Summary
El objetivo de este método es determinar la densidad CR1 en los eritrocitos de cualquier sujeto comparando con tres sujetos cuya densidad de eritrocitos CR1 se conoce. El método utiliza citometría de flujo después de la inmunomancha de los eritrocitos de los sujetos por un anticuerpo monoclonal anti-CR1 acoplado a un sistema amplificado utilizando fileeritrina (PE).
Abstract
CR1 (CD35, Receptor De complemento tipo 1 para C3b/C4b) es una glicoproteína de membrana de alto peso molecular de unos 200 kDa que controla la activación de complemento, transporta complejos inmunológicos y participa en respuestas inmunitarias humorales y celulares. CR1 está presente en la superficie de muchos tipos de células, incluyendo eritrocitos, y exhibe polimorfismos en longitud, estructura (Knops, o KN, grupo sanguíneo), y densidad. La densidad media de CR1 por eritrocitos (CR1/E) es de 500 moléculas por eritrocitos. Esta densidad varía de un individuo a otro (100–1,200 CR1/E) y de un eritrocitos a otro en el mismo individuo. Presentamos aquí un método de citometría de flujo robusto para medir la densidad de CR1/E, incluso en sujetos que expresan una baja densidad, con la ayuda de un sistema de inmunomancha amplificante. Este método nos ha permitido mostrar la disminución de la expresión de eritrocitos CR1 en enfermedades como la enfermedad de Alzheimer (AD), el lupus eritematoso sistémico (LES), el SIDA o la malaria.
Introduction
CR1 (receptor de complemento tipo 1, CD35) es una glicoproteína transmembrana de 200 kDa presente en la superficie de muchos tipos de células, tales como eritrocitos1, linfocitos B2, células monocíticas, algunas células T, células dendríticas foliculares3, astrocitos fetales4,y podocitos glomerulares5. CR1 interfiriendo con sus ligandos C3b, C4b, C3bi6,7,8,9, una subunidad del primer componente de complemento, C1q10 y MBL (lectina de unión al mannan)11 inhibe la activación del complemento y participa en la respuesta inmune humoral y celular.
En primates, incluidos los humanos, eritrocitos CR1 participa en el transporte de complejos inmunes al hígado y al bazo, para purificar la sangre y prevenir su acumulación en tejidos vulnerables como la piel o los riñones12,,13,,14. Este fenómeno de adhesión inmune entre complejos inmunes y eritrocitos depende del número de moléculas CR115. En los seres humanos, la densidad media de CR1/E es de sólo 500 (es decir, 500 moléculas de CR1 por eritrocitos). Esta densidad varía de un individuo a otro (100–1,200 CR1/E) y de un eritrocitos a otro en el mismo individuo. Algunos individuos de fenotipo "nulo" expresan menos de 20 CR1/E16.
La densidad de CR1/E está regulada por dos alelos autosómicos codominantes vinculados a una mutación puntual en el intrón 27 de la codificación genética para CR1*117,,18. Esta mutación produce un sitio de restricción adicional para la enzima HindIII. Los fragmentos de restricción obtenidos después de la digestión con HindIII en este caso son 7,4 kb para el alelo vinculado a una fuerte expresión de CR1 (H: alelo alto) y 6,9 kb para el alelo vinculado a la expresión baja de CR1 (L: alelo bajo). Este enlace se encuentra en los caucásicos y asiáticos, pero no en las personas de ascendencia africana19.
El nivel de expresión de eritrocitos CR1 también está correlacionado con la presencia de mutaciones de nucleótidos puntuales en el exón 13 codificando SCR 10 (I643T) y en el exón 19 codificando SCR16 (Q981H). Es alto en individuos homocigotos 643I/981Q y bajos en individuos homocigotos 643T/981H20. Por lo tanto, los individuos "bajos" expresan alrededor de 150 CR1/E, los individuos "medios" expresan alrededor de 500 individuos CR1/E, y los individuos "altos" expresan alrededor de 1,000 CR1/E.
Además de este polimorfismo de densidad de eritrocitos, CR1 se caracteriza por un polimorfismo de longitud correspondiente a cuatro alotipos de diferentes tamaños: CR1*1 (190 kDa), CR1*2 (220 kDa), CR1*3 (160 kDa) y CR1*4 (250 kDa)21 y un polimorfismo antigénico correspondiente al grupo sanguíneo KN22.
Presentamos nuestro método basado en la citometría de flujo para determinar la densidad de CR1/E. Utilizando tres sujetos cuya densidad CR1/E se conoce, expresando un nivel de baja densidad (180 CR1/E), un nivel de densidad media (646 CR1/E) y un nivel de densidad alto (966 CR1/E), es fácil medir la intensidad media de fluorescencia (MFI) de sus eritrocitos o glóbulos rojos (RBC), o RBC MFI, después de la inmunomancha anti-CR1 utilizando un citómetro de flujo. A continuación, se puede trazar una línea estándar que representa la IMF en función de la densidad CR1/E. La medición de la IMF de sujetos cuya densidad CR1/E no se conoce y compararla con esta línea estándar, es posible determinar la densidad CR1/E de los individuos. Esta técnica se ha utilizado durante muchos años en el laboratorio, y nos ha permitido detectar una reducción en la expresión de eritrocitos CR1 en muchas patologías como el lupus eritematoso sistémico (LES)23, síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA)24, malaria25,y recientemente la enfermedad de Alzheimer (AD)26,27. El desarrollo de fármacos dirigidos a CR1 a la pareja de eritrocitos, como en el caso de los fármacos antitrombóticos28 requiere la evaluación de la densidad CR1/E, y la disponibilidad de una técnica robusta para cuantificar CR1.
El protocolo presentado se ejecuta en singlicado. Es adaptable para determinar la densidad de CR1/E en muchas personas utilizando 96 placas de pozo disponibles comercialmente específicas (ver Tabla de Materiales). Para ello, es fácil adaptar nuestro método a cualquier placa de pozo 96. Para cada muestra, se distribuye una suspensión celular de eritrocitos (0,5 x 106–1 x 106 eritrocitos) por pocto. Para cada pozo, primero se añade el anticuerpo primario anti-CR1, luego la estreptavidina PE, el anticuerpo secundario anti-estreptavidina, y de nuevo la estreptavidina PE, utilizando las mismas diluciones que las de nuestro método, pero adaptando los volúmenes y respetando la proporcionalidad.
Las muestras de sangre de los sujetos de la gama y de los sujetos que deben cuantificarse para CR1 deben extraerse al mismo tiempo, almacenarse en el frigorífico a 4 oC y manipularse a 4 oC (sobre hielo y/o en el frigorífico).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
El protocolo para la recolección y el manejo de la sangre humana fue revisado y aprobado por el comité de ética regional (CPP Est II), y el número de protocolo es 2011-A00594-37. Debido a que el siguiente protocolo describe el manejo de la sangre humana, se deben seguir las pautas institucionales para la eliminación de material biopeligroso. Se debe usar equipo de seguridad de laboratorio, como batas de laboratorio y guantes.
1. Lavado de eritrocitos
NOTA: El día antes de manipularlo, prepare un tampón PBS-BSA con solución salina tamponada de fosfato (PBS) que contenga el 0,15% de la albúmina sérica bovina (BSA) y colóquelo en el refrigerador a 4 oC. Este tampón se utilizará como tampón de lavado y como tampón de dilución.
- Pipetear 20 ml de PBS-BSA en un tubo de 50 ml.
- Aspirar 250 l de ácido tetraacético de etilendiamina de sodio (EDTA) anticoagular la sangre entera de los tubos de almacenamiento sanguíneo y añadir al tubo que contiene los 20 ml de PBS-BSA. Cierre el tubo atornillando la tapa. Mezcle suavemente invirtiendo el tubo 2x.
- Centrifugar el tubo durante 10 min a 4oC a 430 x g. Retire y deseche el sobrenadante con una pipeta de 10 ml. Resuspenda el pellet en el volumen residual de sobrenadante mediante un pipeteo suave y cuidadoso.
- Añadir 20 ml de PBS-BSA frío (4 oC) en el tubo que contiene el pellet. Centrifugar el tubo durante 10 min a 4oC a 430 x g. Retire y deseche el sobrenadante con una pipeta de 10 ml.
- Añadir 20 ml de PBS-BSA frío (4 oC) en el tubo que contiene el pellet. Centrifugar el tubo durante 10 min a 4oC a 430 x g. Dejar el tubo en la centrífuga a 4oC y pasar a la sección 2.
2. Dilución de eritrocitos
- Pipetear 3 ml de PBS-BSA frío en un tubo de 50 ml y almacenarlo a 4 oC en un estante en hielo.
- Coloque el tubo centrifugado que contiene los eritrocitos (paso 1.4) en un estante colocado en hielo.
- Pipetear 8 ml de eritrocitos peletados utilizando la pipeta y añadir al tubo de 50 ml que contiene los 3 ml de PBS-BSA para obtener la dilución de eritrocitos. Mezclar el tubo suavemente a mano para obtener una suspensión celular homogénea de eritrocitos.
3. Inmunomanchado de eritrocitos
- Pipetear 100 l de dilución de eritrocitos (obtenido en la sección 4) y añadir a tubos de 1,4 ml.
- Centrifugar los tubos durante 5 min a 4oC a 430 x g. Durante la centrifugación, prepare una dilución del anticuerpo biotinilado anti-CR1 J3D3 a una concentración de 0,05 g/l en el tampón PBS-BSA.
- Una vez realizada la centrifugación, retire y deseche el sobrenadante.
- Añadir 20 ml de anti-CR1 J3D3 biotinilado directamente al pellet. Para preparar el control negativo, agregue 20 ml de búfer PBS-BSA en su lugar. Mezclar los tubos suavemente e incubar durante 45 min a 4 oC.
- Después de 45 min de incubación, añadir 750 éL de PBS-BSA a los tubos. Centrifugar los tubos durante 5 min a 4oC a 430 x g. Retire y deseche el sobrenadante. Repetir.
- Mientras tanto, prepare una dilución 1:10 de estreptavidina-ficoerytrerina diluida en el tampón PBS-BSA. Pipetear 20 l de la dilución 1:10 de estreptavidina-ficoerythrina y añadir a los tubos. Mezclar los tubos suavemente e incubar durante 45 min a 4 oC.
- Agregue 750 l de búfer PBS-BSA en los tubos. Mezclar bien y centrifugar durante 5 min a 4 oC a 430 x g. Retire y deseche el sobrenadante. Repetir.
- Durante la centrifugación, prepare una dilución 1:100 de anticuerpo anti-estreptavidina biotintilado diluido en el tampón PBS-BSA.
- Una vez realizada la centrifugación, retire y deseche el sobrenadante.
- Pipeta 20 l de la dilución 1:100 de antiestreptavidina biotincada en los tubos. Mezclar los tubos suavemente. Incubar los tubos durante 45 min a 4oC.
- Después de 45 min de incubación, pipeta 750 l de tampón PBS-BSA y añadir en los tubos. Centrifugar los tubos durante 5 min a 4oC a 430 x g. Retire y deseche el sobrenadante. Repetir.
- Pipetear 20 l de la dilución 1:10 de estreptavidina-ficoerythrina y añadir en los tubos. Mezclar los tubos suavemente. Incubar los tubos durante 45 min a 4oC.
- Pipetear 750 l de tampón PBS-BSA y añadir en los tubos. Mezclar bien y centrifugar los tubos durante 5 min a 4 oC a 430 x g. Retire y deseche el sobrenadante. Repita este paso 2x.
4. Fijación de eritrocitos inmunomanchados
- Durante la última centrifugación, prepare el tampón de fijación, una dilución de 1:100 de formaldehído del 37% utilizando el tampón de lavado PBS-BSA.
- Pipetear 450 l de tampón de fijación y añadir en tubos de eritrocitos inmuno-manchados (a partir del paso 3.13) mientras se revuelve durante 5 s.
- Pipetear todas las células fijas en tubos inferiores redondos de 5 ml y almacenar en el refrigerador.
NOTA: El protocolo se puede pausar aquí durante un máximo de 48 horas.
5. Análisis de citometría de flujo de eritrocitos manchados
NOTA: Es aconsejable consultar el manual del operador para el citómetro (ver Tabla de Materiales)para saber cómo realizar las lecturas citométricas. Los parámetros sugeridos a continuación se aplican al instrumento utilizado y deben optimizarse para cada citómetro.
- Encienda el citometro de flujo y, a continuación, encienda el ordenador. Deje que la temperatura del sistema óptico se estabilice dejándola encendida durante 30 minutos. Compruebe la ventana del citómetro en el software para asegurarse de que el citómetro está conectado a la estación de trabajo (se muestra el mensaje Citómetro conectado).
- Compruebe que el contenedor de búfer está lleno y que el contenedor de residuos está vacío. Retire las burbujas de aire en el filtro de búfer y la línea de búfer utilizando el sistema de purga. Pprime el sistema de fluidos pulsando el botón Prime en la consola del catómetro. Espere hasta que la luz indicadora cambie de rojo a verde.
- Para limpiar los fluidos, instale un tubo que contenga 3 ml de una solución de limpieza en el puerto de inyección de muestra y permita que la solución de limpieza funcione durante 5 minutos con un alto caudal de muestra. Repita esto con la solución de enjuague con agua destilada. Deje el tubo que contiene agua en el puerto de inyección de la muestra.
- Para preparar las perlas de calibración, pipeta 400 l de PBS en la parte inferior de un tubo inferior redondo. Mezclar las existencias de cuentas fuertemente por vórtice durante 30 s. Añadir una gota al tubo inferior redondo que contiene PBS. Mezclar cuidadosamente por vórtice durante 30 s.
- Ejecute la comprobación de rendimiento. Abra el módulo Configuración y seguimiento del citometro en el software(Figura 1A). Verifique que la configuración del catómetro sea correcta para el experimento con inmunomancha doliente de PE. Compruebe que el lote de perlas de calibración es correcto con la configuración.
- Instale el tubo de cordón en el puerto de inyección de muestras y déjelo funcionar con un caudal de muestra bajo. Ejecute la comprobación de rendimiento, que tarda aproximadamente 5 minutos en completarse). Una vez completada la comprobación de rendimiento, compruebe que el rendimiento del cytómetro es satisfactorio(Figura 1B). Cierre el módulo de configuración y seguimiento del citómetro en el software.
- Para configurar un experimento y crear la configuración de la aplicación, haga clic en el botón Nuevo experimento de la barra de herramientas del explorador y abra el nuevo experimento. Especifique los parámetros seleccionando la configuración del citómetro adecuado: Dispersión hacia delante (FSC), Dispersión lateral (SSC) y PE en el menú desplegable del experimento(Figura 1C). Seleccione Modo lineal para el parámetro FSC y Modo de lagarithm para los parámetros SSC y PE.
- En el experimento abierto, seleccione Configuración del citómetro (figura 1D) y, a continuación, seleccione Configuración de la aplicacióny cree una hoja de cálculo global(Figura 1E). Utilice los cuadros grises y el punto de mira para guiar la optimización.
- Cargue el tubo de control sin mancha en el citómetro y ejecute Adquisición. Asegúrese de que la población de interés (es decir, los glóbulos rojos) esté a escala optimizando los voltajes FSC y SSC. Optimice el valor umbral FSC para eliminar los desechos sin interferir con la población de interés.
- Dibuje una puerta alrededor de los RCO en la gráfica FSC vs. Muestre la población de RBC en la gráfica de puntos de fluorescencia PE. Si es necesario, aumente la fluorescencia de los voltajes del tubo fotomultiplicador (PMT) para colocar la población negativa dentro de las cajas grises. Descargue el tubo de control sin manchar del catómetro.
- Compruebe que las poblaciones positivas están a escala. Cargue el tubo de control manchado en el citómetro y ejecute Adquisición. Reduzca el voltaje de la PMT para la población positiva si está fuera de escala hasta que la población positiva pueda verse completamente a escala. A continuación, descargue la muestra manchada.
- Para registrar y analizar muestras, en una nueva hoja de trabajo global, cree las siguientes gráficas para obtener una vista previa de los datos: 1) FSC vs SSC y 2) histograma de fluorescencia PE. Cargue la primera muestra en el citómetro y ejecute Adquisición.
- Dibuje una puerta de RBC alrededor de los eritrocitos en la gráfica FSC vs. Visualice la población de RBC en el histograma de fluorescencia PE. En la vista Estadísticas, seleccione la media para los parámetros de fluorescencia de PE en las poblaciones GR(Figura 1F).
- En el panel Adquisición, seleccione todos los eventos de la puerta de detención y 10.000 eventos que se grabarán(figura 1G). Haga clic en Registrar datos. Cuando se haya completado la grabación del evento, retire el primer tubo del citometro. Las gráficas de hoja de cálculo global deben ser similares a las de la Figura 2.
- Cargue los siguientes ejemplos y regístrelos.
6. Determinación de la densidad del eritrocitos CR1
- Tomar los valores de las intensidades medias de fluorescencia de las muestras correspondientes al sujeto "bajo"(Figura 3, Tabla I,RBC MFI), sujeto "medio"(Figura 4, Tabla D, RBC MFI), sujeto "alto"(Figura 4, Tabla I, RBC MFI), y a la muestra de control negativo(Figura 3, Tabla I, RBC MFI).
- En un gráfico que represente la intensidad media de fluorescencia en función de la densidad de CR1, coloque los cuatro puntos correspondientes al control negativo, el sujeto "bajo", el sujeto "medio" y el sujeto "alto" (puntos azules, Figura 6).
- Dibuje la línea de regresión para obtener la línea de calibración y su ecuación.
- Tomar los valores de la intensidad media de fluorescencia de las muestras correspondientes a los sujetos cuya densidad debe determinarse. (Figura5, Tablas D y I, RBC MFI).
- Obtenga la ecuación reemplazando "Y" utilizando los valores de las intensidades medias de fluorescencia, y calcule la densidad de CR1/E(Figura 6).
- Compruebe en el gráfico que los valores medios de intensidad de fluorescencia y la densidad CR1/E determinada corresponden a un punto de la línea de calibración(Figura 6).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Los eritrocitos de tres sujetos cuya densidad de CR1 se conoce ("sujeto bajo" [180 CR1/E], sujeto "medio" [646 CR1/E] y sujeto "alto" [966 CR1/E]), y de dos sujetos cuya densidad CR1 debía determinarse fueron inmunomanchados por un anticuerpo anti-CR1 acoplado a un sistema de amplificación utilizando la fluoracrotrina fierrín. Al principio, la densidad CR1 de los sujetos del rango bajo-alto fue determinada por el método Scatchard29 utilizando anticuerpos radiomarcados. Los estándares (bajos, medios y altos) determinados se utilizaron para una curva de calibración y permiten cuantificar nuevos estándares o subnormas mediante nuestro método de citometría30. Después del paso de eritrocitos inmunomanchados en el citómetro de flujo, se observó la intensidad del etiquetado y se midió como la intensidad media de fluorescencia para cada sujeto (RBC MFI)(Figura 3F,I; Figura 4B,D,F,I; Figura 5B,D,F,I). Se sizó una curva utilizando los valores de los sujetos con la densidad conocida de eritrocitos CR1 ("bajo" a "alto") reportándolos en función de la intensidad media de fluorescencia. La comparación de la línea de regresión resultante de esta curva con los valores de la intensidad media de fluorescencia de los otros sujetos determinó su densidad CR1/E(Figura 6). La figura 7 muestra el flujo de trabajo general.
Figura 1: Consola del citómetro y ventanas que aparecen durante el protocolo de citometría de flujo. (A) Ventana que aparece después de la aplicación del paso 5.5 del protocolo. (B) Ventana que aparece después de la aplicación del paso 5.6 del protocolo. (C) Ventana que aparece después de la aplicación del paso 5.7 del protocolo. (D) Ventana que aparece después de la aplicación del paso 5.8 del protocolo. (E) Ventana que aparece después de la aplicación del paso 5.8 del protocolo. (F) Ventana que aparece después de la aplicación del paso 5.13 del protocolo. (G) Ventana que aparece después de la aplicación del paso 5.14 del protocolo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Apariencia de los objetos de análisis de hoja de cálculo global. Apariencia de los objetos de análisis de hoja de cálculo global después de la aplicación del paso 5.14 del protocolo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Resultados del análisis de citometría de flujo de inmunomanchas anti-CR1 de eritrocitos correspondientes al control negativo y al sujeto del rango ("sujeto bajo") que expresó la densidad baja de CR1 (180 CR1/E). Para cada asignatura: (A,E) una mancha de puntos que muestra la apariencia de los eventos adquiridos de acuerdo con los parámetros de tamaño y granulometría, (G) la puerta que selecciona la población de eritrocitos entre los eventos, (B,F) un histograma que representa la intensidad del etiquetado, (C,H) una tabla estadística asociada que presenta el número de eventos correspondientes a los eritrocitos y su porcentaje, (D,I) una tabla asociada que da la intensidad de significación de fluor (RBC MFI). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Resultados del análisis de citometría de flujo de inmunomanchas anti-CR1 de eritrocitos correspondientes a los sujetos del rango: sujeto "medio" que expresó densidad MEDIUM CR1 (646 CR1/E) y sujeto "alto" que expresó densidad HIGH CR1 (966 CR1/E). Para cada asignatura: (A, E) una mancha de puntos que muestra la apariencia de los eventos adquiridos de acuerdo con los parámetros de tamaño y granulometría, (G) la puerta que selecciona la población de eritrocitos entre los eventos, (B, F) un histograma que representa la intensidad del etiquetado, (C, H) una tabla estadística asociada que presenta el número de eventos correspondientes a los eritrocitos y su porcentaje, (D, I) una tabla asociada que da la intensidad de significación de fluor (RBC MFI). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Resultados del análisis de citometría de flujo de inmunomancha anti-CR1 de eritrocitos correspondientes a los sujetos cuya densidad CR1 debía determinarse. Para cada asignatura: (A, E) una mancha de puntos que muestra la apariencia de los eventos adquiridos de acuerdo con los parámetros de tamaño y granulometría, (G) la puerta que selecciona la población de eritrocitos entre los eventos, (B, F) un histograma que representa la intensidad del etiquetado, (C, H) una tabla estadística asociada que presenta el número de eventos correspondientes a los eritrocitos y su porcentaje, (D, I) una tabla asociada que da la intensidad de significación de fluor (RBC MFI). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Curva de calibración y línea de regresión que permite la determinación de la densidad CR1. (A), (B) Curva de calibración y línea de regresión dibujadas según la densidad CR1 conocida de los sujetos del rango (control negativo: 0 CR1, sujeto "bajo" [180 CR1/E], sujeto "medio" [646 CR1/E] y sujeto "alto" [966 CR1/E]) y sus respectivos valores de intensidad media de fluorescencia obtenida por citometría de flujo. (C), (D) A partir de la ecuación de esta línea de regresión, calculamos la densidad del eritrocito CR1 para sujetos cuya intensidad media de fluorescencia se cuantificó mediante citometría de flujo: flechas naranjas, Asunto 1 (intensidad media de fluorescencia 1.334; Densidad de CR1/E 459) y Asunto 2 (intensidad media de fluorescencia 2820; Densidad DE CR1/E 1.000). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Diagrama de flujo del protocolo para determinar la densidad de eritrocitos CR1 a partir de muestras de sangre humanas. Recoge una muestra de sangre humana. Lavar la muestra de sangre humana por centrifugación para obtener eritrocitos. Mancha los eritrocitos usando un anticuerpo anti-CR1. Utilice la citometría de flujo para determinar la densidad del eritrocitos CR1 de acuerdo con una curva de calibración. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hay varias técnicas disponibles para determinar la densidad del eritrocito CR1 (CR1/E). Las primeras técnicas utilizadas fueron la aglutinación de glóbulos rojos por anticuerpos anti-CR131 y la formación de rosetas en presencia de eritrocitos recubiertos con C3b32. Estas técnicas rudimentarias fueron rápidamente reemplazadas por métodos de inmunomancha utilizando anticuerpos radiomarcados anti-CR11,33. También es posible medir la concentración de CR1 en extractos de membrana mediante ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA)34. Aunque son precisas, estas técnicas solo proporcionan un valor medio de la densidad CR1/E. La distribución de la densidad CR1/E en toda la población de eritrocitos sólo está disponible mediante análisis citométricos de flujo después de la inmunomancha. Esta técnica es difícil debido a la baja densidad de CR1/E. Sin embargo, un método de amplificación ahora permite medir fácilmente la densidad de CR1/E30.
Aquí, presentamos un método de cuantificación de CR1/E por citometría de flujo basado en la amplificación de la señal de fluorescencia de las células inmunoconservadas. El sistema de amplificación implica cuatro capas sucesivas de tinción utilizando el anticuerpo monoclonal biotintilado j3D3; ficoeritrina-streptavidin; un anticuerpo antiesteltripvidina de cabra biotinylated; y otra vez ficoeritrina-streptavidin. J3D3 reconoce tres sitios antigénicos en CR135,aunque no más de uno al mismo tiempo. El anticuerpo antiestirevidina de cabra biotinilado es un anticuerpo policlonal que reconoce múltiples epítopos en la estreptavidina y proporciona un mejor puente entre las dos capas de estreptavidina que la biotina-streptavidina sola. Este proceso también se beneficia del alto rendimiento de fluorescencia de la ficoeritrina36 y del bajo nivel de unión inespecífico de la estreptavidina37. Con una señal amplificada tan fuerte, los ajustes bajos de los tubos fotomultiplicadores del citometro permiten una linealidad perfecta. Este método, que se caracteriza por una excelente sensibilidad y reproducibilidad, permite la detección de menos de 100 CR1/célula.
Sin embargo, este método requiere muestras de tres sujetos cuya densidad de eritrocitos CR1 se conoce: un sujeto que expresa un bajo nivel de eritrocito CR1 (180 CR1/E), un sujeto que expresa un nivel medio de eritrocito CR1 (646 CR1/E) y un sujeto que expresa un alto nivel de eritrocito CR1 (966 CR1/E). Es posible tomar las primeras mediciones de la densidad de eritrocitos CR1 de varios individuos, inicialmente utilizando los eritrocitos de los tres sujetos utilizados en nuestro estudio, que podemos proporcionar. Las muestras de sangre de los sujetos de la gama y los sujetos que se cuantifiquen para CR1 deben extraerse al mismo tiempo, almacenarse en el frigorífico a 4oC y manipularse a 4oC38. La sangre extraída en los tubos EDTA es fácilmente enrutable y se puede almacenar durante 5 días a 4 oC, lo que permite tiempo para la cuantificación de eritrocitos CR1. Después de esto, la densidad de eritrocitos CR1 comienza a disminuir, y hay un colapso de la curva CR1 estándar, especialmente en el punto correspondiente al sujeto que expresa un alto nivel de eritrocito CR1. Dado que la línea de regresión resultante está distorsionada, la medida de la densidad CR1 ya no es precisa. Cabe señalar que el almacenamiento in vitro, las condiciones de manipulación y la tinción multicapa conducen a la agrupación de CR1 y una ligera sobreestimación del número de moléculas CR1. Sin embargo, el uso de un anticuerpo anti-CR1 dirigido a tres epítopos como J3D3 con el sistema de amplificación permite realizar la agrupación en clústeres, lo que permite la medición correcta de la densidad CR139.
De hecho, la densidad de CR1/E disminuye durante la vida del eritrocito40. Esto explicaría la heterogeneidad de la densidad de CR1/E en el mismo individuo. Según algunos autores, la intensidad del catabolismo de CR1 no está correlacionada con la densidad inicial de CR1/E41,mientras que para otros autores, cuanto mayor sea la densidad inicial, mayor será la intensidad del catabolismo42. La vida media de CR1 en la superficie de los eritrocitos es de 11-32 días42.
El método presentado aquí tiene varias ventajas. La primera es poder seleccionar, gracias a la citometría de flujo, las subpoblaciones celulares a estudiar dentro de la misma muestra de sangre. Al seleccionar la población de eritrocitos utilizando la función de compuerta, la medición de la densidad de eritrocitos está garantizada exclusivamente. Se evita un sesgo en la medición del eritrocito CR1 causado por la presencia de otras subpoblaciones celulares como los glóbulos blancos. La segunda ventaja de este método es que es adaptable a la cuantificación de otros receptores celulares cuya densidad es baja simplemente reemplazando el anticuerpo primario anti-CR1 por un anticuerpo dirigido específicamente contra un epítopo del receptor a estudiar. También es adaptable al uso de 96 placas de pozo en lugar de estantes de tubo, que requiere volúmenes más bajos de sangre y reactivos25,,38. La tercera ventaja de este método es que es flexible. En estudios sobre células con una densidad muy alta de CR1, por ejemplo, linfocitos humanos (10.000 CR1/célula), o eritrocitos de primates no humanos cuya densidad CR1 es 10-100 veces mayor que la de los seres humanos (10.000–100.000 CR1/célula)43,44, es posible disminuir el número de capas del sistema de amplificación, utilizando sólo anticuerpos monoclonales biodilados anti-CR1, ficoeritrina-estreptavidina o anticuerpo monoclonal biotintilado anti-CR1, anticuerpo antiratón biotintilado y ficoerytrina-stretvidina, adaptando así el nivel de fluorescencia a la mayor densidad de CR1. La cuarta ventaja de este método es que se puede utilizar para eritrocitos fijos o congelados, permitiendo recoger muestras de sangre en áreas que carecen de las instalaciones de citometría de flujo y almacenadas para una cuantificación precisa posterior de CR138.
En términos más generales, con los nuevos fluorocromos más brillantes, ya no parece obligatorio utilizar el sistema de amplificación indirecta. Además, existen otros métodos que utilizan citometría de flujo que permiten evaluar la densidad de los receptores celulares y cuantificarla en unidades de medida (es decir, ABC, o capacidad de unión de anticuerpos). El ABC por célula también se puede determinar utilizando concentraciones saturantes de anticuerpos y perlas calibradas. Varios sistemas comerciales están disponibles. Algunos kits son perlas estándar precalibradas que contienen niveles conocidos de moléculas de fluorocromo, como PE unido por perla. Las perlas adquiridas en un citómetro de flujo el mismo día en los mismos ajustes del instrumento que las muestras individuales del paciente permiten dibujar una curva estándar comparando la media geométrica de fluorescencia con el contenido de PE conocido de las cuentas. Se determinan el coeficiente de análisis de regresión, pendiente, interceptación y correlación, y los valores ABC se calculan a partir de la fluorescencia media geométrica medida de las células utilizando la curva estándar45,46.
Otro tipo de prueba de perlas se basa en la unión de un anticuerpo conjugado con perlas con niveles específicos de capacidad de unión de anticuerpos a través de la porción cristalable del fragmento (Fc). Las perlas se etiquetan con el mismo anticuerpo utilizado para etiquetar las células cuya densidad de antígeno debe medirse. Por lo tanto, en un solo experimento, cualquier anticuerpo conjugado puede ser utilizado, siempre y cuando el mismo lote con la misma relación fluoróforo/proteína (relación F/P) se utiliza para manchar tanto las perlas como las células47. Algunos kits son mejores para la determinación cuantitativa de antígenos de superficie celular mediante citometría de flujo utilizando ensayos de inmunofluorescencia indirecta48,49.
En conclusión, nuestro método tiene la ventaja de proporcionar detección muy sensible y ser fácil de implementar en material de citometría de flujo ordinario.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a todos los miembros de la URCACyt, plataforma técnica de citometría de flujo, el personal del Departamento de Inmunología, y el personal del Departamento de Medicina Interna y Geriatría, que contribuyeron a optimizar y validar el protocolo. Este trabajo fue financiado por los hospitales universitarios de Reims (número de subvención AOL11UF9156).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1000E Barrier Tip | Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France | 2079E | sample pipetting |
| 1-100 µL Bevelled, filter tip | Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Germany | S1120-1840 | sample pipetting |
| Biotinylated anti-CR1 monoclonal antibody (J3D3) | Home production of non-commercial monoclonal antibody, courtesy of Dr J. Cook | immunostaining | |
| Blouse | protection | ||
| Bovin serum albumin (7,5%) | Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France | 15260037 | cytometry |
| Centrifuge | Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France | 11176917 | centrifugation |
| Clean Solution | BD, F-38801 Le Pont de Claix, France | 340345 | cytometry |
| Comorack-96 | Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath | 944060P | rack |
| Cytometer Setup & Tracking Beads Kit | BD, F-38801 Le Pont de Claix, France | 655051 | cytometry |
| Formaldehyde solution 36.5 % | Sigma Aldrich, F-38070 Saint Quentin Fallavier, France | F8775-25ML | Fixation |
| 10 µL Graduated, filter tip | Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Germany | S1121-3810 | sample pipetting |
| LSRFORTESSA Flow Cytometer | BD, F-38801 Le Pont de Claix, France | 647788 | cytometry |
| Microman Capillary Pistons | Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath | 067494 | sample pipetting |
| Micronic 1.40 mL round bottom tubes | Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath | MP32051 | mix |
| Micropipette Microman - type M25 - | Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath | 066379 | sample pipetting |
| Phosphate buffered Saline (PBS) | Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France | 10010031 | cytometry |
| Pipette PS 325 mm, 10 mL | Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath | 391952 | sample pipetting |
| powder-free Nitrile Exam gloves | Medline Industries, Inc, Mundelein, IL 60060, USA | 486802 | sample protection |
| Reference 2 pipette, 0,5-10 µL | Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France | 4920000024 | sample pipetting |
| Reference 2 pipette, 20-100 µL | Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France | 4920000059 | sample pipetting |
| Reference 2 pipette, 100-1000 µL | Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France | 4920000083 | sample pipetting |
| Rinse Solution | BD, F-38801 Le Pont de Claix, France | 340346 | cytometry |
| Round bottom tube | Sarstedt, F-70150 Marnay, France | 55.1579 | cytometry |
| Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France | 0030120086 | mix |
| streptavidin R-PE | Tebu Bio, F-78612 Le Perray-en-Yvelines, France | AS-60669 | immunostaining |
| Tapered Centrifuge Tubes 50 mL | Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France | 10203001 | mix |
| Vector anti streptavidin biotin | Eurobio Ingen, F-91953 Les Ulis, France | BA-0500 | immunostaining |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries, Inc, Bohemia, NY 111716, USA | SI-0236 | mix |
References
- Fearon, D. T. Identification of the membrane glycoprotein that is the C3b receptor of the human erythrocyte, polymorphonuclear leukocyte, B lymphocyte, and monocyte. Journal of Experimental Medicine. 152 (1), 20-30 (1980).
- Ross, G. D., Winchester, R. J., Rabellino, E. M., Hoffman, T. Surface markers of complement receptor lymphocytes. Journal of Clinical Investigation. 62 (5), 1086-1092 (1978).
- Reynes, M., et al. Human follicular dendritic cells express CR1, CR2, and CR3 complement receptor antigens. The Journal of Immunology. 135 (4), 2687-2694 (1985).
- Gasque, P., et al. Identification and characterization of complement C3 receptors on human astrocytes. The Journal of Immunology. 156 (6), 2247-2255 (1996).
- Pascual, M., et al. Identification of membrane-bound CR1 (CD35) in human urine: evidence for its release by glomerular podocytes. Journal of Experimental Medicine. 179 (3), 889-899 (1994).
- Fearon, D. T. Regulation of the amplification C3 convertase of human complement by an inhibitory protein isolated from human erythrocyte membrane. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (11), 5867-5871 (1979).
- Dobson, N. J., Lambris, J. D., Ross, G. D. Characteristics of isolated erythrocyte complement receptor type one (CR1, C4b-C3b receptor) and CR1-specific antibodies. The Journal of Immunology. 126 (2), 693-698 (1981).
- Schreiber, R. D., Pangburn, M. K., Muller-Eberhard, H. J. C3 modified at the thiolester site: acquisition of reactivity with cellular C3b receptors. Bioscience Reports. 1 (11), 873-880 (1981).
- Ross, G. D., et al. Generation of three different fragments of bound C3 with purified factor I or serum. II. Location of binding sites in the C3 fragments for factors B and H, complement receptors, and bovine conglutinin. Journal of Experimental Medicine. 158 (2), 334-352 (1983).
- Klickstein, L. B., Barbashov, S. F., Liu, T., Jack, R. M., Nicholson-Weller, A. Complement receptor type 1 (CR1, CD35) is a receptor for C1q. Immunity. 7 (3), 345-355 (1997).
- Ghiran, I., et al. Complement receptor 1/CD35 is a receptor for mannan-binding lectin. Journal of Experimental Medicine. 192 (12), 1797-1808 (2000).
- Cornacoff, J. B., et al. Primate erythrocyte-immune complex-clearing mechanism. Journal of Clinical Investigation. 71 (2), 236-247 (1983).
- Waxman, F. J., et al. Complement depletion accelerates the clearance of immune complexes from the circulation of primates. Journal of Clinical Investigation. 74 (4), 1329-1340 (1984).
- Waxman, F. J., et al. Differential binding of immunoglobulin A and immunoglobulin G1 immune complexes to primate erythrocytes in vivo. Immunoglobulin A immune complexes bind less well to erythrocytes and are preferentially deposited in glomeruli. Journal of Clinical Investigation. 77 (1), 82-89 (1986).
- Horgan, C., Taylor, R. P. Studies on the kinetics of binding of complement-fixing dsDNA/anti-dsDNA immune complexes to the red blood cells of normal individuals and patients with systemic lupus erythematosus. Arthritis & Rheumatology. 27 (3), 320-329 (1984).
- Pham, B. N., et al. Analysis of complement receptor type 1 expression on red blood cells in negative phenotypes of the Knops blood group system, according to CR1 gene allotype polymorphisms. Transfusion. 50 (7), 1435-1443 (2010).
- Wilson, J. G., et al. Identification of a restriction fragment length polymorphism by a CR1 cDNA that correlates with the number of CR1 on erythrocytes. Journal of Experimental Medicine. 164 (1), 50-59 (1986).
- Rodriguez de Cordoba, S., Rubinstein, P. Quantitative variations of the C3b/C4b receptor (CR1) in human erythrocytes are controlled by genes within the regulator of complement activation (RCA) gene cluster. Journal of Experimental Medicine. 164 (4), 1274-1283 (1986).
- Herrera, A. H., Xiang, L., Martin, S. G., Lewis, J., Wilson, J. G. Analysis of complement receptor type 1 (CR1) expression on erythrocytes and of CR1 allelic markers in caucasian and african american populations. Clinical Immunology and Immunopathology. 87 (2), 176-183 (1998).
- Birmingham, D. J., et al. A CR1 polymorphism associated with constitutive erythrocyte CR1 levels affects binding to C4b but not C3b. Immunology. 108 (4), 531-538 (2003).
- Dykman, T. R., Hatch, J. A., Aqua, M. S., Atkinson, J. P. Polymorphism of the C3b/C4b receptor (CR1): characterization of a fourth allele. The Journal of Immunology. 134 (3), 1787-1789 (1985).
- Moulds, J. M., Moulds, J. J., Brown, M., Atkinson, J. P. Antiglobulin testing for CR1-related (Knops/McCoy/Swain-Langley/York) blood group antigens: negative and weak reactions are caused by variable expression of CR1. Vox Sanguinis. 62 (4), 230-235 (1992).
- Cohen, J. H., Lutz, H. U., Pennaforte, J. L., Bouchard, A., Kazatchkine, M. D. Peripheral catabolism of CR1 (the C3b receptor, CD35) on erythrocytes from healthy individuals and patients with systemic lupus erythematosus (SLE). Clinical & Experimental Immunology. 87 (3), 422-428 (1992).
- Jouvin, M. H., Rozenbaum, W., Russo, R., Kazatchkine, M. D. Decreased expression of the C3b/C4b complement receptor (CR1) in AIDS and AIDS-related syndromes correlates with clinical subpopulations of patients with HIV infection. AIDS. 1 (2), 89-94 (1987).
- Waitumbi, J. N., Donvito, B., Kisserli, A., Cohen, J. H., Stoute, J. A. Age-related changes in red blood cell complement regulatory proteins and susceptibility to severe malaria. The Journal of Infectious Diseases. 190 (6), 1183-1191 (2004).
- Mahmoudi, R., et al. Alzheimer's disease is associated with low density of the long CR1 isoform. Neurobiology of Aging. 36 (4), 5-12 (2015).
- Mahmoudi, R., et al. Inherited and Acquired Decrease in Complement Receptor 1 (CR1) Density on Red Blood Cells Associated with High Levels of Soluble CR1 in Alzheimer's Disease. International Journal of Molecular Sciences. 19 (8), 2175 (2018).
- Zaitsev, S., et al. Human complement receptor type 1-directed loading of tissue plasminogen activator on circulating erythrocytes for prophylactic fibrinolysis. Blood. 108 (6), 1895-1902 (2006).
- Scatchard, G. The attractions of proteins for small molecules and ions. Annals of the New York Academy of Sciences. 51 (4), 660-672 (1949).
- Cohen, J. H., et al. Enumeration of CR1 complement receptors on erythrocytes using a new method for detecting low density cell surface antigens by flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 99 (1), 53-58 (1987).
- Minota, S., et al. Low C3b receptor reactivity on erythrocytes from patients with systemic lupus erythematosus detected by immune adherence hemagglutination and radioimmunoassays with monoclonal antibody. Arthritis & Rheumatology. 27 (12), 1329-1335 (1984).
- Miyakawa, Y., et al. Defective immune-adherence (C3b) receptor on erythrocytes from patients with systemic lupus erythematosus. The Lancet. 2 (8245), 493-497 (1981).
- Lida, K., Mornaghi, R., Nussenzweig, V. Complement receptor (CR1) deficiency in erythrocytes from patients with systemic lupus erythematosus. Journal of Experimental Medicine. 155 (5), 1427-1438 (1982).
- Tao, K., Nicholls, K., Rockman, S., Kincaid-Smith, P. Expression of complement 3 receptors (CR1 and CR3) on neutrophils and erythrocytes in patients with IgA nephropathy. Clinical Nephrology. 32 (5), 203-208 (1989).
- Nickells, M., et al. Mapping epitopes for 20 monoclonal antibodies to CR1. Clinical and Experimental Immunology. 112 (1), 27-33 (1998).
- Oi, V. T., Glazer, A. N., Stryer, L. Fluorescent phycobiliprotein conjugates for analyses of cells and molecules. The Journal of Cell Biology. 93 (3), 981-986 (1982).
- Chaiet, L., Wolf, F. J. The properties of streptavidin, a biotin-binding protein produced by streptomyces. Archives of Biochemistry and Biophysics. 20 (106), 1-5 (1964).
- Cockburn, I. A., Donvito, B., Cohen, J. H., Rowe, J. A. A simple method for accurate quantification of complement receptor 1 on erythrocytes preserved by fixing or freezing. Journal of Immunological Methods. 20 (271), 59-64 (2002).
- Chen, C. H., et al. Antibody CR1-2B11 recognizes a non-polymorphic epitope of human CR1 (CD35). Clinical & Experimental Immunology. 148 (3), 546-554 (2007).
- Ripoche, J., Sim, R. B. Loss of complement receptor type 1 (CR1) on ageing of erythrocytes. Studies of proteolytic release of the receptor. Biochemical Journal. 235 (3), 815-821 (1986).
- Moldenhauer, F., Botto, M., Walport, M. J. The rate of loss of CR1 from ageing erythrocytes in vivo in normal subjects and SLE patients: no correlation with structural or numerical polymorphisms. Clinical & Experimental Immunology. 72 (1), 74-78 (1988).
- Cohen, J. H., Lutz, H. U., Pennaforte, J. L., Bouchard, A., Kazatchkine, M. D. Peripheral catabolism of CR1 (the C3b receptor, CD35) on erythrocytes from healthy individuals and patients with systemic lupus erythematosus (SLE). Clinical & Experimental Immunology. 87 (3), 422-428 (1992).
- Nickells, M. W., Subramanian, V. B., Clemenza, L., Atkinson, J. P. Identification of complement receptor type 1-related proteins on primate erythrocytes. The Journal of Immunology. 154 (6), 2829-2837 (1995).
- Hebert, L. A., Birmingham, D. J., Shen, X. P., Cosio, F. G. Stimulating erythropoiesis increases complement receptor expression on primate erythrocytes. Clinical Immunology and Immunopathology. 62 (3), 301-306 (1992).
- Davis, K. A., Abrams, B., Iyer, S. B., Hoffman, R. A., Bishop, J. E. Determination of CD4 antigen density on cells: Role of antibody valency, avidity, clones, and conjugation. Cytometry. 33 (2), 197-205 (1998).
- Pannu, K. K., Joe, E. T., Iyer, S. B. Performance evaluation of QuantiBRITE phycoerythrin beads. Cytometry. 45 (4), 250-258 (2001).
- Barnett, D., Storie, I., Wilson, G. A., Granger, V., Reilly, J. T. Determination of leucocyte antibody binding capacity (ABC): the need for standardization. Clinical Laboratory Haematology. 20 (3), 155-164 (1998).
- Bikoue, A., et al. Quantitative analysis of leukocyte membrane antigen expression: normal adult values. Cytometry. 26 (2), 137-147 (1996).
- Serke, S., van Lessen, A., Huhn, D. Quantitative fluorescence flow cytometry: a comparison of the three techniques for direct and indirect immunofluorescence. Cytometry. 33 (2), 179-187 (1998).
