Summary
이 방법의 목적은 적혈구 CR1 밀도가 알려진 세 명의 피험체와 비교하여 임의의 적혈구에서 CR1 밀도를 결정하는 것입니다. 이 방법은 피코에리트린(PE)을 사용하여 증폭된 시스템에 결합된 항 CR1 단일클론 항체에 의한 피험자의 적혈구의 면역 염색 후 유세포분석을 사용한다.
Abstract
CR1 (CD35, C3b/C4b를 위한 보체 수용체 타입 1)은 약 200 kDa의 고분자량 막 당단백질로, 활성화를 보완하고 면역 복합체를 운반하며 체액 및 세포 면역 반응에 참여합니다. CR1은 적혈구를 포함한 많은 세포 유형의 표면에 존재하며, 길이, 구조(Knops, 또는 KN, 혈액형) 및 밀도에서 다형성을 나타낸다. 적혈구 당 CR1의 평균 밀도 (CR1/E) 적혈구 당 500 분자입니다. 이 밀도는 한 개인에서 다른 (100-1,200 CR1/E)와 같은 개인의 적혈구에서 다른 사람까지 다양합니다. 우리는 증폭 면역 염색 시스템의 도움으로 낮은 밀도를 발현하는 과목을 포함하여 CR1/E의 밀도를 측정하는 견고한 유량 세포 분석 방법을 제시합니다. 이 방법은 알츠하이머 병 (AD), 전신 홍반성 루푸스 (SLE), 에이즈 또는 말라리아와 같은 질병에서 CR1 적혈구 발현의 저하를 보여줄 수있게했습니다.
Introduction
CR1(수용체 타입 1, CD35)은 적혈구1,B 림프구2,단핵세포, 일부 T 세포, 여포 수지상 세포3,태아 성상세포4,및 사구체 포세포5와같은 많은 세포 유형의 표면에 존재하는 200 kDa 막 막 당단백질이다. CR1은 리간드 C3b, C4b, C3bi6,,7,,88,9,제1 보체 성분의 소단위, C1q10 및 MBL(mannan-binding lectin)을 방해하여 보체 및 세포 면역 반응의 활성화를 억제한다.11
영장류에서, 인간을 포함하는 영장류에서, 적혈구 CR1은 간 및 비장으로 면역 복합체의 수송에 관여하며, 혈액을 정화하고 피부 또는 신장과 같은 취약한 조직에 그들의 축적을방지12,,13,,14. 면역 복합체와 적혈구 사이의 면역 접착의 이러한 현상은 CR1분자(15)의수에 따라 달라지다. 인간에서, CR1/E의 평균 밀도는 단지 500 (즉, 적혈구 당 CR1의 500 분자)입니다. 이 밀도는 한 개인에서 다른 (100-1,200 CR1/E)와 같은 개인의 적혈구에서 다른 사람까지 다양합니다. "null" 표현형의 일부 개인은 20 CR1/E16보다 적게 표현합니다.
CR1/E의 밀도는 CR1*117,,18에대한 코딩 유전자의 인트론 27에서 점 돌연변이에 연결된 2개의 공동 지배적인 상염색체 대두에 의해 조절된다. 이 돌연변이는 HindIII 효소에 대한 추가적인 제한 부위를 생성한다. 이 경우 HindIII로 소화한 후 얻어진 제한 단편은 CR1(H: 하이 알레일)의 강한 발현에 연결된 대문자에 대해 7.4 kb이고, 낮은 CR1 발현에 연결된 대문자에 대한 6.9 kb이다(L: 저알수). 이 링크는 백인과 아시아인에서 발견되지만 아프리카 혈통의 사람들에서는 발견되지 않습니다19.
적혈구 CR1의 발현 수준은 또한 엑소13 인코딩 SCR 10(I643T) 및 엑소온 19 인코딩 SCR16(Q981H)에서 점 뉴클레오티드 돌연변이의 존재와 상관된다. 그것은 동형 접합 643I / 981Q에서 높고 동형 접합 643T / 981H 개인20에서낮습니다. 따라서, "낮은" 개별은 약 150 CR1/E를 표현하고, "매체" 개별은 약 500 CR1/E를 표현하고, "높은" 개별은 약 1,000 CR1/E를 표현합니다.
이 적혈구 밀도 다형성 이외에, CR1은 서로 다른 크기의 네 개의 allotype에 해당하는 길이 다형성을 특징으로합니다 : CR1 * 1 (190 kDa), CR1 * 2 (220 kDa), CR1 * 3 (160 kDa), CR1 * 4 (250 kDa) 및 항원 다형성21 및 항원 다형성21.
우리는 CR1/E의 밀도를 결정하기 위해 유동 세포측정법을 기반으로 하는 방법을 제시합니다. CR1/E 밀도가 알려진 3명의 피험자를 사용하여 저밀도 수준(180 CR1/E), 중간 밀도 수준(646 CR1/E), 고밀도 수준(966 CR1/E)을 발현하여, 면역항혈투모 또는 RBC-CR1 을 이용한 적혈구 또는 적혈구(RBC) 또는 RBC MFI의 평균 형광 강도(MFI)를 측정하기 가 용이하다. 그런 다음 CR1/E 밀도의 함수로 MFI를 나타내는 표준 선을 플롯할 수 있습니다. CR1/E 밀도가 알려지지 않은 피험자의 MFI를 측정하여 이 표준 선과 비교하여 개인의 CR1/E 밀도를 결정할 수 있습니다. 이 기술은 실험실에서 수년 동안 사용되어 왔으며, 전신 성 홍반성 루푸스 (SLE)23,후천성 면역 결핍 증후군 (AIDS)24,말라리아25,최근 알츠하이머 병 (AD)26, 27과같은 많은 병리학에서 적혈구 CR1의 발현 감소를 검출 할 수있게되었습니다.26, 항혈전성약물(28)의 경우와 같이 적혈구와 결합하여 CR1을 표적으로 하는 약물의 개발은 CR1/E 밀도의 평가, 및 CR1을 정량화하는 견고한 기술의 가용성을 필요로 한다.
제시된 프로토콜은 싱글리케이트에서 실행됩니다. 상업적으로 이용 가능한 96개의 웰 플레이트를 사용하는 많은 개인에 대한 CR1/E의 밀도를 결정하는 데 적합합니다(재료 표참조). 이를 위해 96 웰 플레이트에 당사의 방법을 쉽게 조정할 수 있습니다. 각 견본을 위해, 적혈구의 세포 현탁액 (0.5 x 106 -10 06 적혈구)는 잘 당 분포됩니다. 각 우물을 위해, 첫째로 1 차적인 반대로 CR1 항체가 추가되고, 그 다음 streptavidin PE, 이차 항 스트렙타비딘 항체, 그리고 다시 스트렙타비딘 PE, 우리의 방법의 것과 동일한 희석을 사용하여, 그러나 양을 적응하고 비례를 존중해서.
CR1에 대해 정량화될 범위의 피험자 및 피험자의 혈액 샘플을 동시에 그려서 4 °C에서 냉장고에 보관하고 4 °C (얼음 및 / 또는 냉장고에서)에서 처리해야합니다.
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Protocol
인간의 혈액 수집 및 취급을 위한 프로토콜은 지역 윤리 위원회 (CPP Est II)에 의해 검토되고 승인되었으며, 프로토콜 번호는 2011-A00594-37입니다. 다음 의정서는 인간의 혈액 의학적 처리를 설명하기 때문에 생체 유해 물질 의 폐기에 대한 제도적 지침을 따라야 합니다. 실험실 코트와 장갑과 같은 실험실 안전 장비는 착용해야 합니다.
1. 적혈구 세척
참고: 취급 전날, 소 혈청 알부민(BSA)의 0.15%를 함유한 인산염 완충식염수(PBS)를 함유한 PBS-BSA 완충액을 준비하고 4°C의 냉장고에 놓습니다. 이 버퍼는 세척 버퍼 및 희석 버퍼로 사용됩니다.
- 50 mL 튜브에 PBS-BSA의 파이펫 20 mL.
- 흡인 250 μL 의 나트륨 에틸렌디아민 테트라 아세트산 (EDTA) 항응고전 혈액을 혈액 저장 관으로부터 및 PBS-BSA의 20 mL를 포함하는 튜브에 첨가하였다. 캡을 나사로 조여 튜브를 닫습니다. 튜브를 2x 반전시켜 부드럽게 섞습니다.
- 430 x g에서4 °C에서 10 분 동안 튜브를 원심 분리기. 10 mL 파이펫을 사용하여 상급체를 제거하고 폐기하십시오. 부드럽고 세심한 파이펫팅으로 상급물의 잔류 부피에 펠릿을 다시 놓습니다.
- 펠릿을 함유한 튜브에 20 mL의 차가운 PBS-BSA (4 °C)를 추가합니다. 430 x g에서4 °C에서 10 분 동안 튜브를 원심 분리기. 10 mL 파이펫을 사용하여 상급체를 제거하고 폐기하십시오.
- 펠릿을 함유한 튜브에 20 mL의 차가운 PBS-BSA (4 °C)를 추가합니다. 430 x g에서4 °C에서 10 분 동안 튜브를 원심 분리기. 튜브를 원심분리기에 4°C로 두고 섹션 2로 이동합니다.
2. 적혈구 희석
- 차가운 PBS-BSA의 피펫 3 mL을 50 mL 튜브에 넣고 얼음 선반에 4 °C에 보관하십시오.
- 적혈구를 함유한 원심분리튜브(1.4단계)를 얼음에 놓은 랙에 놓는다.
- 피펫 8 μL의 펠릿적혈구를 사용하여 피펫을 사용하고 적혈구 희석을 얻기 위해 PBS-BSA의 3 mL을 포함하는 50 mL 튜브에 첨가한다. 적혈구의 균질 한 세포 현탁액을 얻기 위해 손으로 부드럽게 튜브를 혼합.
3. 적혈구 면역 염색
- 적혈구 희석의 피펫 100 μL (섹션 4에서 수득) 및 1.4 mL 튜브에 추가.
- 430 x g에서4 °C에서 5 분 동안 튜브를 원심 분리기 . 원심 분리 동안, PBS-BSA 완충액에서 0.05 μg/μL의 농도로 생체 질화된 항 CR1 J3D3 항체의 희석을 준비한다.
- 원심분리가 완료되면 상급체를 제거하고 폐기하십시오.
- 20 μL의 생체 측화 방지 CR1 J3D3을 펠릿에 직접 추가하십시오. 음수 제어를 준비하려면 대신 PBS-BSA 버퍼 20 μL을 추가합니다. 튜브를 부드럽게 혼합하고 4 °C에서 45 분 동안 배양하십시오.
- 45분 간 배양한 후, 튜브에 750 μL의 PBS-BSA를 추가합니다. 430 x g에서4 °C에서 5 분 동안 튜브를 원심 분리기 . 상급체를 제거하고 폐기하십시오. 반복.
- 그 동안, PBS-BSA 완충액에서 희석된 스트렙타비딘-피코에리트린의 1:10 희석을 준비한다. 피펫 20 μL의 1:10 스트렙타비딘-피코에리트린의 희석및 튜브에 첨가한다. 튜브를 부드럽게 혼합하고 4 °C에서 45 분 동안 배양하십시오.
- 튜브에 PBS-BSA 버퍼 750 μL을 추가합니다. 430 x g에서4 °C에서 5 분 동안 잘 섞고 원심 분리기를 섞는다. 상급체를 제거하고 폐기하십시오. 반복.
- 원심 분리 동안, PBS-BSA 완충액에서 희석된 생체질화된 항 스트렙타비딘 항체의 1:100 희석을 준비한다.
- 원심분리가 완료되면 상급체를 제거하고 폐기하십시오.
- 피펫 20 μL의 1:100 의 생물학적 인 항 스트렙타비딘의 희석튜브내로. 튜브를 부드럽게 섞습니다. 4 °C에서 45 분 동안 튜브를 배양하십시오.
- 45분 간 배양한 후, PBS-BSA 완충액의 피펫 750 μL을 튜브에 첨가한다. 430 x g에서4 °C에서 5 분 동안 튜브를 원심 분리기 . 상급체를 제거하고 폐기하십시오. 반복.
- 피펫 20 μL의 1:10 스트렙타비딘-피코에리트린의 희석을 튜브에 첨가한다. 튜브를 부드럽게 섞습니다. 4 °C에서 45 분 동안 튜브를 배양하십시오.
- PBS-BSA 버퍼의 피펫 750 μL을 튜브에 추가합니다. 잘 혼합하고 430 x g에서4 °C에서 5 분 동안 튜브를 원심 분리. 상급체를 제거하고 폐기하십시오. 이 단계를 2x 반복합니다.
4. 면역 염색 적혈구 고정
- 마지막 원심분리 동안, 세척 완충제 PBS-BSA를 사용하여 37% 포름알데히드의 1:100 희석, 고정 완충제를 준비한다.
- 피펫 450 μL의 고정 버퍼를 면역 염색 적혈구 튜브(단계 3.13으로부터)에 첨가하고 5s에 대한 와류를 한다.
- 모든 고정 셀을 5 mL 둥근 바닥 튜브에 피펫을 넣고 냉장고에 보관하십시오.
참고: 프로토콜은 여기에서 최대 48시간 동안 일시 중지할 수 있습니다.
5. 염색된 적혈구의 유세포 분석
참고: 세포측정기(재료 표참조)에 대한 작업자 설명서를 참조하여 세포측정 판독값을 수행하는 방법을 아는 것이 좋습니다. 아래 제안된 파라미터는 사용되는 계측기에 적용되며 각 세포계에 최적화되어야 합니다.
- 유세포계를 켜고 컴퓨터를 켭니다. 30 분 동안 그대로 두면 광학 시스템 온도가 안정화됩니다. Cytometer Connected
- 버퍼 컨테이너가 가득 찼고 폐기물 컨테이너가 비어 있는지 확인합니다. 퍼지 시스템을 사용하여 버퍼 필터와 버퍼 라인의 기포를 제거합니다. 세포계의 콘솔에 프라임 버튼을 눌러 유체 시스템을 프라임. 표시등이 빨간색에서 녹색으로 바뀌를 때까지 기다립니다.
- 유체를 청소하려면 샘플 주입 포트에 3 mL의 세척 액이 들어있는 튜브를 설치하고 높은 샘플 유량으로 5 분 동안 세척 솔루션을 실행할 수 있습니다. 증류수로 헹구는 용액으로 이 것을 반복하십시오. 시료 주입 포트에 물이 들어있는 튜브를 그대로 둡니다.
- 캘리브레이션 비드를 준비하기 위해, PBS의 피펫 400 μL을 둥근 바닥 튜브의 바닥에. 30s. PBS를 포함하는 둥근 바닥 튜브에 드롭을 추가하여 비드 주식을 강하게 섞습니다. 30초 동안 소용돌이를 만들어 조심스럽게 섞으세요.
- 성능 검사를 실행합니다. 소프트웨어에서 세포계 설정 및 추적 모듈을 엽니다(그림1A). PE 면역 염색을 사용하여 실험에 세포계 구성이 올바른지 확인합니다. 비드 배치보정이 구성에 맞는지 확인합니다.
- 샘플 주입 포트에 비드 튜브를 설치하고 낮은 샘플 유량으로 실행하십시오. 완료하는 데 약 5분이 걸리는 성능 검사를 실행합니다. 성능 검사가 완료되면 세포계 성능이 만족스러운지 확인합니다(그림1B). 소프트웨어의 세포계 설정 및 추적 모듈을 닫습니다.
- 실험을 설정하고 응용 프로그램 설정을 만들려면 브라우저 도구 모음에서 새 실험 단추를 클릭하고 새 실험을 엽니다. 실험의 드롭다운 메뉴에서 방향 분산(FSC), 측면 분산(SSC) 및 PE(그림 1C)를선택하여 적절한 세포계 설정을 선택하여 매개변수를 지정합니다. Forward Scatter FSC 매개변수에 대한 선형 모드와 SSC 및 PE 매개변수에 대한 로가리섬 모드를 선택합니다.
- 열린 실험에서 세포계 설정(그림 1D)을선택한 다음 응용 프로그램 설정을선택하고 전역 워크시트(그림1E)를만듭니다. 회색 상자와 십자선을 사용하여 최적화를 안내합니다.
- 스테인드되지 않은 제어 튜브를 세포계에 로드하고 수집을실행합니다. FSC 및 SSC 전압을 최적화하여 관심 있는 인구(즉, RBC)가 확장되어 있는지 확인합니다. FSC 임계값을 최적화하여 관심 있는 인구를 방해하지 않고 이물질을 제거합니다.
- FSC 대 SSC 플롯의 RBC 주위에 게이트를 그립니다. PE 형광의 점 도표에 RBC 인구를 표시합니다. 필요한 경우 광증배관(PMT) 전압의 형광을 증가하여 음수 모집단을 회색 상자 내에 배치합니다. 세포계에서 스테인되지 않은 제어 튜브를 언로드합니다.
- 양수 인구가 규모에 있는지 확인합니다. 스테인드 컨트롤 튜브를 세포계에 적재하고 수집을 실행합니다. 양수 모집단이 완전히 규모로 보일 때까지 규모가 축소된 경우 양수 모집단에 대한 PMT 전압을 낮춥니다. 그런 다음 얼룩진 샘플을 언로드합니다.
- 샘플을 기록하고 분석하려면 새 글로벌 워크시트에서 데이터를 미리 보기 위한 다음 플롯을 만듭니다: 1) FSC 대 SSC 및 2) PE 형광 히스토그램. 첫 번째 샘플을 세포계에 로드하고 수집을실행합니다.
- FSC 대 SSC 플롯의 적혈구 주위에 RBC 게이트를 그립니다. PE 형광 히스토그램에서 RBC 인구를 표시합니다. 통계 보기에서 GR 모집단에서 PE 형광 매개변수에 대한 평균을 선택합니다(그림1F).
- 수집 대시보드에서 중지 게이트의 모든 이벤트와 기록할 10,000개의 이벤트를 선택합니다(그림1G). 데이터 기록 을 클릭합니다. 이벤트 기록이 완료되면 세포계에서 첫 번째 튜브를 제거합니다. 전역 워크시트 플롯은 그림 2의플롯과 같아야 합니다.
- 다음 샘플을 로드하고 기록합니다.
6. 적혈구 CR1의 밀도의 결정
- "낮음" 피험체에 해당하는 샘플의 평균 형광 강도값을 취합니다(도3, 표 I,RBC MFI), "매체" 피험자(도4, 표 D,RBC MFI), "높음" 주제(도4, 표 I,RBC MFI), 및 음의 대조군 샘플(도3, 표 I,RBC MFI).
- CR1의 밀도의 함수로서 평균 형광 강도를 나타내는 그래프에서, 음의 대조군, "낮음" 피사체, "중간" 피사체 및 "높음" 피사체에 해당하는 4개의 점을 배치한다(파란색 점, 도 6).
- 회귀 선을 그려 보정 선과 방정식을 가져옵니다.
- 밀도가 결정되는 피험자에 해당하는 샘플의 평균 형광 강도값을 취합니다. (그림5, 표 D와 I, RBC MFI).
- 평균 형광 강도값을 사용하여 "Y"를 대체하여 방정식을 얻고 CR1/E의 밀도를계산합니다(그림 6).
- 그래프에서 평균 형광 강도 값과 결정된 CR1/E 밀도가 교정 선의 한 점에 해당하는지 확인합니다(그림6).
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Representative Results
CR1의 밀도가 알려진 3명의 피험자의 적혈구("낮음" 대상 [180 CR1/E], "중간" 대상 [646 CR1/E], 및 "높음" 대상 [966 CR1/E]), 그리고 CR1 밀도가 결정되어야 하는 2명의 피험자의 항 CR1 항체결합을 사용하여 증폭계에 면역으로 염색하였다. 처음에, 낮은 고범위로부터 피험자의 CR1 밀도는 방사성 표지된 항체를 이용한 Scatchard 방법29에 의해 결정되었다. 결정된 표준(낮음, 중간 및 높음)은 교정 곡선에 사용되었고, 당사의 세포분석 방법30에의해 새로운 표준 또는 하부 표준을 정량화할 수 있게 하였다. 유세포계에서 면역염색된 적혈구의 통과 후, 표지의 강도는 각 대상체에 대한 평균 형광 강도(RBC MFI)로 관찰 및 측정하였다(도3F,I; 그림 4B,D,F,I; 그림 5B,D,F,I). 곡선은 평균 형광 강도의 함수로 보고하여 적혈구 CR1의 알려진 밀도("낮음"에서 "높음")를 가진 피험자의 값을 사용하여 플롯되었다. 이 곡선으로부터 유래된 회귀선을 다른 피험자의 평균 형광 강도값과 비교하여 그들의 CR1/E 밀도를 결정하였다(도6). 그림 7은 전체 워크플로우를 보여 주며, 전체 워크플로우를 보여 주다.
그림 1: 유세포 측정 프로토콜 중에 나타나는 세포계 콘솔 및 창. (A)프로토콜의 5.5단계 적용 후 윈도우가 나타난다. (B)프로토콜의 5.6단계 적용 후 윈도우가 나타난다. (C)프로토콜의 5.7 단계의 적용 후에 윈도우가 나타납니다. (D)프로토콜의 5.8단계 적용 후 윈도우가 나타난다. (E)프로토콜의 5.8단계의 적용 후에 윈도우가 나타난다. (F)프로토콜의 5.13 단계의 적용 후에 윈도우가 나타납니다. (G)프로토콜의 5.14 단계의 적용 후에 윈도우가 나타납니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 전역 워크시트 분석 객체의 모양입니다. 프로토콜의 5.14 단계를 적용한 후 전역 워크시트 분석 개체의 모양입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 낮은 CR1 밀도를 발현한 범위("낮은" 대상체)로부터 적혈구에 대응하는 적혈구의 항 CR1 면역염색의 유세포분석 결과(180 CR1/E). 각 주제에 대해:(A,E)크기 및 과립계 파라미터에 따라 획득된 이벤트의 모양을 나타내는 도트 블롯,(g)이벤트 중적혈구 집단을 선택하는 게이트,(B,F)표지의 강도를 나타내는 히스토그램,(C,H)관련 통계 표는 적혈구 및 이들의 백분율에 대응하는 이벤트의 수를 나타내는,(D,I)평균 형광 강도(RBC MFI)를 주는 관련 표. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: 범위로부터 대상체에 해당하는 적혈구의 항 CR1 면역염색의 유세포 분석 결과: 중간 CR1 밀도를 발현한 "중간" 피험자(646 CR1/E) 및 높은 CR1 밀도를 발현한 "높은" 피험자(966 CR1/E). 각 주제에 대해:(A, E)크기 및 과립계 파라미터에 따라 획득된 이벤트의 모양을 나타내는 도트 블롯,(g)이벤트 중적혈구 집단을 선택하는 게이트,(B, F)표지의 강도를 나타내는 히스토그램,(C, H)관련 통계 표는 적혈구 및 이들의 백분율에 대응하는 이벤트의 수를 나타내는,(D, I)평균 형광 강도(RBC MFI)를 주는 관련 표. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5: 그의 CR1 밀도가 결정되어야 하는 피험체에 해당하는 적혈구의 항 CR1 면역염색의 유세포분석 결과. 각 주제에 대해:(A, E)크기 및 과립계 파라미터에 따라 획득된 이벤트의 모양을 나타내는 도트 블롯,(g)이벤트 중적혈구 집단을 선택하는 게이트,(B, F)표지의 강도를 나타내는 히스토그램,(C, H)관련 통계 표는 적혈구 및 이들의 백분율에 대응하는 이벤트의 수를 나타내는,(D, I)평균 형광 강도(RBC MFI)를 주는 관련 표. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 보정 곡선 및 회귀 선으로 CR1 밀도 측정이 가능합니다. (A),(A)범위 피험자의 공지된 CR1 밀도에 따라 그려진 캘리브레이션 곡선 및 회귀 선(음극 대조군: 0 CR1, "낮음" 피험자 [180 CR1/E], "중간" 피험자 [646 CR1/E], 및 "높음" 피험자 [966 CR1/E]) 및 이들의 각각의 평균 형광 강도 값에 의해 얻어진 사이토에 의해 얻어진다. (CC),(D)이 회귀 선의 방정식에서, 우리는 그 평균 형광 강도가 유세포에 의해 정량화 된 피험자에 대한 적혈구 CR1의 밀도를 계산 : 주황색 화살표, 주제 1 (평균 형광 강도 = 1,334; CR1/E 밀도 = 459) 및 피험자 2(평균 형광 강도 = 2820; CR1/E 밀도 = 1,000). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 7: 인간 혈액 샘플로부터 적혈구 CR1 밀도를 결정하는 프로토콜의 순서도. 인간의 혈액 샘플을 수집합니다. 적혈구를 얻기 위해 원심 분리에 의해 인간의 혈액 샘플을 씻어. 항 CR1 항체를 사용하여 적혈구를 염색합니다. 유세포 분석기를 사용하여 교정 곡선에 따라 적혈구 CR1 밀도를 결정합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
적혈구 CR1 (CR1/E)의 밀도를 결정하기 위해 몇 가지 기술을 사용할 수 있습니다. 사용된 첫번째 기술은 항 CR1항체(31)에 의한 적혈구의 응집 및 C3b32로코팅된 적혈구의 존재 에 있는 장미의 대형이었습니다. 이러한 기초적인 기술은 방사성 표지된 항 CR1 항체1,,33을사용하여 면역 염색 방법으로 빠르게 대체되었다. 또한 효소 연계 면역흡착제 분석(ELISA)34에의해 막 추출물에서 CR1의 농도를 측정할 수도 있다. 정확하지만 이러한 기술은 CR1/E 밀도의 평균 값만 제공합니다. 전체 적혈구 집단에 대한 CR1/E 밀도의 분포는 면역 염색 후 유동 세포 측정 분석에 의해서만 사용할 수 있습니다. 이 기술은 CR1/E의 밀도가 낮기 때문에 어렵습니다. 그럼에도 불구하고, 증폭 방법은 이제 CR1 /E30의밀도를 쉽게 측정 할 수 있게합니다.
여기서, 우리는 면역 염색 된 세포의 형광 신호의 증폭에 기초하여 유세포측정에 의해 CR1/E를 정량화하는 방법을 제시한다. 증폭 시스템은 생체 면역화된 항 CR1 단일클론 항체 J3D3를 사용하여 염색의 4개의 연속적인 층을 관련시킵니다; 피코에리트린-스트렙타비딘; 생체용 염소 항 스트렙타비딘 항체; 그리고 다시 피코에리트린 - 스트렙타비딘. J3D3는 CR135에서3개의 항원 부위를 인식하지만 동시에 하나 도 는 없습니다. 생체 질화 염소 항 스트렙타비딘 항체는 스트렙타비딘에 다중 에피토프를 인식하고 비오틴 스트렙타비딘 단독보다 두 스트렙타비딘 층 사이의 더 나은 다리를 제공하는 폴리클론 항체입니다. 이 과정은 또한 phycoerythrin36의 높은 형광 수율 및 스트렙타비딘(37)의비특이적 결합의 낮은 수준에서 유익합니다. 이러한 강력한 증폭 신호로, 세포계 광증선튜브의 낮은 설정은 완벽한 선형성을 가능하게 합니다. 우수한 감도와 재현성을 특징으로하는이 방법은 100 CR1 / 셀 미만의 검출을 가능하게합니다.
그러나, 이 방법은 적혈구 CR1의 밀도가 알려진 세 명의 피험자로부터 의 표본을 필요로 합니다: 적혈구 CR1의 낮은 수준을 발현하는 한 피험자(180 CR1/E), 적혈구 CR1(646 CR1/E)의 중간 수준을 발현하는 한 피험자 및 높은 수준의 적혈구 CR1(966 CR1)을 발현하는 한 피험자. 그것은 여러 개인의 적혈구 CR1 밀도의 첫 번째 측정을 취할 수 있습니다, 처음에 우리가 제공 할 수있는 우리의 연구에 사용되는 세 과목에서 적혈구를 사용하여. CR1에 대해 정량화될 범위 및 피험자의 혈액 샘플을 동시에 그려서 4°C에서 냉장고에 보관하고 4°C38에서처리해야 합니다. EDTA 튜브에 그려진 혈액은 쉽게 라우팅 할 수 있으며 4 °C에서 5 일 동안 보관 할 수 있으므로 적혈구 CR1의 정량화 시간이 허용됩니다. 그 후, 적혈구 CR1의 밀도가 감소하기 시작하고, 표준 CR1 곡선의 붕괴가, 특히 높은 수준의 적혈구 CR1을 발현하는 피험체에 대응하는 지점에서 있다. 결과 회귀 선이 왜곡되므로 CR1 밀도측정값이 더 이상 정확하지 않습니다. 시험관 내 저장, 취급 조건 및 다층 염색은 CR1의 군집화 및 CR1 분자의 수의 약간의 과대 평가로 이어진다는 점에 유의해야 한다. 그럼에도 불구하고, 증폭 시스템과 함께 J3D3와 같은 3개의 에피토프를 표적화하는 항 CR1 항체를 사용하면 클러스터링을 완벽하게 수행할 수 있어 CR1 밀도39의정확한 측정이 가능합니다.
사실, CR1/E의 밀도는 적혈구40의수명 동안 감소합니다. 이것은 동일한 개별에 있는 CR1/E의 밀도의 이질성을 설명할 것입니다. 일부 저자에 따르면, CR1의 이화 작용의 강도는 CR1 / E41의초기 밀도와 상관관계가 없는 반면, 다른 저자의 경우 초기 밀도가 높을수록 이화작용의 강도가 42가커집니다. 적혈구의 표면에 CR1의 반감기는 11-32 일42입니다.
여기에 제시된 방법에는 몇 가지 장점이 있습니다. 첫 번째는 유세포측정덕분에 동일한 혈액 샘플 내에서 연구되는 세포 소집단을 선택할 수 있어야 한다. 게이트 기능을 사용하여 적혈구 모집단을 선택하면 적혈구 밀도의 측정이 독점적으로 보장됩니다. 백혈구와 같은 다른 세포 소집단의 존재에 기인한 적혈구 CR1의 측정에 있는 편견은 피할 수 있습니다. 이 방법의 두 번째 장점은 단순히 연구 할 수용체의 에피토프에 대해 특별히 지시 항체로 기본 안티 CR1 항체를 대체하여 밀도가 낮은 다른 세포 수용체의 정량화에 적응할 수 있다는 것입니다. 또한 튜브 랙 대신 96 개의 웰 플레이트를 사용하는 데 적응할 수 있으며, 이는 낮은 혈액 및 시약 볼륨25,38을필요로합니다. 이 방법의 세 번째 장점은 유연하다는 것입니다. CR1의 매우 높은 밀도를 가진 세포에 관한 연구에서, 예를 들어, 인간 림프구 (10,000 CR1 / 세포), 또는 CR1 밀도가 인간 (10,000-100,000 CR1 / 세포)보다 10-100 배 더 큰 비 인간 영장류 적혈구 (10,000-100,000 CR1 / 세포)43,,44, 44,수의 층을 감소시킬 수 있습니다. 생체면역항CR1 단클론 항체, 피코리트린-스트렙타비딘 또는 생체면역항CR1 단일클론 항체, 생체면역항마우스 항체 및 피코리스린-스트렙타비딘만을 사용하여 형광 수준을 CR1의 높은 밀도로 조정합니다. 이 방법의 네 번째 장점은 고정 또는 냉동 적혈구에 사용될 수 있다는 것입니다, 혈액 샘플을 유세포 측정을위한 시설이 부족한 지역에서 수집 할 수 있도록하고 CR138의나중에 정확한 정량화를 위해 저장.
더 일반적으로, 새로운 밝은 불소화와 함께, 그것은 더 이상 간접 증폭 의 시스템을 사용하는 필수 보인다. 게다가, 세포 수용체의 밀도를 평가하고 측정 단위 (즉, ABC, 또는 항체 결합 용량)로 정량화할 수 있게 하는 유세포 측정법을 사용하는 다른 방법이 있다. 세포 당 ABC는 또한 항체및 보정된 비드의 포화 농도를 사용하여 결정될 수 있다. 여러 상용 시스템을 사용할 수 있습니다. 몇몇 키트는 비드 당 PE 결합과 같은 불소 화 분자의 알려진 수준을 포함하는 미리 보정된 표준 구슬입니다. 개별 환자 표본과 동일한 계기 설정에서 같은 날 유동 세포계에서 획득한 비드는 비드의 알려진 PE 함량과 형광의 기하학적 평균을 비교하는 표준 곡선을 그릴 수 있게 합니다. 회귀 분석, 경사, 절편 및 상관 계수가 결정되고, ABC 값은 표준 곡선45,,46을사용하여 셀의 측정된 기하학적 평균 형광으로부터 계산됩니다.
비드 시험의 추가 유형은 단편(Fc)의 결정화 가능한 부분을 통해 특정 항체 결합 용량 수준을 가진 비드에 공액화된 항체의 결합에 기초한다. 비드는 항원 밀도가 측정될 세포를 표지하는 데 사용되는 동일한 항체로 표지됩니다. 따라서, 단일 실험에서, 임의의 공액항체는 동일한 형광부/단백질 비(F/P 비)를 가진 동일한 배치로서 비드 및세포(47)모두를 염색하는데 사용된다. 일부 키트는 간접 면역형광분석실험(48,,49)을이용한 유세포측정에 의한 세포 표면 항원의 정량적 측정에 더 낫다.
결론적으로, 우리의 방법은 매우 민감한 검출을 제공하고 일반 유세포 분석 물질에 구현하기 쉬운 장점이 있다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
우리는 URCACyt의 모든 구성원, 유동 세포 분석 기술 플랫폼, 면역학의 부서의 직원, 그리고 프로토콜을 최적화하고 검증하는 데 기여 한 내과 및 노인학과의 직원에게 감사드립니다. 이 작품은 랭스 대학 병원에 의해 투자되었다 (보조금 번호 AOL11UF9156).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1000E Barrier Tip | Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France | 2079E | sample pipetting |
| 1-100 µL Bevelled, filter tip | Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Germany | S1120-1840 | sample pipetting |
| Biotinylated anti-CR1 monoclonal antibody (J3D3) | Home production of non-commercial monoclonal antibody, courtesy of Dr J. Cook | immunostaining | |
| Blouse | protection | ||
| Bovin serum albumin (7,5%) | Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France | 15260037 | cytometry |
| Centrifuge | Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France | 11176917 | centrifugation |
| Clean Solution | BD, F-38801 Le Pont de Claix, France | 340345 | cytometry |
| Comorack-96 | Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath | 944060P | rack |
| Cytometer Setup & Tracking Beads Kit | BD, F-38801 Le Pont de Claix, France | 655051 | cytometry |
| Formaldehyde solution 36.5 % | Sigma Aldrich, F-38070 Saint Quentin Fallavier, France | F8775-25ML | Fixation |
| 10 µL Graduated, filter tip | Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Germany | S1121-3810 | sample pipetting |
| LSRFORTESSA Flow Cytometer | BD, F-38801 Le Pont de Claix, France | 647788 | cytometry |
| Microman Capillary Pistons | Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath | 067494 | sample pipetting |
| Micronic 1.40 mL round bottom tubes | Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath | MP32051 | mix |
| Micropipette Microman - type M25 - | Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath | 066379 | sample pipetting |
| Phosphate buffered Saline (PBS) | Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France | 10010031 | cytometry |
| Pipette PS 325 mm, 10 mL | Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath | 391952 | sample pipetting |
| powder-free Nitrile Exam gloves | Medline Industries, Inc, Mundelein, IL 60060, USA | 486802 | sample protection |
| Reference 2 pipette, 0,5-10 µL | Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France | 4920000024 | sample pipetting |
| Reference 2 pipette, 20-100 µL | Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France | 4920000059 | sample pipetting |
| Reference 2 pipette, 100-1000 µL | Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France | 4920000083 | sample pipetting |
| Rinse Solution | BD, F-38801 Le Pont de Claix, France | 340346 | cytometry |
| Round bottom tube | Sarstedt, F-70150 Marnay, France | 55.1579 | cytometry |
| Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France | 0030120086 | mix |
| streptavidin R-PE | Tebu Bio, F-78612 Le Perray-en-Yvelines, France | AS-60669 | immunostaining |
| Tapered Centrifuge Tubes 50 mL | Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France | 10203001 | mix |
| Vector anti streptavidin biotin | Eurobio Ingen, F-91953 Les Ulis, France | BA-0500 | immunostaining |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries, Inc, Bohemia, NY 111716, USA | SI-0236 | mix |
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