Summary
Syftet med denna metod är att bestämma CR1 densitet i erytrocyter av något ämne genom att jämföra med tre ämnen vars erytrocyt CR1 densitet är känd. Metoden använder flödescytometri efter immunfärgning av försökspersonernas erytrocyter genom en anti-CR1 monoklonal antikropp kopplad till ett förstärkt system med fykoerytrin (PE).
Abstract
CR1 (CD35, Complement Receptor typ 1 för C3b/C4b) är ett högmolekylmembran glykoprotein på ca 200 kDa som styr komplementaktivering, transporterar immunkomplex och deltar i humorala och cellulära immunsvar. CR1 finns på ytan av många celltyper, inklusive erytrocyter, och uppvisar polymorfismer i längd, struktur (Knops, eller KN, blodgrupp), och densitet. Den genomsnittliga tätheten av CR1 per erytrocyt (CR1/E) är 500 molekyler per erytrocyt. Denna densitet varierar från en individ till en annan (100–1 200 CR1/E) och från en erytrocyt till en annan i samma individ. Vi presenterar här en robust flöde cytometri metod för att mäta densiteten av CR1/E, inklusive i ämnen som uttrycker en låg densitet, med hjälp av en förstärkande immunstainning system. Denna metod har gjort det möjligt för oss att visa sänkning av CR1 erytrocyt uttryck vid sjukdomar som Alzheimers sjukdom (AD), systemisk lupus erythematosus (SLE), aids, eller malaria.
Introduction
CR1 (komplementreceptor typ 1, CD35) är en 200 kDa transmembrane glykoprotein som finns på ytan av många celltyper, såsom erytrocyter1, B lymfocyter2, monocytiska celler, vissa T-celler, follikulära dendritiska celler3, fetala astrocyter4, och glomerular podocyter5. CR1 störa dess ligands C3b, C4b, C3bi6,7,8,9, en underenhet av den första komplement komponenten, C1q10 och MBL (mannan-bindande lectin)11 hämmar aktivering av komplement och är involverad i humorala och cellulära immunsvar.
Hos primater, inklusive människor, erytrocyt CR1 är involverad i transport av immunkomplex till levern och mjälte, för att rena blodet och förhindra deras ackumulering i sårbara vävnader såsom hud eller njurar12,13,14. Detta fenomen av immun vidhäftning mellan immunkomplex och erytrocyter beror på antalet CR1-molekyler15. Hos människa är medeltätheten av CR1/E endast 500 (dvs. 500 molekyler av CR1 per erytrocyt). Denna densitet varierar från en individ till en annan (100–1 200 CR1/E) och från en erytrocyt till en annan i samma individ. Vissa individer av "null" fenotyp uttrycka färre än 20 CR1/E16.
Densiteten hos CR1/E regleras av två samdominerande autosomala alleler kopplade till en punktmutation i intron 27 av genkodningen för CR1*117,18. Denna mutation producerar en ytterligare begränsning webbplats för hindIII enzymet. Begränsningen fragment erhålls efter matsmältningen med HindIII i detta fall är 7,4 kb för allel kopplade till ett starkt uttryck för CR1 (H: hög allel) och 6,9 kb för allelen kopplade till låg CR1 uttryck (L: låg allel). Denna länk finns i Kaukasier och asiater men inte i människor av afrikansk härkomst19.
Nivån av uttryck för erytrocyt CR1 är också korrelerad med förekomsten av punkt nukleotid mutationer i exon 13 kodning SCR 10 (I643T) och i exon 19 kodning SCR16 (Q981H). Det är hög i homozygous 643I/981Q och låg i homozygous 643T/981H individer20. Således uttrycker "låga" individer runt 150 CR1/E, "medium" individer uttrycka runt 500 CR1/E, och "höga" individer uttrycka runt 1000 CR1/E.
Utöver denna erytrocyttäthet polymorfism, CR1 kännetecknas av en längd polymorfism som motsvarar fyra allotyper av olika storlekar: CR1 * 1 (190 kDa), CR1 * 2 (220 kDa), CR1 * 3 (160 kDa), och CR1 * 4 (250 kDa)21 och en antigen polymorfism som motsvarar blodgruppen KN22.
Vi presenterar vår metod baserad på flödescytometri för att bestämma densiteten hos CR1/E. Med hjälp av tre försökspersoner vars CR1/E-densitet är känd, uttrycker en låg densitetsnivå (180 CR1/E), en medeldensitetsnivå (646 CR1/E) och en hög densitetsnivå (966 CR1/E), är det lätt att mäta medelfluoresintensiteten (MFI) för deras erytrocyter eller röda blodkroppar (RBC) eller RBC MFI, efter anti-CR1-immunstämmande med hjälp av en flödescytometer. Man kan sedan rita en standardlinje som representerar MFI som en funktion av CR1/E densitet. Genom att mäta MFI för försökspersoner vars CR1/E-densitet inte är känd och jämföra den med denna standardlinje är det möjligt att bestämma individernas CR1/E-densitet. Denna teknik har använts i många år i laboratoriet, och har gjort det möjligt för oss att upptäcka en minskning av uttrycket av erytrocyt CR1 i många patologier såsom systemisk lupus erythematosus (SLE)23, Förvärvade immunbristsyndrom (AIDS)24, malaria25, och nyligen Alzheimers sjukdom (AD)26,27. Utvecklingen av läkemedel som riktar CR1 till par med erytrocyter, som i fallet med anti-trombotiska läkemedel28 kräver utvärdering av CR1/E densitet, och tillgången på en robust teknik för att kvantifiera CR1.
Det protokoll som presenteras körs i singlicate. Det är anpassningsbart att bestämma densiteten hos CR1/E på många individer med hjälp av specifika kommersiellt tillgängliga 96 brunnsplattor (se Tabell över material). För detta ändamål är det lätt att anpassa vår metod till någon 96 brunnsplatta. För varje prov fördelas en cellupphängning av erytrocyter (0,5 x 106–1x 106 erytrocyter) per brunn. För varje brunn tillsätts först den primära anti-CR1-antikroppen, sedan streptavidin PE, den sekundära anti-streptavidin antikroppen och återigen streptavidin PE, med samma utspädningar som vår metod, men genom att anpassa volymer och respektera proportionalitet.
Blodproverna från försökspersoner i intervallet och från försökspersoner som ska kvantifieras för CR1 bör tas samtidigt, förvaras i kylskåp vid 4 °C och hanteras vid 4 °C (på is och/eller i kylskåp).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollet för insamling och hantering av humant blod granskades och godkändes av den regionala etikkommittén (CPP Est II), och protokollnumret är 2011-A00594-37. Eftersom följande protokoll beskriver hanteringen av humant blod, bör institutionella riktlinjer för bortskaffande av biohazardous material följas. Laboratoriesäkerhetsutrustning, såsom labbrockar och handskar, bör bäras.
1. Erytrocyt tvätt
OBS: Dagen före hantering, bered en PBS-BSA-buffert med fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) som innehåller 0,15 % av bovinserserpeset (BSA) och placera den i kylskåpet vid 4 °C. Denna buffert kommer att användas som en tvättbuffert och som en utspädningsbuffert.
- Pipettera 20 ml PBS-BSA i ett 50 ml-rör.
- Sug upp 250 μl natriumetylendiamintealacketsyra (EDTA) antikoagulerat helblod från blodförvaringsrör och tillsätt det rör som innehåller 20 ml PBS-BSA. Stäng röret genom att skruva fast locket. Blanda försiktigt genom att vända röret 2x.
- Centrifugera röret i 10 min vid 4 °C vid 430 x g. Ta bort och kassera supernatanten med en 10 ml pipett. Resuspend pelleten i den återstående volymen av supernatant genom skonsam och noggrann pipettering.
- Tillsätt 20 ml kall PBS-BSA (4 °C) i röret som innehåller pelleten. Centrifugera röret i 10 min vid 4 °C vid 430 x g. Ta bort och kassera supernatanten med en 10 ml pipett.
- Tillsätt 20 ml kall PBS-BSA (4 °C) i röret som innehåller pelleten. Centrifugera röret i 10 min vid 4 °C vid 430 x g. Lämna röret i centrifugen vid 4 °C och gå till avsnitt 2.
2. Erytrocyt utspädning
- Pipettera 3 ml kall PBS-BSA i ett 50 ml-rör och förvara det vid 4 °C på ett rack i is.
- Lägg det centrifugerade röret som innehåller erytrocyterna (steg 1.4) på ett rack som placerats i is.
- Pipettera 8 μL pelleterade erytrocyter med pipetten och tillsätt 50 ml-röret som innehåller 3 ml PBS-BSA för att erhålla erytrocytutspädningen. Blanda röret försiktigt för hand för att få en homogen cell suspension av erytrocyter.
3. Erytrocyt immunstainning
- Pipettera 100 μL erytrocytutspädning (erhålls i avsnitt 4) och tillsätt till 1,4 ml-rör.
- Centrifugera rören i 5 min vid 4 °C vid 430 x g. Under centrifugering, bered en utspädning av biotinylerade anti-CR1 J3D3 antikroppar vid en koncentration av 0,05 μg/μL i PBS-BSA buffert.
- När centrifugering är klar, ta bort och kasta supernatanten.
- Tillsätt 20 μl biotinylerad anti-CR1 J3D3 direkt till pelleten. För att förbereda den negativa kontrollen, tillsätt 20 μl PBS-BSA-buffert istället. Blanda rören försiktigt och inkubera i 45 min vid 4 °C.
- Efter 45 minuters inkubation, tillsätt 750 μl PBS-BSA till rören. Centrifugera rören i 5 min vid 4 °C vid 430 x g. Ta bort och kassera supernatanten. Upprepa.
- Under tiden, förbereda en 1:10 utspädning av streptavidin-fycoerythrin utspädd i PBS-BSA buffert. Pipettera 20 μL av 1:10-utspädningen av streptavidin-fykoerytrin och tillsätt rören. Blanda rören försiktigt och inkubera i 45 min vid 4 °C.
- Tillsätt 750 μl PBS-BSA-buffert i rören. Blanda väl och centrifug i 5 min vid 4 °C vid 430 x g. Ta bort och kassera supernatanten. Upprepa.
- Under centrifugering, förbereda en 1:100 utspädning av biotinylerade anti-streptavidin antikroppar utspädd i PBS-BSA buffert.
- När centrifugering är klar, ta bort och kasta supernatanten.
- Pipetter 20 μL av 1:100-utspädningen av biotinylerad anti-streptavidin i rören. Blanda rören försiktigt. Inkubera rören i 45 min vid 4 °C.
- Efter 45 minuters inkubation, pipett 750 μL PBS-BSA-buffert och tillsätt i rören. Centrifugera rören i 5 min vid 4 °C vid 430 x g. Ta bort och kassera supernatanten. Upprepa.
- Pipettera 20 μL av 1:10-utspädningen av streptavidin-fykoerytrin och tillsätt i rören. Blanda rören försiktigt. Inkubera rören i 45 min vid 4 °C.
- Pipetter 750 μL PBS-BSA-buffert och tillsätt i rören. Blanda väl och centrifugera rören i 5 min vid 4 °C vid 430 x g. Ta bort och kassera supernatanten. Upprepa detta steg 2x.
4. Immunfläckad erytrocyt fixering
- Under den senaste centrifugering, förbereda fixering buffert, en 1:100 utspädning av 37% formaldehyd med hjälp av tvättbuffert PBS-BSA.
- Pipettera 450 μL fixeringsbuffert och tillsätt i immunostainerade erytrocytrör (från steg 3.13) medan du virvlar i 5 s.
- Pipett alla fasta celler i 5 ml runda bottenrör och förvara i kylskåp.
OBS: Protokollet kan pausas här i upp till 48 timmar.
5. Flödescytometrianalys av färgade erytrocyter
OBS: Det är lämpligt att hänvisa till operatörshandboken för cytometern (se Tabell över material)för att veta hur man utför de cytometriska avläsningarna. De föreslagna parametrarna nedan gäller för det instrument som används och måste optimeras för varje cytometer.
- Slå på flödescytometern och slå sedan på datorn. Låt den optiska systemtemperaturen stabiliseras genom att låta den vara på i 30 minuter. Kontrollera cytometerfönstret i programvaran för att säkerställa att cytometern är ansluten till arbetsstationen (meddelandet Cytometer Connected visas).
- Kontrollera att buffertbehållaren är full och att avfallsbehållaren är tom. Ta bort luftbubblor i buffertfiltret och buffertlinjen med hjälp av utrensningssystemet. Prime fluidics systemet genom att trycka på Prime-knappen på konsolen av cytometern. Vänta tills indikatorlampan ändras från rött till grönt.
- För att rengöra fluidiken, installera ett rör som innehåller 3 ml en rengöringslösning på provinsprutningsporten och låt rengöringslösningen gå i 5 min med ett högt provflöde. Upprepa detta med sköljlösningen med destillerat vatten. Lämna röret som innehåller vatten på provinsprutningsporten.
- För att förbereda de kalibrerande pärlorna, pipett 400 μL PBS i botten av ett runt bottenrör. Blanda pärla bestånden starkt genom att virvla i 30 s. Lägg till en droppe till den runda botten röret som innehåller PBS. Blanda försiktigt genom att virvla i 30 s.
- Kör prestandakontrollen. Öppna modulen för installation och spårning av cytometer i programvaran (bild 1A). Kontrollera att cytometerkonfigurationen är korrekt för experimentet med PE-immunfläckande. Kontrollera att den kalibrerande pärlbatchen är korrekt med konfigurationen.
- Installera pärlröret på provinsprutningsporten och låt det köras med ett lågt provflöde. Kör prestandakontrollen, som tar cirka 5 minuter att slutföra). När prestandakontrollen är klar, kontrollera att cytometerns prestanda är tillfredsställande (figur 1B). Stäng modulen för installation och spårning av cytometer i programvaran.
- Om du vill konfigurera ett experiment och skapa programinställningar klickar du på knappen Nytt experiment i webbläsarens verktygsfält och öppnar det nya experimentet. Ange parametrarna genom att välja lämpliga cytometerinställningar: Framåtspridning (FSC), Side Scatter (SSC) och PE på experimentets rullgardinsmeny (Bild 1C). Välj linjärt läge för FSC-parameter och logaritmläge för SSC- och PE-parametrar.
- I det öppna experimentet väljer du Cytometerinställningar (Bild 1D), välj sedan Programinställningaroch skapa ett globalt kalkylblad (Bild 1E). Använd de grå rutorna och hårkorsen för att styra optimeringen.
- Lasta det ofläckade kontrollröret på cytometern och kör Förvärv. Se till att populationen av intresse (dvs. rbcs) är i skala genom att optimera FSC och SSC spänningar. Optimera FSC tröskelvärdet för att eliminera skräp utan att störa befolkningen av intresse.
- Rita en grind runt RBCs på FSC vs SSC tomt. Visa RBC-populationen i punktområdet för PE-fluorescens. Om det behövs, öka fluorescensen av fotomultiplierröret (PMT) spänningar för att placera den negativa befolkningen inom de grå rutorna. Lossa det ofläckade kontrollröret från cytometern.
- Kontrollera att de positiva populationerna är på skala. Lasta det färgade kontrollröret på cytometern och kör Förvärv. Sänk PMT-spänningen för den positiva populationen om den är avskala tills den positiva populationen kan ses helt i skala. Lasta sedan av det färgade provet.
- Om du vill registrera och analysera exempel skapar du i ett nytt globalt kalkylblad följande ritdiagram för att förhandsgranska data: 1) FSC jämfört med SSC och 2) PE-fluorescens histogram. Ladda det första provet på cytometern och kör Förvärv.
- Rita en RBC-grind runt erytrocyterna på FSC vs SSC-tomten. Visa RBC-populationen i PE-fluorescens histogrammet. I statistikvyn väljer du medelvärdet för PE-fluorescensparametrar för GR-populationer (figur 1F).
- I instrumentpanelen Förvärv väljer du alla händelser i stoppporten och 10 000 händelser som ska registreras (bild 1G). Klicka på Postdata. När händelseregistreringen är klar tar du bort det första röret från cytometern. De globala kalkylbladsdiagrammet ska se ut som de i figur 2.
- Ladda följande prover och spela in dem.
6. Bestämning av tätheten av erytrocyt CR1
- Ta värdena för de genomsnittliga fluorescensintensiteterna för de prover som motsvarar det "låga" ämnet(figur 3, tabell I,RBC MFI), "medium" (figur 4, tabell D,RBC MFI), "högt" ämne (figur 4, tabell I,RBC MFI) och till det negativa kontrollprovet (figur 3, tabell I,RBC MFI).
- På ett diagram som representerar den genomsnittliga fluorescensintensiteten som en funktion av cr1-densiteten placerar du de fyra punkter som motsvarar den negativa kontrollen, "lågt" motiv, "medium" motiv och "högt" motiv (blå punkter, figur 6).
- Rita regressionslinjen för att få kalibreringslinjen och dess ekvation.
- Ta värdena för den genomsnittliga fluorescensintensiteten hos de prover som motsvarar de försökspersoner vars densitet skall bestämmas. (Figur 5, Tabellerna D och I,RBC MFI).
- Hämta ekvationen genom att ersätta "Y" med hjälp av värdena för medelfluorescensintensiteterna och beräkna densiteten för CR1/E (figur 6).
- Kontrollera diagrammet att de genomsnittliga fluorescensintensitetsvärdena och den bestämda CR1/E-densiteten motsvarar en punkt på kalibreringslinjen (figur 6).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Erytrocyterna för tre försökspersoner vars densitet av CR1 är känd ("låg" subjekt [180 CR1/E], "medium" ämne [646 CR1/E] och "hög" ämne [966 CR1/E]), och av två ämnen vars CR1 densitet behövde fastställas var immunostained av en anti-CR1 antikropp kopplad till ett förstärkningssystem med hjälp av phycoerythrin fluorochrome. I början bestämdes CR1-densiteten hos försökspersonerna från det låghöga intervallet av Scatchardmetoden29 med hjälp av radiomärkta antikroppar. De standarder (låg, medium och hög) bestäms användes för en kalibreringskurva och gjorde det möjligt att kvantifiera nya standarder eller understandarder med vår metod för cytometri30. Efter passage av immunostained erytrocyter i flödet cytometer, intensiteten av märkning observerades och mättes som den genomsnittliga fluorescens intensitet för varje ämne (RBC MFI) (figur 3F,I; Figur 4B,D,F,I; Bild 5B,D,F,I). En kurva ritades med hjälp av värdena för försökspersonerna med den kända densiteten av erytrocyt CR1 ("låg" till "hög") genom att rapportera dem som en funktion av den genomsnittliga fluorescensintensiteten. Jämförelse av regressionslinjen till följd av denna kurva med värdena för de andra försökspersonernas genomsnittliga fluorescensintensitet fastställde deras CR1/E-densitet (figur 6). Bild 7 visar det övergripande arbetsflödet.
Bild 1: Cytometerkonsol och fönster som visas under flödescytometriprotokollet. (A)Fönster som visas efter tillämpningen av steg 5.5 i protokollet. B)Fönster som visas efter tillämpningen av steg 5.6 i protokollet. C)Fönster som visas efter tillämpningen av steg 5.7 i protokollet. D)Fönster som visas efter tillämpningen av steg 5.8 i protokollet. E)Fönster som visas efter tillämpningen av steg 5.8 i protokollet. F)Fönster som visas efter tillämpningen av steg 5.13 i protokollet. G)Fönster som visas efter tillämpningen av steg 5.14 i protokollet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 2: Utseendet på de globala kalkylbladsanalysobjekten. Utseendet på de globala kalkylbladsanalysobjekten efter tillämpningen av steg 5.14 i protokollet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Resultat av flödescytometrianalys av anti-CR1-immunfärgning av erytrocyter som motsvarar negativ kontroll och ämnet från det område ("lågt" ämne) som uttryckte LOW CR1-densitet (180 CR1/E). För varje ämne:(A,E)en punkt blot som visar utseendet på händelser som förvärvats beroende på storlek och granulometry parametrar,g)Den grind som väljer erytrocytpopulationen bland händelserna,(B,F)ett histogram som representerar etikettens intensitet,(C,H)en tillhörande statistisk tabell med antalet händelser som motsvarar erytrocyterna och deras procentandel,d,I)en tillhörande tabell med medelfluoresintensitet (RBC MFI). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Resultat av flödescytometrianalys av anti-CR1-immunfärgning av erytrocyter som motsvarar försökspersonerna från området: "medium" ämne som uttryckte MEDIUM CR1-densitet (646 CR1/E) och "högt" ämne som uttryckte HÖG CR1-densitet (966 CR1/E). För varje ämne:(A, E)en punkt blot som visar utseendet på händelser som förvärvats beroende på storlek och granulometry parametrar,g)Den grind som väljer erytrocytpopulationen bland händelserna,(B, F)ett histogram som representerar etikettens intensitet,(C, H)en tillhörande statistisk tabell med antalet händelser som motsvarar erytrocyterna och deras procentandel,d, I)en tillhörande tabell med medelfluoresintensitet (RBC MFI). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Resultat av flödescytometrianalys av anti-CR1-immunfärgning av erytrocyter som motsvarar de försökspersoner vars CR1-densitet skulle bestämmas. För varje ämne:(A, E)en punkt blot som visar utseendet på händelser som förvärvats beroende på storlek och granulometry parametrar,g)Den grind som väljer erytrocytpopulationen bland händelserna,(B, F)ett histogram som representerar etikettens intensitet,(C, H)en tillhörande statistisk tabell med antalet händelser som motsvarar erytrocyterna och deras procentandel,d, I)en tillhörande tabell med medelfluoresintensitet (RBC MFI). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 6: Kalibreringskurva och regressionslinje som gör det möjligt att bestämning av CR1-densitet. (A),(B)Kalibreringskurva och regressionslinje som dras enligt den kända CR1-densiteten hos områdespersonerna (negativ kontroll: 0 CR1, "lågt" ämne [180 CR1/E], "medium" ämne [646 CR1/E] och "högt" ämne [966 CR1/E]) och deras respektive värden för genomsnittlig fluorescens som erhållits intensitet som erhållits med flödescytometri. (C), (D) Från ekvationen för denna regressionslinje beräknade vi densiteten av erytrocyt CR1 för försökspersoner vars genomsnittliga fluorescensintensitet kvantifierades med flödescytometri: orangepilar, ämne 1 (genomsnittlig fluorescensintensitet = 1 334; CR1/E densitet = 459) och ämne 2 (genomsnittlig fluorescensintensitet = 2820; CR1/E densitet = 1000). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: Flödesschema av protokollet för att bestämma erytrocyt CR1 densitet från mänskliga blodprov. Samla ett mänskligt blodprov. Tvätta det mänskliga blodprovet genom centrifugering för att erhålla erytrocyter. Fläcka erytrocyterna med hjälp av en anti-CR1-antikropp. Använd flödescytometri för att bestämma erytrocyt CR1 densitet enligt en kalibreringskurva. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Flera tekniker finns tillgängliga för att bestämma densiteten av erytrocyt CR1 (CR1/E). De första tekniker som användes var agglutination av röda blodkroppar av anti-CR1 antikroppar31 och bildandet av rosetter i närvaro av erytrocyter belagda med C3b32. Dessa rudimentära tekniker ersattes snabbt av immunfärgningsmetoder med radiomärkta anti-CR1-antikroppar1,33. Det är också möjligt att mäta koncentrationen av CR1 i membranextrakt genom enzymkopplade immunsorbentanalys (ELISA)34. Även om dessa tekniker är korrekta ger de bara ett genomsnittligt värde av CR1/E-densiteten. Fördelningen av CR1/E densitet över hela erytrocytpopulationen är endast tillgänglig genom flöde cytometrisk analys efter immunostaining. Denna teknik är svår på grund av den låga densiteten hos CR1/E. En förstärkningsmetod gör det dock nu möjligt att enkelt mäta tätheten av CR1/E30.
Här presenterar vi en metod för att kvantifiera CR1/E genom flöde cytometri baserat på förstärkning av fluorescens signalen av immunostained celler. Förstärkningssystemet omfattar fyra på varandra följande lager av färgning med hjälp av den biotinylerade anti-CR1 monoklonala antikroppen J3D3; fycoerythrin-streptavidin; En biotinylerad get anti-streptavidin antikropp; och igen phycoerythrin-streptavidin. J3D3 känner igen tre antigena platser på CR135, men inte mer än en samtidigt. Den biotinylerade get anti-streptavidin antikroppar är en polyklonal antikropp som känner igen flera epitopes på streptavidin och ger en bättre bro mellan de två streptavidin lager än biotin-streptavidin ensam. Denna process drar också nytta av den höga fluorescensavkastningen av fykoerytrin36 och den låga nivån av ospecifik bindning av streptavidin37. Med en så stark förstärkt signal möjliggör de låga inställningarna för cytometerns fotomultiplikatorrör perfekt linjäritet. Denna metod, som kännetecknas av utmärkt känslighet och reproducerbarhet, möjliggör detektion av färre än 100 CR1/cell.
Denna metod kräver dock prover från tre försökspersoner vars densitet av erytrocyt CR1 är känd: ett ämne som uttrycker en låg nivå av erytrocyt CR1 (180 CR1/E), ett ämne som uttrycker en medelhög nivå av erytrocyt CR1 (646 CR1/E) och ett ämne som uttrycker en hög nivå av erytroteocy CR1 (966 CR1/E). Det är möjligt att ta de första mätningarna av erytrocyt CR1 densitet av flera individer, inledningsvis med hjälp av erytrocyter från de tre ämnen som används i vår studie, som vi kan ge. Blodproverna från försökspersoner i intervallet och försökspersoner som ska kvantifieras för CR1 bör tas samtidigt, förvaras i kylskåp vid 4 °C och hanteras vid 4 °C38. Blodet som tas i EDTA-rör är lätt dirigerbart och kan lagras i 5 dagar vid 4 °C, vilket ger tid för kvantifiering av erytrocyt CR1. Efter detta börjar tätheten av erytrocyt CR1 att minska, och det finns en kollaps av standard CR1 kurvan, särskilt vid den punkt som motsvarar ämnet uttrycker en hög nivå av erytrocyt CR1. Eftersom den resulterande regressionslinjen är förvrängd är måttet CR1-densitet inte längre korrekt. Det bör noteras att in vitro-lagring, hanteringsförhållanden och flerskiktad färgning leder till klustring av CR1 och en liten överskattning av antalet CR1-molekyler. Användningen av en anti-CR1-antikropp som riktar sig mot tre epitoper, såsom J3D3 med förstärkningssystemet, gör det dock möjligt att fullt ut utföra klustring, vilket möjliggör korrekt mätning av CR1-densitet39.
I själva verket minskar tätheten av CR1/E under livslängden för erytrocyt40. Detta skulle förklara heterogeniteten i tätheten av CR1/E i samma individ. Enligt vissa författare, intensiteten av katabolism av CR1 är inte korrelerad med den ursprungliga densiteten av CR1/E41, medan för andra författare, ju högre den ursprungliga densiteten, desto större intensitet katabolism42. Halveringstiden för CR1 på ytan av erytrocyter är 11-32 dagar42.
Den metod som presenteras här har flera fördelar. Den första är att tack vare flödescytometri kunna välja de cellsubpopulationer som ska studeras inom samma blodprov. Genom att välja erytrocytpopulationen med hjälp av gatefunktionen garanteras mätningen av erytrocyttätheten uteslutande. En bias i mätningen av erytrocyt CR1 orsakas av förekomsten av andra cellulära subpopulationer såsom vita blodkroppar undviks. Den andra fördelen med denna metod är att den är anpassningsbar till kvantifiering av andra cellulära receptorer vars densitet är låg genom att helt enkelt ersätta den primära anti-CR1-antikroppen med en antikropp som är specifikt riktad mot en epitop av den receptor som ska studeras. Det är också anpassningsbar till att använda 96 brunnsplattor istället för rörställ, vilket kräver lägre blod- och reagensvolymer25,38. Den tredje fördelen med denna metod är att den är flexibel. I studier om celler med en mycket hög densitet av CR1 till exempel humana lymfocyter (10 000 CR1/cell) eller icke-mänskliga primaterytrocyter vars CR1-densitet är 10–100 x större än för människor (10 000–100 000 CR1/cell)43,,44, är det möjligt att minska antalet skikt i förstärkningssystemet. med endast biotinylerad anti-CR1 monoklonal antikropp, fycoerythrin-streptavidin eller biotinylerad anti-CR1 monoklonal antikropp, biotinylerad antimusantikropp och fycoerythrin-streptavidin, vilket anpassar fluorescensnivån till den högre densiteten av CR1. Den fjärde fördelen med denna metod är att den kan användas för fasta eller frysta erytrocyter, vilket gör det möjligt att samla in blodprover i områden som saknar anläggningar för flödescytometri och lagras för senare exakt kvantifiering av CR138.
Mer allmänt, med de nya ljusare fluorokromer, verkar det inte längre obligatoriskt att använda systemet för indirekt förstärkning. Förutom, Det finns andra metoder som använder flöde cytometri som gör det möjligt att utvärdera densiteten hos cellulära receptorer och att kvantifiera den i måttenheter (dvs. ABC, eller antikroppar bindningsförmåga). ABC per cell kan också bestämmas med hjälp av mättande koncentrationer av antikroppar och kalibrerade pärlor. Flera kommersiella system finns tillgängliga. Vissa kit är förkalibrerade standard pärlor som innehåller kända nivåer av fluorokrom molekyler såsom PE bunden per pärla. De pärlor som förvärvats på en flödescytometer samma dag vid samma instrumentinställningar som de enskilda patientproverna gör det möjligt att rita en standardkurva som jämför fluorescensens geometriska medelvärde med kända PE-innehåll i pärlorna. Regressionsanalysen, lutnings-, skärningskoefficienten och korrelationskoefficienten bestäms och ABC-värdena beräknas utifrån den uppmätta geometriska medelfluorescensen hos celler med standardkurvan45,46.
En ytterligare typ av pärltest baseras på bindning av en antikropp konjugerad till pärlor med specifika antikroppsbindningskapacitetsnivåer via den kristalllizable delen av fragmentet (Fc). Pärlor är märkta med samma antikropp som används för att märka de celler vars antigendensitet ska mätas. Således, i ett enda experiment, kan alla konjugerade antikroppar användas, så länge som samma parti med samma fluorofore / proteinförhållande (F / P-förhållande) används för att färga både pärlor och celler47. Vissa kit är bättre för kvantitativ bestämning av cellytans antigener genom flödescytometri med indirekta immunofluorescensanalyser48,49.
Sammanfattningsvis har vår metod fördelen att ge mycket känslig detektion och att vara lätt att implementera på vanligt flöde cytometri material.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar alla medlemmar i URCACyt, flöde cytometri teknisk plattform, personalen vid institutionen för immunologi, och personalen vid institutionen för internmedicin och geriatrik, som bidragit till att optimera och validera protokollet. Detta arbete finansierades av Reims Universitetssjukhus (bidragsnummer AOL11UF9156).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1000E Barrier Tip | Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France | 2079E | sample pipetting |
| 1-100 µL Bevelled, filter tip | Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Germany | S1120-1840 | sample pipetting |
| Biotinylated anti-CR1 monoclonal antibody (J3D3) | Home production of non-commercial monoclonal antibody, courtesy of Dr J. Cook | immunostaining | |
| Blouse | protection | ||
| Bovin serum albumin (7,5%) | Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France | 15260037 | cytometry |
| Centrifuge | Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France | 11176917 | centrifugation |
| Clean Solution | BD, F-38801 Le Pont de Claix, France | 340345 | cytometry |
| Comorack-96 | Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath | 944060P | rack |
| Cytometer Setup & Tracking Beads Kit | BD, F-38801 Le Pont de Claix, France | 655051 | cytometry |
| Formaldehyde solution 36.5 % | Sigma Aldrich, F-38070 Saint Quentin Fallavier, France | F8775-25ML | Fixation |
| 10 µL Graduated, filter tip | Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Germany | S1121-3810 | sample pipetting |
| LSRFORTESSA Flow Cytometer | BD, F-38801 Le Pont de Claix, France | 647788 | cytometry |
| Microman Capillary Pistons | Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath | 067494 | sample pipetting |
| Micronic 1.40 mL round bottom tubes | Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath | MP32051 | mix |
| Micropipette Microman - type M25 - | Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath | 066379 | sample pipetting |
| Phosphate buffered Saline (PBS) | Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France | 10010031 | cytometry |
| Pipette PS 325 mm, 10 mL | Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath | 391952 | sample pipetting |
| powder-free Nitrile Exam gloves | Medline Industries, Inc, Mundelein, IL 60060, USA | 486802 | sample protection |
| Reference 2 pipette, 0,5-10 µL | Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France | 4920000024 | sample pipetting |
| Reference 2 pipette, 20-100 µL | Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France | 4920000059 | sample pipetting |
| Reference 2 pipette, 100-1000 µL | Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France | 4920000083 | sample pipetting |
| Rinse Solution | BD, F-38801 Le Pont de Claix, France | 340346 | cytometry |
| Round bottom tube | Sarstedt, F-70150 Marnay, France | 55.1579 | cytometry |
| Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France | 0030120086 | mix |
| streptavidin R-PE | Tebu Bio, F-78612 Le Perray-en-Yvelines, France | AS-60669 | immunostaining |
| Tapered Centrifuge Tubes 50 mL | Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France | 10203001 | mix |
| Vector anti streptavidin biotin | Eurobio Ingen, F-91953 Les Ulis, France | BA-0500 | immunostaining |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries, Inc, Bohemia, NY 111716, USA | SI-0236 | mix |
References
- Fearon, D. T. Identification of the membrane glycoprotein that is the C3b receptor of the human erythrocyte, polymorphonuclear leukocyte, B lymphocyte, and monocyte. Journal of Experimental Medicine. 152 (1), 20-30 (1980).
- Ross, G. D., Winchester, R. J., Rabellino, E. M., Hoffman, T. Surface markers of complement receptor lymphocytes. Journal of Clinical Investigation. 62 (5), 1086-1092 (1978).
- Reynes, M., et al. Human follicular dendritic cells express CR1, CR2, and CR3 complement receptor antigens. The Journal of Immunology. 135 (4), 2687-2694 (1985).
- Gasque, P., et al. Identification and characterization of complement C3 receptors on human astrocytes. The Journal of Immunology. 156 (6), 2247-2255 (1996).
- Pascual, M., et al. Identification of membrane-bound CR1 (CD35) in human urine: evidence for its release by glomerular podocytes. Journal of Experimental Medicine. 179 (3), 889-899 (1994).
- Fearon, D. T. Regulation of the amplification C3 convertase of human complement by an inhibitory protein isolated from human erythrocyte membrane. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (11), 5867-5871 (1979).
- Dobson, N. J., Lambris, J. D., Ross, G. D. Characteristics of isolated erythrocyte complement receptor type one (CR1, C4b-C3b receptor) and CR1-specific antibodies. The Journal of Immunology. 126 (2), 693-698 (1981).
- Schreiber, R. D., Pangburn, M. K., Muller-Eberhard, H. J. C3 modified at the thiolester site: acquisition of reactivity with cellular C3b receptors. Bioscience Reports. 1 (11), 873-880 (1981).
- Ross, G. D., et al. Generation of three different fragments of bound C3 with purified factor I or serum. II. Location of binding sites in the C3 fragments for factors B and H, complement receptors, and bovine conglutinin. Journal of Experimental Medicine. 158 (2), 334-352 (1983).
- Klickstein, L. B., Barbashov, S. F., Liu, T., Jack, R. M., Nicholson-Weller, A. Complement receptor type 1 (CR1, CD35) is a receptor for C1q. Immunity. 7 (3), 345-355 (1997).
- Ghiran, I., et al. Complement receptor 1/CD35 is a receptor for mannan-binding lectin. Journal of Experimental Medicine. 192 (12), 1797-1808 (2000).
- Cornacoff, J. B., et al. Primate erythrocyte-immune complex-clearing mechanism. Journal of Clinical Investigation. 71 (2), 236-247 (1983).
- Waxman, F. J., et al. Complement depletion accelerates the clearance of immune complexes from the circulation of primates. Journal of Clinical Investigation. 74 (4), 1329-1340 (1984).
- Waxman, F. J., et al. Differential binding of immunoglobulin A and immunoglobulin G1 immune complexes to primate erythrocytes in vivo. Immunoglobulin A immune complexes bind less well to erythrocytes and are preferentially deposited in glomeruli. Journal of Clinical Investigation. 77 (1), 82-89 (1986).
- Horgan, C., Taylor, R. P. Studies on the kinetics of binding of complement-fixing dsDNA/anti-dsDNA immune complexes to the red blood cells of normal individuals and patients with systemic lupus erythematosus. Arthritis & Rheumatology. 27 (3), 320-329 (1984).
- Pham, B. N., et al. Analysis of complement receptor type 1 expression on red blood cells in negative phenotypes of the Knops blood group system, according to CR1 gene allotype polymorphisms. Transfusion. 50 (7), 1435-1443 (2010).
- Wilson, J. G., et al. Identification of a restriction fragment length polymorphism by a CR1 cDNA that correlates with the number of CR1 on erythrocytes. Journal of Experimental Medicine. 164 (1), 50-59 (1986).
- Rodriguez de Cordoba, S., Rubinstein, P. Quantitative variations of the C3b/C4b receptor (CR1) in human erythrocytes are controlled by genes within the regulator of complement activation (RCA) gene cluster. Journal of Experimental Medicine. 164 (4), 1274-1283 (1986).
- Herrera, A. H., Xiang, L., Martin, S. G., Lewis, J., Wilson, J. G. Analysis of complement receptor type 1 (CR1) expression on erythrocytes and of CR1 allelic markers in caucasian and african american populations. Clinical Immunology and Immunopathology. 87 (2), 176-183 (1998).
- Birmingham, D. J., et al. A CR1 polymorphism associated with constitutive erythrocyte CR1 levels affects binding to C4b but not C3b. Immunology. 108 (4), 531-538 (2003).
- Dykman, T. R., Hatch, J. A., Aqua, M. S., Atkinson, J. P. Polymorphism of the C3b/C4b receptor (CR1): characterization of a fourth allele. The Journal of Immunology. 134 (3), 1787-1789 (1985).
- Moulds, J. M., Moulds, J. J., Brown, M., Atkinson, J. P. Antiglobulin testing for CR1-related (Knops/McCoy/Swain-Langley/York) blood group antigens: negative and weak reactions are caused by variable expression of CR1. Vox Sanguinis. 62 (4), 230-235 (1992).
- Cohen, J. H., Lutz, H. U., Pennaforte, J. L., Bouchard, A., Kazatchkine, M. D. Peripheral catabolism of CR1 (the C3b receptor, CD35) on erythrocytes from healthy individuals and patients with systemic lupus erythematosus (SLE). Clinical & Experimental Immunology. 87 (3), 422-428 (1992).
- Jouvin, M. H., Rozenbaum, W., Russo, R., Kazatchkine, M. D. Decreased expression of the C3b/C4b complement receptor (CR1) in AIDS and AIDS-related syndromes correlates with clinical subpopulations of patients with HIV infection. AIDS. 1 (2), 89-94 (1987).
- Waitumbi, J. N., Donvito, B., Kisserli, A., Cohen, J. H., Stoute, J. A. Age-related changes in red blood cell complement regulatory proteins and susceptibility to severe malaria. The Journal of Infectious Diseases. 190 (6), 1183-1191 (2004).
- Mahmoudi, R., et al. Alzheimer's disease is associated with low density of the long CR1 isoform. Neurobiology of Aging. 36 (4), 5-12 (2015).
- Mahmoudi, R., et al. Inherited and Acquired Decrease in Complement Receptor 1 (CR1) Density on Red Blood Cells Associated with High Levels of Soluble CR1 in Alzheimer's Disease. International Journal of Molecular Sciences. 19 (8), 2175 (2018).
- Zaitsev, S., et al. Human complement receptor type 1-directed loading of tissue plasminogen activator on circulating erythrocytes for prophylactic fibrinolysis. Blood. 108 (6), 1895-1902 (2006).
- Scatchard, G. The attractions of proteins for small molecules and ions. Annals of the New York Academy of Sciences. 51 (4), 660-672 (1949).
- Cohen, J. H., et al. Enumeration of CR1 complement receptors on erythrocytes using a new method for detecting low density cell surface antigens by flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 99 (1), 53-58 (1987).
- Minota, S., et al. Low C3b receptor reactivity on erythrocytes from patients with systemic lupus erythematosus detected by immune adherence hemagglutination and radioimmunoassays with monoclonal antibody. Arthritis & Rheumatology. 27 (12), 1329-1335 (1984).
- Miyakawa, Y., et al. Defective immune-adherence (C3b) receptor on erythrocytes from patients with systemic lupus erythematosus. The Lancet. 2 (8245), 493-497 (1981).
- Lida, K., Mornaghi, R., Nussenzweig, V. Complement receptor (CR1) deficiency in erythrocytes from patients with systemic lupus erythematosus. Journal of Experimental Medicine. 155 (5), 1427-1438 (1982).
- Tao, K., Nicholls, K., Rockman, S., Kincaid-Smith, P. Expression of complement 3 receptors (CR1 and CR3) on neutrophils and erythrocytes in patients with IgA nephropathy. Clinical Nephrology. 32 (5), 203-208 (1989).
- Nickells, M., et al. Mapping epitopes for 20 monoclonal antibodies to CR1. Clinical and Experimental Immunology. 112 (1), 27-33 (1998).
- Oi, V. T., Glazer, A. N., Stryer, L. Fluorescent phycobiliprotein conjugates for analyses of cells and molecules. The Journal of Cell Biology. 93 (3), 981-986 (1982).
- Chaiet, L., Wolf, F. J. The properties of streptavidin, a biotin-binding protein produced by streptomyces. Archives of Biochemistry and Biophysics. 20 (106), 1-5 (1964).
- Cockburn, I. A., Donvito, B., Cohen, J. H., Rowe, J. A. A simple method for accurate quantification of complement receptor 1 on erythrocytes preserved by fixing or freezing. Journal of Immunological Methods. 20 (271), 59-64 (2002).
- Chen, C. H., et al. Antibody CR1-2B11 recognizes a non-polymorphic epitope of human CR1 (CD35). Clinical & Experimental Immunology. 148 (3), 546-554 (2007).
- Ripoche, J., Sim, R. B. Loss of complement receptor type 1 (CR1) on ageing of erythrocytes. Studies of proteolytic release of the receptor. Biochemical Journal. 235 (3), 815-821 (1986).
- Moldenhauer, F., Botto, M., Walport, M. J. The rate of loss of CR1 from ageing erythrocytes in vivo in normal subjects and SLE patients: no correlation with structural or numerical polymorphisms. Clinical & Experimental Immunology. 72 (1), 74-78 (1988).
- Cohen, J. H., Lutz, H. U., Pennaforte, J. L., Bouchard, A., Kazatchkine, M. D. Peripheral catabolism of CR1 (the C3b receptor, CD35) on erythrocytes from healthy individuals and patients with systemic lupus erythematosus (SLE). Clinical & Experimental Immunology. 87 (3), 422-428 (1992).
- Nickells, M. W., Subramanian, V. B., Clemenza, L., Atkinson, J. P. Identification of complement receptor type 1-related proteins on primate erythrocytes. The Journal of Immunology. 154 (6), 2829-2837 (1995).
- Hebert, L. A., Birmingham, D. J., Shen, X. P., Cosio, F. G. Stimulating erythropoiesis increases complement receptor expression on primate erythrocytes. Clinical Immunology and Immunopathology. 62 (3), 301-306 (1992).
- Davis, K. A., Abrams, B., Iyer, S. B., Hoffman, R. A., Bishop, J. E. Determination of CD4 antigen density on cells: Role of antibody valency, avidity, clones, and conjugation. Cytometry. 33 (2), 197-205 (1998).
- Pannu, K. K., Joe, E. T., Iyer, S. B. Performance evaluation of QuantiBRITE phycoerythrin beads. Cytometry. 45 (4), 250-258 (2001).
- Barnett, D., Storie, I., Wilson, G. A., Granger, V., Reilly, J. T. Determination of leucocyte antibody binding capacity (ABC): the need for standardization. Clinical Laboratory Haematology. 20 (3), 155-164 (1998).
- Bikoue, A., et al. Quantitative analysis of leukocyte membrane antigen expression: normal adult values. Cytometry. 26 (2), 137-147 (1996).
- Serke, S., van Lessen, A., Huhn, D. Quantitative fluorescence flow cytometry: a comparison of the three techniques for direct and indirect immunofluorescence. Cytometry. 33 (2), 179-187 (1998).
