Summary
מטרת שיטה זו היא לקבוע את צפיפות CR1 ב אריתרופוציטים של כל נושא על ידי השוואת עם שלושה נושאים שצפיפות הCR1 של erythrocyte ידועה. השיטה משתמשת cy, לאחר כתמים חיסוני של הנבדקים ' אריתרופוציטים על ידי נוגדן אנטי CR1 שבטיים מצמידים למערכת מוגברת באמצעות phycoארימתרין (PE).
Abstract
CR1 (CD35, משלים מסוג הקולטן 1 עבור C3b/C4b) הוא הממברנה מולקולרית משקל גבוה גליקופרוטאין של כ 200 kda כי שולטת הפעלה משלימים, הובלות מתחמי החיסון, ומשתתפת תגובות החיסונית ומוראלית הסלולר. CR1 נמצא על פני השטח של סוגים רבים של תאים, כולל אריתרופוציטים, ומוצגים פולימריות באורך, מבנה (Knops, או KN, קבוצת דם), וצפיפות. הצפיפות הממוצעת של CR1 לאריתרופואריציט (CR1/E) היא 500 מולקולות לכל אריתרופואריציט. צפיפות זו משתנה מאדם אחד למשנהו (100 – 1200 CR1/E) ומתוך אריתרופואריציט אחד למשנהו באותו אדם. אנו מציגים כאן השיטה החזקה cy, למדוד את הצפיפות של CR1/E, כולל בנושאים המבטא צפיפות נמוכה, בעזרת מערכת חיסונית הגברה. שיטה זו אפשרה לנו להראות את הורדת הביטוי CR1 אריתרופוציטים במחלות כגון מחלת אלצהיימר (AD), זאבת מערכתית שושנה (מיקרו), איידס, או מלריה.
Introduction
CR1 (סוג קולטן משלים 1, CD35) הוא 200 kda הטרנסקרום גליקופרוטאין להציג על פני השטח של סוגים רבים של תאים, כגון אריתרופוציטים1, B לימפוציטים2, תאים monocytic, כמה תאים T, תאים דנדריטים הזקיקים3, העובר אסטרוציטים4, ו-podocytes מדומה5. CR1 מתערב עם ליגידיים C3b, C4b, C3bi6,7,8,9, יחידת משנה של רכיב המשלים הראשון, C1q10 ו mbl (mannan-כריכה לקטין)11 מעכב את ההפעלה של המשלים והוא מעורב התגובה החיסונית הוואתית והסלולר.
בפרימטים, כולל בני אדם, אריתרופויציט CR1 מעורב בהובלת מתחמי החיסון לכבד ולטחול, כדי לטהר את הדם ולמנוע את ההצטברות שלהם ברקמות פגיעות כגון העור או הכליות12,13,14. תופעה זו של הדבקה חיסונית בין מכלולי החיסון ו אריתרופוציטים תלוי במספר של CR1 מולקולות15. בבני אדם, הצפיפות הממוצעת של CR1/E היא רק 500 (כלומר, 500 מולקולות של CR1 לכל אריתרופואריציט). צפיפות זו משתנה מאדם אחד למשנהו (100 – 1200 CR1/E) ומתוך אריתרופואריציט אחד למשנהו באותו אדם. אנשים מסוימים של "null" פנוטיפ פחות מ 20 CR1/E16.
את הצפיפות של CR1/E מוסדר על ידי שני שיתוף השכל אללים מקושר מוטציה נקודה ב אינטרון 27 של קידוד הגן עבור CR1 * 117,18. מוטציה זו מייצרת אתר הגבלה נוסף עבור האנזים HindIII. שברי ההגבלה שהתקבלו לאחר העיכול עם hindiii במקרה זה הם 7.4 kb עבור אלל מקושר ביטוי חזק של CR1 (H: high אלל) ו 6.9 kb עבור אלל מקושר CR1 ביטוי נמוך (L: אלל נמוך). קישור זה נמצא בקווקז ובאסיאתים, אך לא באנשים ממוצא אפריקאי19.
רמת הביטוי של אריתרופואריציט CR1 הוא גם מתואם עם נוכחות של נוקלאוטיד הנקודה מוטציות ב אקסון 13 קידוד SCR 10 (I643T) ו ב אקסון 19 קידוד SCR16 (Q981H). הוא גבוה ב homozygous 643I/981Q ונמוך ב homozygous 643I/981Q אנשים20. כך, אנשים "נמוכים" מבטאים סביב 150 CR1/E, "בינוני" אנשים לבטא סביב 500 CR1/E, ו "גבוהה" אנשים מבטאים סביב 1,000 CR1/E.
בנוסף לפולימורפיזם דחיסות זו, CR1 מאופיין בפולימורפיזם אורך התואם לארבעה אלוסוגים של גדלים שונים: CR1 * 1 (190 kDa), CR1 * 2 (220 kDa), CR1 * 3 (160 kDa), ו CR1 * 4 (250 kDa)21 ו פולימורפיזם אנטיגניים המתאימים לקבוצת הדם KN22.
אנו מציגים את השיטה שלנו מבוסס על הזרימה cy, נסה לקבוע את צפיפות CR1/E. באמצעות שלושה נושאים שצפיפות CR1/E שלהם ידועה, ביטוי רמת צפיפות נמוכה (180 CR1/E), רמת צפיפות בינונית (646 CR1/E), ורמת צפיפות גבוהה (966 CR1/E), קל למדוד את עוצמת הזריחה הממוצע (MFI) של האריתרופוציטים שלהם או כדוריות הדם האדומות (RBC), או RBC MFI, אחרי אנטי CR1 מכתים באמצעות cytometry זרימה. ניתן להתוות קו סטנדרטי המייצג את MFI כפונקציה של צפיפות CR1/E. מדידת MFI של נושאים שצפיפות ה-CR1/E שלהם אינה ידועה ומשווה אותו לקו סטנדרטי זה, ניתן לקבוע את צפיפות הCR1/E של האנשים. טכניקה זו שימש במשך שנים רבות במעבדה, והוא איפשר לנו לזהות הפחתה בביטוי של אריתרופולוגיה CR1 בפתווגיות רבות כגון זאבת מערכתית מאריטתסוס (הדלקת)23, תסמונת כשל חיסוני נרכש (איידס)24, מלריה25, ומחלת אלצהיימר לאחרונה (AD)26,27. התפתחות התרופות מיקוד CR1 לזוג עם אריתרופוציטים, כמו במקרה של תרופות נגד טרומבוטיים28 דורש הערכה של CR1/E צפיפות, ואת הזמינות של טכניקה איתנה לכמת CR1.
הפרוטוקול שהוצג. פועל בסינגליאט הוא ניתן להתאמה כדי לקבוע את צפיפות CR1/E על אנשים רבים באמצעות ספציפי מסחרית זמין 96 לוחות היטב (ראה לוח חומרים). למטרה זו, קל להתאים את השיטה שלנו לצלחת כל 96. עבור כל דוגמה, השעיית תא של אריתרופוציטים (0.5 x 106– 1 x 106 אריתרופוציטים) מופץ בכל טוב. עבור כל באר, תחילה את הנוגדן העיקרי anti-CR1 מתווסף, אז streptavidin PE, נוגדן אנטי streptavidin משני, ושוב streptavidin PE, באמצעות הדילול זהה לאלה של השיטה שלנו, אבל על ידי התאמת כרכים וכיבוד המידתיות.
דגימות הדם מהנושאים של הטווח ומנושאים שיש לכמת עבור CR1 צריכות להיות מצוירות באותו זמן, מאוחסנות במקרר ב -4 ° c ומטופלות ב -4 ° צ' (על קרח ו/או במקרר).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הפרוטוקול של איסוף הדם האנושי והטיפול נבדק ואושר על ידי ועדת האתיקה האזורית (CPP Est II), ומספר הפרוטוקול הוא 2011-A00594-37. מכיוון שהפרוטוקול הבא מתאר את הטיפול בדם אנושי, יש לעקוב אחר הנחיות מוסדיים לסילוק חומרים ביולוגיים. יש לענוד ציוד בטיחות מעבדה, כגון מעילי מעבדה וכפפות.
1. שטיפת אריתרופואריציט
הערה: ביום שלפני הטיפול, להכין מאגר PBS-BSA עם מלוחים מואגור פוספט (PBS) המכיל 0.15% של סרום שור פרה (BSA) ולמקם אותו במקרר ב 4 ° c. מאגר זה ישמש כמאגר כביסה וכמאגר דילול.
- פיפטה 20 מ ל של PBS-BSA לתוך שפופרת 50 mL.
- מוצית 250 μL של נתרן ethylenediamine חומצה (EDTA) anticoagulated דם שלם מצינורות אחסון דם ולהוסיף לצינור המכיל את 20 מ ל של PBS-BSA. סגור את הצינור על ידי דופק את הכובע. מערבבים בעדינות על ידי היפוך 2x צינור.
- צנטריפוגה את השפופרת עבור 10 דקות ב 4 ° צ' ב 430 x g. הסר והשמט את הסופרנטנט באמצעות פיפטה של 10 מ"ל. השהה את הגלולה בנפח השאריות של סופרנטנט על-ידי מלטף עדין וזהיר.
- הוסיפו 20 מ ל הצטננות-BSA (4 ° c) לתוך הצינור המכיל את הגלולה. צנטריפוגה את השפופרת עבור 10 דקות ב 4 ° צ' ב 430 x g. הסר והשמט את הסופרנטנט באמצעות פיפטה של 10 מ"ל.
- הוסיפו 20 מ ל הצטננות-BSA (4 ° c) לתוך הצינור המכיל את הגלולה. צנטריפוגה את השפופרת עבור 10 דקות ב 4 ° צ' ב 430 x g. השאירו את השפופרת בצנטריפוגה ב -4 ° c ועבור לסעיף 2.
2. דילול אריתרופוהייט
- פיפטה 3 מ ל קר PBS-BSA לתוך שפופרת 50 mL ולאחסן אותו ב 4 ° c על מתלה בקרח.
- שים את הצינור centrifuged המכיל את האריתרופוציטים (שלב 1.4) על מתלה ממוקם בקרח.
- פיפטה 8 μL של כריתת אריתרופוציטים באמצעות הפיפטה ומוסיפים לצינור 50 mL המכיל את 3 מ ג של PBS-BSA כדי לקבל את דילול האריתרופוציטים. לערבב את הצינור בעדינות ביד כדי לקבל השעיית תא הומוגנית של אריתרופוציטים.
3. חיסוני אריתרופוציט
- פיפטה 100 μL של דילול אריתרופואריציט (מקבל בסעיף 4) ולהוסיף 1.4 mL צינורות.
- צנטריפוגה את הצינורות עבור 5 דקות ב 4 ° צ' ב 430 x g. במהלך צנטריפוגה, להכין דילול של נוגדן biotinylated anti-CR1 J3D3 בריכוז של 0.05 μg/μL במאגר PBS-BSA.
- לאחר הצנטריפוגה נעשה, להסיר ולמחוק את הסופרנטאנט.
- הוסף 20 μL של biotinylated anti-CR1 J3D3 ישירות על הגלולה. כדי להכין את הפקד השלילי, הוסף 20 μL של מאגר PBS-BSA במקום. מערבבים בעדינות את הצינורות עבור 45 דקות ב-4 ° c.
- לאחר 45 דקות של דגירה, להוסיף 750 μL של PBS-BSA לצינורות. צנטריפוגה את הצינורות עבור 5 דקות ב 4 ° צ' ב 430 x g. הסר והשמט את הסופרנטאנט. חזור על.
- בינתיים, הכינו 1:10 דילול של streptavidin-פילקוארירין מדולל במאגר ה-PBS-BSA. פיפטה 20 μL של 1:10 הדילול של streptavidin-פילקוארירין ומוסיפים לצינורות. מערבבים בעדינות את הצינורות עבור 45 דקות ב-4 ° c.
- הוסף 750 μL של מאגר PBS-BSA לתוך הצינורות. מערבבים היטב ואת צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 4 ° צ' ב 430 x g. הסר והשמט את הסופרנטאנט. חזור על.
- במהלך הצנטריפוגה, הכינו דילול 1:100 של נוגדן biotinylated נגד streptavidin מדולל במאגר PBS-BSA.
- לאחר הצנטריפוגה נעשה, להסיר ולמחוק את הסופרנטאנט.
- פיפטה 20 μL של 1:100 דילול של biotinylated anti-streptavidin לתוך הצינורות. מערבבים בעדינות את החצוצרות. דגירה את הצינורות עבור 45 דקות ב 4 ° c.
- לאחר 45 דקות של דגירה, פיפטה 750 μL של מאגר PBS-BSA ולהוסיף את הצינורות. צנטריפוגה את הצינורות עבור 5 דקות ב 4 ° צ' ב 430 x g. הסר והשמט את הסופרנטאנט. חזור על.
- פיפטה 20 μL של 1:10 הדילול של streptavidin-פילקוארירין ומוסיפים לצינורות. מערבבים בעדינות את החצוצרות. דגירה את הצינורות עבור 45 דקות ב 4 ° c.
- פיפטה 750 μL של מאגר PBS-BSA ולהוסיף לתוך הצינורות. מערבבים היטב לצנטריפוגה את הצינורות עבור 5 דקות ב 4 ° צ' ב 430 x g. הסר והשמט את הסופרנטאנט. חזור על שלב 2x זה.
4. קיבעון חיסוני
- במהלך הצנטריפוגה האחרון, להכין את מאגר קיבעון, דילול 1:100 של 37% פורמלדהיד באמצעות מאגר הכביסה PBS-BSA.
- פיפטה 450 μL של מאגר קיבעון ומוסיפים לצינורות המוכתמים החיסונית (משלב 3.13) בזמן vortexing עבור 5 s.
- פיפטה כל התאים קבוע לתוך 5 מ ל צינורות התחתון עגול וחנות במקרר.
הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן עד 48 h.
5. הזרם הציטומטלי ניתוח של אריתרופוציטים ויטראז
הערה: מומלץ להתייחס למדריך המפעיל של הציטוטומטר (ראה טבלת חומרים) כדי לדעת כיצד לבצע את הקריאות הסייטומטריים. הפרמטרים המוצעים להלן חלים על המכשיר המשמש וחייב להיות ממוטב עבור כל cytometer.
- הפעל את הזרימה של cytometer ולאחר מכן הפעל את המחשב. תן את טמפרטורת המערכת האופטית לייצב על ידי השארת אותו על 30 דקות. בדוק את החלון cytometer בתוכנה כדי להבטיח כי cytometer מחובר לתחנת העבודה ( cytometer ההודעה מחובר ).
- בדוק שגורם המכיל של המאגר מלא ושמיכל הפסולת ריק. הסר בועות אוויר במסנן המאגר ובקו המאגר באמצעות מערכת הטיהור. הממשלה מערכת פלואידיקה על ידי לחיצה על כפתור ראשי במסוף של cytometer. המתן עד שנורית החיווי תשתנה מאדום לירוק.
- כדי לנקות את fluidics להתקין צינור המכיל 3 מ ל של פתרון ניקוי על יציאת הזרקת לדוגמה ולאפשר את פתרון הניקוי לרוץ עבור 5 דקות עם קצב הזרימה גבוהה לדוגמה. חזור על זה עם הפתרון לשטוף עם מים מזוקקים. השאר את השפופרת המכילה את המים ביציאת הזרקת הדגימה.
- כדי להכין את חרוזי הכיול, פיפטה 400 μL של PBS לתחתית צינור תחתון עגול. לערבב את המניות חרוז בחוזקה על ידי vortexing עבור 30 s. הוסף טיפה לצינור התחתון העגול המכיל את ה-PBS. מערבבים בקפידה על ידי vortexing עבור 30 s.
- . תריץ את בדיקת הביצועים פתח את מודול ההתקנה והמעקב של cytometer בתוכנה (איור 1a). ודא שתצורת cytometer טר נכונה עבור הניסוי באמצעות כתמים חיסוני PE. ודא שאצוות כיול של החרוז נכונה עם התצורה.
- התקן את שפופרת החרוזים ביציאת הזרקת המדגם ותן לו לפעול עם קצב זרימה נמוך לדוגמה. הפעל את בדיקת הביצועים, שאורכת כ-5 דקות עד להשלמת ההשלמה). לאחר השלמת בדיקת הביצועים, ודא שביצועי cytometer משביע רצון (איור 1B). סגור את מודול ההתקנה והמעקב של cytometer בתוכנה.
- כדי להגדיר ניסוי וליצור הגדרות יישום, לחץ על לחצן ' הניסוי ' החדש בסרגל הכלים של הדפדפן ופתח את הניסוי החדש. ציין את הפרמטרים על-ידי בחירת הגדרות cytometer מתאימות: העבר פיזור (fsc), פיזור צד (מטואס) ו- PE מהתפריט הנפתח של הניסוי (איור 1c). בחר במצב ליניארי עבור פרמטר fsc ובמצב לוגריתם עבור פרמטרים של מהאס-ומע ו-PE.
- בניסוי הפתוח, בחרו ' הגדרות Cytometer ' (איור 1d), ולאחר מכן בחרו ' הגדרות יישום' וצרו גליון עבודה כללי (איור 1d). השתמש בתיבות אפורות כדי להנחות את האופטימיזציה.
- טען את צינור הבקרה הבלתי מוכתם על הציטוטומטר והפעל רכישה. ודא שאוכלוסיית הריבית (כלומר, RBCs) נמצאת בקנה מידה על-ידי אופטימיזציה של מתח FSC ו-אס. אס. סי. מטב את ערך הסף של FSC כדי למנוע הריסות מבלי להפריע לאוכלוסיית הריבית.
- צייר שער סביב האזור RBCs בחלקה FSC לעומת היחידה למען האו. הצג את אוכלוסיית RBC במגרש הנקודה של פלואורסצנטית PE. במקרה הצורך, הגדילו את הקרינה הפלואורסצנטית של המתח הפוטופוטיבי (PMT) כדי למקם את האוכלוסיה השלילית בתוך התיבות האפורות. פרוק את צינור הבקרה הבלתי מוכתם מהציטומטר.
- ודא שאוכלוסיות חיוביות נמצאות בקנה מידה. טען את צינור הבקרה המוכתמת אל הציטוטומטר והפעל רכישה. הנמך את מתח ה-PMT עבור האוכלוסיה החיובית אם היא מחוץ לקנה המידה עד שהאוכלוסייה החיובית נראית לגמרי בקנה מידה. ואז לפרוק את הדגימה המוכתמת.
- כדי להקליט ולנתח דגימות, בגליון עבודה גלובלי חדש, צור את החלקות הבאות לתצוגה מקדימה של הנתונים: 1) FSC לעומת מסוף העולם, ו-2) PE בהיסטוגרמה. טען את הדגימה הראשונה על הציטוטומטר והפעל רכישה.
- לצייר שער RBC סביב האריתרופוציטים על העלילה FSC vs. בהאס. אס. הצג את אוכלוסיית RBC בהיסטוגרמה של הקרינה הפלואורסצנטית PE. בתצוגת הסטטיסטיקה , בחר את הממוצע עבור פרמטרי הזריחה של PE באוכלוסיות GR (איור 1f).
- בלוח המחוונים לרכישה , בחר את כל האירועים בשער העצירה ו-10,000 אירועים להקלטה (איור 1g). לחץ על הקלטת נתונים. כאשר הקלטת אירוע הושלמה, להסיר את הצינור הראשון מהציטומטר. מחלקות גליון העבודה הגלובליות אמורות להיראות כמו אלה שבאיור 2.
- טען את הדגימות הבאות והקלט אותן.
6. קביעת צפיפות הCR1
- קח את הערכים של עוצמות הזריחה הממוצע של הדגימות המתאימות לנושא "נמוך" (איור 3, טבלה i, rbc mfi), "בינוני" נושא (איור 4, טבלה D, rbc mfi), "גבוה" נושא (איור 4, טבלה i, rbc mfi), ולדגימת שליטה שלילית (איור 3, טבלה i, rbc mfi).
- על הגרף המייצג את עוצמת הזריחה הממוצע כפונקציה של צפיפות CR1, מניחים את ארבע הנקודות המתאימות לשליטה השלילית, "נמוך", נושא "בינוני", ונושא "גבוה" (נקודות כחולות, איור 6).
- צייר את קו הרגרסיה כדי לקבל את קו הכיול ואת המשוואה שלו.
- קח את הערכים של העוצמה הפלואורסצנטית מרושע של הדגימות המתאימות לנושאים שצפיפות שלהם להיקבע. (איור 5, שולחנות D ואני, rbc mfi).
- השג את המשוואה על-ידי החלפת "Y" באמצעות הערכים של עוצמות הזריחה הממוצע, וחשב את הצפיפות של CR1/E (איור 6).
- בדוק את הגרף הממוצע של ערכי העוצמה הפלואורסצנטית וצפיפות הCR1/E הנחושה מתאימה לנקודה בשורת הכיול (איור 6).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
אריתרופוציטים של שלושה נושאים אשר צפיפות CR1 ידועה ("נמוך" נושא [180 CR1/E], "בינוני" נושא [646 CR1/E], ו "גבוהה" נושא [966 CR1/E]), ו של שני נושאים שצפיפות הCR1 שלהם צריך להיקבע היו מוכתם בנוגדן אנטי CR1 מצמידים למערכת הגברה באמצעות הפילוקוארירין fluorochrome. בהתחלה, הצפיפות הCR1 של הנושאים מהטווח הנמוך נקבע על-ידי שיטת המלך-שיטה29 באמצעות נוגדנים רדיקולאבים. הסטנדרטים (נמוך, בינוני, גבוה) נקבע שימשו עקומת כיול ואפשרו לכמת סטנדרטים חדשים או תת סטנדרטים על ידי השיטה שלנו של cyהניסיון30. לאחר מעבר של כריתת דם חיסוני ב cytometer העוצמה של תיוג נצפתה ונמדד כאינטנסיביות ממוצע של זריחה עבור כל נושא (RBC MFI) (איור 3F,אני; איור 4B,D,F,I; איור 5B,D,F,I). עיקול הותווה באמצעות הערכים של הנושאים עם הצפיפות הידועה של אריתרופויוציטים CR1 ("נמוך" עד "גבוה") על ידי דיווח עליהם כפונקציה של עוצמת הזריחה מתכוון. השוואה בין קו הרגרסיה כתוצאה מעיקול זה לערכים של העוצמה הפלואורסצנטית ממוצע של הנבדקים האחרים קבעו CR1/E צפיפות שלהם (איור 6). איור 7 מציג את זרימת העבודה הכוללת.
איור 1: קונסולת הקיטומטר והחלונות המופיעים במהלך הפרוטוקול cy, הזרימה. (A) חלון המופיע לאחר היישום של שלב 5.5 של הפרוטוקול. (ב) חלון המופיע לאחר היישום של שלב 5.6 של הפרוטוקול. (ג) חלון הופעה לאחר היישום של שלב 5.7 של הפרוטוקול. (ד) חלון המופיע לאחר היישום של שלב 5.8 של הפרוטוקול. (E) חלון הופעה לאחר היישום של שלב 5.8 של הפרוטוקול. (F) חלון המופיע לאחר היישום של שלב 5.13 של הפרוטוקול. (G) חלון הופעה לאחר היישום של שלב 5.14 של הפרוטוקול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: המראה של אובייקטי ניתוח גליון העבודה הגלובלי. המראה של אובייקטי ניתוח גליון העבודה הגלובלי לאחר היישום של שלב 5.14 של הפרוטוקול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: התוצאות של הניתוח cy, לאחר הזרימה של אנטי CR1 כתמים של אריתרופוציטים המתאימים לשליטה שלילית ולנושא מהטווח ("נמוך" נושא) שהביע צפיפות CR1 נמוכה (180 CR1/E). לכל נושא: (א,ה) כתם כתמי המראה את המראה של אירועים שנרכשו לפי הגודל והפרמטרים של גרמטריה, (ז) השער בוחר את אוכלוסיית אריתרופויטציטים בקרב האירועים, (ב,ו) היסטוגרמה המייצגת את עוצמת התיוג, (ג,ח) טבלה סטטיסטית משויכת המציגה את מספר האירועים המתאימים לאריתרופוציטים והאחוזים שלהם, (ד,I) טבלה משויכת המעניקה את עוצמת הקרינה הפלואורסצנטית (rbc mfi אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: תוצאות של הניתוח cyCR1 try של זרם החיסוני anti-של אריתרופוציטים המתאימים לנושאים מן הטווח: "בינוני" מושא אשר הביע צפיפות CR1 medium (646 CR1/e) ו-"high" המתבטאת צפיפות CR1 גבוהה (966 CR1/e). לכל נושא: (א, ה) כתם כתמי המראה את המראה של אירועים שנרכשו לפי הגודל והפרמטרים של גרמטריה, (ז) השער בוחר את אוכלוסיית אריתרופויטציטים בקרב האירועים, (ב, ו) היסטוגרמה המייצגת את עוצמת התיוג, (ג, ח) טבלה סטטיסטית משויכת המציגה את מספר האירועים המתאימים לאריתרופוציטים והאחוזים שלהם, (ד, I) טבלה משויכת המעניקה את עוצמת הקרינה הפלואורסצנטית (rbc mfi אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: תוצאות של הניתוח cyCR1 try זרימה של אנטי-כתמים של אריתרופוציטים המתאים לנושאים שצפיפות CR1 שלהם היה להיקבע. לכל נושא: (א, ה) כתם כתמי המראה את המראה של אירועים שנרכשו לפי הגודל והפרמטרים של גרמטריה, (ז) השער בוחר את אוכלוסיית אריתרופויטציטים בקרב האירועים, (ב, ו) היסטוגרמה המייצגת את עוצמת התיוג, (ג, ח) טבלה סטטיסטית משויכת המציגה את מספר האירועים המתאימים לאריתרופוציטים והאחוזים שלהם, (ד, I) טבלה משויכת המעניקה את עוצמת הקרינה הפלואורסצנטית (rbc mfi אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: עקומת כיול וקו רגרסיה המאפשרים קביעת צפיפות CR1. (א), (ב) עקומת כיול ושורת רגרסיה שצוירה בהתאם לדחיסות CR1 הידועה של הנושאים (שליטה שלילית: 0 CR1, "נמוך" הנושא [180 CR1/e], "בינוני" הנושא [646 CR1/e], ו-"high" נושא [966 CR1/E]) ואת הערכים המתאימים של עוצמת הזריחה מתכוון (ג), (ד) מהמשוואה של קו רגרסיה זה, מצאנו את הצפיפות של אריתרופואריטה CR1 לנושאים שעוצמתו של הקרינה הפלואורסצנטית שלהם היתה מכמת על ידי cy, החצים כתומים, נושא 1 (ממוצע עוצמת הקרינה = 1,334; CR1/E צפיפות = 459) ואת הנושא 2 (מתכוון עוצמה זריחה = 2820; CR1/E צפיפות = 1,000). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: תרשים זרימה של הפרוטוקול כדי לקבוע את צפיפות CR1 האריתרופוציט מדגימות דם אנושיות. . לאסוף דגימת דם אנושית רוחצים את דגימת הדם האנושית בצנטריפוגה להשגת אריתרופוציטים. כתם האריתרופוציטים באמצעות נוגדן anti-CR1. השתמש cy, הזרמת הזרימה כדי לקבוע את צפיפות CR1 האריתרופוציט בהתאם לעקומת כיול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
טכניקות מסוימות זמינות כדי לקבוע את הצפיפות של אריתרופויציט CR1 (CR1/E). הטכניקות הראשונות ששימשו היו התנוצנות של כדוריות הדם האדומות על ידי anti-CR1 נוגדנים31 ואת היווצרות רוזטות בנוכחות של אריתרופוציטים מצופה עם C3b32. טכניקות אלה בסיסי הוחלפו במהירות על ידי שיטות חיסוני באמצעות radiolabeled אנטי CR1 נוגדנים1,33. ניתן גם למדוד את הריכוז של CR1 בתמציות קרום על ידי האנזים מקושר אנזימים הקשורים באותה שיטת (אליסה)34. למרות מדויק, טכניקות אלה רק לספק ערך ממוצע של צפיפות CR1/E. התפלגות הצפיפות של CR1/E על כל אוכלוסיית אריתרופוציטים כולה זמינה רק על ידי ניתוח ציטומטלי זרימה לאחר העיבוד החיסוני. טכניקה זו קשה בשל הצפיפות הנמוכה של CR1/E. אף על פי כן, שיטת הגברה מאפשרת למדוד בקלות את הצפיפות של CR1/E30.
כאן, אנו מציגים שיטה של כימות CR1/E על-ידי cy, לנסות להזרים את האות הפלואורסצנטית של תאים חיסוניים ויטראז '. מערכת הגברה כרוכה ארבע שכבות רצופות של הצביעת באמצעות נוגדנים biotinylated אנטי CR1 שבטיים J3D3; פילוקוארירין-streptavidin; streptavidin עז ביולוגית אנטי מלאכותית; . ושוב פילוקוארירין-streptavidin J3D3 מזהה שלושה אתרים אנטיגניים ב CR135, אם כי לא יותר מאחד באותו זמן. התיש הביוטינטי נגד הstreptavidin נוגדן הוא נוגדן רב שבטיים המכיר מספר אפיסקופים על streptavidin ומספק גשר טוב יותר בין שתי השכבות streptavidin מאשר biotin-streptavidin לבד. תהליך זה גם מועיל התשואה של הזריחה הגבוהה של phycoerythrin36 ואת רמת נמוכה של איגוד לא ספציפי של streptavidin37. עם האות מוגבר כל כך חזק, הגדרות נמוכות של צינורות פוטוטומטר של cytometer לאפשר יניאריות מושלם. שיטה זו, אשר מתאפיינת רגישות מעולה והפיכת התוכעות, מאפשרת זיהוי של פחות מ 100 CR1/תא.
עם זאת, שיטה זו דורשת דגימות מתוך שלושה נושאים שדחיסות של אריתרופואריציט CR1 ידוע: נושא אחד המבטא רמה נמוכה של אריתרופואריציט CR1 (180 CR1/E), נושא אחד המבטא רמה בינונית של הCR1 אריתרופואריטה (646 CR1/E) ונושא אחד המבטא רמה גבוהה של אריתרופואריציטוט CR1 (966 CR1/E). ניתן לקחת את המידות הראשונות של הצפיפות CR1 האריתרופויוציט של מספר אנשים, בתחילה באמצעות אריתרופוציטים משלושת הנושאים המשמשים במחקר שלנו, אשר אנו יכולים לספק. את דגימות הדם מנושאים של הטווח והנושאים שיש לכמת עבור CR1 יש לצייר באותו זמן, מאוחסנים במקרר ב 4 ° c, ומטופלים ב 4 ° c38. הדם שצויר בצינורות EDTA בקלות ניתן לניתוב והוא יכול להיות מאוחסן עבור 5 ימים ב 4 ° c, המאפשר הזמן לכמת של אריתרופויוציט CR1. לאחר מכן, הצפיפות של אריתרופואריציט CR1 מתחיל לרדת, ויש התמוטטות של עקומת CR1 רגיל, במיוחד בנקודה המתאימה לנושא המבטא רמה גבוהה של אריתרופואריטה CR1. מכיוון שקו הרגרסיה המתקבל מעוות, המדד של צפיפות CR1 כבר אינו מדויק. יש לציין כי באחסון מחוץ לבית הספר, טיפול בתנאים, ואת מגוון מכתים שכבות מוביל לאשכולות של CR1 והערכה קלה של מספרם של מולקולות CR1. אף על פי כן, השימוש בנוגדן anti-CR1 מיקוד שלושה אפיסקופים כגון J3D3 עם מערכת הגברה מאפשר התקבצות להתבצע באופן מלא, אשר מאפשר מדידה נכונה של CR1 צפיפות39.
למעשה, הצפיפות של CR1/E פוחתת במהלך החיים של אריתרופואריציט40. זה יסביר את הטרוגניות של צפיפות CR1/E באותו אדם. על פי כמה מחברים, את האינטנסיביות של קטבוליזם של CR1 הוא לא מתואם את הצפיפות הראשונית של CR1/E41, ואילו עבור מחברים אחרים, גבוה יותר את הצפיפות הראשונית, יותר את העוצמה של קטבוליזם42. מחצית החיים של CR1 על פני השטח של אריתרופוציטים הוא 11 – 32 ימים42.
לשיטה המוצגת כאן יש מספר יתרונות. הראשון הוא להיות מסוגל לבחור, תודות זרימת cy, התאים המשניים ללמוד בתוך דגימת דם זהה. על-ידי בחירת אוכלוסיית אריתרופוציטים באמצעות פונקציית השער, המדידה של צפיפות האריתרופוציט מובטחת באופן בלעדי. הטיה במדידה של אריתרופוציטים CR1 נגרמת על ידי נוכחות של אוכלוסיות משנה אחרות כגון כדוריות הדם הלבנות נמנעת. היתרון השני של שיטה זו היא כי הוא ניתן להתאמה לכמת של קולטנים סלולריים אחרים אשר צפיפות נמוכה על ידי פשוט להחליף את הנוגדן העיקרי anti-CR1 עם נוגדן מכוון במיוחד נגד אפירופה של קולטן להיות נחקר. היא גם ניתנת להתאמה לשימוש ב-96 צלחות היטב במקום בארונות צינורות, הדורשים דם נמוך וכרכים מגיב25,38. היתרון השלישי של שיטה זו הוא שהוא גמיש. במחקרים הנוגעים לתאים בעלי צפיפות גבוהה מאוד של CR1, למשל, לימפוציטים אנושיים (10,000 CR1/cell), או הפרימטים האנוציטים הקופים שCR1 צפיפות הוא 10 – 100x גדול מזה של בני אדם (10000 – 100,000 CR1/תא)43,44, ניתן להקטין את מספר שכבות מערכת הגברה, שימוש בנוגדן biotinylated אנטי CR1 בלבד, phycoerythrin-streptavidin או biotinylated anti-CR1 נוגדן, נוגדן אנטי עכבר biotinylated, ו phycoerythrin-streptavidin, ובכך התאמת רמת הזריחה לצפיפות גבוהה יותר של CR1. היתרון הרביעי של שיטה זו היא כי ניתן להשתמש בו עבור האריתרופוציטים קבוע או קפוא, המאפשר דגימות דם לאסוף באזורים חסרים מתקנים להזרים cy, לנסות ומאוחסן לכמת מדויקת יותר של CR138.
באופן כללי יותר, עם fluorochromes חדש ובהיר, זה כבר לא נראה חובה להשתמש במערכת של הגברה עקיפה. חוץ מזה, יש שיטות אחרות באמצעות הזרמת cy, שמאפשר להעריך את צפיפות הקולטנים הסלולריים ולכמת אותו ביחידות מידה (כלומר, כגון ABC, או קיבולת איגוד הנוגדן). ה-ABC לכל תא יכול להיקבע גם באמצעות ריכוזי שקיעה של נוגדנים וחרוזים מכויל. מספר מערכות מסחריות הינן זמינות. ערכות מסוימות הם מכויל מראש חרוזים סטנדרטיים המכילים רמות ידועות של מולקולות fluorochrome כגון PE מאוגד לכל חרוז. החרוזים שנרכשו על cytometer זרם באותו היום על הגדרות המכשיר אותו כמו דגימות החולה הפרט לאפשר לצייר עקומת רגיל השוואת הממוצע הגיאומטרי של הקרינה הידועה התוכן PE של החרוזים. ניתוח הרגרסיה, השיפוע, החיתוך ומקדם המתאם נקבעים, וערכי ABC מחושבים מהזריחה הגיאומטרית הנמדדת של התאים באמצעות העקומה הסטנדרטית45,46.
סוג נוסף של מבחן חרוז מבוסס על הכריכה של נוגדן מצומת חרוזים עם רמות הקיבולת של איגוד הנוגדן הספציפי באמצעות החלק crystallizable של השבר (Fc). חרוזים מתויגים עם נוגדנים זהה המשמש תווית התאים שצפיפות האנטיגן שלה הוא למדוד. כך, בניסוי אחד, כל נוגדן מצומת ניתן להשתמש, כל עוד את אותה אצווה עם היחס fluorophore/חלבון זהה (F/P יחס) משמש להכתים הן חרוזים ותאים47. ערכות מסוימות טובות יותר עבור הנחישות כמותית של משטח התא אנטיגנים על ידי הזרמת cy, לנסות באמצעות immunofluorescence עקיפים עקיף48,49.
לסיכום, השיטה שלנו יש את היתרון של מתן זיהוי רגיש מאוד ולהיות קל ליישם על החומר הרגיל cy, לנסות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
אנו מודים לכל חברי URCACyt, הזרימה cy, בפלטפורמת הטכנית, צוות המחלקה לאימונולוגיה, וצוות המחלקה לרפואה פנימית וגריאטריה, שתרמו למיטוב ולאימות הפרוטוקול. עבודה זו ממומנת על ידי בתי חולים של אוניברסיטת ריימס (גרנט מספר AOL11UF9156).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1000E Barrier Tip | Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France | 2079E | sample pipetting |
| 1-100 µL Bevelled, filter tip | Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Germany | S1120-1840 | sample pipetting |
| Biotinylated anti-CR1 monoclonal antibody (J3D3) | Home production of non-commercial monoclonal antibody, courtesy of Dr J. Cook | immunostaining | |
| Blouse | protection | ||
| Bovin serum albumin (7,5%) | Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France | 15260037 | cytometry |
| Centrifuge | Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France | 11176917 | centrifugation |
| Clean Solution | BD, F-38801 Le Pont de Claix, France | 340345 | cytometry |
| Comorack-96 | Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath | 944060P | rack |
| Cytometer Setup & Tracking Beads Kit | BD, F-38801 Le Pont de Claix, France | 655051 | cytometry |
| Formaldehyde solution 36.5 % | Sigma Aldrich, F-38070 Saint Quentin Fallavier, France | F8775-25ML | Fixation |
| 10 µL Graduated, filter tip | Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Germany | S1121-3810 | sample pipetting |
| LSRFORTESSA Flow Cytometer | BD, F-38801 Le Pont de Claix, France | 647788 | cytometry |
| Microman Capillary Pistons | Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath | 067494 | sample pipetting |
| Micronic 1.40 mL round bottom tubes | Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath | MP32051 | mix |
| Micropipette Microman - type M25 - | Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath | 066379 | sample pipetting |
| Phosphate buffered Saline (PBS) | Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France | 10010031 | cytometry |
| Pipette PS 325 mm, 10 mL | Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath | 391952 | sample pipetting |
| powder-free Nitrile Exam gloves | Medline Industries, Inc, Mundelein, IL 60060, USA | 486802 | sample protection |
| Reference 2 pipette, 0,5-10 µL | Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France | 4920000024 | sample pipetting |
| Reference 2 pipette, 20-100 µL | Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France | 4920000059 | sample pipetting |
| Reference 2 pipette, 100-1000 µL | Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France | 4920000083 | sample pipetting |
| Rinse Solution | BD, F-38801 Le Pont de Claix, France | 340346 | cytometry |
| Round bottom tube | Sarstedt, F-70150 Marnay, France | 55.1579 | cytometry |
| Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France | 0030120086 | mix |
| streptavidin R-PE | Tebu Bio, F-78612 Le Perray-en-Yvelines, France | AS-60669 | immunostaining |
| Tapered Centrifuge Tubes 50 mL | Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France | 10203001 | mix |
| Vector anti streptavidin biotin | Eurobio Ingen, F-91953 Les Ulis, France | BA-0500 | immunostaining |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries, Inc, Bohemia, NY 111716, USA | SI-0236 | mix |
References
- Fearon, D. T. Identification of the membrane glycoprotein that is the C3b receptor of the human erythrocyte, polymorphonuclear leukocyte, B lymphocyte, and monocyte. Journal of Experimental Medicine. 152 (1), 20-30 (1980).
- Ross, G. D., Winchester, R. J., Rabellino, E. M., Hoffman, T. Surface markers of complement receptor lymphocytes. Journal of Clinical Investigation. 62 (5), 1086-1092 (1978).
- Reynes, M., et al. Human follicular dendritic cells express CR1, CR2, and CR3 complement receptor antigens. The Journal of Immunology. 135 (4), 2687-2694 (1985).
- Gasque, P., et al. Identification and characterization of complement C3 receptors on human astrocytes. The Journal of Immunology. 156 (6), 2247-2255 (1996).
- Pascual, M., et al. Identification of membrane-bound CR1 (CD35) in human urine: evidence for its release by glomerular podocytes. Journal of Experimental Medicine. 179 (3), 889-899 (1994).
- Fearon, D. T. Regulation of the amplification C3 convertase of human complement by an inhibitory protein isolated from human erythrocyte membrane. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (11), 5867-5871 (1979).
- Dobson, N. J., Lambris, J. D., Ross, G. D. Characteristics of isolated erythrocyte complement receptor type one (CR1, C4b-C3b receptor) and CR1-specific antibodies. The Journal of Immunology. 126 (2), 693-698 (1981).
- Schreiber, R. D., Pangburn, M. K., Muller-Eberhard, H. J. C3 modified at the thiolester site: acquisition of reactivity with cellular C3b receptors. Bioscience Reports. 1 (11), 873-880 (1981).
- Ross, G. D., et al. Generation of three different fragments of bound C3 with purified factor I or serum. II. Location of binding sites in the C3 fragments for factors B and H, complement receptors, and bovine conglutinin. Journal of Experimental Medicine. 158 (2), 334-352 (1983).
- Klickstein, L. B., Barbashov, S. F., Liu, T., Jack, R. M., Nicholson-Weller, A. Complement receptor type 1 (CR1, CD35) is a receptor for C1q. Immunity. 7 (3), 345-355 (1997).
- Ghiran, I., et al. Complement receptor 1/CD35 is a receptor for mannan-binding lectin. Journal of Experimental Medicine. 192 (12), 1797-1808 (2000).
- Cornacoff, J. B., et al. Primate erythrocyte-immune complex-clearing mechanism. Journal of Clinical Investigation. 71 (2), 236-247 (1983).
- Waxman, F. J., et al. Complement depletion accelerates the clearance of immune complexes from the circulation of primates. Journal of Clinical Investigation. 74 (4), 1329-1340 (1984).
- Waxman, F. J., et al. Differential binding of immunoglobulin A and immunoglobulin G1 immune complexes to primate erythrocytes in vivo. Immunoglobulin A immune complexes bind less well to erythrocytes and are preferentially deposited in glomeruli. Journal of Clinical Investigation. 77 (1), 82-89 (1986).
- Horgan, C., Taylor, R. P. Studies on the kinetics of binding of complement-fixing dsDNA/anti-dsDNA immune complexes to the red blood cells of normal individuals and patients with systemic lupus erythematosus. Arthritis & Rheumatology. 27 (3), 320-329 (1984).
- Pham, B. N., et al. Analysis of complement receptor type 1 expression on red blood cells in negative phenotypes of the Knops blood group system, according to CR1 gene allotype polymorphisms. Transfusion. 50 (7), 1435-1443 (2010).
- Wilson, J. G., et al. Identification of a restriction fragment length polymorphism by a CR1 cDNA that correlates with the number of CR1 on erythrocytes. Journal of Experimental Medicine. 164 (1), 50-59 (1986).
- Rodriguez de Cordoba, S., Rubinstein, P. Quantitative variations of the C3b/C4b receptor (CR1) in human erythrocytes are controlled by genes within the regulator of complement activation (RCA) gene cluster. Journal of Experimental Medicine. 164 (4), 1274-1283 (1986).
- Herrera, A. H., Xiang, L., Martin, S. G., Lewis, J., Wilson, J. G. Analysis of complement receptor type 1 (CR1) expression on erythrocytes and of CR1 allelic markers in caucasian and african american populations. Clinical Immunology and Immunopathology. 87 (2), 176-183 (1998).
- Birmingham, D. J., et al. A CR1 polymorphism associated with constitutive erythrocyte CR1 levels affects binding to C4b but not C3b. Immunology. 108 (4), 531-538 (2003).
- Dykman, T. R., Hatch, J. A., Aqua, M. S., Atkinson, J. P. Polymorphism of the C3b/C4b receptor (CR1): characterization of a fourth allele. The Journal of Immunology. 134 (3), 1787-1789 (1985).
- Moulds, J. M., Moulds, J. J., Brown, M., Atkinson, J. P. Antiglobulin testing for CR1-related (Knops/McCoy/Swain-Langley/York) blood group antigens: negative and weak reactions are caused by variable expression of CR1. Vox Sanguinis. 62 (4), 230-235 (1992).
- Cohen, J. H., Lutz, H. U., Pennaforte, J. L., Bouchard, A., Kazatchkine, M. D. Peripheral catabolism of CR1 (the C3b receptor, CD35) on erythrocytes from healthy individuals and patients with systemic lupus erythematosus (SLE). Clinical & Experimental Immunology. 87 (3), 422-428 (1992).
- Jouvin, M. H., Rozenbaum, W., Russo, R., Kazatchkine, M. D. Decreased expression of the C3b/C4b complement receptor (CR1) in AIDS and AIDS-related syndromes correlates with clinical subpopulations of patients with HIV infection. AIDS. 1 (2), 89-94 (1987).
- Waitumbi, J. N., Donvito, B., Kisserli, A., Cohen, J. H., Stoute, J. A. Age-related changes in red blood cell complement regulatory proteins and susceptibility to severe malaria. The Journal of Infectious Diseases. 190 (6), 1183-1191 (2004).
- Mahmoudi, R., et al. Alzheimer's disease is associated with low density of the long CR1 isoform. Neurobiology of Aging. 36 (4), 5-12 (2015).
- Mahmoudi, R., et al. Inherited and Acquired Decrease in Complement Receptor 1 (CR1) Density on Red Blood Cells Associated with High Levels of Soluble CR1 in Alzheimer's Disease. International Journal of Molecular Sciences. 19 (8), 2175 (2018).
- Zaitsev, S., et al. Human complement receptor type 1-directed loading of tissue plasminogen activator on circulating erythrocytes for prophylactic fibrinolysis. Blood. 108 (6), 1895-1902 (2006).
- Scatchard, G. The attractions of proteins for small molecules and ions. Annals of the New York Academy of Sciences. 51 (4), 660-672 (1949).
- Cohen, J. H., et al. Enumeration of CR1 complement receptors on erythrocytes using a new method for detecting low density cell surface antigens by flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 99 (1), 53-58 (1987).
- Minota, S., et al. Low C3b receptor reactivity on erythrocytes from patients with systemic lupus erythematosus detected by immune adherence hemagglutination and radioimmunoassays with monoclonal antibody. Arthritis & Rheumatology. 27 (12), 1329-1335 (1984).
- Miyakawa, Y., et al. Defective immune-adherence (C3b) receptor on erythrocytes from patients with systemic lupus erythematosus. The Lancet. 2 (8245), 493-497 (1981).
- Lida, K., Mornaghi, R., Nussenzweig, V. Complement receptor (CR1) deficiency in erythrocytes from patients with systemic lupus erythematosus. Journal of Experimental Medicine. 155 (5), 1427-1438 (1982).
- Tao, K., Nicholls, K., Rockman, S., Kincaid-Smith, P. Expression of complement 3 receptors (CR1 and CR3) on neutrophils and erythrocytes in patients with IgA nephropathy. Clinical Nephrology. 32 (5), 203-208 (1989).
- Nickells, M., et al. Mapping epitopes for 20 monoclonal antibodies to CR1. Clinical and Experimental Immunology. 112 (1), 27-33 (1998).
- Oi, V. T., Glazer, A. N., Stryer, L. Fluorescent phycobiliprotein conjugates for analyses of cells and molecules. The Journal of Cell Biology. 93 (3), 981-986 (1982).
- Chaiet, L., Wolf, F. J. The properties of streptavidin, a biotin-binding protein produced by streptomyces. Archives of Biochemistry and Biophysics. 20 (106), 1-5 (1964).
- Cockburn, I. A., Donvito, B., Cohen, J. H., Rowe, J. A. A simple method for accurate quantification of complement receptor 1 on erythrocytes preserved by fixing or freezing. Journal of Immunological Methods. 20 (271), 59-64 (2002).
- Chen, C. H., et al. Antibody CR1-2B11 recognizes a non-polymorphic epitope of human CR1 (CD35). Clinical & Experimental Immunology. 148 (3), 546-554 (2007).
- Ripoche, J., Sim, R. B. Loss of complement receptor type 1 (CR1) on ageing of erythrocytes. Studies of proteolytic release of the receptor. Biochemical Journal. 235 (3), 815-821 (1986).
- Moldenhauer, F., Botto, M., Walport, M. J. The rate of loss of CR1 from ageing erythrocytes in vivo in normal subjects and SLE patients: no correlation with structural or numerical polymorphisms. Clinical & Experimental Immunology. 72 (1), 74-78 (1988).
- Cohen, J. H., Lutz, H. U., Pennaforte, J. L., Bouchard, A., Kazatchkine, M. D. Peripheral catabolism of CR1 (the C3b receptor, CD35) on erythrocytes from healthy individuals and patients with systemic lupus erythematosus (SLE). Clinical & Experimental Immunology. 87 (3), 422-428 (1992).
- Nickells, M. W., Subramanian, V. B., Clemenza, L., Atkinson, J. P. Identification of complement receptor type 1-related proteins on primate erythrocytes. The Journal of Immunology. 154 (6), 2829-2837 (1995).
- Hebert, L. A., Birmingham, D. J., Shen, X. P., Cosio, F. G. Stimulating erythropoiesis increases complement receptor expression on primate erythrocytes. Clinical Immunology and Immunopathology. 62 (3), 301-306 (1992).
- Davis, K. A., Abrams, B., Iyer, S. B., Hoffman, R. A., Bishop, J. E. Determination of CD4 antigen density on cells: Role of antibody valency, avidity, clones, and conjugation. Cytometry. 33 (2), 197-205 (1998).
- Pannu, K. K., Joe, E. T., Iyer, S. B. Performance evaluation of QuantiBRITE phycoerythrin beads. Cytometry. 45 (4), 250-258 (2001).
- Barnett, D., Storie, I., Wilson, G. A., Granger, V., Reilly, J. T. Determination of leucocyte antibody binding capacity (ABC): the need for standardization. Clinical Laboratory Haematology. 20 (3), 155-164 (1998).
- Bikoue, A., et al. Quantitative analysis of leukocyte membrane antigen expression: normal adult values. Cytometry. 26 (2), 137-147 (1996).
- Serke, S., van Lessen, A., Huhn, D. Quantitative fluorescence flow cytometry: a comparison of the three techniques for direct and indirect immunofluorescence. Cytometry. 33 (2), 179-187 (1998).
