Summary
Lo scopo di questo metodo è quello di determinare la densità di CR1 negli eritrociti di qualsiasi soggetto confrontandosi con tre soggetti la cui densità di eritrocito CR1 è nota. Il metodo utilizza la citometria di flusso dopo l'immunostaining degli eritrociti dei soggetti da parte di un anticorpo monoclonale anti-CR1 accoppiato a un sistema amplificato utilizzando la ficoerythrina (PE).
Abstract
CR1 (CD35, Complement Receptor tipo 1 per C3b/C4b) è una glicoproteina a membrana ad alto peso molecolare di circa 200 kDa che controlla l'attivazione del complemento, trasporta i complessi immunitari e partecipa alle risposte immunitarie umorali e cellulari. CR1 è presente sulla superficie di molti tipi di cellule, tra cui eritrociti, ed esibisce polimorfismi in lunghezza, struttura (Knops, o KN, gruppo sanguigno), e densità. La densità media di CR1 per eritrocite (CR1/E) è di 500 molecole per eritrocito. Questa densità varia da un individuo all'altro (100-1.200 CR1/E) e da un eritrocito all'altro nello stesso individuo. Qui presentiamo un robusto metodo di citometria di flusso per misurare la densità di CR1/E, anche in soggetti che esprimono una bassa densità, con l'aiuto di un sistema di immunostaining amplificante. Questo metodo ci ha permesso di mostrare l'abbassamento dell'espressione di cr1 errociti in malattie come il morbo di Alzheimer (AD), il lupus erythematosus (SLE), l'AIDS o la malaria.
Introduction
CR1 (recettore di complemento di tipo 1, CD35) è una glicoproteina transmembrana da 200 kDa presente sulla superficie di molti tipi di cellule, come gli eritrociti1, B linfociti2, cellule monocitiche, alcune cellule T, cellule dendritiche follicolari3, astrociti fetali4e glomerari podociti5. CR1 che interferisce con i suoi ligandi C3b, C4b, C3bi6,7,8,9, una sottounità del primo componente complementare, C1q10 e MBL (mannan-leg lectin)11 inibisce l'attivazione del complemento ed è coinvolto nella risposta immunitaria umorale e cellulare.
Nei primati, compresi gli esseri umani, l'eritrocite CR1 è coinvolto nel trasporto di complessi immunitari al fegato e alla milza, per purificare il sangue e prevenirne l'accumulo nei tessuti vulnerabili come la pelle o i reni12,13,14. Questo fenomeno di adesione immunitaria tra complessi immunitari ed eritrociti dipende dal numero di molecole CR115. Nell'uomo, la densità media di CR1/E è solo 500 (cioè 500 molecole di CR1 per eritrocito). Questa densità varia da un individuo all'altro (100-1.200 CR1/E) e da un eritrocito all'altro nello stesso individuo. Alcuni individui di fenotipo "null" esprimono meno di 20 CR1/E16.
La densità di CR1/E è regolata da due alleli autosomici co-dominanti legati a una mutazione puntiforme nell'intron 27 della codifica genica per CR1-117,18. Questa mutazione produce un sito di restrizione aggiuntiva per l'enzima HindIII. I frammenti di restrizione ottenuti dopo la digestione con HindIII in questo caso sono 7,4 kb per l'allele legato a una forte espressione di CR1 (H: high allele) e 6,9 kb per l'allele legato alla bassa espressione CR1 (L: basso allele). Questo collegamento si trova in caucasici e asiatici, ma non in persone di origine africana19.
Il livello di espressione dell'eritrocite CR1 è anche correlato alla presenza di mutazioni di nucleotidi puntuali nella codifica exon 13 SCR 10 (I643T) e nella codifica exon 19 SCR16 (Q981H). È alto in omozigolo 643I/981Q e basso in omozygous 643T/981H individui20. Così, individui "bassi" esprimono circa 150 CR1/E, individui "medi" esprimono circa 500 CR1/E, e le persone "alte" esprimono circa 1.000 CR1/E.
Oltre a questo polimorfismo a densità di eritrociti, CR1 è caratterizzato da un polimorfismo di lunghezza corrispondente a quattro allotipi di diverse dimensioni: CR1,1 (190 kDa), CR1-2 (220 kDa), CR1-3 (160 kDa) e CR1-4 (250 kDa)21 e un antimorfismo corrispondente al gruppo sanguigno KN22.
Presentiamo il nostro metodo basato sulla citometria di flusso per determinare la densità di CR1/E. Utilizzando tre soggetti la cui densità CR1/E è nota, esprimendo un basso livello di densità (180 CR1/E), un livello di densità media (646 CR1/E) e un alto livello di densità (966 CR1/E), è facile misurare l'intensità media di fluorescenza (MFI) dei loro eritrociti o globuli rossi (RBC) o RBC MFI, dopo l'anti-CR1ining utilizzando un citometro a flusso. Si può quindi tracciare una linea standard che rappresenta la MFI in funzione della densità CR1/E. Misurando le MFI di soggetti la cui densità CR1/E non è nota e confrontandola con questa linea standard, è possibile determinare la densità CR1/E degli individui. Questa tecnica è stata utilizzata per molti anni in laboratorio, e ci ha permesso di rilevare una riduzione dell'espressione di eritrocite CR1 in molte patologie come il lupus erythematosos sistemico (SLE)23, Sindrome da immunodeficienza acquisita (AIDS)24,malaria25e recentemente malattia di Alzheimer (AD)26,27. Lo sviluppo di farmaci destinati a CR1 ad accoppiarsi con eritrociti, come nel caso dei farmaci antitroculo28 richiede la valutazione della densità CR1/E e la disponibilità di una tecnica robusta per quantificare CR1.
Il protocollo presentato viene eseguito nel singliatore. È adattabile per determinare la densità di CR1/E su molti individui utilizzando specifiche lastre disponibili in commercio 96 pozze (vedi Tabella dei materiali). A tal fine, è facile adattare il nostro metodo a qualsiasi piastra da 96 pozzi. Per ogni campione, una sospensione cellulare di eritrociti (0,5 x 106–1 x 106 eretrociti) viene distribuita per ogni pozzo. Per ogni pozzo, prima viene aggiunto l'anticorpo anti-CR1 primario, poi streptavidin PE, l'anticorpo anti-streptavidin secondario, e di nuovo streptavidin PE, utilizzando le stesse diluizioni del nostro metodo, ma adattando i volumi e rispettando la proporzionalità.
I campioni di sangue provenienti da soggetti della gamma e da soggetti da quantificare per CR1 devono essere prelevati contemporaneamente, conservati in frigorifero a 4 gradi centigradi e trattati a 4 gradi centigradi (sul ghiaccio e/o in frigorifero).
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Protocol
Il protocollo per la raccolta e la manipolazione del sangue umano è stato rivisto e approvato dal comitato etico regionale (CPP Est II), e il numero di protocollo è 2011-A00594-37. Poiché il seguente protocollo descrive la manipolazione del sangue umano, devono essere seguite linee guida istituzionali per lo smaltimento di materiale biopericoloso. Devono essere indossate attrezzature di sicurezza di laboratorio, come cappotti da laboratorio e guanti.
1. Lavaggio eretritrita
NOTA: Il giorno prima della movimentazione, preparare un buffer PBS-BSA con salina tampina tampone fosfata (PBS) contenente lo 0,15% dell'albumina del siero bovino (BSA) e posizionarlo in frigorifero a 4 gradi centigradi. Questo buffer verrà utilizzato come buffer di lavaggio e come buffer di diluizione.
- Pipette 20 mL di PBS-BSA in un tubo da 50 mL.
- Aspirare 250 - L di sodio etilenedia acido tetraacetico (EDTA) anticoagulato sangue intero da tubi di stoccaggio del sangue e aggiungere al tubo contenente i 20 mL di PBS-BSA. Chiudere il tubo avvitando il tappo. Mescolare delicatamente invertendo il tubo 2x.
- Centrifugare il tubo per 10 min a 4 gradi centigradi a 430 x g. Rimuovere e scartare il supernatante utilizzando una pipetta da 10 mL. Risospendere il pellet nel volume residuo del supernatante con una leggera e attenta pipettatura.
- Aggiungere 20 mL di PBS-BSA freddo (4 gradi centigradi) nel tubo contenente il pellet. Centrifugare il tubo per 10 min a 4 gradi centigradi a 430 x g. Rimuovere e scartare il supernatante utilizzando una pipetta da 10 mL.
- Aggiungere 20 mL di PBS-BSA freddo (4 gradi centigradi) nel tubo contenente il pellet. Centrifugare il tubo per 10 min a 4 gradi centigradi a 430 x g. Lasciare il tubo nella centrifuga a 4 gradi centigradi e passare alla sezione 2.
2. Diluizione eritrociti
- Pipette 3 mL di PBS-BSA freddo in un tubo da 50 mL e conservarlo a 4 gradi centigradi su un rack nel ghiaccio.
- Mettere il tubo centrifugato contenente gli eritrociti (passaggio 1.4) su un rack posto nel ghiaccio.
- Pipette 8 - L di eritrociti pelleta utilizzando la pipetta e aggiungere al tubo da 50 mL contenente il 3 mL di PBS-BSA per ottenere la diluizione eritrocita. Mescolare delicatamente il tubo a mano per ottenere una sospensione omogenea delle cellule degli eritrociti.
3. Immunostaining all'eritrocito
- Pipetta 100 - L di diluizione eritrocite (ottenuta nella sezione 4) e aggiunta a tubi da 1,4 mL.
- Centrifugare i tubi per 5 min a 4 gradi centigradi a 430 x g. Durante la centrifugazione, preparare una diluizione dell'anticorpo biotinylato anti-CR1 J3D3 ad una concentrazione di 0,05 g/l nel buffer PBS-BSA.
- Una volta terminata la centrifugazione, rimuovere e scartare il supernatale.
- Aggiungere al pellet 20 l di anti-CR1 J3D3 biotinylato. Per preparare il controllo negativo, aggiungere invece 20 l di buffer PBS-BSA. Mescolare delicatamente i tubi e incubare per 45 min a 4 gradi centigradi.
- Dopo 45 min di incubazione, aggiungere 750 -L di PBS-BSA ai tubi. Centrifugare i tubi per 5 min a 4 gradi centigradi a 430 x g. Rimuovere e scartare il super-natante. Ripetere.
- Nel frattempo, preparare una diluizione 1:10 di streptavidin-phycoerythrin diluita nel buffer PBS-BSA. Pipette 20 -L della diluizione 1:10 di streptavidin-phycoerythrin e aggiungere ai tubi. Mescolare delicatamente i tubi e incubare per 45 min a 4 gradi centigradi.
- Aggiungere 750 l di tampone PBS-BSA nei tubi. Mescolare bene e centrifugare per 5 min a 4 gradi centigradi a 430 x g. Rimuovere e scartare il super-natante. Ripetere.
- Durante la centrifugazione, preparare una diluizione 1:100 dell'anticorpo anti-streptavidinbio biotinylato diluito nel tampone PBS-BSA.
- Una volta terminata la centrifugazione, rimuovere e scartare il supernatale.
- Pipette 20 -L della diluizione 1:100 di anti-streptavidina biomutata nei tubi. Mescolare delicatamente i tubi. Incubare i tubi per 45 min a 4 gradi centigradi.
- Dopo 45 minuti di incubazione, pipetta 750 l di tampone PBS-BSA e aggiungere nei tubi. Centrifugare i tubi per 5 min a 4 gradi centigradi a 430 x g. Rimuovere e scartare il super-natante. Ripetere.
- Pipette 20 -L della diluizione 1:10 di streptavidin-phycoerythrin e aggiungere nei tubi. Mescolare delicatamente i tubi. Incubare i tubi per 45 min a 4 gradi centigradi.
- Pipetta 750 L di tampone PBS-BSA e aggiungere nei tubi. Mescolare bene e centrifugare i tubi per 5 min a 4 gradi centigradi a 430 x g. Rimuovere e scartare il super-natante. Ripetere questo passaggio 2x.
4. Fissazione dell'eritrocito immunostaina
- Durante l'ultima centrifugazione, preparare il buffer di fissaggio, una diluizione di 1:100 del 37% di formaldeide utilizzando il buffer di lavaggio PBS-BSA.
- Pipetta 450 - L di tampone di fissaggio e aggiungere in tubi di eritrocito immunostained (dal punto 3.13) durante il vortice per 5 s.
- Pipette tutte le cellule fisse in tubi di fondo rotondi 5 mL e conservare in frigorifero.
NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui per un massimo di 48 h.
5. Analisi della citometria di flusso degli eritrociti macchiati
NOTA: Si consiglia di fare riferimento al manuale dell'operatore per il citometro (vedi Tabella dei materiali) per sapere come eseguire le letture citometriche. I parametri suggeriti di seguito si applicano allo strumento utilizzato e devono essere ottimizzati per ogni citometro.
- Accendere il citometro di flusso, quindi accendere il computer. Lasciare che la temperatura del sistema ottico si stabilizzi lasciandolo acceso per 30 min. Controllare la finestra del citometro nel software per assicurarsi che il citometro sia collegato alla stazione di lavoro (viene visualizzato il messaggio Cytometer Connected).
- Verificare che il contenitore del buffer sia pieno e che il contenitore dei rifiuti sia vuoto. Rimuovere le bolle d'aria nel filtro buffer e la linea del buffer utilizzando il sistema di spurgo. Prime il sistema fluidico premendo il tasto Prime sulla console del citometro. Attendere che la spia dell'indicatore cambi da rosso a verde.
- Per pulire la fluidicsità, installare un tubo contenente 3 mL di una soluzione di pulizia sulla porta di iniezione del campione e consentire alla soluzione di pulizia di funzionare per 5 min con un'elevata portata di campionamento. Ripetere l'operazione con la soluzione di risciacquo con acqua distillata. Lasciare il tubo contenente acqua sulla porta di iniezione del campione.
- Per preparare le perline di calibrazione, pipetta 400 L di PBS nella parte inferiore di un tubo inferiore rotondo. Mescolare fortemente i supporti di perline vortice per 30 s. Aggiungere una goccia al tubo rotondo inferiore contenente PBS. Mescolare con cura vortice per 30 s.
- Eseguire il controllo delle prestazioni. Aprire il modulo Setup e Tracking del citometro nel software ( Figura1A). Verificare che la configurazione del citometro sia corretta per l'esperimento utilizzando l'immunostaining PE. Verificare che il batch di perline di calibrazione sia corretto con la configurazione.
- Installare il tubo di perline sulla porta di iniezione del campione e lasciarlo funzionare con una bassa portata di campionamento. Eseguire il controllo delle prestazioni, che richiede circa 5 minuti per il completamento). Una volta completato il controllo delle prestazioni, verificare che le prestazioni del citometro siano soddisfacenti (Figura 1B). Chiudere il modulo Impostazione e monitoraggio del citometro nel software.
- Per configurare un esperimento e creare le impostazioni dell'applicazione, fai clic sul pulsante Nuovo esperimento sulla barra degli strumenti del browser e apri il nuovo esperimento. Specificare i parametri selezionando le impostazioni del citometro appropriate: Dispersione in avanti (FSC), Dispersione laterale (SSC) e PE dal menu a discesa dell'esperimento (Figura 1C). Selezionare Modalità lineare per il parametro FSC e Modalità logaritmo per i parametri SSC e PE.
- Nell'esperimento aperto selezionare Impostazioni citometro (Figura 1D), quindi Impostazioni applicazionee creare un foglio di lavoro globale (Figura 1E). Utilizzare le caselle grigie e mirino per guidare l'ottimizzazione.
- Caricare il tubo di controllo non infilato sul citometro ed eseguire Acquisizione. Assicurarsi che la popolazione di interesse (ad esempio, RBC) sia in scala ottimizzando le tensioni FSC e SSC. Ottimizzare il valore soglia FSC per eliminare i detriti senza interferire con la popolazione di interesse.
- Disegnare un cancello intorno agli RBC sul grafico FSC vs SSC. Visualizza la popolazione RBC nella trama a punti della fluorescenza PE. Se necessario, aumentare la fluorescenza delle tensioni del tubo fotomoltiplicatore (PMT) per posizionare la popolazione negativa all'interno delle caselle grigie. Scaricare il tubo di controllo non instanellato dal citometro.
- Verificare che le popolazioni positive siano su larga scala. Caricare il tubo di controllo colorato sul citometro ed eseguire acquisizione. Abbassare la tensione di PMT per la popolazione positiva se è fuori scala fino a quando la popolazione positiva può essere visto interamente su scala. Quindi scaricare il campione macchiato.
- Per registrare e analizzare gli esempi, in un nuovo foglio di lavoro globale creare i grafici seguenti per l'anteprima dei dati: 1) FSC e SSC e 2) istogramma a fluorescenza PE. Caricare il primo campione sul citometro ed eseguire Acquisizione.
- Disegna un cancello RBC intorno agli eritrociti sulla trama FSC contro SSC. Visualizzare la popolazione RBC nell'istogramma della fluorescenza PE. Nella vista Statistiche, selezionare la media per i parametri di fluorescenza PE su popolazioni GR (Figura 1F).
- Nel dashboard Acquisizione selezionare tutti gli eventi nel gate di arresto e 10.000 eventi da registrare (Figura 1G). Fare clic su Registra dati. Al termine della registrazione degli eventi, rimuovere il primo tubo dal citometro. I grafici del foglio di lavoro globale dovrebbero essere simili a quelli della Figura 2.
- Caricare i campioni seguenti e registrarli.
6. Determinazione della densità dell'eritrocito CR1
- Prendere i valori dell'intensità media a fluorescenza dei campioni corrispondenti al soggetto "basso" (Figura 3, Tabella I, RBC MFI), soggetto "medio" ( Figura4, Tabella D, RBC MFI), soggetto "alto" ( Figura4, Tabella I, RBC MFI), e al campione di controllo negativo ( Figura3, Tabella I, RBC MFI).
- In un grafico che rappresenta l'intensità media di fluorescenza in funzione della densità di CR1, posizionare i quattro punti corrispondenti al controllo negativo, al soggetto "basso", al soggetto "medio" e al soggetto "alto" (punti blu, figura 6).
- Disegnare la retta di regressione per ottenere la retta di calibrazione e la relativa equazione.
- Prendere i valori dell'intensità media di fluorescenza dei campioni corrispondenti ai soggetti la cui densità deve essere determinata. (Figura 5, Tabelle D e I, RBC MFI).
- Ottenere l'equazione sostituendo "Y" utilizzando i valori delle intensità di fluorescenza media e calcolare la densità di CR1/E (Figura 6).
- Controllare sul grafico che i valori medi di intensità a fluorescenza e la densità determinata di CR1/E corrispondano a un punto sulla linea di calibrazione (Figura 6).
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Representative Results
Gli eritrociti di tre soggetti la cui densità di CR1 è nota ("bassa" [180 CR1/E], soggetto "medio" [646 CR1/E], e soggetto "alto" [966 CR1/E]), e di due soggetti la cui densità di CR1 doveva essere determinata sono stati immunostained da un anti-organismo anti-CR1 accoppiato ad un sistema di amplificazione utilizzando il fisiologia. All'inizio, la densità CR1 dei soggetti della fascia bassa-alta è stata determinata dal metodo Scatchard29 utilizzando anticorpi radioetichettati. Gli standard (basso, medio e alto) determinati sono stati utilizzati per una curva di calibrazione e hanno permesso di quantificare nuovi standard o sottostandard con il nostro metodo di citometria30. Dopo il passaggio di eritrociti immunostainsi nel citometro di flusso, l'intensità dell'etichettatura è stata osservata e misurata come l'intensità media di fluorescenza per ogni soggetto (RBC MFI)(Figura 3F,I; Figura 4B,D,F,I; Figura 5B,D,F,I). Una curva è stata tracciata utilizzando i valori dei soggetti con la densità nota dell'eritrocito CR1 ("da basso" a "alto") segnalandoli in funzione dell'intensità media di fluorescenza. Confronto tra la retta di regressione risultante da questa curva e i valori dell'intensità media della fluorescenza degli altri soggetti ha determinato la loro densità CR1/E (Figura 6). Figura 7 Mostra il flusso di lavoro complessivo.
Figura 1: Console cytometro e finestre che appaiono durante il protocollo di citometria di flusso. (A) Finestra visualizzata dopo l'applicazione del passaggio 5.5 del protocollo. (B) Finestra visualizzata dopo l'applicazione del passaggio 5.6 del protocollo. (C) Finestra che appare dopo l'applicazione del passaggio 5.7 del protocollo. (D) Finestra visualizzata dopo l'applicazione del passaggio 5.8 del protocollo. (E) Finestra visualizzata dopo l'applicazione del passaggio 5.8 del protocollo. (F) Finestra visualizzata dopo l'applicazione del passaggio 5.13 del protocollo. (G) Finestra che appare dopo l'applicazione del passaggio 5.14 del protocollo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Aspetto degli oggetti di analisi del foglio di lavoro globale. Aspetto degli oggetti di analisi del foglio di lavoro globale dopo l'applicazione del passaggio 5.14 del protocollo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Risultati dell'analisi della citometria di flusso dell'immunostaining anti-CR1 degli eritrociti corrispondenti al controllo negativo e al soggetto dal soggetto di gamma ("basso") che ha espresso densità LOW CR1 (180 CR1/E). Per ogni soggetto: (A,E) una macchia puntino che mostra l'aspetto degli eventi acquisiti in base alle dimensioni e ai parametri di granulometria, (G) il cancello che seleziona la popolazione di eritrociti tra gli eventi, (B,F) un istogramma che rappresenta l'intensità dell'etichettatura, (C,H) una tabella statistica associata che presenta il numero di eventi corrispondenti agli eritrociti e la loro percentuale, (D,I) una tabella associata che fornisce l'intensità media della fluorescenza (RBC MFI). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Risultati dell'analisi della citometria di flusso dell'immunostaining anti-CR1 degli eritrociti corrispondenti ai soggetti della gamma: soggetto "medio" che ha espresso densità MEDIA CR1 (646 CR1/E) e soggetto "alto" che hanno espresso densità HIGH CR1 (966 CR1/E). Per ogni soggetto: (A, E) una macchia puntino che mostra l'aspetto degli eventi acquisiti in base alle dimensioni e ai parametri di granulometria, (G) il cancello che seleziona la popolazione di eritrociti tra gli eventi, (B, F) un istogramma che rappresenta l'intensità dell'etichettatura, (C, H) una tabella statistica associata che presenta il numero di eventi corrispondenti agli eritrociti e la loro percentuale, (D, I) una tabella associata che fornisce l'intensità media della fluorescenza (RBC MFI). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Risultati dell'analisi della citometria di flusso dell'immunostaining anti-CR1 degli eritrociti corrispondenti ai soggetti la cui densità di CR1 doveva essere determinata. Per ogni soggetto: (A, E) una macchia puntino che mostra l'aspetto degli eventi acquisiti in base alle dimensioni e ai parametri di granulometria, (G) il cancello che seleziona la popolazione di eritrociti tra gli eventi, (B, F) un istogramma che rappresenta l'intensità dell'etichettatura, (C, H) una tabella statistica associata che presenta il numero di eventi corrispondenti agli eritrociti e la loro percentuale, (D, I) una tabella associata che fornisce l'intensità media della fluorescenza (RBC MFI). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Curva di calibrazione e linea di regressione che consentono la determinazione della densità di CR1. (A), (B) La curva di calibrazione e la retta di regressione disegnate in base alla densità CR1 nota dei soggetti dell'intervallo (controllo negativo: 0 CR1, soggetto "basso" [180 CR1/E], soggetto "medio" [646 CR1/E], e soggetto "alto" [966 CR1/E]) e ai rispettivi valori di intensità di fluorescenza media ottenuti dalla citometria di flusso. (C), (X) Dall'equazione di questa retta di regressione, abbiamo calcolato la densità dell'eritrocito CR1 per i soggetti la cui intensità media di fluorescenza è stata quantificata dalla citometria di flusso: frecce arancioni, Soggetto 1 (intensità media di fluorescenza - 1.334; Densità di CR1/E - 459) e soggetto 2 (intensità media di fluorescenza - 2820; Densità CR1/E : 1.000). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Diagramma di flusso del protocollo per determinare la densità di eritrociti CR1 da campioni di sangue umano. Raccogliere un campione di sangue umano. Lavare il campione di sangue umano mediante centrifugazione per ottenere eritrociti. Macchiare gli eritrociti usando un anticorpo anti-CR1. Utilizzare la citometria a flusso per determinare la densità di eritrocite CR1 in base a una curva di calibrazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Sono disponibili diverse tecniche per determinare la densità dell'eritrocito CR1 (CR1/E). Le prime tecniche utilizzate sono state l'agglutinazione dei globuli rossi dagli anticorpi anti-CR131 e la formazione di rosette in presenza di eritrociti rivestiti con C3b32. Queste tecniche rudimentali sono state rapidamente sostituite da metodi di immunostainizzazione utilizzando anticorpi anti-CR1 radioetichettati1,33. È anche possibile misurare la concentrazione di CR1 negli estratti di membrana mediante saggio immunosorbente enzimatico (ELISA)34. Sebbene accurate, queste tecniche forniscono solo un valore medio della densità CR1/E. La distribuzione della densità di CR1/E su tutta la popolazione di eritrociti è disponibile solo mediante analisi citometrica a flusso dopo l'immunostaining. Questa tecnica è difficile a causa della bassa densità di CR1/E. Tuttavia, un metodo di amplificazione ora consente di misurare facilmente la densità di CR1/E30.
Qui, presentiamo un metodo di quantificazione CR1/E con citometria di flusso basato sull'amplificazione del segnale di fluorescenza delle cellule immunostainse. Il sistema di amplificazione coinvolge quattro strati successivi di colorazione utilizzando l'anticorpo monoclonale bio-CR1 J3D3; ficoerythrin-streptavidin; un anticorpo biotinylato capra anti-streptavidina; e ancora phycoerythrin-streptavidin. J3D3 riconosce tre siti antigenici su CR135, anche se non più di uno allo stesso tempo. L'anticorpo biotinylato anti-streptavidina capra è un anticorpo policlonale che riconosce più epitopi su streptavidina e fornisce un ponte migliore tra i due strati di streptavidina rispetto alla biotina-streptavidina da solo. Questo processo beneficia anche dell'elevata resa di fluorescenza della ficoerythrin36 e del basso livello di legame non specifico di streptavidina 37. Con un segnale amplificato così forte, le impostazioni basse dei tubi fotomoltiplicatori del citometro consentono una perfetta linearità. Questo metodo, caratterizzato da un'eccellente sensibilità e riproducibilità, consente il rilevamento di meno di 100 CR1/cellula.
Tuttavia, questo metodo richiede campioni di tre soggetti la cui densità di eritrocite CR1 è nota: un soggetto che esprime un basso livello di eritrocito CR1 (180 CR1/E), un soggetto che esprime un livello medio di eritrocite CR1 (646 CR1/E) e un soggetto che esprime un alto livello di eritrocito CR1 (966 CR11/E). È possibile effettuare le prime misurazioni della densità di eritrocite CR1 di diversi individui, inizialmente utilizzando gli eritrociti dei tre soggetti utilizzati nel nostro studio, che possiamo fornire. I campioni di sangue provenienti da soggetti della gamma e soggetti da quantificare per CR1 devono essere prelevati contemporaneamente, conservati in frigorifero a 4 gradi centigradi e trattati a 4 gradicentigradi. Il sangue prelevato nei tubi EDTA è facilmente instradabile e può essere conservato per 5 giorni a 4 gradi centigradi, lasciando il tempo per la quantificazione dell'eritrocito CR1. Dopo di che, la densità di eritrocite CR1 inizia a diminuire, e c'è un crollo della curva standard CR1, soprattutto nel punto corrispondente al soggetto che esprime un alto livello di eritrocito CR1. Poiché la retta di regressione risultante è distorta, la misura della densità CR1 non è più accurata. Va notato che lo stoccaggio in vitro, le condizioni di manipolazione e la colorazione a più livelli portano al clustering di CR1 e a una leggera sopravvalutazione del numero di molecole CR1. Tuttavia, l'uso di un anticorpo anti-CR1 destinato a tre epitopi come J3D3 con il sistema di amplificazione consente di eseguire il clustering completo, che consente una corretta misurazione della densità CR139.
Infatti, la densità di CR1/E diminuisce durante la vita dell'eritrocito40. Ciò spiegherebbe l'eterogeneità della densità di CR1/E nello stesso individuo. Secondo alcuni autori, l'intensità del catabolismo di CR1 non è correlata alla densità iniziale di CR1/E41, mentre per altri autori, maggiore è la densità iniziale, maggiore è l'intensità del catabolismo42. L'emivita di CR1 sulla superficie degli eritrociti è di 11-32 giorni42.
Il metodo qui presentato presenta diversi vantaggi. Il primo è quello di essere in grado di selezionare, grazie alla citometria di flusso, le sottopopolazioni cellulari da studiare all'interno dello stesso campione di sangue. Selezionando la popolazione di eritrociti utilizzando la funzione gate, la misurazione della densità degli eritrociti è garantita esclusivamente. Si evita un pregiudizio nella misurazione dell'eritrocite CR1 causato dalla presenza di altre sottopopolazioni cellulari come i globuli bianchi. Il secondo vantaggio di questo metodo è che è adattabile alla quantificazione di altri recettori cellulari la cui densità è bassa semplicemente sostituendo l'anticorpo anti-CR1 primario con un anticorpo specificamente diretto contro un epitopo del recettore da studiare. È anche adattabile all'utilizzo di 96 pozze invece di rack tubo, che richiede minori volumi di sangue e reagenti25,38. Il terzo vantaggio di questo metodo è che è flessibile. Negli studi riguardanti cellule con una densità molto elevata di CR1, ad esempio, linfociti umani (10.000 CR1/cellula), o eritrociti di primati non umani la cui densità di CR1 è 10-100 volte superiore a quella degli esseri umani (10.000–100.000 CR1/cella)43,44, è possibile ridurre il numero di strati del sistema di amplificazione, utilizzando solo anticorpi monoclonali biotinylati, phycoerythrin-streptavidin o anti-CR1 monoclonalanti biotinylati, anticorpi anti-topo biotinylati e ficoerythrina-streptavidina, adattando così il livello di fluorescenza alla maggiore densità di CR1. Il quarto vantaggio di questo metodo è che può essere utilizzato per eritrociti fissi o congelati, consentendo la raccolta di campioni di sangue in aree prive delle strutture per la citometria di flusso e conservate per una successiva quantificazione accurata di CR138.
Più in generale, con i nuovi fluorocro più luminosi, non sembra più obbligatorio utilizzare il sistema di amplificazione indiretta. Inoltre, ci sono altri metodi che utilizzano citometria di flusso che consentono di valutare la densità dei recettori cellulari e di quantificarla in unità di misura (ad esempio ABC, o capacità di legame degli anticorpi). L'ABC per cellula può anche essere determinato utilizzando concentrazioni saturanti di anticorpi e perline calibrate. Sono disponibili diversi sistemi commerciali. Alcuni kit sono perline standard precalibrate contenenti livelli noti di molecole fluorocromiche come PE legato per tallone. Le perline acquisite su un citometro di flusso nello stesso giorno con le stesse impostazioni dello strumento dei singoli campioni di pazienti consentono di disegnare una curva standard confrontando la media geometrica di fluorescenza con il contenuto noto di PE delle perline. L'analisi di regressione, la pendenza, l'intercetta e il coefficiente di correlazione vengono determinati e i valori ABC vengono calcolati dalla fluorescenza media geometrica misurata delle celle utilizzando la curva standard45,46.
Un ulteriore tipo di test del tallone si basa sul legame di un anticorpo coniugato a perline con specifici livelli di capacità di legame degli anticorpi tramite la porzione cristallizzabile del frammento (Fc). Le perline sono etichettate con lo stesso anticorpo usato per etichettare le cellule la cui densità di antigene deve essere misurata. Così, in un singolo esperimento, qualsiasi anticorpo coniugato può essere utilizzato, purché lo stesso lotto con lo stesso rapporto fluoroforo/proteina (rapporto F/P) viene utilizzato per macchiare sia perline che cellule47. Alcuni kit sono migliori per la determinazione quantitativa degli antigeni della superficie cellulare da citometria di flusso utilizzando assi di immunofluorescenza indiretta48,49.
In conclusione, il nostro metodo ha il vantaggio di fornire un rilevamento molto sensibile ed essere facile da implementare su materiale di citometria di flusso ordinario.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo tutti i membri della piattaforma tecnica URCACyt, la piattaforma tecnica di citometria di flusso, lo staff del Dipartimento di Immunologia e lo staff del Dipartimento di Medicina Interna e Geriatria, che hanno contribuito a ottimizzare e convalidare il protocollo. Questo lavoro è stato finanziato dalla Reims University Hospitals (numero di sovvenzione AOL11UF9156).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1000E Barrier Tip | Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France | 2079E | sample pipetting |
| 1-100 µL Bevelled, filter tip | Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Germany | S1120-1840 | sample pipetting |
| Biotinylated anti-CR1 monoclonal antibody (J3D3) | Home production of non-commercial monoclonal antibody, courtesy of Dr J. Cook | immunostaining | |
| Blouse | protection | ||
| Bovin serum albumin (7,5%) | Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France | 15260037 | cytometry |
| Centrifuge | Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France | 11176917 | centrifugation |
| Clean Solution | BD, F-38801 Le Pont de Claix, France | 340345 | cytometry |
| Comorack-96 | Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath | 944060P | rack |
| Cytometer Setup & Tracking Beads Kit | BD, F-38801 Le Pont de Claix, France | 655051 | cytometry |
| Formaldehyde solution 36.5 % | Sigma Aldrich, F-38070 Saint Quentin Fallavier, France | F8775-25ML | Fixation |
| 10 µL Graduated, filter tip | Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Germany | S1121-3810 | sample pipetting |
| LSRFORTESSA Flow Cytometer | BD, F-38801 Le Pont de Claix, France | 647788 | cytometry |
| Microman Capillary Pistons | Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath | 067494 | sample pipetting |
| Micronic 1.40 mL round bottom tubes | Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath | MP32051 | mix |
| Micropipette Microman - type M25 - | Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath | 066379 | sample pipetting |
| Phosphate buffered Saline (PBS) | Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France | 10010031 | cytometry |
| Pipette PS 325 mm, 10 mL | Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath | 391952 | sample pipetting |
| powder-free Nitrile Exam gloves | Medline Industries, Inc, Mundelein, IL 60060, USA | 486802 | sample protection |
| Reference 2 pipette, 0,5-10 µL | Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France | 4920000024 | sample pipetting |
| Reference 2 pipette, 20-100 µL | Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France | 4920000059 | sample pipetting |
| Reference 2 pipette, 100-1000 µL | Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France | 4920000083 | sample pipetting |
| Rinse Solution | BD, F-38801 Le Pont de Claix, France | 340346 | cytometry |
| Round bottom tube | Sarstedt, F-70150 Marnay, France | 55.1579 | cytometry |
| Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France | 0030120086 | mix |
| streptavidin R-PE | Tebu Bio, F-78612 Le Perray-en-Yvelines, France | AS-60669 | immunostaining |
| Tapered Centrifuge Tubes 50 mL | Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France | 10203001 | mix |
| Vector anti streptavidin biotin | Eurobio Ingen, F-91953 Les Ulis, France | BA-0500 | immunostaining |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries, Inc, Bohemia, NY 111716, USA | SI-0236 | mix |
References
- Fearon, D. T. Identification of the membrane glycoprotein that is the C3b receptor of the human erythrocyte, polymorphonuclear leukocyte, B lymphocyte, and monocyte. Journal of Experimental Medicine. 152 (1), 20-30 (1980).
- Ross, G. D., Winchester, R. J., Rabellino, E. M., Hoffman, T. Surface markers of complement receptor lymphocytes. Journal of Clinical Investigation. 62 (5), 1086-1092 (1978).
- Reynes, M., et al. Human follicular dendritic cells express CR1, CR2, and CR3 complement receptor antigens. The Journal of Immunology. 135 (4), 2687-2694 (1985).
- Gasque, P., et al. Identification and characterization of complement C3 receptors on human astrocytes. The Journal of Immunology. 156 (6), 2247-2255 (1996).
- Pascual, M., et al. Identification of membrane-bound CR1 (CD35) in human urine: evidence for its release by glomerular podocytes. Journal of Experimental Medicine. 179 (3), 889-899 (1994).
- Fearon, D. T. Regulation of the amplification C3 convertase of human complement by an inhibitory protein isolated from human erythrocyte membrane. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (11), 5867-5871 (1979).
- Dobson, N. J., Lambris, J. D., Ross, G. D. Characteristics of isolated erythrocyte complement receptor type one (CR1, C4b-C3b receptor) and CR1-specific antibodies. The Journal of Immunology. 126 (2), 693-698 (1981).
- Schreiber, R. D., Pangburn, M. K., Muller-Eberhard, H. J. C3 modified at the thiolester site: acquisition of reactivity with cellular C3b receptors. Bioscience Reports. 1 (11), 873-880 (1981).
- Ross, G. D., et al. Generation of three different fragments of bound C3 with purified factor I or serum. II. Location of binding sites in the C3 fragments for factors B and H, complement receptors, and bovine conglutinin. Journal of Experimental Medicine. 158 (2), 334-352 (1983).
- Klickstein, L. B., Barbashov, S. F., Liu, T., Jack, R. M., Nicholson-Weller, A. Complement receptor type 1 (CR1, CD35) is a receptor for C1q. Immunity. 7 (3), 345-355 (1997).
- Ghiran, I., et al. Complement receptor 1/CD35 is a receptor for mannan-binding lectin. Journal of Experimental Medicine. 192 (12), 1797-1808 (2000).
- Cornacoff, J. B., et al. Primate erythrocyte-immune complex-clearing mechanism. Journal of Clinical Investigation. 71 (2), 236-247 (1983).
- Waxman, F. J., et al. Complement depletion accelerates the clearance of immune complexes from the circulation of primates. Journal of Clinical Investigation. 74 (4), 1329-1340 (1984).
- Waxman, F. J., et al. Differential binding of immunoglobulin A and immunoglobulin G1 immune complexes to primate erythrocytes in vivo. Immunoglobulin A immune complexes bind less well to erythrocytes and are preferentially deposited in glomeruli. Journal of Clinical Investigation. 77 (1), 82-89 (1986).
- Horgan, C., Taylor, R. P. Studies on the kinetics of binding of complement-fixing dsDNA/anti-dsDNA immune complexes to the red blood cells of normal individuals and patients with systemic lupus erythematosus. Arthritis & Rheumatology. 27 (3), 320-329 (1984).
- Pham, B. N., et al. Analysis of complement receptor type 1 expression on red blood cells in negative phenotypes of the Knops blood group system, according to CR1 gene allotype polymorphisms. Transfusion. 50 (7), 1435-1443 (2010).
- Wilson, J. G., et al. Identification of a restriction fragment length polymorphism by a CR1 cDNA that correlates with the number of CR1 on erythrocytes. Journal of Experimental Medicine. 164 (1), 50-59 (1986).
- Rodriguez de Cordoba, S., Rubinstein, P. Quantitative variations of the C3b/C4b receptor (CR1) in human erythrocytes are controlled by genes within the regulator of complement activation (RCA) gene cluster. Journal of Experimental Medicine. 164 (4), 1274-1283 (1986).
- Herrera, A. H., Xiang, L., Martin, S. G., Lewis, J., Wilson, J. G. Analysis of complement receptor type 1 (CR1) expression on erythrocytes and of CR1 allelic markers in caucasian and african american populations. Clinical Immunology and Immunopathology. 87 (2), 176-183 (1998).
- Birmingham, D. J., et al. A CR1 polymorphism associated with constitutive erythrocyte CR1 levels affects binding to C4b but not C3b. Immunology. 108 (4), 531-538 (2003).
- Dykman, T. R., Hatch, J. A., Aqua, M. S., Atkinson, J. P. Polymorphism of the C3b/C4b receptor (CR1): characterization of a fourth allele. The Journal of Immunology. 134 (3), 1787-1789 (1985).
- Moulds, J. M., Moulds, J. J., Brown, M., Atkinson, J. P. Antiglobulin testing for CR1-related (Knops/McCoy/Swain-Langley/York) blood group antigens: negative and weak reactions are caused by variable expression of CR1. Vox Sanguinis. 62 (4), 230-235 (1992).
- Cohen, J. H., Lutz, H. U., Pennaforte, J. L., Bouchard, A., Kazatchkine, M. D. Peripheral catabolism of CR1 (the C3b receptor, CD35) on erythrocytes from healthy individuals and patients with systemic lupus erythematosus (SLE). Clinical & Experimental Immunology. 87 (3), 422-428 (1992).
- Jouvin, M. H., Rozenbaum, W., Russo, R., Kazatchkine, M. D. Decreased expression of the C3b/C4b complement receptor (CR1) in AIDS and AIDS-related syndromes correlates with clinical subpopulations of patients with HIV infection. AIDS. 1 (2), 89-94 (1987).
- Waitumbi, J. N., Donvito, B., Kisserli, A., Cohen, J. H., Stoute, J. A. Age-related changes in red blood cell complement regulatory proteins and susceptibility to severe malaria. The Journal of Infectious Diseases. 190 (6), 1183-1191 (2004).
- Mahmoudi, R., et al. Alzheimer's disease is associated with low density of the long CR1 isoform. Neurobiology of Aging. 36 (4), 5-12 (2015).
- Mahmoudi, R., et al. Inherited and Acquired Decrease in Complement Receptor 1 (CR1) Density on Red Blood Cells Associated with High Levels of Soluble CR1 in Alzheimer's Disease. International Journal of Molecular Sciences. 19 (8), 2175 (2018).
- Zaitsev, S., et al. Human complement receptor type 1-directed loading of tissue plasminogen activator on circulating erythrocytes for prophylactic fibrinolysis. Blood. 108 (6), 1895-1902 (2006).
- Scatchard, G. The attractions of proteins for small molecules and ions. Annals of the New York Academy of Sciences. 51 (4), 660-672 (1949).
- Cohen, J. H., et al. Enumeration of CR1 complement receptors on erythrocytes using a new method for detecting low density cell surface antigens by flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 99 (1), 53-58 (1987).
- Minota, S., et al. Low C3b receptor reactivity on erythrocytes from patients with systemic lupus erythematosus detected by immune adherence hemagglutination and radioimmunoassays with monoclonal antibody. Arthritis & Rheumatology. 27 (12), 1329-1335 (1984).
- Miyakawa, Y., et al. Defective immune-adherence (C3b) receptor on erythrocytes from patients with systemic lupus erythematosus. The Lancet. 2 (8245), 493-497 (1981).
- Lida, K., Mornaghi, R., Nussenzweig, V. Complement receptor (CR1) deficiency in erythrocytes from patients with systemic lupus erythematosus. Journal of Experimental Medicine. 155 (5), 1427-1438 (1982).
- Tao, K., Nicholls, K., Rockman, S., Kincaid-Smith, P. Expression of complement 3 receptors (CR1 and CR3) on neutrophils and erythrocytes in patients with IgA nephropathy. Clinical Nephrology. 32 (5), 203-208 (1989).
- Nickells, M., et al. Mapping epitopes for 20 monoclonal antibodies to CR1. Clinical and Experimental Immunology. 112 (1), 27-33 (1998).
- Oi, V. T., Glazer, A. N., Stryer, L. Fluorescent phycobiliprotein conjugates for analyses of cells and molecules. The Journal of Cell Biology. 93 (3), 981-986 (1982).
- Chaiet, L., Wolf, F. J. The properties of streptavidin, a biotin-binding protein produced by streptomyces. Archives of Biochemistry and Biophysics. 20 (106), 1-5 (1964).
- Cockburn, I. A., Donvito, B., Cohen, J. H., Rowe, J. A. A simple method for accurate quantification of complement receptor 1 on erythrocytes preserved by fixing or freezing. Journal of Immunological Methods. 20 (271), 59-64 (2002).
- Chen, C. H., et al. Antibody CR1-2B11 recognizes a non-polymorphic epitope of human CR1 (CD35). Clinical & Experimental Immunology. 148 (3), 546-554 (2007).
- Ripoche, J., Sim, R. B. Loss of complement receptor type 1 (CR1) on ageing of erythrocytes. Studies of proteolytic release of the receptor. Biochemical Journal. 235 (3), 815-821 (1986).
- Moldenhauer, F., Botto, M., Walport, M. J. The rate of loss of CR1 from ageing erythrocytes in vivo in normal subjects and SLE patients: no correlation with structural or numerical polymorphisms. Clinical & Experimental Immunology. 72 (1), 74-78 (1988).
- Cohen, J. H., Lutz, H. U., Pennaforte, J. L., Bouchard, A., Kazatchkine, M. D. Peripheral catabolism of CR1 (the C3b receptor, CD35) on erythrocytes from healthy individuals and patients with systemic lupus erythematosus (SLE). Clinical & Experimental Immunology. 87 (3), 422-428 (1992).
- Nickells, M. W., Subramanian, V. B., Clemenza, L., Atkinson, J. P. Identification of complement receptor type 1-related proteins on primate erythrocytes. The Journal of Immunology. 154 (6), 2829-2837 (1995).
- Hebert, L. A., Birmingham, D. J., Shen, X. P., Cosio, F. G. Stimulating erythropoiesis increases complement receptor expression on primate erythrocytes. Clinical Immunology and Immunopathology. 62 (3), 301-306 (1992).
- Davis, K. A., Abrams, B., Iyer, S. B., Hoffman, R. A., Bishop, J. E. Determination of CD4 antigen density on cells: Role of antibody valency, avidity, clones, and conjugation. Cytometry. 33 (2), 197-205 (1998).
- Pannu, K. K., Joe, E. T., Iyer, S. B. Performance evaluation of QuantiBRITE phycoerythrin beads. Cytometry. 45 (4), 250-258 (2001).
- Barnett, D., Storie, I., Wilson, G. A., Granger, V., Reilly, J. T. Determination of leucocyte antibody binding capacity (ABC): the need for standardization. Clinical Laboratory Haematology. 20 (3), 155-164 (1998).
- Bikoue, A., et al. Quantitative analysis of leukocyte membrane antigen expression: normal adult values. Cytometry. 26 (2), 137-147 (1996).
- Serke, S., van Lessen, A., Huhn, D. Quantitative fluorescence flow cytometry: a comparison of the three techniques for direct and indirect immunofluorescence. Cytometry. 33 (2), 179-187 (1998).
