Summary
Describimos el aislamiento, dispersión y chapado de células primarias de pulpa dental (DP) con neuronas trigéminos (TG) cultivadas sobre filtros transwell. Las respuestas celulares de las células DP se pueden analizar con inmunofluorescencia o análisis de ARN/proteína. La inmunofluorescencia de marcadores neuronales con microscopía confocal permite el análisis de las respuestas de crecimiento de neurita.
Abstract
La inervación dental permite que los dientes perciban la presión, la temperatura y la inflamación, todos los cuales son cruciales para el uso y mantenimiento del órgano dental. Sin la inervación sensorial, las actividades orales diarias causarían daños irreparables. A pesar de su importancia, los papeles de la inervación en el desarrollo y mantenimiento de los dientes se han pasado por alto en gran medida. Varios estudios han demostrado que las células DP secretan proteínas de matriz extracelular y señales paracrinas para atraer y guiar los axones TG dentro y a lo largo del diente. Sin embargo, pocos estudios han proporcionado información detallada sobre la conversación cruzada entre el mesenquime DP y los afferents neuronales. Para abordar esta brecha en el conocimiento, los investigadores han comenzado a utilizar cocultivos y una variedad de técnicas para investigar estas interacciones. Aquí, demostramos los múltiples pasos involucrados en el co-cultivo de células DP primarias con neuronas TG dispersas en un filtro transwell overlying con poros de gran diámetro para permitir el crecimiento axonal a través de los poros. Las células primarias de DP con el gen de interés flanqueado por sitios loxP se utilizaron para facilitar la eliminación de genes utilizando un sistema de recombinación Adenovirus-Cre-GFP. El uso de neuronas TG del ratón Thy1-YFP permitió imágenes precisas aferentes, con una expresión muy por encima de los niveles de fondo mediante microscopía confocal. Las respuestas DP se pueden investigar a través de la recolección y análisis de proteínas o ARN, o alternativamente, a través de la tinción inmunofluorescente de células DP chapadas en tapas de vidrio extraíbles. Los medios se pueden analizar utilizando técnicas como los análisis proteómicos, aunque esto requerirá agotamiento de la albúmina debido a la presencia de suero bovino fetal en los medios. Este protocolo proporciona un método simple que se puede manipular para estudiar las respuestas morfológicas, genéticas y citoesqueléticas de las neuronas TG y células DP en respuesta al entorno controlado de un ensayo de cocultivo.
Introduction
La inervación dental permite que los dientes perciban la presión, la temperatura y la inflamación, todos los cuales son cruciales para el uso y mantenimiento del órgano dental. La falta de detección del dolor dental asociado con la caries dental y el trauma tensias conduce a la progresión de la enfermedad. Por lo tanto, la inervación adecuada es un requisito para el crecimiento normal de los dientes, la función y el cuidado.
Mientras que la mayoría de los órganos son completamente funcionales e inervados en el momento del nacimiento, el desarrollo dental se extiende a la vida adulta, con la inervación dental y la mineralización que se produce en concierto durante las etapas postnatales1,2. Curiosamente, el mesenquimo de pulpa dental (DP) inicialmente secreta señales repelentes durante la embriogénesis para evitar la entrada de axón en el órgano dental en desarrollo, que más tarde se desplaza a la secreción de factores de atracción a medida que el diente se acerca a la erupción3,4. Durante las etapas posnatales, los axones aferentes del nervio trigémino (TG) penetran en y a lo largo del diente alrededor del momento en que comienza la deposición de la dentina (revisado en Pagella, P. et al.5). Varios estudios in vivo han demostrado que las interacciones neuronales-mesenquimales guían la inervación dental en ratones (revisado en Luukko, K. et al.6), pero pocos detalles de los mecanismos moleculares están disponibles.
Los cocultivos celulares proporcionan entornos controlados en los que los investigadores pueden manipular las interacciones entre las poblaciones neuronal y mesenquimales. Los experimentos de cocultivo permiten profundizar en las vías de señalización que guían la inervación y el desarrollo de los dientes. Sin embargo, varios de los métodos convencionales utilizados para estudiar células en cocultivo presentan desafíos técnicos. Por ejemplo, la tinción violeta cristalina del crecimiento de neurita puede manchar no específicamente las células Schwann incluidas en las dispersiones del haz tG, y puede haber picos de intensidad de color con respuestas relativamente pequeñas7. Las cámaras microfluídicas ofrecen una opción atractiva, pero son considerablemente más caras que los filtros transwell8,9 y solo permiten la investigación de las respuestas neuronales a las secreciones del PD. Para abordar estos problemas, hemos desarrollado un protocolo que permite: a) la tinción precisa y la toma de imágenes del crecimiento de neurita TG en respuesta a las secreciones de DP, b) la modificación genética de las células DP y / o neuronas TG para investigar vías de señalización específicas, y c) la investigación de las respuestas celulares DP a los factores secretados por las neuronas TG. Este protocolo proporciona la capacidad de investigar con precisión varias características de la inervación dental en el entorno controlado de un ensayo de cocultivo in vitro.
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Protocol
Todos los experimentos con ratones fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC, por sus) por sus úDS.
1. Preparación de placas
NOTA: Coverslips se puede utilizar para crear imágenes de celdas DP al final del ensayo. Asegúrese de que la tapa de la placa esté encendida durante todos los pasos de incubación y ensanación fuera de la campana de cultivo de tejido estéril para evitar la contaminación durante el procesamiento de la muestra.
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Preparación de cubreobjetos
- Autoclave de cubiertas circulares.
- Filtrar agua ultrapura debajo de la campana.
- Transfiera los cubrecones a una placa de 24 pocillos y cubra cada uno con 400 ml de poli-D-lisina de 0,1 mg/ml.
- Deje que los cubreobjetos se empapan, sumergidos durante 5 minutos, en un balancín a 12 rpm o agitador orbital a 40-50 rpm. Asegúrese de que la tapa esté encendida para evitar la contaminación.
- Enjuague los cubreobjetos con agua ultrapura filtrada durante unos 5 minutos en un balancín a 12 rpm o agitador a 50 rpm. Repetir.
- Deje que los cubreobjetos se sequen durante al menos 2 horas debajo de la capucha con la tapa de la placa apagada para facilitar la evaporación. Estos cubreobjetos deben utilizarse en un plazo de 48 h.
- Las células DP de semillas cubren los labios y el proceso al final del ensayo para la inmunofluorescencia (sección 3.3).
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Filtros de recubrimiento
- Diluir la minin a 10 g/ml. Filtrar el laminin diluido debajo del capó.
- Pipetear 450-500 l de laminin a cada pocal de una placa de 24 pocillos.
- Colocar el filtro transwell, porosidad de 3 m, en un pozo para que entre en contacto con la solución laminina y déjela en una incubadora de 37oC durante 2 horas o durante la noche. Los poros de filtro deben permitir que parte de la solución se difunda y recubra tanto la parte superior como la parte inferior del filtro. Estos filtros deben utilizarse en un plazo de 48 h o refrigerarse a 4 oC durante un máximo de 1 semana.
2. Revestimiento celular con manipulación genética opcional
- Ratones: Se puede realizar una alteración genética de las células DP (pero no es necesaria) para estudiar las interacciones mesenquimal-neuronal. Consulte las secciones 2.3 y 2.4 para conocer las variaciones genéticas sugeridas.
- Disección DP, dispersión y chapado (Figura 1)
NOTA: Para la disección DP, utilice fórceps ultrafinos y rectos. Los bordes ultrafinos permitirán al usuario cuñar el borde de forrteo entre la estructura mineralizada y el tejido DP.- Cosecha de ratones P5-P8. En esta etapa, los dientes deben ser mineralizantes, y la raíz está abierta.
- Anestetiza los neonatos a través de hipotermia colocándolos en un plato en el refrigerador de 4oC hasta que ya no se muevan o respondan al tacto. Eutanasia de los neonatos por decapitación y de acuerdo con los procedimientos de la IACUC en las instalaciones designadas.
- Preparar una alícuota de 3-5 ml de 0.25% trypsin-EDTA en un tubo cónico de 50 ml para recoger el DP de cada ratón. Esto facilitará la digestión de la pulpa dental de ratones postnatales. Utilice más de 3 ml si digiere tejido de más de 10 ratones postnatales.
- Coloque la cabeza en una almohadilla inferior desechable para que la boca esté hacia el techo y la base del cuello esté plana en la superficie de trabajo. Utilice una cuchilla de afeitar en un movimiento de aserrado para separar la mandíbula del maxilar.
- Opcionalmente, retire la lengua con tijeras o con fórceps para permitir un acceso más fácil a los molares.
- Coloque la cabeza abierta en un plato sobre una gasa estéril y colóquela bajo un microscopio de disección(Figura 1D).
- Retire el tejido óseo alveolar que rodea los primeros molares. Los dientes submandibulares no están completamente en erupción en este punto. Inserte fórceps en la abertura alveolar y se bílegue sobre el tejido lejos del diente hacia el lado bucal (mejilla) o lingual (lengua) de la boca. Los dientes maxilares requerirán la extracción completa de la hendidura alrededor del diente para la exposición y extracción.
- Transfiera suavemente los primeros molares submandibulares y maxilares (M1s) a un plato de cultivo celular separado con 1 salina con búfer de fosfato (PBS).
- Repita 2.2.4-2.2.8 hasta que se recojan todos los M1. Mantenga el plato que contiene los M1 en hielo durante la cosecha.
- Retire el órgano exterior del esmalte (EOE) que rodea el exterior de cada M1. Esto se puede hacer alternativamente después del paso 2.2.11.
- Con un conjunto de fórceps, gire el M1 para que las cúspides estén abajo y la raíz abierta se exponga. Habrá una abertura ovalada en la parte inferior del diente, y tejido DP opaco encapsulado por una fina capa de dentina y esmalte.
- Usando la punta de los fórceps, afloje suavemente el PD ejecutando un brazo de los fórceps alrededor de la circunferencia interna del tejido mineralizado. Retire el tejido DP de la estructura mineralizada y transfieralo a un tercer plato que contenga 1 x PBS. Quite el EOE si aún no estaba separado(Figura 1E).
- Transfiera todo el tejido DP al 0,25% de trippsina-EDTA en un tubo cónico de 50 ml. Vortex la mezcla y colocar en un baño de agua caliente de 37 oC durante 10 minutos. Esto se puede hacer con los mismos fórceps o con fórceps largos del vial. El tejido será difícil de dispersar y requerirá vórtice cada 3-4 minutos. NO exceda la trippsinización de 10 minutos ya que la tripsina puede dañar las membranas celulares.
- Bajo una capucha estéril, agregue los medios de cocultivo calentados (Tabla 1) a una proporción final de al menos 1:1 medio para que la triplina indesactive la enzima. Las relaciones más grandes son aceptables si se desea más dispersión de tejido.
- Pipetee los medios hacia arriba y hacia abajo varias veces con una pipeta de 10 ml para dispersar aún más el DP en los medios. Tenga cuidado de evitar burbujas grandes. La dispersión completa es casi imposible debido a la naturaleza pegajosa del tejido. Sin embargo, tampoco es necesario ya que las células migrarán hacia afuera desde el tejido una vez chapadas.
- Transfiera 1 ml del DP disperso a cada pocal de una placa de cultivo de tejido de 24 pocillos(Figura 1F).
- Colocar la placa en una incubadora a 37 oC y permitir que las células se adhieran y migren del tejido no disperso durante 48 horas antes de cambiar el medio. Las células primarias necesitan ser chapadas a concentraciones relativamente altas con el fin de alcanzar 85-90% de confluencia dentro de 1 semana. Si esto no se logra después de 1 semana, deseche la placa.
- Manipulación genética opcional de células DP
- Para alterar las vías de señalización celular, coseche las células DP de ratones nocaut genéticos o de ratones en los que un gen de interés esté flanqueado por sitios loxP. En este último caso, el gen se puede eliminar utilizando la recombinación Adenovirus-Cre-GFP (Ad-Cre-GFP) para eliminar el gen flanqueado, como se describe a continuación. Utilice Adenovirus-eGFP (Ad-eGFP) como virus de control para asegurarse de que la infección viral no causa una respuesta celular.
NOTA: Ad-eGFP es controlado por el potenciador promotor CMV, que es muy fuerte. Ad-Cre-GFP está regulado por un IRES, una región reguladora interna entre el Cre y el GFP, que no es muy fuerte. Esto resulta en una fluorescencia más brillante en las células Ad-eGFP que las células Ad-Cre-GFP. Confirmar niveles de infección equivalentes basados en el número total de células fluorescencia, no en los niveles de fluorescencia celular. - Preparar 500 ml de medios que contengan virus y 10 g/ml de polibrino por poca. El polibreno ayuda con la infección viral en células cercanas a la confluencia10. Este protocolo se basa en una multiplicidad de infección (MOI) de 100 para Ad-eGFP y 200 Ad-Cre-GFP para una infección génica eficiente con poco o ningún efecto sobre la viabilidad celular. El número de celda estimado es 4 x 104 células/pozo de una placa de 24 pocillos:
- Mezcle los medios con un breve vórtice o pipeteo y agregue 500 l a cada poca.
- Después de las 24 h, agregue 500 ml adicionales de medios de cocultura que no contengan polibrino o virus adicionales.
- Después de un total de 48 h, aspirar medios que contengan virus y reemplazarlos con nuevos medios de cocultura. En este punto, las neuronas TG se pueden agregar sobre filtros transwell.
- Para alterar las vías de señalización celular, coseche las células DP de ratones nocaut genéticos o de ratones en los que un gen de interés esté flanqueado por sitios loxP. En este último caso, el gen se puede eliminar utilizando la recombinación Adenovirus-Cre-GFP (Ad-Cre-GFP) para eliminar el gen flanqueado, como se describe a continuación. Utilice Adenovirus-eGFP (Ad-eGFP) como virus de control para asegurarse de que la infección viral no causa una respuesta celular.
- Disección, dispersión y chapado de neuronas trigéminos
NOTA: En este protocolo, la toma de imágenes del crecimiento de neurita en el cocultivo con células DP se optimizó utilizando adolescentes (6 semanas de edad) B6.Cg-Tg(Thy1-YFP)16Jrs/J ratones. Los sistemas nerviosos centrales y periféricos de los ratones Thy1-YFP tienen una etiqueta de proteína fluorescente amarilla (YFP) cuya expresión comienza alrededor de P6-P10 en las neuronas y aumenta exponencialmente en todo el sistema nervioso durante la vida postnatal y adulta11,12. YFP y GFP han conservado secuencias que permiten que estos nervios se tiñen con anticuerpos anti-GFP, lo que resulta en una mancha panneuronal. En última instancia, estos ratones permiten una mejor visualización y cuantificación de las neuronas utilizadas y cultivadas en el cultivo celular.- Eutanasia ratones adolescentes con dióxido de carbono seguido de luxación cervical.
- Decapita a los ratones y retira la piel del cráneo. Asegúrese de incluir números equivalentes de machos y hembras.
- Inserte la punta de un par de tijeras de micro-disección en la base del cráneo. Corte a lo largo de la sutura sagital del cráneo(Figura 1A).
- Hacer cuatro pequeños cortes horizontales: dos a lo largo de las suturas coronales por las orejas, y dos a lo largo de las suturas lambdoidas en la base del cráneo. Esto debería crear dos colgajos de hueso.
- Usa los fórceps para pelar los dos colgajos de hueso. Esto debería revelar el cerebro.
- Quita el cerebro. Transfiera la cabeza a un plato de cultivo de tejido con 1 x PBS y colóquela bajo el microscopio.
- Localizar el tanda del TG, que es fácilmente visible en los roedores13,alojados en la dura materia entre el cerebro y el hueso del proceso maxilar(Figura 1B).
- Corta las tres ramas que viajan a los ojos, el maxilar y la mandíbula y transfiere los ganglios a 1o PBS frío usando fórceps finos de borde recto. Mantenga el plato que contiene los ganglios TG en hielo durante la cosecha.
- Una vez cosechados todos los paquetes de TG, transfiera los ganglios a un tubo cónico de 50 ml que contenga 5 mg/ml de colagenasa filtrada estérilmente tipo II utilizando fórceps de vial.
- Vortex la colagenasa con el haz de TG y colocar el tubo en un baño de agua de 37 oC durante 25-30 min. Durante este tiempo, saque el tubo cónico del baño de agua, vórtice y vuelva al baño cada 5-10 minutos.
- Centrifugar la solución de neurona de colagenasa-TG durante 2 min a 643 x g.
- Bajo una capucha de cultivo de tejido, aspira suavemente la colagenasa con una micropipette.
- Añadir 5 ml de 1% de trippsina filtrada estérilmente tipo II y vórtice. Colocar el tubo cónico en un baño de agua de 37oC durante 5 min.
- Centrifugar la mezcla trypsin-TG durante 5 min a 643 x g. Retire la parte superior de la trippsina con un micropipeta, de modo que no se eliminen las neuronas TG. Todavía habrá líquido en el tubo.
- Agregue suficientes medios para desactivar la trippsina restante (en una proporción 1:1 o inferior de trippsina a medios).
- Cuente el número de células y diluya la solución a 200.000 células/ml (250 ml de 50.000 células que contienen células).
- Coloque los filtros transwell recubiertos de la sección 1.2 en pozos con DP.
- Diluir la solución que contiene células de modo que haya 200.000 células/ml. Pipetear 250 l sobre el filtro transwell y cultivar las células a 37 oC durante la noche(Figura 1F).
- Al día siguiente, sustituya los medios por 1 ml de medios de cocultivo por 1 m de uridina y 15 M 5'-fluor-2'desoxiuridina para detener la sobreproliferación de células mesenquimales que pueden prevenir el crecimiento de neurita. Opcional: Agregue factores de crecimiento o inhibidores en este medio si intenta una manipulación adicional.
- Comate las celdas para obtener puntos de tiempo deseados adicionales. Este protocolo fue optimizado para 5 días totales de cultivo con los medios cambiados sólo el día 2 para agregar inhibidores mitóticos. Los períodos de tiempo más largos requerirán cambios adicionales en los medios.
3. Recolección y procesamiento de muestras
- Tinción del trigémino
- Pipetear 1 ml de alícuotas de 1x PBS estéril en una placa de 24 pocillos bajo una campana de cultivo de tejido para cada filtro transwell a procesar.
- Retire el líquido encima del filtro con una pipeta de 200-1.000 l, teniendo cuidado de dejar intactas las capas celulares. Las células conectadas deben permanecer unidas y las células no conectadas se soltarán durante este suave pipeteo. Un filtro de vacío puede dañar la capa celular y no se recomienda para la aspiración.
- Transfiera el filtro a la placa 1x PBS, asegurándose de eliminar la capa superior de medios como se mencionó en el paso anterior.
- Coloque la placa con todos los filtros y tapas transwell en un balancín a 12 rpm o 40-50 rpm en un agitador orbital durante 10 minutos.
- Aspirar el PBS, incluyendo la capa superior como se describió anteriormente, añadir 500 s de 1xPBS y colocar en el balancín o agitador orbital para un enjuague adicional de 5-10 minutos.
- Aspirar el 1x PBS una vez más y reemplazar con 4% de paraformaldehído (PFA). Utilice al menos 500 ml para que toda la superficie del filtro esté sumergida. Coloque la placa en un balancín a 12 rpm o agitador orbital a 40-50 rpm a temperatura ambiente durante 1 h.
- Retire el PFA y enjuague las placas dos veces durante 5-10 min cada una en un balancín con 500 s de 1x PBS.
- Bloquear con albúmina sérica 10% bovina (BSA) + 5% de suero de cabra/donkey, dependiendo del animal huésped de anticuerpos secundarios, en 0.05% Tween-1xPBS (PBST). Utilice 450-500 ml de solución para que el filtro se sumerja en el líquido.
NOTA: En esta etapa, estas placas se pueden almacenar a 4 oC durante varios meses para procesarlas más adelante. Utilice el parafilm para sellar la placa para asegurarse de que la evaporación no se produzca y compruebe regularmente la evaporación para que las superficies del filtro permanezcan sumergidas. - Retire el bloque y agregue 450-500 s de anticuerpo primario en 1% BSA-PBST sin un enjuague adicional. Incubar a 4oC durante la noche, balanceándose suavemente.
- Retire la solución primaria de anticuerpos y enjuague con 500 ml de 1xPBST en un balancín, 3 veces, a temperatura ambiente
- Retire el PBST, agregue el anticuerpo secundario e incubar en un balancín durante la noche a 4 oC envuelto en papel de aluminio para proteger a los fluoróforos de la degradación de la luz. Enjuague de nuevo, 3 veces, con 1pbST en un balancín a temperatura ambiente. Reemplace por 1pbS.
NOTA: En este punto, la placa se puede almacenar durante varios meses a 4 oC si se envuelve en papel de aluminio para evitar la degradación del fluoróforo. Utilice el parafilm para sellar la placa para asegurarse de que la evaporación no se produzca y compruebe regularmente la evaporación para que las superficies del filtro permanezcan sumergidas. Lo mejor es crear una imagen en el plazo de un mes. - Para obtener imágenes óptimas, utilice las neuronas de ratón Thy1-YFP con un anticuerpo anti-GFP para manchar específicamente los aferentes neuronales muy por encima de los niveles de fondo. Utilice Anti-Neurofilamento 200 para manchar con precisión las estructuras axonales si los ratones Thy1-YFP no están disponibles.
- Imagen como se desee. Los filtros no necesitan ser chapados y en su lugar se pueden colocar sobre un cubreobjetos o deslizarse para obtener imágenes con un microscopio invertido.
NOTA: Las áreas del filtro no contendrán estructuras aferentes. Tome varias imágenes con una profundidad de pila z que capture todas las estructuras aferentes. Utilice el software de costura para visualizar el crecimiento de neurita en áreas grandes, o (preferiblemente) regiones de filtro enteras.
- Recolección de ARN, proteínas y medios
- Mientras se procesan los filtros transwell, recoja los medios en tubos libres de ARNi/DNAse y se congele para ensayos posteriores (ELISA, proteómica, etc.).
- Inmediatamente después de la recolección de medios, tampón de lisis alícuota o ensayo de precipitación de radio inmuno (RIPA) tampón con inhibidores de la proteinasa y la fosfatasa en los pozos. Este protocolo fue optimizado para 100 l/bien en una placa de 24 pocillos.
- Permita que los tampones a las células de la durante 5 minutos, luego raspe cada filtro con una nueva punta de pipeta y recoja las muestras de células en tubos libres de ARNI/ADN. Congele la lisis para futuros ensayos (PCR semicuantitativo y/o cuantitativo, Western blot, etc.).
- Inmunofluorescencia opcional de células de pulpa dental:
- Levante suavemente los cubreobjetos de la Sección 1.1 con fórceps y transfieralos a diferentes pozos con un 4% de PFA durante 1 h con balanceo.
- Aspirar PFA y enjuagar los labios de las cubiertas dos veces con 1x PBS. Siga esto con permeabilización, bloqueo e inmunofluorescencia para marcadores de interés con técnicas de inmunofluorescencia estándar.
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Representative Results
Estos resultados muestran que el crecimiento de la neurita TG se incrementó en presencia de células DP primarias en el pozo subyacente en comparación con el control del monocultivo de neurita TG(Figura 2A,C). Hay cierta variabilidad de ensayo a ensayo en el crecimiento de neurita. Por lo tanto, un monocultivo de neurona TG debe incluirse en todos los ensayos como un control para detectar los niveles basales de crecimiento de neurita. Las células primarias del ratón Tgfbr2f/f se utilizaron en este protocolo después de que se confirmara la infección de Ad-Cre-GFP y Ad-eGFP en números equivalentes de células(Figura 2D). El Ad-eGFP sirvió como vector viral de control. El Ad-Cre-GFP eliminó el gen flanqueado, Tgfbr2, como lo demuestra el PCR semicuantitativo(Figura 2E). En los cultivos con la eliminación del receptor beta 2 del factor de crecimiento transformador (Tgfbr2), se redujo el crecimiento de la neurita(Figura 2A-C).
Utilizamos las neuronas TG de ratón Thy1-YFP y las teñimos con un anticuerpo anti-GFP que produjo imágenes muy específicas y brillantes de estructuras axonales muy por encima de este fondo, como se muestra en la Figura 2. Esto permitió la tinción específica de marcadores neuronales sin tinción inespecífica de células no neuronales mediante la utilización de métodos previamente reportados como violetacristalino 7. Los poros grandes de los filtros pueden autofluoresce y/o acumular anticuerpos secundarios y disminuir la precisión de las imágenes axonales(Figura 3). Mientras que las neuronas Thy1-YFP con inmunofluorescencia mejoran drásticamente la imagen, se pueden eliminar más antecedentes con software de umbral automático y luego cuantificar. También recomendamos realizar inmunofluorescencia para Neurofilamento 200 basándose en nuestros hallazgos preliminares (no mostrados) así como otros8,9 si no hay ratones Thy1-YFP disponibles.
Figura 1: Un esquema de la disección del ratón para obtener celdas para el cocultivo. (A) Un diagrama de dónde cortar para abrir el cráneo del ratón y localizar los nervios TG, mostrados en negro en la última representación. Las tijeras indican dónde insertar las puntas de las tijeras para cortar a lo largo de las líneas punteadas. (B) Una imagen combinada de campo oscuro y GFP que muestra los nervios Thy1-YFP+ TG circuló en blanco. (C) Los ganglios TG diseccionados pueden ser dispersados y cultivados, como se muestra en F. (D) La mandíbula de un ratón P7, con fórceps sosteniendo la mandíbula a la izquierda y crestas óseas alveolares que contienen dientes sin erupciones a cada lado de la lengua. (E) Tejido DP (círculo) extraído de la estructura mineralizada (arriba), y el epitelio exterior del esmalte (inferior) que se extrajo para dispersar y placa en una placa tratada con cultivo tisular, como se muestra en F. Las imágenes no se muestran a escala. Las células DP se dispersaron y crecieron hasta confluencia antes de agregar neuronas TG. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Resultados representativos de la cocultura. (A-C) Las neuronas Thy1-YFP TG se cultivaron en filtros transwell con poros de 3 m sobre células Primarias Tgfbr2f/f DP. Se realizó una tinción inmunofluorescente para la proteína YFP utilizando un anticuerpo anti-GFP para proporcionar una tinción muy específica de las estructuras neuronales en todo el filtro. Las proyecciones máximas de imágenes de microscopía confocal de pila z de 100 m a 10x fueron recogidas y cosidas con software de costura. Las neuronas TG demostraron un crecimiento significativamente mayor cuando se co-cultivaron con células DP (A) que cuando se cultivan solas (C). No se indujo el crecimiento de neurita cuando las neuronas fueron co-cultivadas con células DP infectadas con Ad-Cre-GFP para derribar Tgfbr2 (B). Barra de escala a 1.000 m. Números equivalentes de células infectadas con Ad-eGFP y Ad-Cre-GFP se muestran en (D). Barra de escala a 125 m. PCR semicuantitativo confirmó el Tgfbr2 KD (E). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Dificultades técnicas presentadas en imágenes aferentes. (A) Imágenes de campo brillante de filtros transwell después de la tinción violeta cristalina de las poblaciones celulares. Los poros grandes son frecuentes. La flecha grande señala una célula que exhibe morfología mesenquimal, mientras que la flecha pequeña apunta a una célula de morfología neuronal. Cristal violeta manchado ambas células sin sesgo. (B) La tinción inmunofluorescente de la tubulina n.o 3 con un anticuerpo secundario Alexa-488 mostró tinción no específica de múltiples células, lo que dificultaba la toma de imágenes de estructuras aferentes. Las imágenes son representativas y se repitieron en varios ensayos para optimizar las imágenes que se muestran en la Figura 2. Barra de escala a 50 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Componente | Volumen | Concentración | |
| MEM | 440 ml | ||
| Suero bovino fetal inactivado por calor | 50 mL | 10% | |
| 100x L-glutamina | 5 mL | 1x | |
| Penicilina-estreptomicina 100 x | 5 mL | 1x | |
| Cambiar los medios el día 2 con inhibidores mitoticos en estas concentraciones finales | |||
| Uridina | 1 M | ||
| 5'-Fluor-2'desoxiuridina | 15 m | ||
Tabla 1: Medios de cocultura.
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Discussion
Las actividades diarias de la cavidad oral requieren que los dientes sienten los estímulos externos y la inflamación interna con el fin de permitir el uso adecuado y el mantenimiento. Sin embargo, sólo se dispone de información limitada con respecto a las señales que impulsan los procesos de desarrollo de la inervación dental. Este protocolo proporciona un método para aislar y co-cultivar células DP primarias y neuronas TG con el fin de estudiar la comunicación cruzada entre las dos poblaciones. Se optimizaron varias variables y se abran más vías de investigación, como se describe a continuación.
Los controles son importantes en cada paso de este ensayo. Un filtro transwell con neuronas TG sin células DP subyacentes debe incluirse en cada ensayo para proporcionar una línea de base para el crecimiento de TG. Al eliminar un gen flanqueado de interés con una recombinación Ad-Cre-GFP, se debe utilizar un virus de control que exprese únicamente el marcador fluorescente para confirmar que se han infectado números equivalentes de células. Si bien demostramos altos niveles de infección con una muerte celular mínima a 100 y 200 MOI para Ad-eGFP y Ad-Cre-GFP, respectivamente, cada laboratorio debe optimizar este paso. Debido a que las proteínas fluorescentes se pueden unir a diferentes promotores y, por lo tanto, causar números equivalentes de expresión diferencial de infectados, se deben contar las células fluorescentes. La intensidad general de la fluorescencia es irrelevante porque no refleja con precisión el estado de la infección. Es importante demostrar la eliminación del gen, como se muestra con la PCR semicuantitativa en este protocolo(Figura 2). Si bien este protocolo no abordó este tema, investigaciones anteriores demostraron que los ensayos de control con otras líneas celulares podrían incluirse para demostrar que el crecimiento de neurita es inducido específicamente por el cocultivo con células DP8.
Debido a que este protocolo utiliza células primarias, hay varias etapas en las que se puede introducir la contaminación. Para evitar esto, todos los reactivos deben ser estériles filtrados. Además, se recomienda que los experimentos para cada variable se ejecuten en duplicado o triplicado para permitir la eliminación de un filtro y la esterilización de un pozo contaminado sin fallas completas del ensayo.
Los revestimientos deben estar recubiertos con poli-D-lisina y/o una proteína de matriz extracelular para asegurar la adhesión de las células DP. Mientras que las células se unen inicialmente, la infección viral causa la muerte por elevación celular en los cubreescudos sin recubrimiento y previene la manipulación genética del ensayo de cocultura.
Está bien establecido que las células no neuronales, como las células Schwann de los ganglios TG, pueden afectar la supervivencia de las células neuronales en el cultivo14,15,16. En este protocolo, la supervivencia neuronal se optimizó añadiendo 1 m de uridina y 15 M 5-fluoro-2'deoxyuridina. Sin la adición de estos agentes antimitóticos para inhibir la proliferación celular de Schwann, no se producirá el crecimiento de neurita. Se desconoce si la presencia de estas células Senescentes de Schwann en el cocultivo altera la respuesta neuronal. Aislar las neuronas murinas requiere varios pasos adicionales, y los protocolos están disponibles para los investigadores que quieren eliminar esta variable17. En cualquier caso, la dispersión de la neurona imita un poco una axotomía y podría considerarse que representa una lesión/reparación18 más que el desarrollo. Se requerirían más estudios para determinar las diferencias entre el crecimiento axonal in vivo de fascículos frente al crecimiento axonal de neuronas individuales in vitro, y estos no se abordan en este protocolo.
Este protocolo tarda 1-3 semanas de principio a fin. Si bien es posible utilizar células DP que requieren más de 1 semana para alcanzar 85-90% de confluencia, se recomienda que las células se sembran a una densidad lo suficientemente alta como para alcanzar la confluencia dentro de unos pocos días ya que estas células se dividen muy lentamente más allá de ese punto. Esto generalmente requiere alrededor de 5-7 P5-8 ratones por fila de una placa de 24 pocillos. Este protocolo fue optimizado para un total de 5 días de co-cultivo, momento en el que los medios con fenol rojo comenzaron a cambiar de color. Los medios deben cambiarse si se desean ensayos más largos.
Se han realizado varios ensayos de cocultivo para demostrar el crecimiento de la neurita en respuesta a factores secretados por el PD secretos factores con placas de cultivo de tejido recubiertas de ECM estándar3,19,20,21 o cámaras microfluídicas8,22,23. Este protocolo ofrece varias ventajas sobre estos métodos. Por ejemplo, la cocultura de tanda y tejido DP requiere una relación espacial específica para que los neurites perciban y respondan a las señales paracrinas de corto alcance. Con el cultivo de órganos, sólo los neuros en los ganglios más cercanos al tejido DP son capaces de responder3, mientras que las neuronas TG dispersas utilizadas en este protocolo se cultivan a la misma distancia de las células DP debajo. En segundo lugar, los cultivos de órganos pueden introducir necrosis tisular debido a la falta de oxígeno y nutrientes disponibles en grandes muestras24. El cocultivo de células dispersas elimina esta posibilidad. Algunos cocultivos, incluyendo las neuronas requieren medios neuronales3,22 que pueden desempeñar un papel dominante en la promoción del crecimiento de la neurita. Este protocolo no agrega factores de crecimiento específicos de las neuronas, lo que permite una evaluación de la relación directa entre las señales paracrinos de las células DP subyacentes y las respuestas de crecimiento de neurita. Vale la pena señalar que los medios de cocultura también carecen de componentes para promover la mineralización, como el beta-glucerofosfato. Esto permite a los investigadores determinar cómo los neurites podrían secretar señales para fomentar la mineralización. Sin embargo, también limita el estudio incluyendo sólo células DP menos diferenciadas sin los odontoblastos mineralizantes que normalmente estarían presentes in vivo.
Las respuestas colorimétricas de investigaciones anteriores7,8 no delinean las contribuciones celulares de Schwann ni demuestran la morfología neuronal ya que el cristal violeta no mancha específicamente todas las células. La tinción inmunofluorescente de los filtros puede dar lugar a altos niveles de fondo que dificultan la imagen aferente(Figura 2). El protocolo actual permite la tinción precisa de afferents neuronales mediante la utilización de neuronas Thy1-YFP TG y un anticuerpo anti-GFP y proporciona una señal lo suficientemente brillante como para generar grandes imágenes de crecimiento a lo largo de toda una cifra(Figura 3). Es posible utilizar otros marcadores neuronales, como Anti-Neurofilamento 200, si los ratones Thy1-YFP no están disponibles.
Por último, el uso de células DP primarias de ratones con genes de interés flanqueados por sitios loxP permite la eliminación simple y eficiente de estos genes con un sistema Ad-Cre-GFP. En estudios futuros, el sistema de recombinación Ad-Cre podría utilizarse en las neuronas TG si tienen un gen de interés flanqueado por sitios loxP. Esto facilitaría los estudios sobre cómo las señales paracrinas de la población neuronal influyen en las células DP, particularmente si las células DP se sembran sobre los cubrepitos (Sección 1.1). Estudios futuros pueden utilizar otras manipulaciones, como la adición de inhibidores farmacológicos y / o factores de crecimiento. También es posible modificar este protocolo para incluir estudios de migración mediante el uso de filtros de transolería de porosidad de 8 m.
En conclusión, este ensayo de cocultivo transwell utilizando neuronas y células DP permite la investigación de múltiples parámetros celulares. Esto hace posible ampliar el cuerpo de conocimiento sobre las interacciones mesenquimal-neuronal es decir, que promueven y apoyan la inervación dental.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por a) la beca National Institutes of Health/NIAMS (números de subvención R01 AR062507 y R01 AR053860 a RS), b) la beca de formación académica dental de la Universidad de Alabama en Birmingham (DART) (número T90DE022736 (PI MacDougall)) al PAS del Instituto Nacional de Investigación Dental y Craneofacial (DART) c) una subvención piloto y de viabilidad del Centro Global de Trastornos Craneofaciales, Orales y Dentales (GC-CODED) de la UAB a la PAS y d) al Instituto Nacional de Trastornos Dentales y Craneofaciales Investigación/Institutos Nacionales de Salud K99 DE024406 a Pas pasión.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-Fluoro-2'-deoxyuridine | Sigma-Aldrich | F0503 | Used as a mitotic Inhibitor at 15 μM concentration in co-culture media, Day 2 |
| 24 Well Cell Culture Plate | Corning | 3524 | Co-culture plate |
| Alexa-546 anti-chicken | Invitrogen | A-11040 | Secondary to stain neurite outgrowth labeled by anti-GFP antibody, 1:500 dilution |
| Anti-GFP Antibody | Aves Lab, Inc | GFP-1010 | Primary antibody to label Thy1-YFP neurons, 1:200 dilution |
| Anti-Neurofilament 200 antibody | Sigma-Aldrich | NO142 | Monoclonal primary antibody to label neurons, 1:1000 dilution, alternative if YFP mice are not available |
| B6;129- Tgfbr2tm1Karl/J | The Jackson Laboratory | 12603 | Tgfbr2f/f mouse model used for dental pulp cells in optimized protocol |
| B6.Cg-Tg(Thy1-YFP)16Jrs/J | The Jackson Laboratory | 3709 | Thy1-YFP mouse model genotype used for trigeminal neurons |
| Collagenase Type II | Millipore | 234155-100MG | Used to disperse trigeminal neurons |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437 | Additive to co-culture media |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11413-11 | Fine forceps for TG dissection |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | Coats the transwell inserts at final concentration of 10 μg/ml, stock solution is assumed at 1.5 mg/ml |
| Lysis Buffer (Buffer RLT) | Qiagen | 79216 | Extracts RNA from dental pulp cells post co-culture |
| L-Glutamine | Gibco | 25030081 | Additive to co-culture media |
| Micro-dissecting scissors | Sigma-Aldrich | S3146-1EA | Dissection scissors to open skull |
| Microscope Cover Glass | Fisherbrand | 12-545-81 | Circlular coverslip for optional cell culturing and immunofluorescence processing |
| Minimal Essential Medium a | Gibco | 12571063 | Co-culture media base |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070063 | Antibiotic additive to co-culture media |
| Phosphatase Inhibitor | Sigma-Aldrich | 04 906 837 001 | Additive to RIPA Buffer for extracting protein from dental pulp cells post co-culture |
| Polybrene | Millipore | TR-1003-G | Used to aid in dental pulp cell transfection |
| Poly-D-Lysine | Sigma-Aldrich | P7280 | Coverslip coating to aid dental pulp cellular adhesion |
| Protease Inhibitors | Millipore | 05 892 791 001 | Additive to RIPA Buffer for extracting protein from dental pulp cells post co-culture |
| RNAse/DNAse free eppendorf tubes | Denville | C-2172 | Presterilized 1.7 ml tubes for RNA, DNA or protein collection at the end of assay |
| ThinCert Cell Culture Insert | Greiner Bio-One | 662631 | Transwell inserts for trigeminal neurons in co-culture assays |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | Used fto disperse dental pulp cells |
| Trypsin Type II | Sigma-Aldrich | T-7409 | Used to disperse trigeminal neurons |
| Ultra Fine Forceps | Fine Science Tools | 11370-40 | Ultra fine forceps for dissection |
| Uridine | Sigma-Aldrich | U3750 | Used as a mitotic Inhibitor at 1 μM concentration in co-culture media, Day 2 |
| Vacuum Filtration System | Millipore | SCNY00060 | Steriflip disposable filter, 50 μm nylon net filter |
| Vial forceps | Fine Science Tools | 110006-15 | Long forceps for tissue transfer to conicals |
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