Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Messung des Erythrozytenkomplementrezeptors 1 mit Durchflusszytometrie

Published: May 19, 2020 doi: 10.3791/60810
Automatic Translation
1,2, 3, 2,4, 2,4, 2, 5,6
1Oncogeriatric Coordination Unit, Reims University Hospitals, Maison Blanche Hospital, 2Faculty of Medicine, University of Reims Champagne-Ardenne, 3URCACyt, Flow cytometry technical platform, University of Reims Champagne-Ardenne, 4Department of Immunology, Reims University Hospitals, Robert Debre Hospital, 5Department of Internal Medicine and Geriatrics, Reims University Hospitals, Maison Blanche Hospital, 6Faculty of Medicine, University of Reims Champagne-Ardenne

Summary

Das Ziel dieser Methode ist es, die CR1-Dichte in den Erythrozyten eines jeden Probanden zu bestimmen, indem man mit drei Probanden vergleicht, deren Erythrozyten-CR1-Dichte bekannt ist. Die Methode verwendet Durchflusszytometrie nach Immunfärbung der Erythrozyten der Probanden durch einen monoklonalen Anti-CR1-Antikörper, der mit einem verstärkten System mit Phycoerythrin (PE) gekoppelt ist.

Abstract

CR1 (CD35, Komplementrezeptor Typ 1 für C3b/C4b) ist ein hochmolekulares Membranglykoprotein von etwa 200 kDa, das die Komplementaktivierung steuert, Immunkomplexe transportiert und an humoralen und zellulären Immunreaktionen teilnimmt. CR1 ist auf der Oberfläche vieler Zelltypen vorhanden, einschließlich Erythrozyten, und weist Polymorphismen in Länge, Struktur (Knops oder KN, Blutgruppe) und Dichte auf. Die durchschnittliche Dichte von CR1 pro Erythrozyten (CR1/E) beträgt 500 Moleküle pro Erythrozyten. Diese Dichte variiert von Individuum zu Individuum (100–1.200 CR1/E) und von einem Erythrozyten zum anderen in demselben Individuum. Wir präsentieren hier eine robuste Durchflusszytometrie-Methode zur Messung der Dichte von CR1/E, auch bei Probanden, die eine geringe Dichte ausdrücken, mit Hilfe eines amplifizierenden Immunstainierungssystems. Diese Methode hat es uns ermöglicht, die Senkung der CR1-Erythrozytenexpression bei Krankheiten wie Alzheimer (AD), systemischem Lupus erythematodes (SLE), AIDS oder Malaria zu zeigen.

Introduction

CR1 (Komplementrezeptor Typ 1, CD35) ist ein 200 kDa Transmembran-Glykoprotein auf der Oberfläche vieler Zelltypen, wie Erythrozyten1, B-Lymphozyten2, monozytäre Zellen, einige T-Zellen, follikuläre dendritische Zellen3, fetale Astrozyten4und glomeruläre Podozyten5. CR1 stört seine Liganden C3b, C4b, C3bi6,7,8,9, eine Untereinheit der ersten Komplementkomponente, C1q10 und MBL (mannan-binding lectin)11 hemmt die Aktivierung der Komplementierung und ist an der humoralen und zellulären Immunantwort beteiligt.

Bei Primaten, einschließlich Menschen, ist Erythrozyten CR1 am Transport von Immunkomplexen zur Leber und Milz beteiligt, um das Blut zu reinigen und ihre Ansammlung in empfindlichen Geweben wie der Haut oder den Nieren zu verhindern12,13,14. Dieses Phänomen der Immunhaftung zwischen Immunkomplexen und Erythrozyten hängt von der Anzahl der CR1-Moleküle15ab. Beim Menschen beträgt die mittlere Dichte von CR1/E nur 500 (d.h. 500 Moleküle von CR1 pro Erythrozyten). Diese Dichte variiert von Individuum zu Individuum (100–1.200 CR1/E) und von einem Erythrozyten zum anderen in demselben Individuum. Einige Personen des "Null"-Phänotyps drücken weniger als 20 CR1/E16aus.

Die Dichte von CR1/E wird durch zwei ko-dominante autosomale Allele reguliert, die mit einer Punktmutation in Intron 27 des Genkodierungsmittels für CR1*117,18verbunden sind. Diese Mutation erzeugt eine zusätzliche Restriktionsstelle für das HindIII-Enzym. Die Restriktionsfragmente, die nach der Verdauung mit HindIII erhalten wurden, sind 7,4 kb für das Allel, das mit einem starken Ausdruck von CR1 (H: hohes Allel) verbunden ist, und 6,9 kb für das Allel, das mit einem niedrigen CR1-Ausdruck verbunden ist (L: niedriges Allel). Diese Verbindung findet sich bei Kaukasiern und Asiaten, aber nicht bei Menschen afrikanischer Abstammung19.

Der Ausdrucksgrad von Erythrozyten CR1 korreliert auch mit dem Vorhandensein von Punktnukleotidmutationen in exon 13 Codierung SCR 10 (I643T) und in exon 19 Codierung SCR16 (Q981H). Es ist hoch in homozygoten 643I/981Q und niedrig in homozygoten 643T/981H Personen20. So drücken "niedrige" Individuen etwa 150 CR1/E aus, "mittlere" Individuen etwa 500 CR1/E und "hohe" Individuen etwa 1.000 CR1/E.

Zusätzlich zu diesem Erythrozytendichtepolymorphismus zeichnet sich CR1 durch einen Längenpolymorphismus aus, der vier Allotypen unterschiedlicher Größen entspricht: CR1*1 (190 kDa), CR1*2 (220 kDa), CR1*3 (160 kDa) und CR1*4 (250 kDa)21 und ein antigener Polymorphismus, der der Blutgruppe KN22entspricht.

Wir stellen unsere Methode auf der Grundlage der Durchflusszytometrie vor, um die Dichte von CR1/E zu bestimmen. Mit einem niedrigen Dichtegrad (180 CR1/E), einer mittleren Dichte (646 CR1/E) und einer hohen Dichte (966 CR1/E) ist es einfach, die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) ihrer Erythrozyten oder roten Blutkörperchen (RBC) oder RBC MFI nach Anti-CR1-Immunfärbung mit einem Durchflusszytometer zu messen. Man kann dann eine Standardlinie darstellen, die das MFI als Funktion der CR1/E-Dichte darstellt. Durch messung des MFI von Probanden, deren CR1/E-Dichte nicht bekannt ist, und vergleicht man es mit dieser Standardlinie, ist es möglich, die CR1/E-Dichte der Individuen zu bestimmen. Diese Technik wird seit vielen Jahren im Labor verwendet, und hat es uns ermöglicht, eine Verringerung der Expression von Erythrozyten CR1 in vielen Pathologien wie systemische Lupus erythematodes (SLE)23, Erworbene Immundefizienz-Syndrom (AIDS)24, Malaria25, und vor kurzem Alzheimer-Krankheit (AD)26,27. Die Entwicklung von Medikamenten, die auf CR1 abzielen, um sich mit Erythrozyten zu paaren, wie im Fall von Antithrombotika28 erfordert die Bewertung der CR1/E-Dichte und die Verfügbarkeit einer robusten Technik zur Quantifizierung von CR1.

Das vorgestellte Protokoll läuft in singlicate. Es ist anpassungsfähig, um die Dichte von CR1/E bei vielen Individuen mit spezifischen handelsüblichen 96 Brunnenplatten zu bestimmen (siehe Tabelle der Materialien). Zu diesem Zweck ist es einfach, unsere Methode an jede 96-Well-Platte anzupassen. Für jede Probe wird eine Zellsuspension von Erythrozyten (0,5 x 106–1 x 106 Erythrozyten) pro Brunnen verteilt. Für jeden Brunnen wird zunächst der primäre Anti-CR1-Antikörper hinzugefügt, dann Streptavidin PE, der sekundäre Anti-Streptavidin-Antikörper, und wieder Streptavidin PE, wobei die gleichen Verdünnungen wie die unserer Methode verwendet werden, aber durch Anpassung der Volumina und die Wahrung der Verhältnismäßigkeit.

Die Blutproben von Probanden des Bereichs und von Probanden, die für CR1 quantifiziert werden sollen, sollten gleichzeitig gezogen, bei 4 °C im Kühlschrank gelagert und bei 4 °C behandelt werden (auf Eis und/oder im Kühlschrank).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Das Protokoll zur Entnahme und Handhabung von menschlichem Blut wurde von der regionalen Ethikkommission (CPP Est II) überprüft und genehmigt, und die Protokollnummer lautet 2011-A00594-37. Da das folgende Protokoll den Umgang mit menschlichem Blut beschreibt, sollten institutionelle Richtlinien für die Entsorgung von biogefährlichem Material befolgt werden. Laborsicherheitsgeräte wie Labormäntel und Handschuhe sollten getragen werden.

1. Erythrozytenwaschen

HINWEIS: Bereiten Sie am Tag vor der Handhabung einen PBS-BSA-Puffer mit Phosphatgepufferter Kochsaline (PBS) vor, der 0,15 % Rinderserumalbumin (BSA) enthält, und legen Sie ihn bei 4 °C in den Kühlschrank. Dieser Puffer wird als Waschpuffer und als Verdünnungspuffer verwendet.

  1. Pipette 20 ml PBS-BSA in ein 50 ml Rohr.
  2. Aspirieren Sie 250 l Natriumethylendiamintetraessigsäure (EDTA) antikoaguliert Vollblut aus Blutspeicherröhrchen und fügen Sie in die Röhre mit den 20 ml PBS-BSA. Schließen Sie das Rohr, indem Sie die Kappe verschrauben. Mischen Sie sanft, indem Sie das Rohr 2x invertieren.
  3. Zentrifugieren Sie das Rohr für 10 min bei 4 °C bei 430 x g. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand mit einer 10 ml Pipette. Setzen Sie das Pellet im Restvolumen des Überstandes durch sanftes und sorgfältiges Pipettieren wieder auf.
  4. 20 ml kalte PBS-BSA (4 °C) in das Rohr geben, das das Pellet enthält. Zentrifugieren Sie das Rohr für 10 min bei 4 °C bei 430 x g. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand mit einer 10 ml Pipette.
  5. 20 ml kalte PBS-BSA (4 °C) in das Rohr geben, das das Pellet enthält. Zentrifugieren Sie das Rohr für 10 min bei 4 °C bei 430 x g. Lassen Sie das Rohr in der Zentrifuge bei 4 °C und gehen Sie zu Abschnitt 2.

2. Erythrozytenverdünnung

  1. 3 ml kalte PBS-BSA in ein 50 ml Rohr geben und bei 4 °C auf einem Rack in Eis lagern.
  2. Legen Sie das Zentrifugenrohr mit den Erythrozyten (Schritt 1.4) auf ein in Eis gelegtes Rack.
  3. Pipette 8 l pelletierte Erythrozyten mit der Pipette und fügen Sie dem 50 ml Rohr, das die 3 ml PBS-BSA enthält, die Erythrozytenverdünnung zu erhalten. Mischen Sie das Rohr vorsichtig von Hand, um eine homogene Zellsuspension von Erythrozyten zu erhalten.

3. Erythrozyten-Immunostainierung

  1. Pipette 100 l Erythrozytenverdünnung (in Abschnitt 4 erhalten) und zu 1,4 ml Röhren hinzufügen.
  2. Zentrifugieren Sie die Rohre für 5 min bei 4 °C bei 430 x g. Bereiten Sie während der Zentrifugation eine Verdünnung des biotinylierten Anti-CR1 J3D3-Antikörpers in einer Konzentration von 0,05 g/l im PBS-BSA-Puffer vor.
  3. Sobald die Zentrifugation abgeschlossen ist, entfernen und entsorgen Sie den Überstand.
  4. Fügen Sie 20 L biotinylierte anti-CR1 J3D3 direkt in das Pellet. Um den Negativ-Control vorzubereiten, fügen Sie stattdessen 20 L DES PBS-BSA-Puffers hinzu. Mischen Sie die Schläuche sanft und brüten Sie 45 min bei 4 °C.
  5. Nach 45 min Inkubation 750 l PBS-BSA in die Rohre geben. Zentrifugieren Sie die Rohre für 5 min bei 4 °C bei 430 x g. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand. Wiederholen.
  6. In der Zwischenzeit eine 1:10 Verdünnung von Streptavidin-Phycoerythrin im PBS-BSA-Puffer verdünnt vorbereiten. Pipette 20 l der 1:10 Verdünnung von Streptavidin-Phycoerythrin und in die Schläuche geben. Mischen Sie die Schläuche sanft und brüten Sie 45 min bei 4 °C.
  7. Fügen Sie 750 L PBS-BSA-Puffer in die Rohre ein. Gut mischen und Zentrifugen 5 min bei 4 °C bei 430 x gmischen. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand. Wiederholen.
  8. Während der Zentrifugation eine 1:100 Verdünnung des biotinylierten Anti-Streptavidin-Antikörpers vorbereiten, der im PBS-BSA-Puffer verdünnt ist.
  9. Sobald die Zentrifugation abgeschlossen ist, entfernen und entsorgen Sie den Überstand.
  10. Pipette 20 l der 1:100 Verdünnung von biotinyliertem Anti-Streptavidin in die Rohre. Mischen Sie die Rohre sanft. Inkubieren Sie die Rohre für 45 min bei 4 °C.
  11. Nach 45 min Inkubation, Pipette 750 l PBS-BSA Puffer und in die Rohre geben. Zentrifugieren Sie die Rohre für 5 min bei 4 °C bei 430 x g. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand. Wiederholen.
  12. Pipette 20 l der 1:10 Verdünnung von Streptavidin-Phycoerythrin und in die Schläuche geben. Mischen Sie die Rohre sanft. Inkubieren Sie die Rohre für 45 min bei 4 °C.
  13. Pipette 750 l PBS-BSA Puffer und in die Rohre geben. Die Rohre gut mischen und zentrifugieren für 5 min bei 4 °C bei 430 x g. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand. Wiederholen Sie diesen Schritt 2x.

4. Immunostainierte Erythrozytenfixierung

  1. Während der letzten Zentrifugation den Fixationspuffer vorbereiten, eine 1:100 Verdünnung von 37% Formaldehyd mit dem Waschpuffer PBS-BSA.
  2. Pipette 450 l Fixationspuffer und in immunostainierte Erythrozytenröhren (ab Schritt 3.13) geben, während sie für 5 s wirbeln.
  3. Alle festen Zellen in 5 ml runde Bodenrohre zersiekern und im Kühlschrank aufbewahren.
    HINWEIS: Das Protokoll kann hier für bis zu 48 h angehalten werden.

5. Durchflusszytometrie-Analyse von gefärbten Erythrozyten

HINWEIS: Es ist ratsam, sich auf das Bedienungshandbuch für das Zytometer (siehe Materialtabelle) zu beziehen, um zu wissen, wie die zytometrischen Messwerte durchgeführt werden. Die folgenden Parameter werden für das verwendete Instrument verwendet und müssen für jedes Zytometer optimiert werden.

  1. Schalten Sie das Durchflusszytometer ein, und schalten Sie dann den Computer ein. Lassen Sie die Temperatur des optischen Systems stabilisieren, indem Sie sie 30 min eingeschaltet lassen. Überprüfen Sie das Zytometerfenster in der Software, um sicherzustellen, dass das Zytometer mit dem Arbeitsplatz verbunden ist (die Meldung Cytometer Connected wird angezeigt).
  2. Überprüfen Sie, ob der Pufferbehälter voll ist und dass der Abfallbehälter leer ist. Entfernen Sie Luftblasen im Pufferfilter und in der Pufferlinie mithilfe des Spülsystems. Primieren Sie das Fluidiksystem, indem Sie die Prime-Taste an der Konsole des Zytometers drücken. Warten Sie, bis die Kontrollleuchte von rot auf grün wechselt.
  3. Um die Fluidik zu reinigen, installieren Sie ein Rohr mit 3 ml einer Reinigungslösung am Probeninjektionsanschluss und lassen Sie die Reinigungslösung 5 min mit einer hohen Probendurchflussrate laufen. Wiederholen Sie dies mit der Spüllösung mit destilliertem Wasser. Lassen Sie das Rohr mit Wasser auf dem Probeninjektionsanschluss.
  4. Zur Vorbereitung der Kalibrierperlen, Pipette 400 L PBS in den Boden eines runden Bodenrohrs. Mischen Sie die Perlenbestände stark, indem Sie für 30 s wirbeln. Fügen Sie einen Tropfen auf das runde Unterrohr mit PBS. Mischen Sie sorgfältig durch Wirbeln für 30 s.
  5. Führen Sie die Leistungsprüfung aus. Öffnen Sie das Modul Für das Zytometer-Setup und -Tracking in der Software ( Abbildung1A). Stellen Sie sicher, dass die Zytometerkonfiguration für das Experiment mit PE-Immunostainierung korrekt ist. Stellen Sie sicher, dass die kalibrierende Perlencharge mit der Konfiguration korrekt ist.
  6. Installieren Sie das Perlenrohr am Probeninjektionsanschluss und lassen Sie es mit einer niedrigen Abtastdurchflussrate laufen. Führen Sie die Leistungsprüfung aus, die ca. 5 min dauert). Überprüfen Sie nach Abschluss der Leistungsprüfung, ob die Zytometerleistung zufriedenstellend ist (Abbildung 1B). Schließen Sie das Cytometer-Setup- und Tracking-Modul in der Software.
  7. Um ein Experiment einzurichten und Anwendungseinstellungen zu erstellen, klicken Sie auf der Browsersymbolleiste auf die Schaltfläche Neues Experiment, und öffnen Sie das neue Experiment. Geben Sie die Parameter an, indem Sie die entsprechenden Zytometereinstellungen auswählen: Forward Scatter (FSC), Side Scatter (SSC) und PE aus dem Dropdown-Menü des Experiments (Abbildung 1C). Wählen Sie Linearmodus für FSC-Parameter und Logarithmusmodus für SSC- und PE-Parameter aus.
  8. Wählen Sie im offenen Experiment Cytometer-Einstellungen (Abbildung 1D) aus, wählen Sie dann Anwendungseinstellungenaus, und erstellen Sie ein globales Arbeitsblatt (Abbildung 1E). Verwenden Sie die grauen Kästchen und Fadenkreuze, um die Optimierung zu leiten.
  9. Laden Sie das ungefärbte Steuerrohr auf das Zytometer und führen Sie Acquisitionaus. Stellen Sie sicher, dass die Interessenspopulation (d. h. RBCs) skaliert wird, indem Sie die FSC- und SSC-Spannungen optimieren. Optimieren Sie den FSC-Schwellenwert, um Schmutz zu beseitigen, ohne die Interessenpopulation zu beeinträchtigen.
  10. Zeichnen Sie ein Tor um die RBCs auf dem FSC vs. SSC-Plot. Zeigen Sie die RBC-Population im Punktdiagramm der PE-Fluoreszenz an. Erhöhen Sie bei Bedarf die Fluoreszenz der Photomultiplier-Rohrspannungen (PMT), um die negative Population in den grauen Feldern zu platzieren. Entladen Sie das ungefärbte Steuerrohr aus dem Zytometer.
  11. Stellen Sie sicher, dass die positiven Populationen auf der Skala sind. Laden Sie das gebeizte Steuerrohr auf das Zytometer und führen Sie Acquisition aus. Senken Sie die PMT-Spannung für die positive Population, wenn sie nicht skaliert ist, bis die positive Population vollständig in der Skala zu sehen ist. Dann entladen Sie die gefärbte Probe.
  12. Um Beispiele aufzuzeichnen und zu analysieren, erstellen Sie in einem neuen globalen Arbeitsblatt die folgenden Diagramme für die Vorschau der Daten: 1) FSC vs. SSC und 2) PE-Fluoreszenzhistogramm. Laden Sie die erste Probe auf das Zytometer, und führen Sie Acquisition aus.
  13. Zeichnen Sie ein RBC-Tor um die Erythrozyten auf dem FSC vs. SSC-Plot. Zeigen Sie die RBC-Population im PE-Fluoreszenz-Histogramm an. Wählen Sie in der Statistikansicht den Mittelwert für PE-Fluoreszenzparameter für GR-Populationen aus (Abbildung 1F).
  14. Wählen Sie im Erfassungs-Dashboard alle Ereignisse im Stoppgate und 10.000 Ereignisse aus, die aufzeichnen sollen (Abbildung 1G). Klicken Sie auf Datensatzdaten. Wenn die Ereignisaufzeichnung abgeschlossen ist, entfernen Sie das erste Rohr aus dem Zytometer. Die globalen Arbeitsblattdiagramme sollten wie die in Abbildung 2aussehen.
  15. Laden Sie die folgenden Beispiele, und zeichnen Sie sie auf.

6. Bestimmung der Dichte von Erythrozyten CR1

  1. Nehmen wir die Werte der mittleren Fluoreszenzintensitäten der Proben, die dem "niedrigen" Thema entsprechen (Abbildung 3, Tabelle I, RBC MFI), "mittleres" Thema ( Abbildung4, Tabelle D, RBC MFI), "hoher" Betreff ( Abbildung4, Tabelle I, RBC MFI) und der Negativkontrollstichprobe ( Abbildung3, Tabelle I, RBC MFI).
  2. Platzieren Sie in einem Diagramm, das die mittlere Fluoreszenzintensität in Abhängigkeit von der Dichte von CR1 darstellt, die vier Punkte, die dem Negativkontroll, dem "niedrigen" Subjekt, dem "mittleren" Subjekt und dem "hohen" Subjekt entsprechen (blaue Punkte, Abbildung 6).
  3. Zeichnen Sie die Regressionslinie, um die Kalibrierungslinie und ihre Gleichung zu erhalten.
  4. Nehmen Wir die Werte der mittleren Fluoreszenzintensität der Proben, die den Probanden entsprechen, deren Dichte zu bestimmen ist. (Abbildung 5, Tabellen D und I, RBC MFI).
  5. Erhalten Sie die Gleichung, indem Sie "Y" durch die Werte der mittleren Fluoreszenzintensitäten ersetzen, und berechnen Sie die Dichte von CR1/E (Abbildung 6).
  6. Überprüfen Sie im Diagramm, ob die mittleren Fluoreszenzintensitätswerte und die ermittelte CR1/E-Dichte einem Punkt auf der Kalibrierlinie entsprechen (Abbildung 6).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Die Erythrozyten von drei Probanden, deren CR1-Dichte bekannt ist ("niedriges" Subjekt [180 CR1/E], "mittleres" Subjekt [646 CR1/E] und "hohes" Subjekt [966 CR1/E]) und von zwei Probanden, deren CR1-Dichte bestimmt werden musste, wurden durch einen Anti-CR1-Antikörper immunisiert, der mit einem Amplifikationssystem gekoppelt war, das den Phycoerythrin Fluor chrom verwendete. Zu Beginn wurde die CR1-Dichte der Probanden aus dem niedrigen Bereich durch die Scatchard-Methode29 mit radioaktiv markierten Antikörpern bestimmt. Die ermittelten Standards (niedrig, mittel und hoch) wurden für eine Kalibrierkurve verwendet und ermöglichten die Quantifizierung neuer Standards oder Unterstandards nach unserer Zytometriemethode30. Nach dem Durchgang immunobefleckter Erythrozyten im Durchflusszytometer wurde die Intensität der Etikettierung beobachtet und als mittlere Fluoreszenzintensität für jedes Subjekt (RBC MFI) gemessen (Abbildung 3F,I; Abbildung 4B,D,F,I; Abbildung 5B,D,F,I). Eine Kurve wurde unter Verwendung der Werte der Probanden mit der bekannten Dichte von Erythrozyten CR1 ("niedrig" bis "hoch") gezeichnet, indem sie als Funktion der mittleren Fluoreszenzintensität gemeldet wurde. Vergleich der Regressionslinie, die sich aus dieser Kurve ergibt, mit den Werten der mittleren Fluoreszenzintensität der anderen Probanden ermittelte ihre CR1/E-Dichte (Abbildung 6). Abbildung 7 zeigt den gesamten Workflow.

Figure 1
Abbildung 1: Zytometerkonsole und Fenster, die während des Flow-Zytometrieprotokolls angezeigt werden. (A) Fenster, das nach der Anwendung von Schritt 5.5 des Protokolls erscheint. (B) Fenster, das nach der Anwendung von Schritt 5.6 des Protokolls erscheint. (C) Fenster, das nach der Anwendung von Schritt 5.7 des Protokolls erscheint. (D) Fenster, das nach der Anwendung von Schritt 5.8 des Protokolls erscheint. (E) Fenster, das nach der Anwendung von Schritt 5.8 des Protokolls erscheint. (F) Fenster, das nach der Anwendung von Schritt 5.13 des Protokolls erscheint. (G) Fenster, das nach der Anwendung von Schritt 5.14 des Protokolls erscheint. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Darstellung der globalen Arbeitsblattanalyseobjekte. Darstellung der globalen Arbeitsblattanalyseobjekte nach der Anwendung von Schritt 5.14 des Protokolls. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Ergebnisse der Durchflusszytometrie-Analyse der Anti-CR1-Immunfärbung von Erythrozyten, die der Negativen Kontrolle entsprechen, und dem Subjekt aus dem Bereich ("niedriges" Subjekt), das die LOW CR1-Dichte (180 CR1/E) ausdrückte. Für jedes Thema: (A,E) ein Punktfleck, der das Aussehen von Ereignissen zeigt, die nach der Größe und den Granulatometrieparametern erworben wurden, (G) das Tor, das die Erythrozytenpopulation unter den Ereignissen auswählt, (B,F) ein Histogramm, das die Intensität der Beschriftung darstellt, (C,H) eine zugeordnete statistische Tabelle, die die Anzahl der Ereignisse darstellt, die den Erythrozyten entsprechen, und deren Prozentsatz, (D,I) eine zugeordnete Tabelle mit der mittleren Fluoreszenzintensität (RBC MFI). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Ergebnisse der Durchflusszytometrie-Analyse der Anti-CR1-Immunfärbung von Erythrozyten, die den Probanden aus dem Bereich entsprechen: "mittleres" Subjekt, das MEDIUM CR1-Dichte (646 CR1/E) und "hohe" Probanden ausdrückte, die HOHE CR1-Dichte (966 CR1/E) ausdrückten. Für jedes Thema: (A, E) ein Punktfleck, der das Aussehen von Ereignissen zeigt, die nach der Größe und den Granulatometrieparametern erworben wurden, (G) das Tor, das die Erythrozytenpopulation unter den Ereignissen auswählt, (B, F) ein Histogramm, das die Intensität der Beschriftung darstellt, (C, H) eine zugeordnete statistische Tabelle, die die Anzahl der Ereignisse darstellt, die den Erythrozyten entsprechen, und deren Prozentsatz, (D, I) eine zugeordnete Tabelle mit der mittleren Fluoreszenzintensität (RBC MFI). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: Ergebnisse der Durchflusszytometrieanalyse der Anti-CR1-Immunfärbung von Erythrozyten entsprechend den Probanden, deren CR1-Dichte zu bestimmen war. Für jedes Thema: (A, E) ein Punktfleck, der das Aussehen von Ereignissen zeigt, die nach der Größe und den Granulatometrieparametern erworben wurden, (G) das Tor, das die Erythrozytenpopulation unter den Ereignissen auswählt, (B, F) ein Histogramm, das die Intensität der Beschriftung darstellt, (C, H) eine zugeordnete statistische Tabelle, die die Anzahl der Ereignisse darstellt, die den Erythrozyten entsprechen, und deren Prozentsatz, (D, I) eine zugeordnete Tabelle mit der mittleren Fluoreszenzintensität (RBC MFI). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 6
Abbildung 6: Kalibrierkurve und Regressionslinie, die die Bestimmung der CR1-Dichte ermöglicht. (A), (B) Kalibrierkurve und Regressionslinie, gezeichnet nach der bekannten CR1-Dichte der Bereichssubjekte (negative Kontrolle: 0 CR1, "niedriges" Subjekt [180 CR1/E], "mittleres" Subjekt [646 CR1/E] und "hoher" Subjekt [966 CR1/E]) und ihre jeweiligen Werte der mittleren Fluoreszenzintensität, die durch Durchflusszytometrie erreicht werden. (C), (D) Aus der Gleichung dieser Regressionslinie haben wir die Dichte von Erythrozyten CR1 für Probanden berechnet, deren mittlere Fluoreszenzintensität durch Durchflusszytometrie quantifiziert wurde: orange Pfeile, Subjekt 1 (mittlere Fluoreszenzintensität = 1.334; CR1/E-Dichte = 459) und Subjekt 2 (mittlere Fluoreszenzintensität = 2820; CR1/E-Dichte = 1.000). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 7
Abbildung 7: Flussdiagramm des Protokolls zur Bestimmung der Erythrozyten-CR1-Dichte aus menschlichen Blutproben. Sammeln Sie eine menschliche Blutprobe. Waschen Sie die menschliche Blutprobe durch Zentrifugation, um Erythrozyten zu erhalten. Färben Sie die Erythrozyten mit einem Anti-CR1-Antikörper. Verwenden Sie die Durchflusszytometrie, um die Erythrozyten-CR1-Dichte gemäß einer Kalibrierkurve zu bestimmen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Zur Bestimmung der Dichte von Erythrozyten CR1 (CR1/E) stehen verschiedene Techniken zur Verfügung. Die ersten verwendeten Techniken waren die Agglutination roter Blutkörperchen durch Anti-CR1-Antikörper31 und die Bildung von Rosetten in Gegenwart von Erythrozyten, die mit C3b32beschichtet sind. Diese rudimentären Techniken wurden schnell durch Immunstaining-Methoden mit radioaktiv markierten Anti-CR1-Antikörpern1,33ersetzt. Es ist auch möglich, die Konzentration von CR1 in Membranextrakten durch enzymgebundenen Immunsorbent Assay (ELISA)34zu messen. Obwohl diese Techniken genau sind, liefern sie nur einen Durchschnittswert der CR1/E-Dichte. Die Verteilung der CR1/E-Dichte auf die gesamte Erythrozytenpopulation ist nur durch zytometrische Flussanalyse nach Immunfärbung verfügbar. Diese Technik ist aufgrund der geringen Dichte von CR1/E schwierig. Dennoch ermöglicht eine Verstärkungsmethode nun die einfache Messung der Dichte von CR1/E30.

Hier stellen wir eine Methode zur Quantifizierung von CR1/E durch Durchflusszytometrie auf der Grundlage der Amplifikation des Fluoreszenzsignals immunobefleckter Zellen vor. Das Amplifikationssystem umfasst vier aufeinander folgende Färbeschichten mit dem biotinylierten monoklonalen Anti-CR1-Antikörper J3D3; Phycoerythrin-Streptavidin; ein biotinylierter Ziegenanti-Streptavidin-Antikörper; und wieder Phycoerythrin-Streptavidin. J3D3 erkennt drei antigene Standorte auf CR135, wenn auch nicht mehr als eine gleichzeitig. Der biotinylierte Ziegenanti-Streptavidin-Antikörper ist ein polyklonaler Antikörper, der mehrere Epitope auf Streptavidin erkennt und eine bessere Brücke zwischen den beiden Streptavidinschichten bietet als Biotin-Streptavidin allein. Dieses Verfahren profitiert auch von der hohen Fluoreszenzausbeute von Phycoerythrin36 und dem niedrigen Niveau der unspezifischen Bindung von Streptavidin37. Bei einem so starken verstärkten Signal ermöglichen die niedrigen Einstellungen der Zytometer-Photomultiplierröhren eine perfekte Linearität. Dieses Verfahren, das sich durch eine hervorragende Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit auszeichnet, ermöglicht die Detektion von weniger als 100 CR1/Zelle.

Diese Methode erfordert jedoch Proben von drei Probanden, deren Erythrozytendichte CR1 bekannt ist: ein Subjekt, das ein niedriges Niveau von Erythrozyten CR1 (180 CR1/E) ausdrückt, ein Subjekt, das ein mittleres Niveau von Erythrozyten CR1 (646 CR1/E) ausdrückt, und ein Subjekt, das ein hohes Niveau an Erythrozyt CR1 (966 CR1/E) ausdrückt. Es ist möglich, die ersten Messungen der Erythrozyten-CR1-Dichte mehrerer Individuen zu machen, zunächst mit den Erythrozyten der drei in unserer Studie verwendeten Probanden, die wir bereitstellen können. Die Blutproben von Probanden des Bereichs und den für CR1 zu quantifizierenden Probanden sollten gleichzeitig entnommen, bei 4 °C im Kühlschrank gelagert und bei 4 °C38behandelt werden. Das in EDTA-Röhrchen entnommene Blut ist leicht routableundundundkannt und kann 5 Tage bei 4 °C gelagert werden, was Zeit für die Quantifizierung von Erythrozyten CR1 lässt. Danach beginnt die Dichte von Erythrozyten CR1 zu sinken, und es gibt einen Zusammenbruch der Standard-CR1-Kurve, insbesondere an dem Punkt, der dem Subjekt entspricht und ein hohes Niveau von Erythrozyten CR1 ausdrückt. Da die resultierende Regressionslinie verzerrt ist, ist das Maß der CR1-Dichte nicht mehr genau. Es sei darauf hingewiesen, dass in vitro Lagerung, Handhabungsbedingungen, und die mehrschichtige Färbung führen zu Clustering von CR1 und eine leichte Überschätzung der Anzahl der CR1-Moleküle. Dennoch ermöglicht die Verwendung eines Anti-CR1-Antikörpers, der auf drei Epitope wie J3D3 mit dem Amplifikationssystem abzielt, die vollständige Clustering-Funktion, was eine korrekte Messung der CR1-Dichte39ermöglicht.

Tatsächlich nimmt die Dichte von CR1/E während der Lebensdauer des Erythrozyten40ab. Dies würde die Heterogenität der Dichte von CR1/E im selben Individuum erklären. Einigen Autoren zufolge ist die Intensität des Katabolismus von CR1 nicht mit der Anfangsdichte von CR1/E41korreliert, während bei anderen Autoren je höher die Anfangsdichte, desto größer die Intensität des Katabolismus42. Die Halbwertszeit von CR1 auf der Oberfläche von Erythrozyten beträgt 11–32 Tage42.

Die hier vorgestellte Methode hat mehrere Vorteile. Die erste besteht darin, dank der Durchflusszytometrie die Zellsubpopulationen auszuwählen, die innerhalb derselben Blutprobe untersucht werden sollen. Durch die Auswahl der Erythrozytenpopulation unter Verwendung der Gate-Funktion wird die Messung der Erythrozytendichte ausschließlich gewährleistet. Eine Verzerrung bei der Messung von Erythrozyten CR1, die durch das Vorhandensein anderer zellulärer Subpopulationen wie weißer Blutkörperchen verursacht wird, wird vermieden. Der zweite Vorteil dieser Methode ist, dass sie an die Quantifizierung anderer zellulärer Rezeptoren angepasst werden kann, deren Dichte gering ist, indem sie einfach den primären Anti-CR1-Antikörper durch einen Antikörper ersetzt, der speziell gegen ein Zuflächige des zu untersuchenden Rezeptors gerichtet ist. Es ist auch anpassungsfähig an die Verwendung von 96 Brunnenplatten anstelle von Rohrträgern, die geringere Blut- und Reagenzvolumen25,38erfordert. Der dritte Vorteil dieser Methode ist, dass sie flexibel ist. In Studien an Zellen mit einer sehr hohen CR1-Dichte, z. B. menschlichen Lymphozyten (10.000 CR1/Zelle) oder nichtmenschlichen Primatenerythrozyten, deren CR1-Dichte 10–100x größer ist als die des Menschen (10.000–100.000 CR1/Zelle)43,44, ist es möglich, die Anzahl der Amplifikationssystemschichten zu verringern, verwendung nur biotinylierter monoklonaler Antikörper gegen CR1, Phycoerythrin-Streptavidin oder biotinylierten monoklonalen Anti-CR1-Antikörper, biotinylierten Anti-Maus-Antikörper n. MwMm. und Phycoerythrin-Streptavidin, wodurch der Fluoreszenzspiegel an die höhere Dichte von CR1 angepasst wird. Der vierte Vorteil dieser Methode besteht darin, dass sie für feste oder gefrorene Erythrozyten verwendet werden kann, so dass Blutproben in Gebieten entnommen werden können, in denen die Möglichkeiten für die Durchflusszytometrie fehlen und für eine spätere genaue Quantifizierung von CR138gespeichert werden.

Allgemeiner ausgedrückt, mit den neuen helleren Fluorchromen, scheint es nicht mehr obligatorisch, das System der indirekten Verstärkung zu verwenden. Außerdem gibt es andere Methoden mit Durchflusszytometrie, die es ermöglichen, die Dichte der zellulären Rezeptoren zu bewerten und in Maßeinheiten zu quantifizieren (z. B. ABC oder Antikörperbindungskapazität). Das ABC pro Zelle kann auch mit sättverschiedenen Konzentrationen von Antikörpern und kalibrierten Perlen bestimmt werden. Es stehen mehrere kommerzielle Systeme zur Verfügung. Einige Kits sind vorkalibrierte Standardperlen, die bekannte Fluorchrommoleküle wie PE-gebunden e.B. pro Perle enthalten. Die Perlen, die am selben Tag auf einem Durchflusszytometer an denselben Instrumenteneinstellungen wie die einzelnen Patientenproben erworben wurden, ermöglichen es, eine Standardkurve zu zeichnen, die den geometrischen Mittelwert der Fluoreszenz mit dem bekannten PE-Gehalt der Perlen vergleicht. Die Regressionsanalyse, Neigung, Abfang- und Korrelationskoeffizient werden ermittelt, und die ABC-Werte werden aus der gemessenen geometrischen mittelsmetschigen Fluoreszenz von Zellen unter Verwendung der Standardkurve45,46berechnet.

Ein weiterer Arten von Perlentests basiert auf der Bindung eines Antikörpers, der über den kristallisierbaren Teil des Fragments (Fc) zu Perlen mit spezifischen Antikörperbindungsgehalten konjugiert ist. Perlen werden mit demselben Antikörper gekennzeichnet, der zur Kennzeichnung der Zellen verwendet wird, deren Antigendichte gemessen werden soll. So kann in einem einzigen Experiment jeder konjugierte Antikörper verwendet werden, solange die gleiche Charge mit dem gleichen Fluorophor/Protein-Verhältnis (F/P-Verhältnis) verwendet wird, um sowohl Perlen als auch Zellen zu färben47. Einige Kits sind besser für die quantitative Bestimmung von Zelloberflächenantigenen durch Durchflusszytometrie mit indirekten Immunfluoreszenz-Assays48,49.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass unsere Methode den Vorteil hat, eine sehr empfindliche Detektion zu bieten und einfach auf gewöhnliches Durchflusszytometriematerial zu implementieren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Wir danken allen Mitgliedern der technischen Plattform URCACyt, Flow Cytometry, den Mitarbeitern der Abteilung für Immunologie und den Mitarbeitern der Abteilung für Innere Medizin und Geriatrie, die zur Optimierung und Validierung des Protokolls beigetragen haben. Diese Arbeit wurde von den Reims University Hospitals (Grant-Nummer AOL11UF9156) finanziert.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1000E Barrier Tip Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France 2079E sample pipetting
1-100 µL Bevelled, filter tip Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Germany S1120-1840 sample pipetting
Biotinylated anti-CR1 monoclonal antibody (J3D3) Home production of non-commercial monoclonal antibody, courtesy of Dr J. Cook immunostaining
Blouse protection
Bovin serum albumin (7,5%) Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France 15260037 cytometry
Centrifuge Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France 11176917 centrifugation
Clean Solution BD, F-38801 Le Pont de Claix, France 340345 cytometry
Comorack-96 Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath 944060P rack
Cytometer Setup & Tracking Beads Kit BD, F-38801 Le Pont de Claix, France 655051 cytometry
Formaldehyde solution 36.5 % Sigma Aldrich, F-38070 Saint Quentin Fallavier, France F8775-25ML Fixation
10 µL Graduated, filter tip Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Germany S1121-3810 sample pipetting
LSRFORTESSA Flow Cytometer BD, F-38801 Le Pont de Claix, France 647788 cytometry
Microman Capillary Pistons Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath 067494 sample pipetting
Micronic 1.40 mL round bottom tubes Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath MP32051 mix
Micropipette Microman - type M25 - Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath 066379 sample pipetting
Phosphate buffered Saline (PBS) Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France 10010031 cytometry
Pipette PS 325 mm, 10 mL Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath 391952 sample pipetting
powder-free Nitrile Exam gloves Medline Industries, Inc, Mundelein, IL 60060, USA 486802 sample protection
Reference 2 pipette, 0,5-10 µL Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France 4920000024 sample pipetting
Reference 2 pipette, 20-100 µL Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France 4920000059 sample pipetting
Reference 2 pipette, 100-1000 µL Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France 4920000083 sample pipetting
Rinse Solution BD, F-38801 Le Pont de Claix, France 340346 cytometry
Round bottom tube Sarstedt, F-70150 Marnay, France 55.1579 cytometry
Safe-Lock Tubes, 1.5 mL Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France 0030120086 mix
streptavidin R-PE Tebu Bio, F-78612 Le Perray-en-Yvelines, France AS-60669 immunostaining
Tapered Centrifuge Tubes 50 mL Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France 10203001 mix
Vector anti streptavidin biotin Eurobio Ingen, F-91953 Les Ulis, France BA-0500 immunostaining
Vortex-Genie 2 Scientific Industries, Inc, Bohemia, NY 111716, USA SI-0236 mix

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fearon, D. T. Identification of the membrane glycoprotein that is the C3b receptor of the human erythrocyte, polymorphonuclear leukocyte, B lymphocyte, and monocyte. Journal of Experimental Medicine. 152 (1), 20-30 (1980).
  2. Ross, G. D., Winchester, R. J., Rabellino, E. M., Hoffman, T. Surface markers of complement receptor lymphocytes. Journal of Clinical Investigation. 62 (5), 1086-1092 (1978).
  3. Reynes, M., et al. Human follicular dendritic cells express CR1, CR2, and CR3 complement receptor antigens. The Journal of Immunology. 135 (4), 2687-2694 (1985).
  4. Gasque, P., et al. Identification and characterization of complement C3 receptors on human astrocytes. The Journal of Immunology. 156 (6), 2247-2255 (1996).
  5. Pascual, M., et al. Identification of membrane-bound CR1 (CD35) in human urine: evidence for its release by glomerular podocytes. Journal of Experimental Medicine. 179 (3), 889-899 (1994).
  6. Fearon, D. T. Regulation of the amplification C3 convertase of human complement by an inhibitory protein isolated from human erythrocyte membrane. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (11), 5867-5871 (1979).
  7. Dobson, N. J., Lambris, J. D., Ross, G. D. Characteristics of isolated erythrocyte complement receptor type one (CR1, C4b-C3b receptor) and CR1-specific antibodies. The Journal of Immunology. 126 (2), 693-698 (1981).
  8. Schreiber, R. D., Pangburn, M. K., Muller-Eberhard, H. J. C3 modified at the thiolester site: acquisition of reactivity with cellular C3b receptors. Bioscience Reports. 1 (11), 873-880 (1981).
  9. Ross, G. D., et al. Generation of three different fragments of bound C3 with purified factor I or serum. II. Location of binding sites in the C3 fragments for factors B and H, complement receptors, and bovine conglutinin. Journal of Experimental Medicine. 158 (2), 334-352 (1983).
  10. Klickstein, L. B., Barbashov, S. F., Liu, T., Jack, R. M., Nicholson-Weller, A. Complement receptor type 1 (CR1, CD35) is a receptor for C1q. Immunity. 7 (3), 345-355 (1997).
  11. Ghiran, I., et al. Complement receptor 1/CD35 is a receptor for mannan-binding lectin. Journal of Experimental Medicine. 192 (12), 1797-1808 (2000).
  12. Cornacoff, J. B., et al. Primate erythrocyte-immune complex-clearing mechanism. Journal of Clinical Investigation. 71 (2), 236-247 (1983).
  13. Waxman, F. J., et al. Complement depletion accelerates the clearance of immune complexes from the circulation of primates. Journal of Clinical Investigation. 74 (4), 1329-1340 (1984).
  14. Waxman, F. J., et al. Differential binding of immunoglobulin A and immunoglobulin G1 immune complexes to primate erythrocytes in vivo. Immunoglobulin A immune complexes bind less well to erythrocytes and are preferentially deposited in glomeruli. Journal of Clinical Investigation. 77 (1), 82-89 (1986).
  15. Horgan, C., Taylor, R. P. Studies on the kinetics of binding of complement-fixing dsDNA/anti-dsDNA immune complexes to the red blood cells of normal individuals and patients with systemic lupus erythematosus. Arthritis & Rheumatology. 27 (3), 320-329 (1984).
  16. Pham, B. N., et al. Analysis of complement receptor type 1 expression on red blood cells in negative phenotypes of the Knops blood group system, according to CR1 gene allotype polymorphisms. Transfusion. 50 (7), 1435-1443 (2010).
  17. Wilson, J. G., et al. Identification of a restriction fragment length polymorphism by a CR1 cDNA that correlates with the number of CR1 on erythrocytes. Journal of Experimental Medicine. 164 (1), 50-59 (1986).
  18. Rodriguez de Cordoba, S., Rubinstein, P. Quantitative variations of the C3b/C4b receptor (CR1) in human erythrocytes are controlled by genes within the regulator of complement activation (RCA) gene cluster. Journal of Experimental Medicine. 164 (4), 1274-1283 (1986).
  19. Herrera, A. H., Xiang, L., Martin, S. G., Lewis, J., Wilson, J. G. Analysis of complement receptor type 1 (CR1) expression on erythrocytes and of CR1 allelic markers in caucasian and african american populations. Clinical Immunology and Immunopathology. 87 (2), 176-183 (1998).
  20. Birmingham, D. J., et al. A CR1 polymorphism associated with constitutive erythrocyte CR1 levels affects binding to C4b but not C3b. Immunology. 108 (4), 531-538 (2003).
  21. Dykman, T. R., Hatch, J. A., Aqua, M. S., Atkinson, J. P. Polymorphism of the C3b/C4b receptor (CR1): characterization of a fourth allele. The Journal of Immunology. 134 (3), 1787-1789 (1985).
  22. Moulds, J. M., Moulds, J. J., Brown, M., Atkinson, J. P. Antiglobulin testing for CR1-related (Knops/McCoy/Swain-Langley/York) blood group antigens: negative and weak reactions are caused by variable expression of CR1. Vox Sanguinis. 62 (4), 230-235 (1992).
  23. Cohen, J. H., Lutz, H. U., Pennaforte, J. L., Bouchard, A., Kazatchkine, M. D. Peripheral catabolism of CR1 (the C3b receptor, CD35) on erythrocytes from healthy individuals and patients with systemic lupus erythematosus (SLE). Clinical & Experimental Immunology. 87 (3), 422-428 (1992).
  24. Jouvin, M. H., Rozenbaum, W., Russo, R., Kazatchkine, M. D. Decreased expression of the C3b/C4b complement receptor (CR1) in AIDS and AIDS-related syndromes correlates with clinical subpopulations of patients with HIV infection. AIDS. 1 (2), 89-94 (1987).
  25. Waitumbi, J. N., Donvito, B., Kisserli, A., Cohen, J. H., Stoute, J. A. Age-related changes in red blood cell complement regulatory proteins and susceptibility to severe malaria. The Journal of Infectious Diseases. 190 (6), 1183-1191 (2004).
  26. Mahmoudi, R., et al. Alzheimer's disease is associated with low density of the long CR1 isoform. Neurobiology of Aging. 36 (4), 5-12 (2015).
  27. Mahmoudi, R., et al. Inherited and Acquired Decrease in Complement Receptor 1 (CR1) Density on Red Blood Cells Associated with High Levels of Soluble CR1 in Alzheimer's Disease. International Journal of Molecular Sciences. 19 (8), 2175 (2018).
  28. Zaitsev, S., et al. Human complement receptor type 1-directed loading of tissue plasminogen activator on circulating erythrocytes for prophylactic fibrinolysis. Blood. 108 (6), 1895-1902 (2006).
  29. Scatchard, G. The attractions of proteins for small molecules and ions. Annals of the New York Academy of Sciences. 51 (4), 660-672 (1949).
  30. Cohen, J. H., et al. Enumeration of CR1 complement receptors on erythrocytes using a new method for detecting low density cell surface antigens by flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 99 (1), 53-58 (1987).
  31. Minota, S., et al. Low C3b receptor reactivity on erythrocytes from patients with systemic lupus erythematosus detected by immune adherence hemagglutination and radioimmunoassays with monoclonal antibody. Arthritis & Rheumatology. 27 (12), 1329-1335 (1984).
  32. Miyakawa, Y., et al. Defective immune-adherence (C3b) receptor on erythrocytes from patients with systemic lupus erythematosus. The Lancet. 2 (8245), 493-497 (1981).
  33. Lida, K., Mornaghi, R., Nussenzweig, V. Complement receptor (CR1) deficiency in erythrocytes from patients with systemic lupus erythematosus. Journal of Experimental Medicine. 155 (5), 1427-1438 (1982).
  34. Tao, K., Nicholls, K., Rockman, S., Kincaid-Smith, P. Expression of complement 3 receptors (CR1 and CR3) on neutrophils and erythrocytes in patients with IgA nephropathy. Clinical Nephrology. 32 (5), 203-208 (1989).
  35. Nickells, M., et al. Mapping epitopes for 20 monoclonal antibodies to CR1. Clinical and Experimental Immunology. 112 (1), 27-33 (1998).
  36. Oi, V. T., Glazer, A. N., Stryer, L. Fluorescent phycobiliprotein conjugates for analyses of cells and molecules. The Journal of Cell Biology. 93 (3), 981-986 (1982).
  37. Chaiet, L., Wolf, F. J. The properties of streptavidin, a biotin-binding protein produced by streptomyces. Archives of Biochemistry and Biophysics. 20 (106), 1-5 (1964).
  38. Cockburn, I. A., Donvito, B., Cohen, J. H., Rowe, J. A. A simple method for accurate quantification of complement receptor 1 on erythrocytes preserved by fixing or freezing. Journal of Immunological Methods. 20 (271), 59-64 (2002).
  39. Chen, C. H., et al. Antibody CR1-2B11 recognizes a non-polymorphic epitope of human CR1 (CD35). Clinical & Experimental Immunology. 148 (3), 546-554 (2007).
  40. Ripoche, J., Sim, R. B. Loss of complement receptor type 1 (CR1) on ageing of erythrocytes. Studies of proteolytic release of the receptor. Biochemical Journal. 235 (3), 815-821 (1986).
  41. Moldenhauer, F., Botto, M., Walport, M. J. The rate of loss of CR1 from ageing erythrocytes in vivo in normal subjects and SLE patients: no correlation with structural or numerical polymorphisms. Clinical & Experimental Immunology. 72 (1), 74-78 (1988).
  42. Cohen, J. H., Lutz, H. U., Pennaforte, J. L., Bouchard, A., Kazatchkine, M. D. Peripheral catabolism of CR1 (the C3b receptor, CD35) on erythrocytes from healthy individuals and patients with systemic lupus erythematosus (SLE). Clinical & Experimental Immunology. 87 (3), 422-428 (1992).
  43. Nickells, M. W., Subramanian, V. B., Clemenza, L., Atkinson, J. P. Identification of complement receptor type 1-related proteins on primate erythrocytes. The Journal of Immunology. 154 (6), 2829-2837 (1995).
  44. Hebert, L. A., Birmingham, D. J., Shen, X. P., Cosio, F. G. Stimulating erythropoiesis increases complement receptor expression on primate erythrocytes. Clinical Immunology and Immunopathology. 62 (3), 301-306 (1992).
  45. Davis, K. A., Abrams, B., Iyer, S. B., Hoffman, R. A., Bishop, J. E. Determination of CD4 antigen density on cells: Role of antibody valency, avidity, clones, and conjugation. Cytometry. 33 (2), 197-205 (1998).
  46. Pannu, K. K., Joe, E. T., Iyer, S. B. Performance evaluation of QuantiBRITE phycoerythrin beads. Cytometry. 45 (4), 250-258 (2001).
  47. Barnett, D., Storie, I., Wilson, G. A., Granger, V., Reilly, J. T. Determination of leucocyte antibody binding capacity (ABC): the need for standardization. Clinical Laboratory Haematology. 20 (3), 155-164 (1998).
  48. Bikoue, A., et al. Quantitative analysis of leukocyte membrane antigen expression: normal adult values. Cytometry. 26 (2), 137-147 (1996).
  49. Serke, S., van Lessen, A., Huhn, D. Quantitative fluorescence flow cytometry: a comparison of the three techniques for direct and indirect immunofluorescence. Cytometry. 33 (2), 179-187 (1998).

Tags

Immunologie und Infektion Ausgabe 159 CR1 CD35 Komplement C3b/C4b-Rezeptor CR1-Dichtepolymorphismus Durchflusszytometrie Alzheimer-Krankheit Systemischer Lupus erythematodes Malaria
Messung des Erythrozytenkomplementrezeptors 1 mit Durchflusszytometrie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kisserli, A., Audonnet, S., Duret,… More

Kisserli, A., Audonnet, S., Duret, V., Tabary, T., Cohen, J. H. M., Mahmoudi, R. Measuring Erythrocyte Complement Receptor 1 Using Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (159), e60810, doi:10.3791/60810 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter