Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Måling Erythrocyt Supplement Receptor 1 Brug Flow cytometri

Published: May 19, 2020 doi: 10.3791/60810
Automatic Translation
1,2, 3, 2,4, 2,4, 2, 5,6
1Oncogeriatric Coordination Unit, Reims University Hospitals, Maison Blanche Hospital, 2Faculty of Medicine, University of Reims Champagne-Ardenne, 3URCACyt, Flow cytometry technical platform, University of Reims Champagne-Ardenne, 4Department of Immunology, Reims University Hospitals, Robert Debre Hospital, 5Department of Internal Medicine and Geriatrics, Reims University Hospitals, Maison Blanche Hospital, 6Faculty of Medicine, University of Reims Champagne-Ardenne

Summary

Formålet med denne metode er at bestemme CR1-tætheden i erythrocytter af ethvert forsøgsperson ved at sammenligne med tre forsøgspersoner, hvis erythrocyt CR1-tæthed er kendt. Metoden anvender flowcytometri efter immunfarvning af forsøgspersonernes erythrocytter med et anti-CR1 monoklonalt antistof koblet til et forstærket system ved hjælp af phycoerythrin (PE).

Abstract

CR1 (CD35, Complement Receptor type 1 for C3b/C4b) er en høj molekylvægt membran glycoprotein på omkring 200 kDa, der styrer supplement aktivering, transporterer immun komplekser, og deltager i humoral og cellulære immunrespons. CR1 er til stede på overfladen af mange celletyper, herunder erythrocytter, og udviser polymorfier i længde, struktur (Knops, eller KN, blodtype), og tæthed. Den gennemsnitlige massefylde af CR1 pr. erythrocyt (CR1/E) er 500 molekyler pr. erythrocyt. Denne tæthed varierer fra individ til individ (100-1.200 CR1/E) og fra en erythrocyt til en anden i samme person. Vi præsenterer her en robust flow cytometri metode til at måle tætheden af CR1/E, herunder i forsøgspersoner, der udtrykker en lav tæthed, ved hjælp af en forstærkende immunfarvning system. Denne metode har gjort det muligt for os at vise sænkning af CR1 erythrocyt udtryk i sygdomme som Alzheimers sygdom (AD), systemisk lupus erythematosus (SLE), AIDS, eller malaria.

Introduction

CR1 (supplement receptor type 1, CD35) er en 200 kDa transmembrane glycoprotein til stede på overfladen af mange celletyper, såsom erythrocytter1, B lymfocytter2, monocytiske celler, nogle T-celler, follikulære dendritiske celler3, føtale astrocytter4, og glomerular podocytter5. CR1 forstyrrer dens ligander C3b, C4b, C3bi6,,7,8,9, en underenhed af den første komplementkomponent, C1q10 og MBL (mannan-bindende lectin)11 hæmmer aktivering af komplemente og er involveret i humoral og cellulær immunrespons.

Hos primater, herunder mennesker, erythrocyt CR1 involveret i transport af immunkomplekser til leveren og milten, at rense blodet og forhindre deres ophobning i sårbare væv såsom hud eller nyrer12,13,14. Dette fænomen af immun vedhæfte mellem immun komplekser og erythrocytter afhænger af antallet af CR1 molekyler15. Hos mennesker er den gennemsnitlige massefylde af CR1/E kun 500 (dvs. 500 cr1-molekyler pr. erythrocyt). Denne tæthed varierer fra individ til individ (100-1.200 CR1/E) og fra en erythrocyt til en anden i samme person. Nogle personer af "null" fænotype udtrykker færre end 20 CR1/E16.

Tætheden af CR1/E reguleres af to meddominerende autosomaller, der er forbundet med en punktmutation i intron 27 af genkoden for CR1*117,18. Denne mutation producerer et ekstra restriktionssted for HindIII-enzymet. De restriktionsfragmenter, der er opnået efter fordøjelsen med HindIII i dette tilfælde, er 7,4 kb for allel, der er forbundet med et stærkt udtryk for CR1 (H: høj allel) og 6,9 kb for allelen, der er forbundet med lavt CR1-udtryk (L: lav allel). Dette link findes i kaukasiere og asiater, men ikke i mennesker af afrikansk afstamning19.

Niveauet af udtryk for erythrocyt CR1 er også korreleret med tilstedeværelsen af punkt nukleotid mutationer i exon 13 kodning SCR 10 (I643T) og i exon 19 kodning SCR16 (Q981H). Det er højt i homozygot 643I/981Q og lav i homozygot 643T/981H individer20. Således "lav" individer udtrykke omkring 150 CR1/E, "medium" individer udtrykke omkring 500 CR1 / E, og "høj" individer udtrykke omkring 1.000 CR1 / E.

Ud over denne erythrocyt density polymorfi, CR1 er kendetegnet ved en længde polymorfi svarende til fire allotyper af forskellige størrelser: CR1 * 1 (190 kDa), CR1 * 2 (220 kDa), CR1 * 3 (160 kDa), og CR1 * 4 (250 kDa)21 og en antigen polymorfi svarende til blodgruppen KN22.

Vi præsenterer vores metode baseret på flow cytometri at bestemme tætheden af CR1/E. Ved hjælp af tre emner, hvis CR1/E tæthed er kendt, med et lavt densitetsniveau (180 CR1/E), et mellemhøjt niveau (646 CR1/E) og et højt densitetsniveau (966 CR1/E), er det let at måle den gennemsnitlige fluorescensintensitet (MFI) af deres erythrocytter eller røde blodlegemer (RBC) eller RBC MFI, efter anti-CR1 immunfarvning ved hjælp af en flowcytometer. Man kan derefter afbilde en standardlinje, der repræsenterer MFI som en funktion af CR1/E tæthed. Måling af MFI af emner, hvis CR1/E tæthed ikke er kendt, og sammenligne det med denne standard linje, er det muligt at bestemme den enkeltes CR1/E tæthed. Denne teknik har været brugt i mange år i laboratoriet, og har gjort det muligt for os at opdage en reduktion i udtrykket af erythrocyt CR1 i mange patologier såsom systemisk lupus erythematosus (SLE)23, Erhvervet immundefekt syndrom (AIDS)24, malaria25, og for nylig Alzheimers sygdom (AD)26,27. Udviklingen af lægemidler rettet mod CR1 til par med erythrocytter, som det er tilfældet med anti-trombotiske lægemidler28 kræver evaluering af CR1/E tæthed, og tilgængeligheden af en robust teknik til at kvantificere CR1.

Den præsenterede protokol kører i singlicate. Det er fleksibelt at bestemme tætheden af CR1/E på mange personer ved hjælp af specifikke kommercielt tilgængelige 96 brøndplader (se Materialetabel). Til dette formål er det nemt at tilpasse vores metode til enhver 96 brøndplade. For hver prøve fordeles en cellesuspension af erythrocytter (0,5 x 106-1 x 106 erythrocytter) pr. brønd. For hver brønd, først den primære anti-CR1 antistof tilsættes, derefter streptavidin PE, den sekundære anti-streptavidin antistof, og igen streptavidin PE, ved hjælp af de samme fortyndinger som dem af vores metode, men ved at tilpasse mængder og respekt for proportionalitet.

Blodprøver fra forsøgspersoner i området og fra forsøgspersoner, der skal kvantificeres for CR1, udtages samtidig, opbevares i køleskabet ved 4 °C og håndteres ved 4 °C (på is og/eller i køleskabet).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Protokollen for indsamling og håndtering af blod hos mennesker blev gennemgået og godkendt af den regionale etiske komité (CPP Est II), og protokolnummeret er 2011-A00594-37. Da følgende protokol beskriver håndtering af humant blod, bør der følges institutionelle retningslinjer for bortskaffelse af biofarligt materiale. Laboratoriesikkerhedsudstyr, såsom laboratoriekitler og handsker, skal bæres.

1. Erythrocyt vask

BEMÆRK: Dagen før håndtering fremstilles en PBS-BSA-buffer med fosfatbuffer (PBS), der indeholder 0,15 % af kvægserumalbuminen (BSA), og den anbringes i køleskabet ved 4 °C. Denne buffer vil blive brugt som vaskebuffer og som fortyndingsbuffer.

  1. Pipette 20 ml PBS-BSA i et 50 ml rør.
  2. Aspirerer 250 μL natriumethylenediamintetraacticsyre (EDTA) antikoaguleret fuldblod fra blodlagrer og tilsættes til røret, der indeholder 20 ml PBS-BSA. Luk røret ved at skrue hætten. Bland forsigtigt ved at vende røret 2x.
  3. Røret centrifugeres i 10 minutter ved 4 °C ved 430 x g. Fjern og kassér supernatanten med en 10 ml pipette. Resuspender pellet i restmængden af supernatant ved blid og omhyggelig pipettering.
  4. Der tilsættes 20 ml kold PBS-BSA (4 °C) i det rør, der indeholder pelleten. Røret centrifugeres i 10 minutter ved 4 °C ved 430 x g. Fjern og kassér supernatanten med en 10 ml pipette.
  5. Der tilsættes 20 ml kold PBS-BSA (4 °C) i det rør, der indeholder pelleten. Røret centrifugeres i 10 minutter ved 4 °C ved 430 x g. Lad røret stå i centrifugen ved 4 °C og gå til sektion 2.

2. Erythrocyt fortynding

  1. Pipetter 3 ml kold PBS-BSA i et 50 ml rør og opbevares ved 4 °C på en rist i is.
  2. Det centrifugerede rør, der indeholder erythrocytterne (trin 1.4), anbringes på en rist, der er anbragt i isen.
  3. Pipetter8 μL pelleterede erythrocytter ved hjælp af pipetten og tilsættes til 50 ml-røret, der indeholder 3 ml PBS-BSA for at opnå erythrocytfortynding. Røret blandes forsigtigt i hånden for at opnå en homogen cellesuspension af erythrocytter.

3. Erythrocyt immunfarvning

  1. 100 μL erythrocytfortynding (opnået i punkt 4) og tilsættes til 1,4 ml rør.
  2. Rørene centrifugeres i 5 min ved 4 °C ved 430 x g. Under centrifugering fremstilles et fortyndingsstof af biotinylateret anti-CR1 J3D3-antistof i en koncentration på 0,05 μg/μL i PBS-BSA-buffer.
  3. Når centrifugering er færdig, fjerne og kassere supernatanten.
  4. Der tilsættes 20 μL biotinylateret anti-CR1 J3D3 direkte til pelleten. For at forberede den negative kontrol tilsættes der i stedet 20 μL PBS-BSA-buffer. Rørene blandes forsigtigt og inkuberes i 45 minutter ved 4 °C.
  5. Efter 45 min inkubation tilsættes 750 μL PBS-BSA til rørene. Rørene centrifugeres i 5 min ved 4 °C ved 430 x g. Fjern og kassér supernatanten. Gentag.
  6. I mellemtiden fremstilles en 1:10 fortynding af streptavidin-phycoerythrin fortyndet i PBS-BSA buffer. 20 μL af 1:10 fortynding af streptavidin-phycoerythrin og tilsættes til rørene. Rørene blandes forsigtigt og inkuberes i 45 minutter ved 4 °C.
  7. Der tilsættes 750 μL PBS-BSA-buffer i rørene. Der blandes godt og centrifugeres i 5 min ved 4 °C ved 430 x g. Fjern og kassér supernatanten. Gentag.
  8. Under centrifugering fremstilles et 1:100 fortyndingaf biotinyt anti-streptavidin antistof fortyndet i PBS-BSA buffer.
  9. Når centrifugering er færdig, fjerne og kassere supernatanten.
  10. 20 μL af 1:100 fortynding af biotinylateret anti-streptavidin i rørene. Bland rørene forsigtigt. Rørene inkuberes i 45 minutter ved 4 °C.
  11. Efter 45 minutters inkubation tilsættes 750 μL PBS-BSA-buffer og tilsættes i rørene. Rørene centrifugeres i 5 min ved 4 °C ved 430 x g. Fjern og kassér supernatanten. Gentag.
  12. 20 μL af 1:10 fortynding af streptavidin-phycoerythrin og tilsættes i rørene. Bland rørene forsigtigt. Rørene inkuberes i 45 minutter ved 4 °C.
  13. Pipette 750 μL PBS-BSA buffer og tilsættes i rørene. Rørene blandes godt og centrifugeres i 5 minutter ved 4 °C ved 430 x g. Fjern og kassér supernatanten. Gentag dette trin 2x.

4. Immunplettet erythrocytfiksering

  1. Under den sidste centrifugering fremstilles fikseringsbufferen, en 1:100 fortynding af 37% formaldehyd ved hjælp af vaskebufferen PBS-BSA.
  2. Pipette 450 μL fikseringsbuffer og tilsættes immunbesværede erythrocytrør (fra trin 3.13), mens der hvirvles i 5 s.
  3. Pipette alle faste celler i 5 ml runde bundrør og opbevares i køleskabet.
    BEMÆRK: Protokollen kan sættes på pause her i op til 48 timer.

5. Flow cytometri analyse af farvede erythrocytter

BEMÆRK: Det anbefales at henvise til betjeningsvejledningen til cytometeret (se Materialetabel)for at vide, hvordan de cytometriske aflæsninger skal udføres. De foreslåede parametre nedenfor gælder for det anvendte instrument og skal optimeres for hvert cytometer.

  1. Tænd for flowcytometeret, og tænd derefter computeren. Lad den optiske systemtemperatur stabilisere ved at lade den være tændt i 30 min. Kontroller cytometervinduet i softwaren for at sikre, at cytometeret er tilsluttet arbejdsstationen (meddelelsen CytometerConnected vises).
  2. Kontroller, at bufferbeholderen er fuld, og at affaldsbeholderen er tom. Fjern luftbobler i bufferfilteret og bufferlinjen ved hjælp af udrensningssystemet. Prime fluidics systemet ved at trykke på Prime-knappen på konsollen af cytometeret. Vent, indtil indikatorlampen skifter fra rød til grøn.
  3. For at rengøre fluidiksen skal der installeres et rør, der indeholder 3 ml af en rengøringsopløsning, på prøveinjektionsporten, og lad rengøringsopløsningen køre i 5 minutter med en høj prøvestrømningshastighed. Dette gentages med skylleopløsningen med destilleret vand. Lad røret indeholde vand på prøveinjektionsporten.
  4. For at forberede kalibrering perler, pipette 400 μL af PBS i bunden af en rund bund rør. Bland perlelagrene kraftigt ved vortexing i 30 s. Tilføj en dråbe til det runde bundrør, der indeholder PBS. Bland omhyggeligt ved vortexing i 30 s.
  5. Kør ydelseskontrollen. Åbn cytometeropsætnings- og sporingsmodulet i softwaren (Figur 1A). Kontroller, at cytometerkonfigurationen er korrekt for forsøget ved hjælp af PE immunfarvning. Kontroller, at den kalibrerende perlebatch er korrekt med konfigurationen.
  6. Se perlerøret på prøveinjektionsporten, og lad det køre med en lav prøvestrømningshastighed. Kør ydelseskontrollen, som tager ca. 5 minutter at gennemføre). Når præstationskontrollen er afsluttet, skal det kontrolleres, at cytometerets ydeevne er tilfredsstillende (figur 1B). Luk cytometeropsætnings- og sporingsmodulet i softwaren.
  7. Hvis du vil konfigurere et eksperiment og oprette programindstillinger, skal du klikke på knappen Nyt eksperiment på browserværktøjslinjen og åbne det nye eksperiment. Angiv parametrene ved at vælge passende cytometerindstillinger: Forward Scatter (FSC), Side Scatter (SSC) og PE i rullemenuen for eksperimentet (Figur 1C). Vælg Lineær tilstand for FSC-parameter og Logaritme-tilstand for SSC- og PE-parametre.
  8. I det åbne eksperiment skal du vælge Cytometerindstillinger (Figur 1D), og derefter vælge Programindstillingerog oprette et globalt regneark (Figur 1E). Brug de grå bokse og trådkors til at styre optimeringen.
  9. Læg det ubejdende kontrolrør på cytometeret, og kør Anskaffelse. Sørg for, at den interessepopulation (dvs. rBC' er i stor skala ved at optimere FSC- og SSC-spændingerne. Optimer FSC-tærskelværdien for at eliminere snavs uden at forstyrre den population af interesse.
  10. Tegn en port rundt om RBC'erne på FSC vs. SSC-plottet. Vis RBC-populationen i dotplottet af PE fluorescens. Hvis det er nødvendigt, øge fluorescens af photomultiplier rør (PMT) spændinger til at placere den negative befolkning i de grå kasser. Fjern det ubejdende kontrolrør fra cytometeret.
  11. Kontroller, at de positive populationer er i stor skala. Læg det farvede kontrolrør på cytometeret og kør Anskaffelse. Sænk PMT-spændingen for den positive befolkning, hvis den er uden for skalaen, indtil den positive befolkning kan ses helt på skalaen. Fjern derefter den farvede prøve.
  12. Hvis du vil registrere og analysere eksempler, skal du oprette følgende parceller til visning af dataene i et nyt globalt regneark for at få vist dataene: 1) FSC vs. SSC og 2) PE fluorescenshistogram. Læg den første prøve på cytometeret, og kør Anskaffelse.
  13. Tegn en RBC-port rundt om erythrocytterne på FSC vs. SSC-plottet. Vis RBC-populationen i PE fluorescenshistogram. I visningen Statistik skal du vælge middelværdien for PE-fluorescensparametre for GR-populationer (figur 1F).
  14. Vælg alle hændelser i stopg- og 10.000 hændelser, der skal registreres (Figur 1G), i dashboardet Anskaffelse . Klik på Registrer data. Når hændelsesregistreringen er afsluttet, fjernes det første rør fra cytometeret. De globale regnearksplots skal se ud som dem i figur 2.
  15. Læg følgende prøver i, og registrer dem.

6. Bestemmelse af massefyldet af erythrocyt CR1

  1. Der er værdier for de gennemsnitlige fluorescensintensiteter for prøverne svarende til "lav" emnet (Figur 3, tabel I, RBC MFI), "medium" emne ( Figur4, Tabel D, RBC MFI), "høj" emne (Figur 4, Tabel I, RBC MFI) og til den negative kontrolprøve (Figur 3, Tabel I, RBC MFI).
  2. På en graf, der repræsenterer den gennemsnitlige fluorescensintensitet som funktion af CR1-tætheden, anbringes de fire punkter, der svarer til den negative kontrol, "lav" motiv, "medium" emne og "høj" emne (blå punkter, figur 6).
  3. Tegn regressionslinjen for at få kalibreringslinjen og dens ligning.
  4. Der udtages værdier for den gennemsnitlige fluorescensintensitet for de prøver, der svarer til de forsøgspersoner, hvis tæthed skal bestemmes. (Figur 5, tabel D og I, RBC MFI).
  5. Indstil ligningen ved at erstatte "Y" ved hjælp af værdierne for de gennemsnitlige fluorescensintensiteter, og beregn tætheden af CR1/E (figur 6).
  6. Kontroller på grafen, at de gennemsnitlige fluorescensintensitetsværdier og den bestemte CR1/E-tæthed svarer til et punkt på kalibreringslinjen (figur 6).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Erythrocytter af tre forsøgspersoner, hvis massefylde af CR1 er kendt ("lav" emne [180 CR1/E], "medium" emne [646 CR1/E], og "høj" emne [966 CR1/E]), og af to forsøgspersoner, hvis CR1 tæthed skulle bestemmes var immunstained af en anti-CR1 antistof koblet til et forstærkningssystem ved hjælp af phycoerythrin fluorokrom. I begyndelsen blev CR1-tætheden af forsøgspersonerne fra det lave område bestemt af Scatchard-metoden29 ved hjælp af radioaktivt mærkede antistoffer. De fastlagte standarder (lav, medium og høj) blev anvendt til en kalibreringskurve og gjorde det muligt at kvantificere nye standarder eller understandarder ved vores metode til cytometri30. Efter passage af immunbejdserythrocytter i flowcytometeret blev mærkningens intensitet observeret og målt som den gennemsnitlige fluorescensintensitet for hvert emne (RBC MFI) (figur 3F,I; Figur 4B,D,F,I; Figur 5B,D,F,I). En kurve blev afbildet ved hjælp af værdierne af forsøgspersonerne med den kendte tæthed af erythrocyt CR1 ("lav" til "høj") ved at rapportere dem som en funktion af den gennemsnitlige fluorescensintensitet. Sammenligning af regressionslinjen som følge af denne kurve og værdierne af de andre forsøgspersoners gennemsnitlige fluorescensintensitet bestemte deres CR1/E-tæthed (figur 6). Figur 7 viser den overordnede arbejdsgang.

Figure 1
Figur 1: Cytometerkonsol og vinduer, der vises under cytometriprotokollen for flow. (A) Vindue, der vises efter anvendelse af trin 5.5 i protokollen. (B) Vindue, der vises efter anvendelse af trin 5.6 i protokollen. (C) Vindue, der vises efter anvendelse af trin 5.7 i protokollen. (D) Vindue, der vises efter anvendelse af trin 5.8 i protokollen. (E) Vindue, der vises efter anvendelse af trin 5.8 i protokollen. (F) Vindue, der vises efter anvendelsen af trin 5.13 i protokollen. (G) Vindue, der vises efter anvendelse af trin 5.14 i protokollen. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Udseendet af de globale regnearksanalyseobjekter. Udseendet af de globale regnearksanalyseobjekter efter anvendelsen af trin 5.14 i protokollen. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Resultater af flowcytometrianalyse af anti-CR1-immunfarvning af erythrocytter svarende til negativ kontrol og til motivet fra området ("lavt" emne), som udtrykte lav CR1-tæthed (180 CR1/E). For hvert emne: (A,E) en prikblot, der viser forekomsten af begivenheder, der er erhvervet i henhold til parametrene for størrelse og granulometrig) den port, der udvælger erythrocytpopulationen blandt begivenhederne , (B,F) et histogram, der repræsenterer mærkningens intensitet (C,H) en tilknyttet statistisk tabel, der viser antallet af hændelser, der svarer til erythrocytterne, og deres procentdel, (D,I) en tilknyttet tabel, der giver den gennemsnitlige fluorescensintensitet (RBC MFI). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Resultater af flowcytometrianalyse af anti-CR1 immunfarvning af erythrocytter svarende til forsøgspersonerne fra området: "medium" emne, der udtrykte MEDIUM CR1-tæthed (646 CR1/E) og "høj" forsøgsperson, som udtrykte HØJ CR1-tæthed (966 CR1/E). For hvert emne: (A, E) en prikblot, der viser forekomsten af begivenheder, der er erhvervet i henhold til parametrene for størrelse og granulometrig) den port, der udvælger erythrocytpopulationen blandt begivenhederne , (B, F) et histogram, der repræsenterer mærkningens intensitet (C, H) en tilknyttet statistisk tabel, der viser antallet af hændelser, der svarer til erythrocytterne, og deres procentdel, (D, I) en tilknyttet tabel, der giver den gennemsnitlige fluorescensintensitet (RBC MFI). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Resultater af flowcytometrianalyse af anti-CR1 immunfarvning af erythrocytter svarende til de forsøgspersoner, hvis CR1-tæthed skulle bestemmes. For hvert emne: (A, E) en prikblot, der viser forekomsten af begivenheder, der er erhvervet i henhold til parametrene for størrelse og granulometrig) den port, der udvælger erythrocytpopulationen blandt begivenhederne , (B, F) et histogram, der repræsenterer mærkningens intensitet (C, H) en tilknyttet statistisk tabel, der viser antallet af hændelser, der svarer til erythrocytterne, og deres procentdel, (D, I) en tilknyttet tabel, der giver den gennemsnitlige fluorescensintensitet (RBC MFI). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: Kalibreringskurve og regressionslinje, der gør det muligt at bestemme CR1-tætheden. (A) (B) Kalibreringskurve og regressionslinje tegnet efter områdeemnernes kendte CR1-tæthed (negativ kontrol: 0 CR1, "lav" emne [180 CR1/E], "medium" emne [646 CR1/E] og "høj" emne [966 CR1/E]) og deres respektive værdier af middelfluorescensintensitet opnået ved flowcytometri. (C), (D) Ud fra ligningen af denne regressionslinje beregnede vi tætheden af erythrocyt CR1 for forsøgspersoner, hvis gennemsnitlige fluorescensintensitet blev kvantificeret ved flowcytometri: orange pile, emne 1 (gennemsnitlig fluorescensintensitet = 1.334; CR1/E-tæthed = 459) og emne 2 (gennemsnitlig fluorescensintensitet = 2820; CR1/E tæthed = 1.000). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: Rutediagram af protokollen til bestemmelse af erythrocyt CR1 tæthed fra humane blodprøver. Opsaml en blodprøve fra menneske. Den humane blodprøve vaskes ved centrifugering for at opnå erythrocytter. Plette erythrocytter ved hjælp af en anti-CR1 antistof. Brug flowcytometri til at bestemme erythrocyt CR1-tætheden i henhold til en kalibreringskurve. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Der findes flere teknikker til at bestemme tætheden af erythrocyt CR1 (CR1/E). De første anvendte teknikker var agglutination af røde blodlegemer ved anti-CR1-antistoffer31 og dannelsen af rosetter ved tilstedeværelse af erythrocytter belagt med C3b32. Disse rudimentære teknikker blev hurtigt erstattet af immunfarvningsmetoder ved hjælp af radioaktivt betegnede anti-CR1-antistoffer1,33. Det er også muligt at måle koncentrationen af CR1 i membranekstrakter ved enzymbundet immunsorbent analyse (ELISA)34. Selv om disse teknikker er nøjagtige, giver de kun en gennemsnitlig værdi af CR1/E-tætheden. Fordelingen af CR1/E-tætheden over hele erythrocytpopulationen er kun tilgængelig ved flowcytometrisk analyse efter immunfarvning. Denne teknik er vanskelig på grund af den lave tæthed af CR1/E. Ikke desto mindre gør en forstærkningsmetode det nu muligt nemt at måle tætheden af CR1/E30.

Her præsenterer vi en metode til kvantificering af CR1/E ved flowcytometri baseret på forstærkning af fluorescenssignalet fra immunbesfarvede celler. Forstærkningssystemet omfatter fire på hinanden følgende lag af farvning ved hjælp af det biotinylated anti-CR1 monoklonale antistof J3D3; phycoerythrin-streptavidin et biotinylateret anti-streptavidinantistof og igen phycoerythrin-streptavidin. J3D3 genkender tre antigene steder på CR135,men ikke mere end én på samme tid. Den biotinylated ged anti-streptavidin antistof er et polyklonalt antistof, der genkender flere epitoper på streptavidin og giver en bedre bro mellem de to streptavidin lag end biotin-streptavidin alene. Denne proces nyder også godt af det høje fluorescensudbytte af phycoerythrin36 og det lave niveau af uspecifik binding af streptavidin37. Med et så stærkt forstærket signal muliggør cytometerfotomultiplierrørenes lave indstillinger perfekt linearitet. Denne metode, som er kendetegnet ved fremragende følsomhed og reproducerbarhed, gør det muligt at detektere færre end 100 CR1/celle.

Denne metode kræver dog prøver fra tre forsøgspersoner, hvis tæthed af erythrocyt CR1 er kendt: et emne, der udtrykker et lavt niveau af erythrocyt CR1 (180 CR1/E), et emne, der udtrykker et mellemhøjt niveau af erythrocyt CR1 (646 CR1/E) og et emne, der udtrykker et højt niveau af erythrocyt CR1 (966 CR1/E). Det er muligt at tage de første målinger af erythrocyt CR1 tæthed en flere individer, i første omgang ved hjælp af erythrocytter fra de tre emner, der anvendes i vores undersøgelse, som vi kan give. Blodprøver fra forsøgspersoner i området og forsøgspersoner, der skal kvantificeres for CR1, udtages samtidig, opbevares i køleskabet ved 4 °C og håndteres ved 4 °C38. Blodet, der trækkes i EDTA-rør, kan let sendes og kan opbevares i 5 dage ved 4 °C, hvilket giver tid til kvantificering af erythrocyt CR1. Efter dette begynder tætheden af erythrocyt CR1 at falde, og der er et sammenbrud af standard CR1 kurven, især på det punkt, der svarer til det emne, der udtrykker et højt niveau af erythrocyt CR1. Da den resulterende regressionslinje er forvrænget, er cr1-tæthedsmålet ikke længere nøjagtigt. Det skal bemærkes, at in vitro-lagring, håndteringsbetingelser og flerlagsfarvning fører til klyngedannelse af CR1 og en let overvurdering af antallet af CR1-molekyler. Ikke desto mindre gør brugen af et anti-CR1 antistof rettet mod tre epitoper såsom J3D3 med forstærkningssystemet det muligt at foretage en fuldstændig klyngedannelse, hvilket muliggør korrekt måling af CR1-tæthed39.

Faktisk falder tætheden af CR1/E i løbet af erythrocyt40. Dette ville forklare heterogeniteten af tætheden af CR1/E i samme person. Ifølge nogle forfattere, intensiteten af katabolisme af CR1 er ikke korreleret med den oprindelige tæthed af CR1/E41, mens der for andre forfattere, jo højere den oprindelige tæthed, jo større intensiteten af katabolisme42. Halveringstiden for CR1 på overfladen af erythrocytter er 11-32 dage42.

Den metode, der præsenteres her, har flere fordele. Den første er at kunne vælge, takket være flowcytometri, de cellesubpopulationer, der skal undersøges inden for samme blodprøve. Ved at vælge erythrocytpopulationen ved hjælp af gatefunktionen er målingen af erythrocyttætheden garanteret udelukkende. En bias i målingen af erythrocyt CR1 forårsaget af tilstedeværelsen af andre cellulære subpopulationer såsom hvide blodlegemer undgås. Den anden fordel ved denne metode er, at den kan tilpasses kvantificeringen af andre cellulære receptorer, hvis tæthed er lav, ved blot at erstatte det primære anti-CR1 antistof med et antistof, der specifikt er rettet mod en epitop af den receptor, der skal undersøges. Det kan også tilpasses til at bruge 96 godt plader i stedet for rør stativer, som kræver lavere blod og reagens mængder25,38. Den tredje fordel ved denne metode er, at den er fleksibel. I undersøgelser vedrørende celler med en meget høj massefylde af CR1, for eksempel, menneskelige lymfocytter (10.000 CR1/celle), eller ikke-menneskelige primat erythrocytter, hvis CR1 tæthed er 10-100x større end mennesker (10.000-100.000 CR1/ celle)43,44, er det muligt at reducere antallet af forstærkningsystemlag, anvendelse af kun monoklonalt anti-CR1-antistof, phycoerythrin-streptavidin eller biotinylateret anti-CR1 monoklonalt antistof, monoklonalt antistof, biotinylateret antimuseantistof og phycoerythrin-streptavidin, hvorved fluorescensniveauet tilpasses til CR1's højere tæthed. Den fjerde fordel ved denne metode er, at den kan anvendes til faste eller frosne erythrocytter, hvilket gør det muligt at indsamle blodprøver i områder, der mangler faciliteter til flowcytometri, og opbevares med henblik på senere nøjagtig kvantificering af CR138.

Mere generelt, med de nye lysere fluoromoner, synes det ikke længere obligatorisk at bruge systemet med indirekte forstærkning. Desuden er der andre metoder, der anvender flowcytometri, der gør det muligt at vurdere tætheden af de cellulære receptorer og kvantificere den i måleenheder (dvs. ABC pr. celle kan også bestemmes ved hjælp af mættende koncentrationer af antistof og kalibrerede perler. Flere kommercielle systemer er tilgængelige. Nogle kits er prækalibrerede standard perler, der indeholder kendte niveauer af fluoromlær molekyler såsom PE bundet pr perle. Perlerne erhvervet på et flow cytometer samme dag på samme instrumentindstillinger som de enkelte patientprøver gør det muligt at tegne en standardkurve, der sammenligner det geometriske gennemsnit af fluorescens med kendt PE-indhold i perlerne. Regressionsanalyse-, hældnings-, opskærings- og korrelationskoefficienten bestemmes, og ABC-værdierne beregnes ud fra den målte geometriske middelfluorescens af celler ved hjælp af standardkurven45,46.

En yderligere type perletest er baseret på binding af et antistof, der er konjugeret til perler med specifikke antistofbindingsevneniveauer via den krystalliserbare del af fragmentet (Fc). Perler er mærket med det samme antistof, der anvendes til at mærke de celler, hvis antigentæthed skal måles. Således kan ethvert konjugeret antistof anvendes i et enkelt forsøg, så længe det samme parti med det samme fluorophore/protein-forhold (F/P-forhold) anvendes til at plette både perler og celler47. Nogle sæt er bedre til kvantitativ bestemmelse af celleoverfladeantigener ved flowcytometri ved hjælp af indirekte immunfluorescensanalyser48,49.

Afslutningsvis har vores metode den fordel, at den giver meget følsom detektion og er let at implementere på almindeligt flow cytometrimateriale.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi takker alle medlemmer af URCACyt, flow cytometri tekniske platform, personalet i Institut for Immunologi, og personalet i Institut for Intern Medicin og Geriatrics, der har bidraget til at optimere og validere protokollen. Dette arbejde blev finansieret af Reims Universitetshospitaler (tilskudsnummer AOL11UF9156).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1000E Barrier Tip Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France 2079E sample pipetting
1-100 µL Bevelled, filter tip Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Germany S1120-1840 sample pipetting
Biotinylated anti-CR1 monoclonal antibody (J3D3) Home production of non-commercial monoclonal antibody, courtesy of Dr J. Cook immunostaining
Blouse protection
Bovin serum albumin (7,5%) Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France 15260037 cytometry
Centrifuge Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France 11176917 centrifugation
Clean Solution BD, F-38801 Le Pont de Claix, France 340345 cytometry
Comorack-96 Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath 944060P rack
Cytometer Setup & Tracking Beads Kit BD, F-38801 Le Pont de Claix, France 655051 cytometry
Formaldehyde solution 36.5 % Sigma Aldrich, F-38070 Saint Quentin Fallavier, France F8775-25ML Fixation
10 µL Graduated, filter tip Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Germany S1121-3810 sample pipetting
LSRFORTESSA Flow Cytometer BD, F-38801 Le Pont de Claix, France 647788 cytometry
Microman Capillary Pistons Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath 067494 sample pipetting
Micronic 1.40 mL round bottom tubes Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath MP32051 mix
Micropipette Microman - type M25 - Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath 066379 sample pipetting
Phosphate buffered Saline (PBS) Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France 10010031 cytometry
Pipette PS 325 mm, 10 mL Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath 391952 sample pipetting
powder-free Nitrile Exam gloves Medline Industries, Inc, Mundelein, IL 60060, USA 486802 sample protection
Reference 2 pipette, 0,5-10 µL Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France 4920000024 sample pipetting
Reference 2 pipette, 20-100 µL Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France 4920000059 sample pipetting
Reference 2 pipette, 100-1000 µL Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France 4920000083 sample pipetting
Rinse Solution BD, F-38801 Le Pont de Claix, France 340346 cytometry
Round bottom tube Sarstedt, F-70150 Marnay, France 55.1579 cytometry
Safe-Lock Tubes, 1.5 mL Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France 0030120086 mix
streptavidin R-PE Tebu Bio, F-78612 Le Perray-en-Yvelines, France AS-60669 immunostaining
Tapered Centrifuge Tubes 50 mL Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France 10203001 mix
Vector anti streptavidin biotin Eurobio Ingen, F-91953 Les Ulis, France BA-0500 immunostaining
Vortex-Genie 2 Scientific Industries, Inc, Bohemia, NY 111716, USA SI-0236 mix

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fearon, D. T. Identification of the membrane glycoprotein that is the C3b receptor of the human erythrocyte, polymorphonuclear leukocyte, B lymphocyte, and monocyte. Journal of Experimental Medicine. 152 (1), 20-30 (1980).
  2. Ross, G. D., Winchester, R. J., Rabellino, E. M., Hoffman, T. Surface markers of complement receptor lymphocytes. Journal of Clinical Investigation. 62 (5), 1086-1092 (1978).
  3. Reynes, M., et al. Human follicular dendritic cells express CR1, CR2, and CR3 complement receptor antigens. The Journal of Immunology. 135 (4), 2687-2694 (1985).
  4. Gasque, P., et al. Identification and characterization of complement C3 receptors on human astrocytes. The Journal of Immunology. 156 (6), 2247-2255 (1996).
  5. Pascual, M., et al. Identification of membrane-bound CR1 (CD35) in human urine: evidence for its release by glomerular podocytes. Journal of Experimental Medicine. 179 (3), 889-899 (1994).
  6. Fearon, D. T. Regulation of the amplification C3 convertase of human complement by an inhibitory protein isolated from human erythrocyte membrane. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (11), 5867-5871 (1979).
  7. Dobson, N. J., Lambris, J. D., Ross, G. D. Characteristics of isolated erythrocyte complement receptor type one (CR1, C4b-C3b receptor) and CR1-specific antibodies. The Journal of Immunology. 126 (2), 693-698 (1981).
  8. Schreiber, R. D., Pangburn, M. K., Muller-Eberhard, H. J. C3 modified at the thiolester site: acquisition of reactivity with cellular C3b receptors. Bioscience Reports. 1 (11), 873-880 (1981).
  9. Ross, G. D., et al. Generation of three different fragments of bound C3 with purified factor I or serum. II. Location of binding sites in the C3 fragments for factors B and H, complement receptors, and bovine conglutinin. Journal of Experimental Medicine. 158 (2), 334-352 (1983).
  10. Klickstein, L. B., Barbashov, S. F., Liu, T., Jack, R. M., Nicholson-Weller, A. Complement receptor type 1 (CR1, CD35) is a receptor for C1q. Immunity. 7 (3), 345-355 (1997).
  11. Ghiran, I., et al. Complement receptor 1/CD35 is a receptor for mannan-binding lectin. Journal of Experimental Medicine. 192 (12), 1797-1808 (2000).
  12. Cornacoff, J. B., et al. Primate erythrocyte-immune complex-clearing mechanism. Journal of Clinical Investigation. 71 (2), 236-247 (1983).
  13. Waxman, F. J., et al. Complement depletion accelerates the clearance of immune complexes from the circulation of primates. Journal of Clinical Investigation. 74 (4), 1329-1340 (1984).
  14. Waxman, F. J., et al. Differential binding of immunoglobulin A and immunoglobulin G1 immune complexes to primate erythrocytes in vivo. Immunoglobulin A immune complexes bind less well to erythrocytes and are preferentially deposited in glomeruli. Journal of Clinical Investigation. 77 (1), 82-89 (1986).
  15. Horgan, C., Taylor, R. P. Studies on the kinetics of binding of complement-fixing dsDNA/anti-dsDNA immune complexes to the red blood cells of normal individuals and patients with systemic lupus erythematosus. Arthritis & Rheumatology. 27 (3), 320-329 (1984).
  16. Pham, B. N., et al. Analysis of complement receptor type 1 expression on red blood cells in negative phenotypes of the Knops blood group system, according to CR1 gene allotype polymorphisms. Transfusion. 50 (7), 1435-1443 (2010).
  17. Wilson, J. G., et al. Identification of a restriction fragment length polymorphism by a CR1 cDNA that correlates with the number of CR1 on erythrocytes. Journal of Experimental Medicine. 164 (1), 50-59 (1986).
  18. Rodriguez de Cordoba, S., Rubinstein, P. Quantitative variations of the C3b/C4b receptor (CR1) in human erythrocytes are controlled by genes within the regulator of complement activation (RCA) gene cluster. Journal of Experimental Medicine. 164 (4), 1274-1283 (1986).
  19. Herrera, A. H., Xiang, L., Martin, S. G., Lewis, J., Wilson, J. G. Analysis of complement receptor type 1 (CR1) expression on erythrocytes and of CR1 allelic markers in caucasian and african american populations. Clinical Immunology and Immunopathology. 87 (2), 176-183 (1998).
  20. Birmingham, D. J., et al. A CR1 polymorphism associated with constitutive erythrocyte CR1 levels affects binding to C4b but not C3b. Immunology. 108 (4), 531-538 (2003).
  21. Dykman, T. R., Hatch, J. A., Aqua, M. S., Atkinson, J. P. Polymorphism of the C3b/C4b receptor (CR1): characterization of a fourth allele. The Journal of Immunology. 134 (3), 1787-1789 (1985).
  22. Moulds, J. M., Moulds, J. J., Brown, M., Atkinson, J. P. Antiglobulin testing for CR1-related (Knops/McCoy/Swain-Langley/York) blood group antigens: negative and weak reactions are caused by variable expression of CR1. Vox Sanguinis. 62 (4), 230-235 (1992).
  23. Cohen, J. H., Lutz, H. U., Pennaforte, J. L., Bouchard, A., Kazatchkine, M. D. Peripheral catabolism of CR1 (the C3b receptor, CD35) on erythrocytes from healthy individuals and patients with systemic lupus erythematosus (SLE). Clinical & Experimental Immunology. 87 (3), 422-428 (1992).
  24. Jouvin, M. H., Rozenbaum, W., Russo, R., Kazatchkine, M. D. Decreased expression of the C3b/C4b complement receptor (CR1) in AIDS and AIDS-related syndromes correlates with clinical subpopulations of patients with HIV infection. AIDS. 1 (2), 89-94 (1987).
  25. Waitumbi, J. N., Donvito, B., Kisserli, A., Cohen, J. H., Stoute, J. A. Age-related changes in red blood cell complement regulatory proteins and susceptibility to severe malaria. The Journal of Infectious Diseases. 190 (6), 1183-1191 (2004).
  26. Mahmoudi, R., et al. Alzheimer's disease is associated with low density of the long CR1 isoform. Neurobiology of Aging. 36 (4), 5-12 (2015).
  27. Mahmoudi, R., et al. Inherited and Acquired Decrease in Complement Receptor 1 (CR1) Density on Red Blood Cells Associated with High Levels of Soluble CR1 in Alzheimer's Disease. International Journal of Molecular Sciences. 19 (8), 2175 (2018).
  28. Zaitsev, S., et al. Human complement receptor type 1-directed loading of tissue plasminogen activator on circulating erythrocytes for prophylactic fibrinolysis. Blood. 108 (6), 1895-1902 (2006).
  29. Scatchard, G. The attractions of proteins for small molecules and ions. Annals of the New York Academy of Sciences. 51 (4), 660-672 (1949).
  30. Cohen, J. H., et al. Enumeration of CR1 complement receptors on erythrocytes using a new method for detecting low density cell surface antigens by flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 99 (1), 53-58 (1987).
  31. Minota, S., et al. Low C3b receptor reactivity on erythrocytes from patients with systemic lupus erythematosus detected by immune adherence hemagglutination and radioimmunoassays with monoclonal antibody. Arthritis & Rheumatology. 27 (12), 1329-1335 (1984).
  32. Miyakawa, Y., et al. Defective immune-adherence (C3b) receptor on erythrocytes from patients with systemic lupus erythematosus. The Lancet. 2 (8245), 493-497 (1981).
  33. Lida, K., Mornaghi, R., Nussenzweig, V. Complement receptor (CR1) deficiency in erythrocytes from patients with systemic lupus erythematosus. Journal of Experimental Medicine. 155 (5), 1427-1438 (1982).
  34. Tao, K., Nicholls, K., Rockman, S., Kincaid-Smith, P. Expression of complement 3 receptors (CR1 and CR3) on neutrophils and erythrocytes in patients with IgA nephropathy. Clinical Nephrology. 32 (5), 203-208 (1989).
  35. Nickells, M., et al. Mapping epitopes for 20 monoclonal antibodies to CR1. Clinical and Experimental Immunology. 112 (1), 27-33 (1998).
  36. Oi, V. T., Glazer, A. N., Stryer, L. Fluorescent phycobiliprotein conjugates for analyses of cells and molecules. The Journal of Cell Biology. 93 (3), 981-986 (1982).
  37. Chaiet, L., Wolf, F. J. The properties of streptavidin, a biotin-binding protein produced by streptomyces. Archives of Biochemistry and Biophysics. 20 (106), 1-5 (1964).
  38. Cockburn, I. A., Donvito, B., Cohen, J. H., Rowe, J. A. A simple method for accurate quantification of complement receptor 1 on erythrocytes preserved by fixing or freezing. Journal of Immunological Methods. 20 (271), 59-64 (2002).
  39. Chen, C. H., et al. Antibody CR1-2B11 recognizes a non-polymorphic epitope of human CR1 (CD35). Clinical & Experimental Immunology. 148 (3), 546-554 (2007).
  40. Ripoche, J., Sim, R. B. Loss of complement receptor type 1 (CR1) on ageing of erythrocytes. Studies of proteolytic release of the receptor. Biochemical Journal. 235 (3), 815-821 (1986).
  41. Moldenhauer, F., Botto, M., Walport, M. J. The rate of loss of CR1 from ageing erythrocytes in vivo in normal subjects and SLE patients: no correlation with structural or numerical polymorphisms. Clinical & Experimental Immunology. 72 (1), 74-78 (1988).
  42. Cohen, J. H., Lutz, H. U., Pennaforte, J. L., Bouchard, A., Kazatchkine, M. D. Peripheral catabolism of CR1 (the C3b receptor, CD35) on erythrocytes from healthy individuals and patients with systemic lupus erythematosus (SLE). Clinical & Experimental Immunology. 87 (3), 422-428 (1992).
  43. Nickells, M. W., Subramanian, V. B., Clemenza, L., Atkinson, J. P. Identification of complement receptor type 1-related proteins on primate erythrocytes. The Journal of Immunology. 154 (6), 2829-2837 (1995).
  44. Hebert, L. A., Birmingham, D. J., Shen, X. P., Cosio, F. G. Stimulating erythropoiesis increases complement receptor expression on primate erythrocytes. Clinical Immunology and Immunopathology. 62 (3), 301-306 (1992).
  45. Davis, K. A., Abrams, B., Iyer, S. B., Hoffman, R. A., Bishop, J. E. Determination of CD4 antigen density on cells: Role of antibody valency, avidity, clones, and conjugation. Cytometry. 33 (2), 197-205 (1998).
  46. Pannu, K. K., Joe, E. T., Iyer, S. B. Performance evaluation of QuantiBRITE phycoerythrin beads. Cytometry. 45 (4), 250-258 (2001).
  47. Barnett, D., Storie, I., Wilson, G. A., Granger, V., Reilly, J. T. Determination of leucocyte antibody binding capacity (ABC): the need for standardization. Clinical Laboratory Haematology. 20 (3), 155-164 (1998).
  48. Bikoue, A., et al. Quantitative analysis of leukocyte membrane antigen expression: normal adult values. Cytometry. 26 (2), 137-147 (1996).
  49. Serke, S., van Lessen, A., Huhn, D. Quantitative fluorescence flow cytometry: a comparison of the three techniques for direct and indirect immunofluorescence. Cytometry. 33 (2), 179-187 (1998).

Tags

Immunologi og infektion CR1 CD35 supplere C3b/C4b receptor CR1 densitet polymorfi flow cytometri Alzheimers sygdom Systemisk lupus erythematosus malaria
Måling Erythrocyt Supplement Receptor 1 Brug Flow cytometri
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kisserli, A., Audonnet, S., Duret,… More

Kisserli, A., Audonnet, S., Duret, V., Tabary, T., Cohen, J. H. M., Mahmoudi, R. Measuring Erythrocyte Complement Receptor 1 Using Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (159), e60810, doi:10.3791/60810 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter