באורך, כולל הזרוע 30-35 nt הומולוגיה ומשלימה את grna, הראה גבוה דפיקה-in עריכת יעילות21.
    2. הכנס את השינוי המיועד ומוטציה שקטה ברצף פם או, אם לא אפשרי, על 5 ′ בסיס השכנה של פאם לחסום את חיתוך מחדש לאחר עריכת הגנום.
      הערה: ה-crRNA ו-ssODN המשמשים במחקר זה מפורטים בטבלה השלמה 1.

2. הפריה חוץ-גופית, הקפאת העובר והקפאה

  1. הפריה חוץ גופית
    1. Superovulate C57BL/6J עכברים נקבה (4 או 8-בן שבועות) על ידי הזרקת IP עם הריון גונדוטרופין מארה בהריון (PMSG) ואחריו הזרקה עם 7.5 IU כוריוני האדם גונדוטרופין (hCG) לאחר 48 h.
      הערה: מספר הovulated אוציטים יכול להיות מוגבר על-ידי כ-3x באמצעות אולטרה-ביוץ22.
    2. הסר את האפידיתמים מינית בוגרת C57BL/6J עכברים גברים (3 – 5 חודשים).
      הערה: ניתן לאסוף מזרע מבלי להקריב את העכברים הזכרים.
    3. לחלץ קרישי דם של זרע עם המחט מבתר ו-דגירה אותם ב-200 μL שחרור של נוזל תובל אדם (HTF) ב-CO2 חממה עבור 1.5 h עבור מדרכיכים.
    4. לאסוף את מכלולי קומולוס-oocyte (COCs) מתוך ההטלה 16 – 18 h לאחר הזרקת hCG ו הדגירה אותם בירידה טריים 200 μL של המדיום HTF מכוסה פרפין נוזל ב-CO2 חממה (5% CO2, 37 ° c) עבור לא יותר מ 2 h.
      הערה: עדיף להקריב את העכברים על ידי פריקה צוואר הרחם תחת הרדמה כי המתת החסד באמצעות שאיפת2 משפיע על הפריה חוץ גופית ו העובר התפתחות23.
    5. הוסף 1 – 5 μL של השעיית זרע מן הגבול של בינונית דגירה ל-200 μL של שחרור HTF בינונית המכילה COCs ו-דגירה אותם ב-CO2 חממה עבור 3 h.
    6. לשטוף את oocytes עם אשלגן-בינוני אופטימיזציה בינונית (KSOM) 3x כדי להסיר את הזרע הנותרים תאים קומולוס.
    7. בדוק את היווצרות התאים ואת הציון של עוברי תא אחד באמצעות מיקרוסקופ הפוך.
  2. הקפאה של עוברי תא אחד
    1. מודנת תאים אחד העוברים בירידה μL 200 של HTF המכיל 20% FBS (לא מכוסה פרפין נוזל) עבור 10 דקות בחממה CO2 .
    2. העבר 20 – 100 עוברים אל 50 μL של 1 M diמתיל סולפוקסיד (DMSO) פתרון24.
    3. העברה 5 μL של פתרון המכיל 100 עוברים לתחתית הקריוצינור וקריר עבור 5 דקות ב 0 ° צ' באמצעות מצנן או על קרח.
    4. הוסף 45 μL של DAP213 (2 מסולפוקסיד diמתיל, 1 מרחאמיד, ו 3 M פרופילן גליקול) הפתרון לאט לאורך הקיר הצינור, כיסוי הצינורות, ולשמור על 5 דקות בתוך שאיפה או על קרח ב 0 ° c.
      הערה: אין להדק את כובעים חזק מדי כדי להסיר אותם בקלות במהלך הפשרה לדוגמה.
    5. אחסן צינורות במהירות בחנקן נוזלי.
  3. העובר הפשרה
    1. פתח את המכסה של הקריוצינור, להשליך את החנקן הנוזלי הנותרים, ולהוסיף 900 μL של 0.25 M הפתרון מחומם מראש ל 37 ° c.
      הערה: הפתרון ה0.25 של הג חייב להיות מחומם ל-37 ° c מראש משום שהשימוש בתמיסה קרה מקטין את הכדאיות העובר לאחר הפשרה.
    2. Pipet במהירות 10x ולהעביר את התוכן של הקריוצינור לתוך צלחת פלסטיק.
      הערה: יש לבצע את הליטוף בזהירות, כך ששום בועות לא נוצרות ופוגעות בעוברים.
    3. שטוף מורפולוגית נורמלית מופרית 2x ב-KSOM בינונית מכוסה פרפין נוזלי ולשמור אותם ב-CO2 חממה עד אלקטרופורציה.

3. הרכבה ואלקטרופורציה של מריאגנטים קריספיר

הערה: עבור electroporation, השתמשנו לוחית פלטינה האלקטרודה (גובה: 0.5 מ"מ, אורך: 10 מ"מ, רוחב: 3 מ"מ, פער: 1 מ"מ) ו-one-צעד electroporation מסוג אחד שתוארו קודם לכן8 (טבלת חומרים). ניתן להשתמש גם בשני שלבים מסוג אלקטרופורטור (רשימת חומרים).

  1. הכנה והרכבה של ריאגנטים קריספלאר
    1. הזמנת CRISPR ריאגנטים (כלומר, crRNA, tracrRNA, ו Cas9 חלבון) ו ssODN אם ביצוע ניסויים בעריכת HDR-תיווך (טבלת חומרים ושולחן משלים 1).
    2. הכינו את פתרון הריפוי כדלקמן.
      1. להכין 1 μg/μL crRNA ו 1 μg/μL tracrRNA בפתרון בינוני מינימלי בינונית Essential (טבלת חומרים), ולהוסיף 6 μl של כל פתרון כדי 42 μl של מאגר חינם nuclease.
      2. מודיית את התערובת בתנור יבש ב 95 ° c עבור 3 דקות וקריר ב RT עבור 5 דקות.
      3. הכינו 1 μg/μL HiFi Cas9 חלבון מדולל ב-Opti-גברתי ולהוסיף 6 μL לתערובת הקודמת עבור נפח כולל של 60 μL.
      4. ביצוע ניסויים בעריכת HDR-תיווך, הוסף 6 μL של 1 μg/μL ssODN. מכיוון שאמצעי האחסון הסופי צריך להיות 60 μL, השתמש 36 μL של מים ללא החכירה בשלב 3.1.2.1.
        הערה: הריכוז הסופי של crRNA, tracrRNA, Cas9 חלבון, ו ssODN יהיה 100 ng/μL.
      5. העברת עד 100 עוברים עד 25 μL של התערובת הסופית (RNP מורכבים) בזכוכית אחת שקופית חור ו-מארג אותם ב 37 ° צ' עבור 10 דקות.
  2. אלקטרופורציה
    1. למלא את פער האלקטרודה עם 6 μL של התערובת החדשה של ריאגנטים CRISPR ולהוסיף 20 – 25 עוברים לתערובת.
      הערה: חשוב להימנע מכל קשר בין העוברים לבין האלקטרודה האלקטרופורציה, העלולה לגרום נזק לעוברים במהלך פולסים חשמליים.
    2. בצע את האלקטרופורציה בתנאים הבאים עבור אלקטרופוראטור סוג של צעד אחד:
      מתח: 25 V, כיוון הפעימה (Pd) +
      ON: 3 אלפיות הזאת, OFF: 97 ms
      חזרה על: 5x
      הערה: האלקטרופורציה צריכה להתבצע לא יותר מ 1 h לאחר הפשרה כדי להבטיח עריכת הגנום מתרחשת לפני שכפול ה-DNA הראשון כדי למנוע פסיפס.
    3. עבור אלקטרופוראטור מסוג שני שלבים, הגדר את התנאים כדלקמן:
      דופק poring = 40V, Pd +
      ב = 1 או 2.5 אלפיות הראשונה; דופק מרווח = 50 ms
      חזרה על: 4x, דעיכה 10%

      דופק העברה = 5 או 7V; משטרת ניו-אורלינס
      ב: 50 ms; דופק מרווח = 50 ms.
      חזרה על = 5x; דעיכה = 40%.
      הערה: חשוב לכוונן את אמצעי האחסון כדי לשמור על העכבה בטווח הספציפי שצוין על-ידי היצרן.
    4. לשטוף את העוברים 3x עם שונה Krebs-צלצול ביקרבונט מאגר 2 (M2) בינוני ואחריו שני שוטף עם טיפה של מדיום KSOM מכוסה פרפין נוזל.
    5. מודטה את העוברים שטף (ב-KSOM בינונית) ב חממה2 לילה להשתלה נוספת.

4. העברת עובר

  1. . הכן pseudopregnant עכברים נשיים החבר icr נקבה עכברים (3 – 6 חודשים) עם עכברים גברים עיקור יום אחד לפני העברת העובר (ET).
    הערה: יש לבדוק את העכברים בבוקר שלמחרת לצורך חיבור שלילי. העכברים בעלי תקע נחשבים לpseudopregnant וניתן להשתמש בהם עבור ET.
  2. כאשר אתם מחפשים מיזוג אוויר ומאוורר, במרווחים חלופיים של 2 – 3 מ"מ לתוך נימי זכוכית כסמן להשתלה מוצלחת.
  3. הציגו 20 – 24 עוברים לתוך ירידה של 200 μL של KSOM (בלי פרפין נוזל) ולצייר 10 – 12 עוברים לתוך נימי הזכוכית עבור השרשה בכל צינור ההטלה.
  4. ליכלו את העכברים הנשיים על ידי isofליקאן (אינהלציה) או הזרקת IP של פתרון המשלב medetomidine/midazolam/butorphanol (0.3 mg/kg, 4.0 mg/ק"ג, ו 5.0 מ"ג/ק"ג בהתאמה). הצב את העכבר הורדם על צידו הגייתי במשטח חימום. להגן על העיניים של העכבר מורדם עם ג'ל לחות.
  5. להתגלח לאורך החלק התחתון של קו האמצע ולחטא את האזור עם יוד povidone ואחריו עם 70% אתנול.
  6. הפוך חתך ארוך של 1 ס מ במקביל לקו האמצע.
  7. תוציא את תעלת ההטלה ומניחים. על העטוף בפלסטיק סטרילי שמור את זה לח באמצעות תמיסת מלח סטרילית חם.
  8. הנח את צינור ההטלה מתחת למיקרוסקופ סטריאוסקופי.
  9. הפוך חור לתוך הקיר של תעלת ההטלה בין שפך ו ampulla כמה מילימטרים במעלה של ampulla על ידי מספריים microspring.
  10. הכניסו את קצה נימי הזכוכית המכילים את העוברים לתוך החור ומפוצצים בעדינות את פיו של בעל הנימים כדי לגרש את העוברים עד שבועת האוויר תהיה גלויה באמפוללה.
    הערה: העברה בין 10-12 עוברים לכל ההטלה.
  11. משוך את נימי הזכוכית מהקיר ההטלה ודחף את איבר הרבייה בעדינות חזרה לחלל הגוף.
  12. חזור על התהליך הקודם כדי להחדיר את העוברים לתעלת ההטלה האחרת.
  13. לאחר השלמת הליך ה-ET, תפר את הצפק בתבנית תפר פשוטה ומקוטע (50, נספג, תפר סינתטי קלוע) ולאחר מכן העור בתבנית מופסקת פשוטה או בתבנית תפר משנית שהופסקה (60 שאינם נספגים, תפרים מונוסינתטיים).
  14. לשמור על העכבר חם על צלחת התחממות 37 ° c עד שהוא מתאושש מן ההרדמה.
  15. נטר את בריאותו של בעל החיים מדי יום למשך 7 ימים לאחר הניתוח.

5. ניתוח הקלדה ורצף הגנוזות

  1. הפקת דנ א גנומית
    הערה: השתמשנו בערכות ה-DNA של רקמת הרקמה לחלץ את ה-DNA גנומית מרקמת האוזן לאחר ההמלצות של היצרן.
    1. להוסיף 180 μL של מאגר T1 ו 25 μL של הפתרון פרוטאינאז K למדגם ומערבבים על ידי vortexing עבור 10 s.
    2. מודטה ב 56 ° צ' עבור 2 h או עד להשלמת הפירוק מתקבל. מערבולת עבור 10 s כל 30 דקות של הדגירה.
    3. הוסף 200 μL של מאגר B3, מערבולת במרץ עבור 30 s, ו-דגירה ב 70 ° צ' עבור 10 דקות.
    4. הוסף 210 μL של 100% אתנול למדגם מערבולת במרץ.
    5. עבור כל דוגמה, מקם עמודת רקמה אחת בתוך צינור אוסף והחל את המדגם על העמודה.
    6. צנטריפוגה עבור 1 דקות ב 11,000 x g, למחוק את הפרח דרך, ולמקם את העמודה בחזרה לתוך צינור האוסף.
    7. הוסף 500 μL של מאגר BW כדי לשטוף את המדגם (1 לשטוף), צנטריפוגה עבור 1 דקות ב 11,000 x g, למחוק את הפרח דרך ולמקם את העמודה בחזרה לתוך צינור האוסף.
    8. הוסף 600 μL של מאגר B5 לעמודה (לשטוף 2), צנטריפוגה עבור 1 דקות ב 11,000 x g, למחוק את הפרח דרך, ולמקם את העמודה בחזרה לתוך צינור האוסף.
    9. צנטריפוגה את העמודה עבור 1 דקות ב 11,000 x g כדי לייבש את קרום סיליקה ולמקם את העמודה נוקלאוטיספין הרקמה לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL.
    10. הוסף 100 μL של מאגר BE, דגירה בטמפרטורת החדר עבור 1 דקות, ואז צנטריפוגה 1 דקות ב 11,000 x g.
  2. הגברה וטיהור של הPCR
    1. עיצוב התחל באמצעות אתר primer3 plus (https://primer3plus.com/) על מנת להגביר את רצף הלחץ של 400-500 המקיף את מקום היעד.
    2. עצב פרוטוקול PCR חדש ובדוק אותה באמצעות התוכנית.
    3. טהר את מוצר ה-PCR כדי להסיר את האנזימים הלא רצויים, נוקלאוטידים, התחל ורכיבי המאגר. ניתן להשתמש בשיטת טיהור סטנדרטית כדלקמן.
      1. הוסף 50 μL של פנול כדי 50 μL של מוצרי ה-PCR ומערבבים על ידי vortexing.
      2. צנטריפוגה עבור 1 דקות ב 11,000 x g והעבר את השכבה השקופה העליונה לשפופרת חדשה.
      3. הוסף 120 μL של 99.5% אתנול ו 20 μL של 5 מטרים אמוניום אצטט ו מערבולת עבור 30 s.
      4. לשמור על RT עבור 10 דקות ו צנטריפוגה ב 11,000 x g עבור 10 דקות.
      5. להיפטר supernatant ולשטוף את הגלולה DNA עם 1 mL של 70% אתנול.
      6. יבש את הגלולה ב RT עבור 10 דקות ולפזר 10 μL של RNase מים חופשיים.
        הערה: ערכות הטיהור המבוססות על העמוד PCR ממליצים משום שפנול רעיל לבני אדם.
  3. רצף שטנגר
    1. הפעל ניתוח כימות DNA (ראה טבלת חומרים) כדי לכמת את ה-PCR הטהור amplicon.
    2. שלח את מוצרי ה-PCR ואת הרצף (ים) לספק שירות ברצף.
    3. ניתוח הרצף באמצעות אתרי האינטרנט המקוונים הזמינים.
      הערה: במחקר זה, חד-מזהה25 (http:/crispid. gbiomed.) שימש לניתוח רצף.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

השיטה המתוקנת שלנו עבור הקפאה של עוברי תא אחד, כולל הדגירה של HTF המכיל 20% FBS עבור 10 דקות ואחריו הקפאה ב 1 מסוג DMSO ו DAP213 פתרון, שיפור הקצב ההתפתחותי של העוברים הקפאת המופשנים לשלב שני תאים (איור 1, p = 0.009, סטודנט של t-test). העוברים הקפאה שימשו לייצור עכברים GM ותנאי אלקטרופורציה היו ממוטבים: חמש חוזר על 25 וולט עם 3 הפולסים ms ו 97 ms מרווחי זמן באמצעות אלקטרופורציה כפי שמתואר בסעיף פרוטוקול. תחולתה של הפרוטוקול נבדק על ידי דור של הלבקן Tyrosinase gene (Tyr) בעכברים (איור 2). כדי לעשות זאת, grna פילוח אקסון 2 תוכנן (איור 2a) ו-crispr ריאגנטים היו מוכנים כמתואר בסעיף פרוטוקול. כלי העריכה היו electroporated בתוך 1 h של העובר הפשרה כדי להבטיח עריכת הגנום התרחשה לפני השכפול הראשון של הגנום ובכך מנעו פסיפס של המייסדים (איור 2B). כל העכברים שנוצרו היו לבקנים, ורק עכבר אחד היה פסיפס, עם מעיל עם טלאים לבנים ושחורים (איור 2C). כל העכברים לבקן מחסה שני אללים מוטציות שונות (heterozygous מוטציה) למעט עכבר אחד מחסה רק אללים אחד (homozygous מוטציה) מוצגים באיור 2e. ניתן להסיק כי השיטה שלנו יכול לספק יעילות עריכה של קרוב 100% עם שיעור פסיפס נמוך כפי שאושר על ידי ניתוח רצף כמו גם צבע מעיל (איור 2CE).

לאחר מכן, את השגות של הפרוטוקול נבדק על ידי הדור של כמה שורות של נוקאאוט ועכברים לנקוש. כפי שמוצג בטבלה 1, הפרוטוקול יכול ליצור הסתרה ועכברים דופקים עם יעילות גבוהה ושיעורי פסיפס נמוך. רוב העכברים שנוצרו F0 הזדווג עם סוג פראי C57BL/6j עכברים כדי לאשר את השידור germline של אללים מוטציות לדורות F1. כפי שציפינו, כל הצאצאים F1 של העכברים homozygous F0 היו heterozygous, המכיל אחד אלל מוטציה ואחד פראי אלל סוג. לא נצפו מוטציות שונים בין הגנוטיפים של המייסדים לבין הדורות שלהם. הפרוטוקול המתואר הופק עכברים GM בתוך זמן קצר (כלומר, ~ 4 שבועות) כפי שמוצג בזרימת העבודה של הפרוטוקול באיור 3.

Figure 1
איור 1: סרום העובר העוברי (FBS) שיפר את שיעור שני התא התפתחותי השלב של העוברים הקפאת להקפיא. מספר העוברים FBS + היה 286 (הניסוי חזר על 3x), ומספר העוברים FBS היה 272 (הניסוי חזר על 3x). נתונים מוצגים כממוצע ± SEM. איור זה מועתק מדרוויש מ' ואח '16 באישור. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: הדור של עכבר הסתרה Tyr עם יעילות גבוהה ושיעור פסיפס נמוך. נתון זה משתנה מדרוויש מ' ואח '16 באישור. (א) תרשים סכמטי המציג את העיצוב של grna. . הרצף של פם מוצג באדום (ב) איור המציג את עיתוי האלקטרופורציה לעוברים הקפאת ההקפאה, הסמל הצהוב מייצג את זמן האלקטרופורציה. (ג) תמונות מייצגות של עכברי הנוקאאוט של tyr שנוצרו. (ד) ניתוח רצף של אלולים שונים של עכברי הנוקאאוט של tyr. רצף היעד מסומן באדום ומקפים מצביעים על מחיקת נוקלאוטידים באלוס המוטציות. WT = פראי סוג M = מוטציה allele. (ה) חלק מייצג של כרומוטוגרמה של העכבר הלבקן המכיל את אלל M1 מוצג D. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: זרימת העבודה של הפרוטוקול עבור הדור של עכברים GM. הצעד הראשון היה הכנת שעוברים הקפאת שמורות. C57BL נקבה/6J עכברים היו superovulated, הראשון על ידי PMSG הזרקת, ואז 48 h מאוחר יותר על ידי הזרקת hCG. COCs נאספו 16 h מאוחר יותר ונתון הפריה חוץ גופית עם זרע שנאספו מC57BL זכר/6J העכבר. המוציטים המוופרות שמורות ואוחסנו בחנקן נוזלי עד לצורך. השלב השני כלל את העוברים והאלקטרופוריות. הקפאת העוברי העוברים הופלו ו CRISPR ריאגנטים (כלומר, tracrRNA, crRNA, ו Cas9 חלבון) התאספו ואלקטרופורבתוך 1 h לאחר התאגף את העוברים. השלב השלישי כלל העברת העובר והולדת עכברים. יום לאחר האלקטרופורציה, עוברים שני תאים הועברו ההטלה של עכברים pseudopregnant נקבה כדי ליצור עכברים מהונדסים גנטית שהיו מאוחר יותר מגנטי באמצעות רצף Sanger כדי לאשר את יעילות העריכה. הזמן והמאמץ הנדרשים להכנת האוציטים מופרות לפני כל ניסוי (שלב 1) ניתן לתקצר אם מספר רב של עוברים הקפאת שמורות מוכן מראש. דמות זו מותאמת מדרוויש מ' ואח '16אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

עכברים מוטנטים עוברים אלקטרופורבטים שני תאים עוברים עוברים שהועברו כלבלבים (%) עכברים מוטנטים (%) אין עכברי פסיפס
טיר קו 124 84 48 12 (25) 100 1
גלrb 151 94 40 6 (15) 100 0
Slc39a6 קו 48 25 25 5 (20) 100 0
Bag3 קי 233 84 20 3 (15) 50 1
Camk2a קי 124 70 70 14 (20) 64.3 0

טבלה 1: הפקה של מספר שורות של עכברים GM באמצעות הקפאת עוברים המופשרים של C57BL/6J רקע.

טבלה משלימה 1. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הטבלה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

הפרוטוקול המתואר מאפשר דור של עכברים GM עם יעילות גבוהה ושיעורי פסיפס נמוך (שולחן 1). זה מאפשר לחוקרים ללא מניפולציה מתקדמת מיומנויות העובר כדי ליצור עכברים מוטציה בקלות כי זה מנצל את ההתקדמות האחרונה ושימושי ביותר הן הנדסת הרבייה והגנום עריכת טכנולוגיות: crispr/Cas9 ribonucleoprotein (rnp) ו אלקטרופורציה לתוך הקפאת עוברים המופשלים. ההתקדמות הזאת הקלה ומואצת את הדור של עכברים GM. כפי שמתואר באיור 3, זה לוקח ~ 4 שבועות כדי ליצור את העכברים GM. לעומת פרוטוקולים אחרים באמצעות גישות דומות26, השיטה שלנו היא נעלה מבחינת היעילות, קצב הלידה והפסיפס.

הדגירה של עוברים תא אחד ב-FBS לפני ההזמנה הקריוגנית היא קריטית לשיפור קצב ההתפתחות של העוברים. תנאי האלקטרופורציה של העוברים הקריושמורים, המתוארים בפרוטוקול, מאפשרים פשרה בין יעילות העריכה של ריאגנטים CRISPR והישרדות העוברים. ואכן, תנאים מיותר או יותר מתון עשויים להשפיע על הקצב ההתפתחותי של העוברים ויעילות העריכה, בהתאמה16. העיתוי של האלקטרופורציה (איור 2B) הוא קריטי להתגבר על הפסיפס של המייסדים ולהבטיח ששינוי הגנום יתרחש בנוכחות של שני אללים בלבד. הדבר מתאים לדיווחים קודמים המראים כי אלקטרופורציה של השלב המוקדם עלולה ליצור מוטציות שאינן מפסיפס17. בנוסף, השימוש RNP במקום gRNA/mRNA מקטין את שיעור הפסיפס ומשפר את יעילות העריכה17.

הפרוטוקול המתואר כולל מספר יתרונות. ראשית, הוא יוצר את עכברי המוטציות תוך זמן קצר (~ 4 שבועות). שנית, זהו פרוטוקול יעיל ויציב מאוד; כמה שורות של נוקאאוט (KO) ו-טוק-in (KI) עכברים נוצרו עם שיעורי מוטציה גבוהה (KO = 100%, KI = 50 64.3%). שלישית, היא נוחה וחסכונית. השימוש של crRNA סינתטי מלאה, tracrRNA, ssODN, ו Cas9 חלבון מבטלת את הצורך הכנה מייגע של וקטורים Cas9 ו שעתוק מבחנה. במקום זאת, הוא מאפשר לחוקרים פשוט להשתמש ריאגנטים מסחרי וציוד סטנדרטי. רביעית, היא אינה משתמשת במיקרו הזרקה, הדורשת כישורים טכניים גבוהים. החמישית, היא מפחיתה את הפסיפס של המייסדים, ובכך מובילה להעברת שורות מאוד יעילה של האללים הערוכות, והתגברות על ניתוח גנוסטימית מורכב של עכברי הפסיפס. לבסוף, פרוטוקול זה הוא יעיל עם C57BL/6J זן הטבעי, אשר מונעת את השימוש של כלאיים F1, ובכך את הצורך לבצע צלבים רבים מאחור כדי להיפטר המורכבות הגנטית. . אישר שידור מדויק של גרמקו עם זאת, לא מומלץ ללמוד את פנוטיפים של עכברים F0 בשל המורכבות אלל ואת החיזוי מטעה של הגנויות של הדור הבאים מתוך הפקת הגנויות של F0 המייסדים14,27.

זה החשיבות העיקרית לרתום את השימוש של העוברים הקפאת להפשיר בעריכת הגנום של פרימטים שאינם אנושיים ובעלי חיים גדולים כמו חזירים וכבשים, אשר אינם תמיד זמינים. דרכי הקיפאון של העובר משתנות מאוד בהתאם למין החי. לכן, אנו סבורים שפרוטוקול הקריופפלקס שלנו עשוי להיות ישים רק לעכברים. מצד שני, הפרוטוקול שלנו הוא ישים להשתמש בנוקלאוסים הנדסיים שונים מ-Cas9 לדור של עכברים GM, כי אלקטרופורציה דווחה בעבר כדי להציג נוקלאוסים אחרים כגון Cas12a לתוך העובר ביעילות28,29.

מגבלה אחת של הפרוטוקול היא שילוב מדויק של הגנום הארוך לתוך הגנים, אשר נחשב קשה בפרוטוקולים מבוססי אלקטרופורציה. עם זאת, פתרון פוטנציאלי אחד דווח: שילוב של transgenes עד 4.9 Kb בגנום העכבר בוצע בהצלחה על ידי שילוב אלקטרופורציה עם וירוס הקשורים adeno (aav)-בתיווך מערכת משלוח של תורם HDR30, אישור פרסום מוקדם יותר31. כמו כן, ההתרחשות הפוטנציאלית של תופעות לוואי מחוץ ליעד היא דאגה מרכזית עם השימוש בטכנולוגיית CRISPR/Cas9. אנחנו לא ביצעו רצף הגנום השלם של העכברים שנערכו כדי להוציא את הפוטנציאל הפוטנציאלי מחוץ ליעד. עם זאת, השתמשנו בכלי CRISPR שדווחו כדי להפחית את האפקט מחוץ ליעד, כגון RNP32. יתר על כן, השתמשנו Cas9 variant באיכות גבוהה שמפחית באופן משמעותי את העריכה מחוץ ליעד מבלי להקריב את הביצועים על היעד33. כמו כן, עיצבנו gRNAs באמצעות תוכנה CRISPRdirect (https://crispr.dbcls.jp), אשר אמור לגרום רצפי היעד עם ממוזער מחוץ לאתר היעד19. כדי לאשר את גנוטיפ-פנוטיפ סיבתיות ולהקל את החששות לגבי השפעות מחוץ ליעד, החוקרים צריכים ליצור עכברים שנערכו מספר באותו גנוטיפ באמצעות gRNAs שונים או לבצע backcrossing חוצה של עכברים שנוצרו במשך מספר דורות.

עכברים הנוקאאוט שנוצר באמצעות מנגנון NHEJ ומוטציות frameshift כבר בשימוש נרחב להראות פנוטיפים רלוונטיים. עם זאת, חלבון שיורית קטומה יכול להתקיים עקב או הליך מחדש תרגום או דילוג על אקסון נערך34,35. לכן, כדי לפרש בדיוק את הפנוטיפים, האפיון של תפקוד או ביטוי של חלבון שיורית הוא הכרחי. הדור של העכבר המלא הסתרה עכברים באמצעות יותר gRNA אחד יהיה חלופה טובה. עם זאת, יש לשלם תשומת לב מיוחדת כדי לוודא שהגן אינו מכיל אזורים לא מוגדרים לקידוד RNAs, שייתכן שיהיו בעלי פונקציות רגולטוריות ומכאן לסבך את הניתוח הפנופי.

במחקר זה, אנו מראים פרוטוקול פשוט שבו חוקרים רבים יכולים ליצור עכברים ששונו גנטית ב 4 שבועות או פחות. על-ידי שילוב השימוש בעוברים הקפאת הקפאה ואלקטרופורציה, אנו משרים את הכנת דגמי העכבר של מחלות האדם בקלות, מהירה ויעילה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין גילויים פיננסיים רלוונטיים.

Acknowledgments

אנו מבקשים להודות לחיטומי סוראדה. ואליזבת גרסיה לטיפול בחיות עבודה זו היתה נתמכת על ידי KAKENHI (15K20134, 17K11222, 16H06276 ו 16H06276) ו Hokugin מחקר גרנט (ל ח), ו Jichi רפואי האוניברסיטה הצעירה פרס החוקר הצעיר (כדי H.U.). קרן מלגות אוטסקה טושימי נתמכת md

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25 M Sucrose ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) SUCROSE
1 M DMSO ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) 1M DMSO
Butorphanol Meiji Seika Pharma Co., Ltd. (Tokyo, Japan) Vetorphale 5mg
Cas9 protein: Alt-R® S.p. HiFi Cas9 Nuclease 3NLS Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA) 1081060
C57BL/6J mice Japan SLC (Hamamatsu, Japan) N/A
DAP213 ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) DAP213
FBS Sigma-Aldrich, Inc. (St. Louis, MO) ES-009-C
hCG MOCHIDA PHARMACEUTICAL CO., LTD (Tokyo, Japan) HCG Mochida 3000
HTF ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) HTF
ICR mice Japan SLC (Hamamatsu, Japan) N/A
Isoflurane Petterson Vet Supply, Inc. (Greeley, CO) 07-893-1389
KSOM ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) KSOM
LN2 Tank Chart Industries (Ball Ground, GA) XC 34/18
M2 ARK Resource Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) M2
Medetomidine Nippon Zenyaku Kogyo Co.,Ltd. (Koriyama, Japan) 1124401A1060
Microscope Nikon Co. (Tokyo, Japan) SMZ745T
Midazolam Sandoz K.K. (Tokyo, Japan) 1124401A1060
Nuclease free buffer Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA) 1072570
Nucleospin DNA extraction kit Takara Bio Inc (Kusatsu, Japan) 740952 .5
One-hole slide glass Matsunami Glass Ind., Ltd. (Kishiwada, Japan) S339929
One-step type Electroporator BEX Co., Ltd. (Tokyo, Japan) CUY21EDIT II
Paraffin Liquid NACALAI TESQUE Inc. (Kyoto, Japan) SP 26137-85
Platinum plate electrode BEX Co., Ltd. (Tokyo, Japan) LF501PT1-10, GE-101
PMSG ASKA Animal Health Co., Ltd (Tokyo, Japan) SEROTROPIN 1000
Povidone iodide Professional Disposables International, Inc. (Orangeburg, NY) C12400
Reduced-Serum Minimal Essential Medium: OptiMEM I Sigma-Aldrich, Inc. (St. Louis, MO) 22600134
Two-step type Electroporator Nepa Gene Co., Ltd. (Ichikawa, Japan) NEPA21

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/cas-mediated genome engineering. Cell. 153, (4), 910-918 (2013).
  2. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA - guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337, (6096), 816-822 (2012).
  3. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, (6121), 823-826 (2013).
  4. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/VCas systems. Science. 339, (6121), 819-823 (2013).
  5. Doudna, J. A., Charpentier, E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346, (6213), 1258096 (2014).
  6. Mashiko, D., et al. Generation of mutant mice by pronuclear injection of circular plasmid expressing Cas9 and single guided RNA. Scientific Reports. 3, 3355 (2013).
  7. Yen, S. T., et al. Somatic mosaicism and allele complexity induced by CRISPR/Cas9 RNA injections in mouse zygotes. Developmental Biology. 393, (1), 3-9 (2014).
  8. Kaneko, T., Mashimo, T. Simple genome editing of rodent intact embryos by electroporation. PLoS ONE. 10, (11), 1-7 (2015).
  9. Qin, W., et al. Efficient CRISPR/cas9-mediated genome editing in mice by zygote electroporation of nuclease. Genetics. 200, (2), 423-430 (2015).
  10. Kaneko, T., Sakuma, T., Yamamoto, T., Mashimo, T. Simple knockout by electroporation of engineered endonucleases into intact rat embryos. Scientific Reports. 4, 6382 (2014).
  11. Hashimoto, M., Takemoto, T. Electroporation enables the efficient mRNA delivery into the mouse zygotes and facilitates CRISPR/Cas9-based genome editing. Scientific Reports. 5, 11315 (2015).
  12. Chen, S., Lee, B., Lee, A. Y. F., Modzelewski, A. J., He, L. Highly efficient mouse genome editing by CRISPR ribonucleoprotein electroporation of zygotes. Journal of Biological Chemistry. 291, (28), 14457-14467 (2016).
  13. Modzelewski, A. J., et al. Efficient mouse genome engineering by CRISPR-EZ technology. Nature Protocols. 13, (6), 1253-1274 (2018).
  14. Teixeira, M., et al. Electroporation of mice zygotes with dual guide RNA/Cas9 complexes for simple and efficient cloning-free genome editing. Scientific Reports. 8, 474 (2018).
  15. Nakagawa, Y., et al. Production of knockout mice by DNA microinjection of various CRISPR/Cas9 vectors into freeze-thawed fertilized oocytes. BMC Biotechnology. 15, (1), 1-10 (2015).
  16. Darwish, M., et al. Rapid and high-efficient generation of mutant mice using freeze-thawed embryos of the C57BL/6J strain. Journal of Neuroscience Methods. 317, 149-156 (2019).
  17. Hashimoto, M., Yamashita, Y., Takemoto, T. Electroporation of Cas9 protein/sgRNA into early pronuclear zygotes generates non-mosaic mutants in the mouse. Developmental Biology. 418, (1), 1-9 (2016).
  18. Sakamoto, W., Kaneko, T., Nakagata, N. Use of frozen-thawed oocytes for efficient production of normal offspring from cryopreserved mouse spermatozoa showing low fertility. Comparative Medicine. 55, (2), 136-139 (2005).
  19. Naito, Y., Hino, K., Bono, H., Ui-Tei, K. CRISPRdirect: Software for designing CRISPR/Cas guide RNA with reduced off-target sites. Bioinformatics. 31, (7), 1120-1123 (2015).
  20. Torres-Perez, R., Garcia-Martin, J. A., Montoliu, L., Oliveros, J. C., Pazos, F. WeReview: CRISPR Tools-Live Repository of Computational Tools for Assisting CRISPR/Cas Experiments. Bioengineering. 6, (3), 63 (2019).
  21. Okamoto, S., Amaishi, Y., Maki, I., Enoki, T., Mineno, J. Highly efficient genome editing for single-base substitutions using optimized ssODNs with Cas9-RNPs. Scientific Reports. 9, 4811 (2019).
  22. Takeo, T., Nakagata, N. Superovulation using the combined administration of inhibin antiserum and equine chorionic gonadotropin increases the number of ovulated oocytes in C57BL/6 female mice. PLoS ONE. 10, (5), 1-11 (2015).
  23. Wuri, L., Agca, C., Agca, Y. Euthanasia via CO2 inhalation causes premature cortical granule exocytosis in mouse oocytes and influences in vitro fertilization and embryo development. Molecular Reproduction and Development. 86, (7), 825-834 (2019).
  24. Nakagata, N. High survival rate of unfertilized mouse oocytes after vitrification. Journal of Reproduction and Fertility. 87, (2), 479-483 (1989).
  25. Dehairs, J., Talebi, A., Cherifi, Y., Swinnen, J. V. CRISP-ID: Decoding CRISPR mediated indels by Sanger sequencing. Scientific Reports. 6, 28973 (2016).
  26. Nakagawa, Y., Sakuma, T., Takeo, T., Nakagata, N., Yamamoto, T. Electroporation-mediated genome editing in vitrified/warmed mouse zygotes created by ivf via ultra-superovulation. Experimental Animals. 67, (4), 535-543 (2018).
  27. Nakajima, K., Nakajima, T., Takase, M., Yaoita, Y. Generation of albino Xenopus tropicalis using zinc-finger nucleases. Development Growth and Differentiation. 54, (9), 777-784 (2012).
  28. Hur, J. K., et al. Targeted mutagenesis in mice by electroporation of Cpf1 ribonucleoproteins. Nature Biotechnology. 34, 807-808 (2016).
  29. Dumeau, C. E., et al. Introducing gene deletions by mouse zygote electroporation of Cas12a/Cpf1. Transgenic Research. 28, (5-6), 525-535 (2019).
  30. Chen, S., et al. CRISPR-READI: Efficient Generation of Knockin Mice by CRISPR RNP Electroporation and AAV Donor Infection. Cell Reports. 27, (13), 3780-3789 (2019).
  31. Mizuno, N., et al. Intra-embryo Gene Cassette Knockin by CRISPR/Cas9-Mediated Genome Editing with Adeno-Associated Viral Vector. iScience. 9, 286-297 (2018).
  32. Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly Efficient RNA-guide genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24, (6), 1012-1019 (2014).
  33. Vakulskas, C. A., et al. A high-fidelity Cas9 mutant delivered as a ribonucleoprotein complex enables efficient gene editing in human hematopoietic stem and progenitor cells. Nature Medicine. 24, (8), 1216-1224 (2018).
  34. Rodriguez-Rodriguez, J. A., et al. Distinct Roles of RZZ and Bub1-KNL1 in Mitotic Checkpoint Signaling and Kinetochore Expansion. Current Biology. 28, (21), 3422-3429 (2018).
  35. Smits, A. H., et al. Biological Plasticity Rescues Target Activity in CRISPR Knockouts. Nature Methods. 16, 1087-1093 (2019).
השימוש של עוברים הקפאת-הפשפה לייצור יעילות גבוהה של עכברים ששונו גנטית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nishizono, H., Darwish, M., Uosaki, H., Masuyama, N., Seki, M., Abe, H., Yachie, N., Yasuda, R. Use of Freeze-thawed Embryos for High-efficiency Production of Genetically Modified Mice. J. Vis. Exp. (158), e60808, doi:10.3791/60808 (2020).More

Nishizono, H., Darwish, M., Uosaki, H., Masuyama, N., Seki, M., Abe, H., Yachie, N., Yasuda, R. Use of Freeze-thawed Embryos for High-efficiency Production of Genetically Modified Mice. J. Vis. Exp. (158), e60808, doi:10.3791/60808 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter