Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Het meten van Erythroocyte Complement Receptor 1 met behulp van Flow Cytometrie

Published: May 19, 2020 doi: 10.3791/60810
Automatic Translation
1,2, 3, 2,4, 2,4, 2, 5,6
1Oncogeriatric Coordination Unit, Reims University Hospitals, Maison Blanche Hospital, 2Faculty of Medicine, University of Reims Champagne-Ardenne, 3URCACyt, Flow cytometry technical platform, University of Reims Champagne-Ardenne, 4Department of Immunology, Reims University Hospitals, Robert Debre Hospital, 5Department of Internal Medicine and Geriatrics, Reims University Hospitals, Maison Blanche Hospital, 6Faculty of Medicine, University of Reims Champagne-Ardenne

Summary

Het doel van deze methode is om de CR1-dichtheid in de erytrocyten van elk onderwerp te bepalen door te vergelijken met drie proefpersonen waarvan de erytrocyten CR1-dichtheid bekend is. De methode maakt gebruik van flow cytometrie na immunostaining van de erytrocyten van de proefpersonen door een anti-CR1 monoklonale antilichaam gekoppeld aan een versterkt systeem met behulp van fycoerythrin (PE).

Abstract

CR1 (CD35, Complement Receptor type 1 voor C3b/C4b) is een hoog moleculair gewicht membraan glycoproteïne van ongeveer 200 kDa dat de activering van de activatie regelt, immuuncomplexen vervoert en deelneemt aan humorale en cellulaire immuunreacties. CR1 is aanwezig op het oppervlak van vele celtypes, waaronder erythrocyten, en vertoont polymorfismen in lengte, structuur (Knops, of KN, bloedgroep), en dichtheid. De gemiddelde dichtheid van CR1 per erythrocyte (CR1/E) is 500 moleculen per erythrocyt. Deze dichtheid varieert van individu tot individu (100-1.200 CR1/E) en van de ene erytrocyt tot de andere in hetzelfde individu. We presenteren hier een robuuste flow cytometrie methode om de dichtheid van CR1/E te meten, ook in onderwerpen die een lage dichtheid uitdrukken, met behulp van een versterkend immunostaining systeem. Deze methode heeft ons in staat gesteld om het verlagen van CR1 erytrocytenexpressie te tonen bij ziekten zoals de ziekte van Alzheimer (AD), systemische lupus erythematosus (SLE), AIDS of malaria.

Introduction

CR1 (complement receptor type 1, CD35) is een 200 kDa transmembraan glycoproteïne aanwezig op het oppervlak van vele celtypes, zoals erythrocyten1, B lymfocyten2,monocytische cellen, sommige T-cellen, folliculaire dendritische cellen3,foetale astrocyten4, en glomeraire podocyten5. CR1 die zijn liganden C3b, C4b, C3bi6,,7,8,,9verstoort, een subeenheid van de eerste complementcomponent, C1q10 en MBL (mannan-bindende lectine)11 remt de activering van complement en is betrokken bij humorale en cellulaire immuunrespons.

Bij primaten, waaronder mensen, is erytrocyten CR1 betrokken bij het transport van immuuncomplexen naar de lever en milt, om het bloed te zuiveren en hun accumulatie te voorkomen in kwetsbare weefsels zoals de huid of nieren12,13,14. Dit fenomeen van immuunhechting tussen immuuncomplexen en erytrocyten hangt af van het aantal CR1-moleculen15. Bij mensen is de gemiddelde dichtheid van CR1/E slechts 500 (d.w.z. 500 moleculen CR1 per erytrocyt). Deze dichtheid varieert van individu tot individu (100-1.200 CR1/E) en van de ene erytrocyt tot de andere in hetzelfde individu. Sommige personen van "null" fenotype uitdrukken minder dan 20 CR1/E16.

De dichtheid van CR1/E wordt geregeld door twee co-dominante autosomaltale allelen gekoppeld aan een puntmutatie in intron 27 van de gencodering voor CR1*117,18. Deze mutatie produceert een extra beperkingsplaats voor het HindIII-enzym. De beperkingsfragmenten verkregen na de vertering met HindIII zijn in dit geval 7,4 kb voor het allel gekoppeld aan een sterke expressie van CR1 (H: hoog allel) en 6,9 kb voor het allel gekoppeld aan lage CR1-expressie (L: laag allel). Deze link is te vinden in Kaukasiërs en Aziaten, maar niet in mensen van Afrikaanse afkomst19.

Het expressieniveau van erytrocyten CR1 is ook gecorreleerd met de aanwezigheid van puntnucleotidemutaties in exon 13 codering SCR 10 (I643T) en in exon 19 codering SCR16 (Q981H). Het is hoog in homozygous 643I/981Q en laag in homozygous 643T/981H individuen20. Zo, "lage" individuen express ongeveer 150 CR1 /E, "medium" individuen express ongeveer 500 CR1 /E, en "hoge" individuen express ongeveer 1.000 CR1 / E.

Naast deze erytrocytendichtheid polymorfisme, cr1 wordt gekenmerkt door een lengte polymorfisme die overeenkomt met vier allotypes van verschillende grootte: CR1 * 1 (190 kDa), CR1 * 2 (220 kDa), CR1 * 3 (160 kDa), en CR1 * 4 (250 kDa)21 en een antigenpolymorfisme die overeenkomt met de bloedgroep KN22.

We presenteren onze methode op basis van flow cytometrie om de dichtheid van CR1/E te bepalen. Met behulp van drie proefpersonen waarvan de CR1/E-dichtheid bekend is, die een laag dichtheidsniveau (180 CR1/E), een gemiddelde dichtheid (646 CR1/E) en een hoge dichtheid (966 CR1/E) uitdrukken, is het gemakkelijk om de gemiddelde fluorescentieintensiteit (MFI) van hun erythrocyten of rode bloedcellen (RBC) of RBC MFI te meten, na anti-CR1 immunostaining met behulp van een stroomcytometer. Men kan dan een standaardlijn uitzetten die de MFI vertegenwoordigt als functie van CR1/E-dichtheid. Het meten van de MFI van proefpersonen waarvan de CR1/E-dichtheid niet bekend is en deze te vergelijken met deze standaardlijn, is het mogelijk om de CR1/E-dichtheid van de individuen te bepalen. Deze techniek is gebruikt voor vele jaren in het laboratorium, en heeft ons in staat gesteld om een vermindering van de expressie van erythrocyte CR1 detecteren in vele pathologieën zoals systemische lupus erythematosus (SLE)23, Verworven immunodeficiëntie syndroom (AIDS)24, malaria25, en onlangs de ziekte van Alzheimer (AD)26,27. De ontwikkeling van geneesmiddelen gericht op CR1 om te koppelen met erythrocyten, zoals in het geval van anti-trombotische geneesmiddelen28 vereist de evaluatie van CR1/E-dichtheid en de beschikbaarheid van een robuuste techniek om CR1 te kwantificeren.

Het gepresenteerde protocol loopt in singlicaat. Het is aanpasbaar om de dichtheid van CR1/E op veel individuen te bepalen met behulp van specifieke commercieel beschikbare 96 putplaten (zie Tabel van materialen). Hiertoe is het eenvoudig om onze methode aan te passen aan elke 96 putplaat. Voor elk monster wordt een celsuspensie van erytrocyten (0,5 x 106–1 x 106 erythrocyten) per put verdeeld. Voor elke put, eerst de primaire anti-CR1 antilichaam wordt toegevoegd, dan streptavidinPE, de secundaire anti-streptavidinantilichaam, en opnieuw streptavidinPE, met behulp van dezelfde verdunningen als die van onze methode, maar door aanpassing van volumes en evenredigheid respect.

De bloedmonsters van proefpersonen uit het verspreidingsgebied en van de voor CR1 te kwantificeren onderwerpen moeten tegelijkertijd worden genomen, bij 4 °C in de koelkast worden opgeslagen en bij 4 °C (op ijs en/of in de koelkast) worden behandeld.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Het protocol voor het verzamelen en behandelen van menselijk bloed werd herzien en goedgekeurd door de regionale ethische commissie (CPP Est II), en het protocolnummer is 2011-A00594-37. Omdat het volgende protocol de behandeling van menselijk bloed beschrijft, moeten institutionele richtlijnen voor het verwijderen van biogevaarlijk materiaal worden gevolgd. Laboratoriumveiligheidsuitrusting, zoals laboratoriumjassen en handschoenen, moet worden gedragen.

1. Erytrocyten wassen

OPMERKING: Bereid de dag voor de behandeling een PBS-BSA-buffer voor met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) die 0,15% van het runderserumalbumine (BSA) bevat en plaats deze in de koelkast bij 4 °C. Deze buffer wordt gebruikt als wasbuffer en als verdunningsbuffer.

  1. Pipetteer 20 mL PBS-BSA in een 50 mL buis.
  2. Aanzuigen 250 μL natriumethylenediamine tetraazijnzuur (EDTA) antistollingsbloed uit bloedopslagbuizen en toe te voegen aan de buis met de 20 mL van PBS-BSA. Sluit de buis door de dop te schroeven. Meng voorzichtig door de buis 2x om te keren.
  3. Centrifugeer de buis gedurende 10 min bij 4 °C bij 430 x g. Verwijder en gooi de supernatant weg met een pipet van 10 mL. Resuspend de pellet in het resterende volume van supernatant door zachte en zorgvuldige pipetteren.
  4. Voeg 20 mL koude PBS-BSA (4 °C) toe aan de buis die de pellet bevat. Centrifugeer de buis gedurende 10 min bij 4 °C bij 430 x g. Verwijder en gooi de supernatant weg met een pipet van 10 mL.
  5. Voeg 20 mL koude PBS-BSA (4 °C) toe aan de buis die de pellet bevat. Centrifugeer de buis gedurende 10 min bij 4 °C bij 430 x g. Laat de buis in de centrifuge bij 4 °C en ga naar sectie 2.

2. Verdunning van erytrocyten

  1. Pipetteer 3 mL koude PBS-BSA in een 50 mL buis en bewaar deze bij 4 °C op een rek in ijs.
  2. Leg de gecentrifugeerde buis met de erytrocyten (stap 1.4) op een rek in ijs.
  3. Pipetteer 8 μL pelleted erythrocyten met behulp van de pipet en voeg toe aan de 50 mL buis met de 3 mL van PBS-BSA om de erytrocytenverdunning te verkrijgen. Meng de buis voorzichtig met de hand om een homogene celsuspensie van erythrocyten te verkrijgen.

3. Erytrocytocyte immunostaining

  1. Pipetteer 100 μL erytrocytenverdunning (verkregen in punt 4) en voeg toe aan buizen van 1,4 mL.
  2. Centrifugeer de buizen gedurende 5 min bij 4 °C bij 430 x g. Bereid tijdens de centrifugatie een verdunning voor van bioateulaat anti-CR1 J3D3-antilichaam bij een concentratie van 0,05 μg/μL in de PBS-BSA-buffer.
  3. Zodra de centrifugering is gedaan, verwijder en gooi de supernatant.
  4. Voeg 20 μL biotinylated anti-CR1 J3D3 direct aan de pellet toe. Als u de negatieve controle wilt voorbereiden, voegt u in plaats daarvan 20 μL PBS-BSA-buffer toe. Meng de buizen voorzichtig en incubeer gedurende 45 min bij 4 °C.
  5. Na 45 min incubatie, voeg 750 μL PBS-BSA toe aan de buizen. Centrifugeer de buizen gedurende 5 min bij 4 °C bij 430 x g. Verwijder en gooi de supernatant weg. Herhaal.
  6. Bereid ondertussen een verdunning van 1:10 van streptavidin-phycoerythrin verdund in PBS-BSA buffer. Pipetteer 20 μL van de 1:10 verdunning van streptavidin-phycoerythrin en voeg toe aan de buizen. Meng de buizen voorzichtig en incubeer gedurende 45 min bij 4 °C.
  7. Voeg 750 μL PBS-BSA buffer in de buizen. Meng goed en centrifugeer gedurende 5 min bij 4 °C bij 430 x g. Verwijder en gooi de supernatant weg. Herhaal.
  8. Bereid tijdens het centrifugeren een verdunning van 1:100 van bioatuite anti-streptavidine-antilichamen die in PBS-BSA-buffer zijn verdund.
  9. Zodra de centrifugering is gedaan, verwijder en gooi de supernatant.
  10. Pipetteer 20 μL van de 1:100 verdunning van bioateulaat anti-streptavidine in de buizen. Meng de buizen voorzichtig. Incubeer de buizen gedurende 45 min bij 4 °C.
  11. Na 45 min incubatie pipett u 750 μL PBS-BSA buffer en voeg u toe in de buizen. Centrifugeer de buizen gedurende 5 min bij 4 °C bij 430 x g. Verwijder en gooi de supernatant weg. Herhaal.
  12. Pipetteer 20 μL van de 1:10 verdunning van streptavidin-phycoerythrin en voeg toe in de buizen. Meng de buizen voorzichtig. Incubeer de buizen gedurende 45 min bij 4 °C.
  13. Pipetteer 750 μL PBS-BSA buffer en voeg toe in de buizen. Meng goed en centrifugeer de buizen gedurende 5 min bij 4 °C bij 430 x g. Verwijder en gooi de supernatant weg. Herhaal deze stap 2x.

4. Immunostained erytrocytenfixatie

  1. Bereid tijdens de laatste centrifugatie de fixatiebuffer voor, een verdunning van 1:100 van 37% formaldehyde met behulp van de wasbuffer PBS-BSA.
  2. Pipetteer 450 μL fixatiebuffer en voeg toe aan immuunbevlekte erytrocytenbuizen (vanaf stap 3.13) terwijl u 5 s vortexing.
  3. Pipetteer alle vaste cellen in 5 mL ronde bodembuizen en bewaar in de koelkast.
    LET OP: Het protocol kan hier worden onderbroken voor maximaal 48 uur.

5. Stroomcytometrieanalyse van gekleurde erytrocyten

OPMERKING: Het is raadzaam om te verwijzen naar de handleiding van de operator voor de cytometer (zie Tabel van materialen)om te weten hoe de cytometrische metingen uit te voeren. De onderstaande parameters zijn van toepassing op het gebruikte instrument en moeten voor elke cytometer worden geoptimaliseerd.

  1. Schakel de stroomcytometer in en schakel de computer in. Laat de temperatuur van het optische systeem stabiliseren door deze 30 minuten aan te laten staan. Controleer het cytometervenster in de software om ervoor te zorgen dat de cytometer is aangesloten op het werkstation (het bericht Dat Cytometer Connected wordt weergegeven).
  2. Controleer of de buffercontainer vol is en of de afvalcontainer leeg is. Verwijder luchtbellen in het bufferfilter en de bufferlijn met behulp van het zuiveringssysteem. Prime het fluidics systeem door op de Prime-knop op de console van de cytometer te drukken. Wacht tot het lampje van de indicator verandert van rood naar groen.
  3. Om de fluidics schoon te maken, installeert u een buis met 3 mL van een reinigingsoplossing op de monsterinjectiepoort en laat u de reinigingsoplossing 5 min laten lopen met een hoge monsterstroomsnelheid. Herhaal dit met de spoeloplossing met gedestilleerd water. Laat de buis met water op de injectiepoort van het monster.
  4. Om de kalibrerende kralen voor te bereiden, pipett 400 μL PBS in de bodem van een ronde bodembuis. Meng de kraal voorraden sterk door vortexing voor 30 s. Voeg een druppel op de ronde bodembuis met PBS. Meng voorzichtig door vortexing voor 30 s.
  5. Voer de prestatiecontrole uit. Open de module Setup and Tracking van de cytometer in de software ( figuur1A). Controleer of de cytometerconfiguratie correct is voor het experiment met PE-immunostaining. Controleer of de kalibrerende kraalbatch correct is met de configuratie.
  6. Installeer de kraalbuis op de injectiepoort van het monster en laat deze met een lage monsterstroomgang draaien. Voer de prestatiecontrole uit, die ongeveer 5 minuten in beslag neemt). Controleer na of de prestaties van de cytometerprestaties bevredigend zijn (figuur 1B). Sluit de module Setup and Tracking van de cytometer in de software.
  7. Als u een experiment wilt instellen en toepassingsinstellingen wilt maken, klikt u op de knop Nieuw experiment op de werkbalk van de browser en opent u het nieuwe experiment. Geef de parameters op door de juiste cytometerinstellingen te selecteren: Forward Scatter (FSC), Side Scatter (SSC) en PE in het vervolgkeuzemenu van het experiment (figuur 1C). Selecteer lineaire modus voor FSC-parameter en Logaritmemodus voor SSC- en PE-parameters.
  8. Selecteer in het geopende experiment Cytometer-instellingen (figuur 1D),selecteer vervolgens Toepassingsinstellingenen maak een globaal werkblad (figuur 1E). Gebruik de grijze vakken en crosshairs om de optimalisatie te begeleiden.
  9. Laad de niet-bevlekte bedieningsbuis op de cytometer en voer Acquisitieuit. Zorg ervoor dat de populatie van belang (d.w.z. RBCs) op schaal is door de FSC- en SSC-spanningen te optimaliseren. Optimaliseer de FSC-drempelwaarde om vuil te elimineren zonder de bevolking van belang te storen.
  10. Teken een poort rond de RBCs op de FSC vs. SSC plot. Geef de RBC-populatie weer in de puntplot van PE-fluorescentie. Indien nodig, verhoging van de fluorescentie van de fotomultiplier buis (PMT) spanningen om de negatieve populatie plaats binnen de grijze dozen. Los de onbevlekte bedieningsbuis uit de cytometer.
  11. Controleer of de positieve populaties op schaal zijn. Laad de gekleurde controlebuis op de cytometer en voer Acquisitie uit. Verlaag de PMT-spanning voor de positieve populatie als deze niet op schaal is totdat de positieve populatie volledig op schaal kan worden gezien. Laad vervolgens het bevlekte monster uit.
  12. Als u monsters wilt opnemen en analyseren, maakt u op een nieuw globaal werkblad de volgende plots voor het bekijken van de gegevens: 1) FSC vs. SSC en 2) PE-fluorescentiehistogram. Laad het eerste monster op de cytometer en voer Acquisitieuit.
  13. Teken een RBC-poort rond de erythrocyten op het FSC vs. SSC-perceel. Geef de RBC-populatie weer in het PE-fluorescentiehistogram. Selecteer in de weergave Statistieken het gemiddelde voor PE-fluorescentieparameters op GR-populaties (figuur 1F).
  14. Selecteer in het dashboard Acquisitie alle gebeurtenissen in de stoppoort en 10.000 gebeurtenissen om op te nemen (Figuur 1G). Klik op Gegevens opnemen. Wanneer de gebeurtenisopname is voltooid, verwijdert u de eerste buis van de cytometer. De globale werkbladplots moeten er uitzien als die in figuur 2.
  15. Laad de volgende monsters en neem ze op.

6. Bepaling van de dichtheid van erytrocytenCR1

  1. Neem de waarden van de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van de monsters die overeenkomen met het "lage" onderwerp (figuur 3, tabel I, RBC MFI), "medium" onderwerp ( figuur4, tabel D, RBC MFI), "hoog" onderwerp ( Figuur4, Tabel I, RBC MFI), en de negatieve controle steekproef (Figuur 3, Tabel I, RBC MFI).
  2. Plaats op een grafiek die de gemiddelde fluorescentieintensiteit weergeeft als functie van de dichtheid van CR1, plaats de vier punten die overeenkomen met de negatieve controle, het "lage" onderwerp, het "gemiddelde" onderwerp en het "hoge" onderwerp (blauwe punten, figuur 6).
  3. Teken de regressielijn om de kalibratielijn en de vergelijking te krijgen.
  4. Neem de waarden van de gemiddelde fluorescentieintensiteit van de monsters die overeenkomen met de proefpersonen waarvan de dichtheid moet worden bepaald. (Figuur 5, tabellen D en I, RBC MFI).
  5. Verkrijg de vergelijking door "Y" te vervangen aan de hand van de waarden van de gemiddelde fluorescentie-intensiteiten en bereken de dichtheid van CR1/E (figuur 6).
  6. Controleer op de grafiek of de gemiddelde fluorescentieintensiteitswaarden en de bepaalde CR1/E-dichtheid overeenkomen met een punt op de kalibratielijn (figuur 6).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De erytrocyten van drie proefpersonen waarvan de dichtheid van CR1 bekend is ("laag" onderwerp [180 CR1/E], "medium" onderwerp [646 CR1/E], en "hoog" onderwerp [966 CR1/E]), en van twee proefpersonen waarvan de CR1-dichtheid moest worden bepaald, werden immunostained door een anti-CR1-antilichaam gekoppeld aan een versterkingssysteem met behulp van het fycoerythrinfluorchroom. In het begin werd de CR1-dichtheid van de proefpersonen uit het lage bereik bepaald door de Scatchard-methode29 met behulp van radioactieve antilichamen. De (lage, middelgrote en hoge) normen werden gebruikt voor een kalibratiecurve en maakten het mogelijk om nieuwe normen of substandaarden te kwantificeren volgens onze methode van cytometrie30. Na passage van geimmunostained erytrocyten in de stroomcytometer werd de intensiteit van de etikettering waargenomen en gemeten als de gemiddelde fluorescentieintensiteit voor elk onderwerp (RBC MFI) (Figuur 3F,I; Figuur 4b,D,F,I; Figuur 5B,D,F,I). Een curve werd uitgezet met behulp van de waarden van de proefpersonen met de bekende dichtheid van erythrocyte CR1 ("laag" tot "hoog") door ze te rapporteren als een functie van de gemiddelde fluorescentieintensiteit. Vergelijking van de regressielijn als gevolg van deze curve met de waarden van de gemiddelde fluorescentieintensiteit van de andere proefpersonen bepaalde hun CR1/E-dichtheid (figuur 6). Figuur 7 toont de totale workflow.

Figure 1
Figuur 1: Cytometerconsole en vensters die verschijnen tijdens het stroomcytometrieprotocol. (A) Venster dat wordt weergegeven na de toepassing van stap 5.5 van het protocol. bB) venster dat wordt weergegeven na de toepassing van stap 5.6 van het protocol. cC) venster dat wordt weergegeven na toepassing van stap 5.7 van het protocol. (D) Venster dat wordt weergegeven na de toepassing van stap 5.8 van het protocol. (E) Venster dat wordt weergegeven na de toepassing van stap 5.8 van het protocol. fF) venster dat wordt weergegeven na toepassing van stap 5.13 van het protocol. gG) venster dat wordt weergegeven na de toepassing van stap 5.14 van het protocol. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Weergave van de globale werkbladanalyseobjecten. Weergave van de globale werkbladanalyseobjecten na de toepassing van stap 5.14 van het protocol. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Resultaten van de analyse van de stromingscytometrie van anti-CR1 immunostaining van erytrocyten die overeenkomen met negatieve controle en het onderwerp uit het bereik ("laag" onderwerp) die lage CR1-dichtheid (180 CR1/E) uitdrukten. Voor elk onderwerp: (A,E) een puntvlek met het uiterlijk van gebeurtenissen die zijn verworven op basis van de grootte en de granulometry-parameters;g) de poort die de erytrocytenpopulatie selecteert tussen de gebeurtenissen,b,f) een histogram dat de intensiteit van de etikettering weergeeft, (C,H) een bijbehorende statistische tabel met het aantal gebeurtenissen dat overeenkomt met de erytrocyten en hun percentage, (D,I) een bijbehorende tabel met de gemiddelde fluorescentieintensiteit (RBC MFI). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Resultaten van de analyse van de hydratometrie van anti-CR1 immunostaining van erytrocyten die overeenkomen met de proefpersonen uit het bereik: "medium" subject who expressed MEDIUM CR1 density (646 CR1/E) and "high" subject who expressed HIGH CR1 density (966 CR1/E). Voor elk onderwerp: (A, E) een puntvlek met het uiterlijk van gebeurtenissen die zijn verworven op basis van de grootte en de granulometry-parameters;g) de poort die de erytrocytenpopulatie selecteert tussen de gebeurtenissen,b, f) een histogram dat de intensiteit van de etikettering weergeeft, (C, H) een bijbehorende statistische tabel met het aantal gebeurtenissen dat overeenkomt met de erytrocyten en hun percentage, (D, I) een bijbehorende tabel met de gemiddelde fluorescentieintensiteit (RBC MFI). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Resultaten van de analyse van de cytometrie van de stroming van anti-CR1-immunostaining van erytrocyten die overeenkomen met de proefpersonen waarvan de CR1-dichtheid moest worden bepaald. Voor elk onderwerp: (A, E) een puntvlek met het uiterlijk van gebeurtenissen die zijn verworven op basis van de grootte en de granulometry-parameters;g) de poort die de erytrocytenpopulatie selecteert tussen de gebeurtenissen,b, f) een histogram dat de intensiteit van de etikettering weergeeft, (C, H) een bijbehorende statistische tabel met het aantal gebeurtenissen dat overeenkomt met de erytrocyten en hun percentage, (D, I) een bijbehorende tabel met de gemiddelde fluorescentieintensiteit (RBC MFI). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 6
Figuur 6: Kalibratiecurve en regressielijn die bepaling van de CR1-dichtheid mogelijk maken. (A),B) Kalibratiecurve en regressielijn getrokken op basis van de bekende CR1-dichtheid van de proefpersonen (negatieve controle: 0 CR1, "laag" onderwerp [180 CR1/E], "gemiddeld" onderwerp [646 CR1/E] en "hoog" onderwerp [966 CR1/E]) en hun respectieve waarden van gemiddelde fluorescentieintensiteit verkregen door stromingscytometrie. (C),d) Uit de vergelijking van deze regressielijn berekenden we de dichtheid van erytrocyten CR1 voor proefpersonen waarvan de gemiddelde fluorescentieintensiteit werd gekwantificeerd door stromingscytometrie: oranje pijlen, onderwerp 1 (gemiddelde fluorescentieintensiteit = 1.334; CR1/E-dichtheid = 459) en onderwerp 2 (gemiddelde fluorescentieintensiteit = 2820; CR1/E-dichtheid = 1.000). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 7
Figuur 7: Stroomdiagram van het protocol om de erythrocyte CR1-dichtheid te bepalen uit menselijke bloedmonsters. Verzamel een menselijk bloedmonster. Was het menselijk bloedmonster door centrifugering om erythrocyten te verkrijgen. Bevlek de erythrocyten met behulp van een anti-CR1 antilichaam. Gebruik stroomcytometrie om de cr1-dichtheid van erythrocyte te bepalen aan de hand van een kalibratiecurve. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Er zijn verschillende technieken beschikbaar om de dichtheid van erythrocyte CR1 (CR1/E) te bepalen. De eerste gebruikte technieken waren de agglutinatie van rode bloedcellen door anti-CR1 antilichamen31 en de vorming van rozetten in aanwezigheid van erytrocyten bekleed met C3b32. Deze rudimentaire technieken werden snel vervangen door immunobevlekmethoden met behulp van anti-CR1-antilichamen met behulp vanradiolabel1 1,33. Het is ook mogelijk om de concentratie van CR1 in membraanextracten te meten door enzymgebonden immunosorbent-test (ELISA)34. Hoewel nauwkeurig, bieden deze technieken slechts een gemiddelde waarde van de CR1/E dichtheid. De verdeling van cr1/e dichtheid over de gehele erytrocyten populatie is alleen beschikbaar door stroom cytometrische analyse na immunostaining. Deze techniek is moeilijk vanwege de lage dichtheid van CR1/E. Niettemin maakt een versterkingsmethode het nu mogelijk om gemakkelijk de dichtheid van CR1/E30te meten.

Hier presenteren we een methode voor het kwantificeren van CR1/E door stromingscytometrie op basis van versterking van het fluorescentiesignaal van geimmunosmetecellen. Het versterkingssysteem omvat vier opeenvolgende lagen van kleuring met behulp van de biotinylated anti-CR1 monoklonale antilichaam J3D3; phycoerythrin-streptavidin; een bioatitanti-streptavidinantilichaam; en opnieuw fycoerythrin-streptavidin. J3D3 herkent drie antigene sites op CR135,hoewel niet meer dan een op hetzelfde moment. De bioatlated geit anti-streptavidin antilichaam is een polyklonale antilichaam dat meerdere epitopen herkent op streptavidine en biedt een betere brug tussen de twee streptavidine lagen dan biotin-streptavidin alleen. Dit proces profiteert ook van de hoge fluorescentieopbrengst van fycoerythrin36 en het lage niveau van niet-specifieke binding van streptavidine37. Met zo'n sterk versterkt signaal maken de lage instellingen van de cytometerfotomultiplierbuizen een perfecte lineariteit mogelijk. Deze methode, die wordt gekenmerkt door een uitstekende gevoeligheid en reproduceerbaarheid, maakt de detectie van minder dan 100 CR1/cel mogelijk.

Deze methode vereist echter monsters van drie proefpersonen waarvan de dichtheid van erythrocyte CR1 bekend is: één onderwerp dat een laag niveau van erytrocyten CR1 (180 CR1/E) uitdrukt, één onderwerp dat een gemiddeld niveau van erythrocyte CR1 (646 CR1/E) uitdrukt en één onderwerp dat een hoog niveau van erytrocyten CR1 (966 CR1/E) uitdrukt. Het is mogelijk om de eerste metingen te doen van de erytrocytCR1-dichtheid van verschillende personen, in eerste instantie met behulp van de erytrocyten van de drie proefpersonen die in onze studie worden gebruikt, die we kunnen bieden. De bloedmonsters van proefpersonen uit het bereik en de voor CR1 te kwantificeren onderwerpen moeten tegelijkertijd worden genomen, bij 4 °C in de koelkast worden opgeslagen en bij 4 °C38worden behandeld . Het bloed dat in EDTA-buizen wordt getrokken, is gemakkelijk routeerbaar en kan 5 dagen bij 4 °C worden bewaard, waardoor erytrocyten CR1 kan worden gekwantificeerd. Hierna begint de dichtheid van erytrocyten CR1 af te nemen en is er een ineenstorting van de standaard CR1-curve, vooral op het punt dat overeenkomt met het onderwerp dat een hoog niveau van erytrocyten CR1 uitdrukt. Omdat de resulterende regressielijn is vervormd, is de meting van de CR1-dichtheid niet langer nauwkeurig. Opgemerkt moet worden dat in vitro opslag, handling voorwaarden, en de meerlaagse kleuring leiden tot clustering van CR1 en een lichte overschatting van het aantal CR1 moleculen. Niettemin maakt het gebruik van een anti-CR1-antilichaam gericht op drie epitopen, zoals J3D3 met het versterkingssysteem, het mogelijk om volledig te clusteren, waardoor een correcte meting van CR1-dichtheid39mogelijk is.

In feite neemt de dichtheid van CR1/E af tijdens de levensduur van de erytrocyt40. Dit zou de heterogeniteit van de dichtheid van CR1/E in hetzelfde individu verklaren. Volgens sommige auteurs is de intensiteit van katabolisme van CR1 niet gecorreleerd met de initiële dichtheid van CR1/E41, terwijl voor andere auteurs, hoe hoger de initiële dichtheid, hoe groter de intensiteit van katabolisme42. De halveringstijd van CR1 op het oppervlak van erythrocyten is 11-32 dagen42.

De hier gepresenteerde methode heeft verschillende voordelen. De eerste is om dankzij de stromingscytometrie de celsubpopulaties te kunnen selecteren die binnen hetzelfde bloedmonster moeten worden bestudeerd. Door de erytrocytenpopulatie te selecteren met behulp van de poortfunctie, wordt de meting van de erytrocytendichtheid uitsluitend gegarandeerd. Een vooroordeel in de meting van erythrocyte CR1 veroorzaakt door de aanwezigheid van andere cellulaire subpopulaties zoals witte bloedcellen wordt vermeden. Het tweede voordeel van deze methode is dat het aanpasbaar is aan de kwantificering van andere cellulaire receptoren waarvan de dichtheid laag is door simpelweg het primaire anti-CR1-antilichaam te vervangen door een antilichaam dat specifiek gericht is tegen een epitoop van de te bestuderen receptor. Het is ook aanpasbaar aan het gebruik van 96 goed platen in plaats van buis rekken, die vereist lager bloed en reagens volumes25,38. Het derde voordeel van deze methode is dat deze flexibel is. In studies over cellen met een zeer hoge dichtheid van CR1, bijvoorbeeld menselijke lymfocyten (10.000 CR1/cell), of niet-menselijke primatenerytrocyten waarvan de CR1-dichtheid 10-100x groter is dan die van mensen (10.000-100.000 CR1/cel)43,44, is het mogelijk om het aantal lagen van het versterkingssysteem te verminderen, met alleen bioateuze anti-CR1 monoklonale antilichaam, fycoerythrin-streptavidinof biotinylated anti-CR1 monoklonale antilichaam, biotinylated anti-muis antilichaam, en fycoerythrin-streptavidin, waardoor het fluorescentieniveau aan te passen aan de hogere dichtheid van CR1. Het vierde voordeel van deze methode is dat het kan worden gebruikt voor vaste of bevroren erytrocyten, waardoor bloedmonsters kunnen worden verzameld in gebieden die niet over de faciliteiten voor stroomcytometrie beschikken en worden opgeslagen voor een latere nauwkeurige kwantificering van CR138.

Meer in het algemeen lijkt het met de nieuwe helderdere fluorkoolwaterstoffen niet langer verplicht om het systeem van indirecte versterking te gebruiken. Bovendien zijn er andere methoden met behulp van flow cytometrie die het mogelijk maken om de dichtheid van de cellulaire receptoren te evalueren en te kwantificeren in maateenheden (dwz ABC, of antilichaam binding capaciteit). De ABC per cel kan ook worden bepaald met behulp van verzadigende concentraties van antilichamen en gekalibreerde kralen. Er zijn verschillende commerciële systemen beschikbaar. Sommige kits zijn vooraf gekalibreerde standaard kralen met bekende niveaus van fluorchroom moleculen zoals PE gebonden per kraal. De kralen die op dezelfde dag op een stroomcytometer zijn verkregen op dezelfde instrumentinstellingen als de individuele patiëntspecimens, maken het mogelijk om een standaardcurve te tekenen waarin het meetkundig gemiddelde van fluorescentie wordt vergeleken met het bekende PE-gehalte van de kralen. De regressieanalyse, helling, onderschepping en correlatiecoëfficiënt worden bepaald en de ABC-waarden worden berekend op basis van de gemeten geometrische gemiddelde fluorescentie van cellen met behulp van de standaardcurve45,46.

Een ander type kraaltest is gebaseerd op de binding van een antilichaam dat is geconjugeerd met kralen met specifieke antilichaambindingscapaciteitsniveaus via het kristallkristalliste gedeelte van het fragment (Fc). Kralen zijn gelabeld met hetzelfde antilichaam dat wordt gebruikt om de cellen te etiketteren waarvan de antigeendichtheid moet worden gemeten. Zo kan in één enkel experiment elk geconjugeerd antilichaam worden gebruikt, zolang dezelfde partij met dezelfde fluorophore/eiwitverhouding (F/P-verhouding) wordt gebruikt om zowel kralen als cellen te bevlekken47. Sommige kits zijn beter voor de kwantitatieve bepaling van celoppervlakteantigenen door stromingscytometrie met behulp van indirecte immunofluorescentietesten48,49.

Tot slot, onze methode heeft het voordeel van het verstrekken van zeer gevoelige detectie en zijn gemakkelijk te implementeren op gewone stroom cytometrie materiaal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Wij danken alle leden van de URCACyt, flow cytometrie technisch platform, het personeel van de afdeling Immunologie, en het personeel van de afdeling Interne Geneeskunde en Geriatrie, die hebben bijgedragen aan het optimaliseren en valideren van het protocol. Dit werk werd gefinancierd door de universitaire ziekenhuizen van Reims (subsidienummer AOL11UF9156).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1000E Barrier Tip Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France 2079E sample pipetting
1-100 µL Bevelled, filter tip Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Germany S1120-1840 sample pipetting
Biotinylated anti-CR1 monoclonal antibody (J3D3) Home production of non-commercial monoclonal antibody, courtesy of Dr J. Cook immunostaining
Blouse protection
Bovin serum albumin (7,5%) Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France 15260037 cytometry
Centrifuge Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France 11176917 centrifugation
Clean Solution BD, F-38801 Le Pont de Claix, France 340345 cytometry
Comorack-96 Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath 944060P rack
Cytometer Setup & Tracking Beads Kit BD, F-38801 Le Pont de Claix, France 655051 cytometry
Formaldehyde solution 36.5 % Sigma Aldrich, F-38070 Saint Quentin Fallavier, France F8775-25ML Fixation
10 µL Graduated, filter tip Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Germany S1121-3810 sample pipetting
LSRFORTESSA Flow Cytometer BD, F-38801 Le Pont de Claix, France 647788 cytometry
Microman Capillary Pistons Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath 067494 sample pipetting
Micronic 1.40 mL round bottom tubes Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath MP32051 mix
Micropipette Microman - type M25 - Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath 066379 sample pipetting
Phosphate buffered Saline (PBS) Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France 10010031 cytometry
Pipette PS 325 mm, 10 mL Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath 391952 sample pipetting
powder-free Nitrile Exam gloves Medline Industries, Inc, Mundelein, IL 60060, USA 486802 sample protection
Reference 2 pipette, 0,5-10 µL Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France 4920000024 sample pipetting
Reference 2 pipette, 20-100 µL Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France 4920000059 sample pipetting
Reference 2 pipette, 100-1000 µL Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France 4920000083 sample pipetting
Rinse Solution BD, F-38801 Le Pont de Claix, France 340346 cytometry
Round bottom tube Sarstedt, F-70150 Marnay, France 55.1579 cytometry
Safe-Lock Tubes, 1.5 mL Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France 0030120086 mix
streptavidin R-PE Tebu Bio, F-78612 Le Perray-en-Yvelines, France AS-60669 immunostaining
Tapered Centrifuge Tubes 50 mL Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France 10203001 mix
Vector anti streptavidin biotin Eurobio Ingen, F-91953 Les Ulis, France BA-0500 immunostaining
Vortex-Genie 2 Scientific Industries, Inc, Bohemia, NY 111716, USA SI-0236 mix

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fearon, D. T. Identification of the membrane glycoprotein that is the C3b receptor of the human erythrocyte, polymorphonuclear leukocyte, B lymphocyte, and monocyte. Journal of Experimental Medicine. 152 (1), 20-30 (1980).
  2. Ross, G. D., Winchester, R. J., Rabellino, E. M., Hoffman, T. Surface markers of complement receptor lymphocytes. Journal of Clinical Investigation. 62 (5), 1086-1092 (1978).
  3. Reynes, M., et al. Human follicular dendritic cells express CR1, CR2, and CR3 complement receptor antigens. The Journal of Immunology. 135 (4), 2687-2694 (1985).
  4. Gasque, P., et al. Identification and characterization of complement C3 receptors on human astrocytes. The Journal of Immunology. 156 (6), 2247-2255 (1996).
  5. Pascual, M., et al. Identification of membrane-bound CR1 (CD35) in human urine: evidence for its release by glomerular podocytes. Journal of Experimental Medicine. 179 (3), 889-899 (1994).
  6. Fearon, D. T. Regulation of the amplification C3 convertase of human complement by an inhibitory protein isolated from human erythrocyte membrane. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (11), 5867-5871 (1979).
  7. Dobson, N. J., Lambris, J. D., Ross, G. D. Characteristics of isolated erythrocyte complement receptor type one (CR1, C4b-C3b receptor) and CR1-specific antibodies. The Journal of Immunology. 126 (2), 693-698 (1981).
  8. Schreiber, R. D., Pangburn, M. K., Muller-Eberhard, H. J. C3 modified at the thiolester site: acquisition of reactivity with cellular C3b receptors. Bioscience Reports. 1 (11), 873-880 (1981).
  9. Ross, G. D., et al. Generation of three different fragments of bound C3 with purified factor I or serum. II. Location of binding sites in the C3 fragments for factors B and H, complement receptors, and bovine conglutinin. Journal of Experimental Medicine. 158 (2), 334-352 (1983).
  10. Klickstein, L. B., Barbashov, S. F., Liu, T., Jack, R. M., Nicholson-Weller, A. Complement receptor type 1 (CR1, CD35) is a receptor for C1q. Immunity. 7 (3), 345-355 (1997).
  11. Ghiran, I., et al. Complement receptor 1/CD35 is a receptor for mannan-binding lectin. Journal of Experimental Medicine. 192 (12), 1797-1808 (2000).
  12. Cornacoff, J. B., et al. Primate erythrocyte-immune complex-clearing mechanism. Journal of Clinical Investigation. 71 (2), 236-247 (1983).
  13. Waxman, F. J., et al. Complement depletion accelerates the clearance of immune complexes from the circulation of primates. Journal of Clinical Investigation. 74 (4), 1329-1340 (1984).
  14. Waxman, F. J., et al. Differential binding of immunoglobulin A and immunoglobulin G1 immune complexes to primate erythrocytes in vivo. Immunoglobulin A immune complexes bind less well to erythrocytes and are preferentially deposited in glomeruli. Journal of Clinical Investigation. 77 (1), 82-89 (1986).
  15. Horgan, C., Taylor, R. P. Studies on the kinetics of binding of complement-fixing dsDNA/anti-dsDNA immune complexes to the red blood cells of normal individuals and patients with systemic lupus erythematosus. Arthritis & Rheumatology. 27 (3), 320-329 (1984).
  16. Pham, B. N., et al. Analysis of complement receptor type 1 expression on red blood cells in negative phenotypes of the Knops blood group system, according to CR1 gene allotype polymorphisms. Transfusion. 50 (7), 1435-1443 (2010).
  17. Wilson, J. G., et al. Identification of a restriction fragment length polymorphism by a CR1 cDNA that correlates with the number of CR1 on erythrocytes. Journal of Experimental Medicine. 164 (1), 50-59 (1986).
  18. Rodriguez de Cordoba, S., Rubinstein, P. Quantitative variations of the C3b/C4b receptor (CR1) in human erythrocytes are controlled by genes within the regulator of complement activation (RCA) gene cluster. Journal of Experimental Medicine. 164 (4), 1274-1283 (1986).
  19. Herrera, A. H., Xiang, L., Martin, S. G., Lewis, J., Wilson, J. G. Analysis of complement receptor type 1 (CR1) expression on erythrocytes and of CR1 allelic markers in caucasian and african american populations. Clinical Immunology and Immunopathology. 87 (2), 176-183 (1998).
  20. Birmingham, D. J., et al. A CR1 polymorphism associated with constitutive erythrocyte CR1 levels affects binding to C4b but not C3b. Immunology. 108 (4), 531-538 (2003).
  21. Dykman, T. R., Hatch, J. A., Aqua, M. S., Atkinson, J. P. Polymorphism of the C3b/C4b receptor (CR1): characterization of a fourth allele. The Journal of Immunology. 134 (3), 1787-1789 (1985).
  22. Moulds, J. M., Moulds, J. J., Brown, M., Atkinson, J. P. Antiglobulin testing for CR1-related (Knops/McCoy/Swain-Langley/York) blood group antigens: negative and weak reactions are caused by variable expression of CR1. Vox Sanguinis. 62 (4), 230-235 (1992).
  23. Cohen, J. H., Lutz, H. U., Pennaforte, J. L., Bouchard, A., Kazatchkine, M. D. Peripheral catabolism of CR1 (the C3b receptor, CD35) on erythrocytes from healthy individuals and patients with systemic lupus erythematosus (SLE). Clinical & Experimental Immunology. 87 (3), 422-428 (1992).
  24. Jouvin, M. H., Rozenbaum, W., Russo, R., Kazatchkine, M. D. Decreased expression of the C3b/C4b complement receptor (CR1) in AIDS and AIDS-related syndromes correlates with clinical subpopulations of patients with HIV infection. AIDS. 1 (2), 89-94 (1987).
  25. Waitumbi, J. N., Donvito, B., Kisserli, A., Cohen, J. H., Stoute, J. A. Age-related changes in red blood cell complement regulatory proteins and susceptibility to severe malaria. The Journal of Infectious Diseases. 190 (6), 1183-1191 (2004).
  26. Mahmoudi, R., et al. Alzheimer's disease is associated with low density of the long CR1 isoform. Neurobiology of Aging. 36 (4), 5-12 (2015).
  27. Mahmoudi, R., et al. Inherited and Acquired Decrease in Complement Receptor 1 (CR1) Density on Red Blood Cells Associated with High Levels of Soluble CR1 in Alzheimer's Disease. International Journal of Molecular Sciences. 19 (8), 2175 (2018).
  28. Zaitsev, S., et al. Human complement receptor type 1-directed loading of tissue plasminogen activator on circulating erythrocytes for prophylactic fibrinolysis. Blood. 108 (6), 1895-1902 (2006).
  29. Scatchard, G. The attractions of proteins for small molecules and ions. Annals of the New York Academy of Sciences. 51 (4), 660-672 (1949).
  30. Cohen, J. H., et al. Enumeration of CR1 complement receptors on erythrocytes using a new method for detecting low density cell surface antigens by flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 99 (1), 53-58 (1987).
  31. Minota, S., et al. Low C3b receptor reactivity on erythrocytes from patients with systemic lupus erythematosus detected by immune adherence hemagglutination and radioimmunoassays with monoclonal antibody. Arthritis & Rheumatology. 27 (12), 1329-1335 (1984).
  32. Miyakawa, Y., et al. Defective immune-adherence (C3b) receptor on erythrocytes from patients with systemic lupus erythematosus. The Lancet. 2 (8245), 493-497 (1981).
  33. Lida, K., Mornaghi, R., Nussenzweig, V. Complement receptor (CR1) deficiency in erythrocytes from patients with systemic lupus erythematosus. Journal of Experimental Medicine. 155 (5), 1427-1438 (1982).
  34. Tao, K., Nicholls, K., Rockman, S., Kincaid-Smith, P. Expression of complement 3 receptors (CR1 and CR3) on neutrophils and erythrocytes in patients with IgA nephropathy. Clinical Nephrology. 32 (5), 203-208 (1989).
  35. Nickells, M., et al. Mapping epitopes for 20 monoclonal antibodies to CR1. Clinical and Experimental Immunology. 112 (1), 27-33 (1998).
  36. Oi, V. T., Glazer, A. N., Stryer, L. Fluorescent phycobiliprotein conjugates for analyses of cells and molecules. The Journal of Cell Biology. 93 (3), 981-986 (1982).
  37. Chaiet, L., Wolf, F. J. The properties of streptavidin, a biotin-binding protein produced by streptomyces. Archives of Biochemistry and Biophysics. 20 (106), 1-5 (1964).
  38. Cockburn, I. A., Donvito, B., Cohen, J. H., Rowe, J. A. A simple method for accurate quantification of complement receptor 1 on erythrocytes preserved by fixing or freezing. Journal of Immunological Methods. 20 (271), 59-64 (2002).
  39. Chen, C. H., et al. Antibody CR1-2B11 recognizes a non-polymorphic epitope of human CR1 (CD35). Clinical & Experimental Immunology. 148 (3), 546-554 (2007).
  40. Ripoche, J., Sim, R. B. Loss of complement receptor type 1 (CR1) on ageing of erythrocytes. Studies of proteolytic release of the receptor. Biochemical Journal. 235 (3), 815-821 (1986).
  41. Moldenhauer, F., Botto, M., Walport, M. J. The rate of loss of CR1 from ageing erythrocytes in vivo in normal subjects and SLE patients: no correlation with structural or numerical polymorphisms. Clinical & Experimental Immunology. 72 (1), 74-78 (1988).
  42. Cohen, J. H., Lutz, H. U., Pennaforte, J. L., Bouchard, A., Kazatchkine, M. D. Peripheral catabolism of CR1 (the C3b receptor, CD35) on erythrocytes from healthy individuals and patients with systemic lupus erythematosus (SLE). Clinical & Experimental Immunology. 87 (3), 422-428 (1992).
  43. Nickells, M. W., Subramanian, V. B., Clemenza, L., Atkinson, J. P. Identification of complement receptor type 1-related proteins on primate erythrocytes. The Journal of Immunology. 154 (6), 2829-2837 (1995).
  44. Hebert, L. A., Birmingham, D. J., Shen, X. P., Cosio, F. G. Stimulating erythropoiesis increases complement receptor expression on primate erythrocytes. Clinical Immunology and Immunopathology. 62 (3), 301-306 (1992).
  45. Davis, K. A., Abrams, B., Iyer, S. B., Hoffman, R. A., Bishop, J. E. Determination of CD4 antigen density on cells: Role of antibody valency, avidity, clones, and conjugation. Cytometry. 33 (2), 197-205 (1998).
  46. Pannu, K. K., Joe, E. T., Iyer, S. B. Performance evaluation of QuantiBRITE phycoerythrin beads. Cytometry. 45 (4), 250-258 (2001).
  47. Barnett, D., Storie, I., Wilson, G. A., Granger, V., Reilly, J. T. Determination of leucocyte antibody binding capacity (ABC): the need for standardization. Clinical Laboratory Haematology. 20 (3), 155-164 (1998).
  48. Bikoue, A., et al. Quantitative analysis of leukocyte membrane antigen expression: normal adult values. Cytometry. 26 (2), 137-147 (1996).
  49. Serke, S., van Lessen, A., Huhn, D. Quantitative fluorescence flow cytometry: a comparison of the three techniques for direct and indirect immunofluorescence. Cytometry. 33 (2), 179-187 (1998).

Tags

Immunologie en infectie nummer 159 CR1 CD35 aanvulling C3b/C4b receptor CR1 dichtheid polymorfisme flow cytometrie de ziekte van Alzheimer Systemische lupus erythematosus malaria
Het meten van Erythroocyte Complement Receptor 1 met behulp van Flow Cytometrie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kisserli, A., Audonnet, S., Duret,… More

Kisserli, A., Audonnet, S., Duret, V., Tabary, T., Cohen, J. H. M., Mahmoudi, R. Measuring Erythrocyte Complement Receptor 1 Using Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (159), e60810, doi:10.3791/60810 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter