Summary
この方法の目的は、赤血球CR1密度が知られている3人の被験者と比較することによって、任意の被験体の赤血球中のCR1密度を決定することである。この方法は、フィコエリスリン(PE)を用いて増幅系に結合した抗CR1モノクローナル抗体による被験者の赤血球の免疫染色後のフローサイトメトリーを使用する。
Abstract
CR1(CD35、C3b/C4b用補体受容体1型)は、約200kDaの高分子膜糖タンパク質であり、補体活性化を制御し、免疫複合体を輸送し、体液性および細胞性免疫応答に関与する。CR1は、赤血球を含む多くの細胞型の表面に存在し、長さ、構造(Knops、またはKN、血液群)、および密度において多型を示す。赤血球当たりのCR1(CR1/E)の平均密度は、赤血球当たり500分子である。この密度は、ある個体(100~1,200 CR1/E)、同一個体の赤血球から別の赤血球へと変化する。ここでは、増幅免疫染色システムの助けを借りて、低密度を発現する被験者を含むCR1/Eの密度を測定する堅牢なフローサイトメトリー法を提示する。この方法により、アルツハイマー病(AD)、全身性エリテマトーシス(SLE)、エイズ、マラリアなどの疾患におけるCR1赤血球発現の低下を示す。
Introduction
CR1(補体受容体型1、CD35)は、赤血球1、Bリンパ球2、単球細胞、一部のT細胞、濾胞樹状細胞3、胎児アストロサイト4、および糸球体ポドサイト5のような多くの細胞型の表面に存在する200kDa膜貫通糖タンパク質である。CR1は、そのリガンドC3b、C4b、C3bi6、7、8、9、第1の補体成分のサブユニット、C1q6,7,8,910およびMBL(マンナン結合レクチン)11は、補体の活性化を阻害し、体液性および細胞性免疫応答に関与する。
ヒトを含む霊長類において、赤血球CR1は、肝臓および脾臓への免疫複合体の輸送に関与し、血液を浄化し、皮膚または腎臓12、13、14,13,14などの脆弱な組織に蓄積するのを防ぐ。免疫複合体と赤血球との間の免疫接着のこの現象は、CR1分子15の数に依存する。ヒトでは、CR1/Eの平均密度はわずか500(すなわち、赤血球当たりCR1の500分子)である。この密度は、ある個体(100~1,200 CR1/E)、同一個体の赤血球から別の赤血球へと変化する。"null" 表現型の一部の個体は、20 CR1/E16未満を表現する。
CR1/Eの密度は、CR1*117、18,18に対してコードする遺伝子のイントロン27における点突然変異に結合した2つの共支配性常染色体対立遺伝子によって調節される。この変異は、HindIII酵素に対する追加の制限部位を生成する。この場合のHindIIIでの消化後に得られた制限フラグメントは、CR1(H:高アレル)の強い発現にリンクされたアレルの7.4kb、低CR1発現にリンクされたアレルの6.9kb(L:低アレル)である。このリンクは白人やアジア人に見られますが、アフリカ系の人々には見られません19.
赤血球CR1の発現レベルは、SCR10をコードするエキソン13(I643T)およびExON 19コードSCR16(Q981H)におけるポイントヌクレオチド突然変異の存在とも相関している。ホモ接合643I/981Qでは高く、ホモ接合体643T/981H個体20では低い。したがって、「低い」個体は約150 CR1/Eを表現し、「中程度」の個体は約500のCR1/Eを表現し、「高い」個体は約1,000 CR1/Eを表現する。
この赤血球密度多型に加えて、CR1は、異なるサイズの4つの異なる異形型に対応する長さの多形によって特徴付けられる:CR1*1(190 kDa)、CR1*2(220kDa)、CR1*3(160kDa)、およびCR1*4(250 kDa)21と抗原多型の22に対応する。21
CR1/Eの密度が既知の3つの被験者を用いて、CR1/Eの密度を決定するためのフローサイトメトリーに基づく方法を提示します。 低密度レベル(180 CR1/E)、中密度レベル(646 CR1/E)、高密度レベル(966 CR1/E)を発現し、赤血球または赤血球(RBC)の平均蛍光強度(MFI)、またはRBC MFIを測定することは容易です。その後、MFI を CR1/E 密度の関数として表す標準線をプロットできます。CR1/E密度が知られていない被験者のMFIを測定し、これをこの標準線と比較して、個人のCR1/E密度を決定することができる。この技術は、研究室で長年使用されており、全身性エリテマトース(SLE)23、後天性免疫不全症候群(AIDS)24、マラリア25、および最近アルツハイマー病(AD)26、27など多くの病態において、赤血球CR1の発現の低下を検出することを可能26に27している。23抗血栓薬28の場合のように、赤血球と結合するCR1を標的とする薬物の開発は、CR1/E密度の評価、およびCR1を定量化するための堅牢な技術の入手可能性を必要とする。
提示されたプロトコルは、1回で実行されます。特定の市販の96ウェルプレートを使用して多くの個人のCR1/Eの密度を決定するために適応可能です(材料表を参照)。この上で、それは任意の96ウェルプレートに私たちの方法を適応させることは容易です。各サンプルについて、赤血球の細胞懸濁液(0.5 x 106-1 x 106赤血球)がウェルごとに分布する。各井戸に対して、最初の一次抗CR1抗体を添加し、次にストレプトアビジンPE、二次抗ストレプトアビジン抗体、および再びストレプトアビジンPEを、我々の方法のものと同じ希釈を用いるが、体積を適応させ、比例性を尊重することによって。
CR1の範囲の被験者および被験者から採検される被験者からの血液サンプルは、同時に採取し、4°Cの冷蔵庫に保存し、4°C(氷上および/または冷蔵庫)で取り扱う必要があります。
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Protocol
ヒトの採血と取り扱いの議定書は、地域倫理委員会(CPP Est II)によって審査され、承認され、プロトコル番号は2011-A00594-37です。以下のプロトコルは、ヒトの血液の取扱いについて説明しているので、生体有害物質の廃棄に関する制度上のガイドラインに従うべきである。ラボコートや手袋などの実験室の安全装置を着用する必要があります。
1. 赤血球洗浄
注意:取り扱い前日に、ウシ血清アルブミン(BSA)の0.15%を含むリン酸緩衝生理食塩分(PBS)を用いてPBS-BSAバッファーを調製し、4°Cで冷蔵庫に入れます。このバッファーは、洗浄バッファーとして、希釈バッファーとして使用されます。
- ピペット20 mLのPBS-BSAを50 mLチューブにします。
- 250μLのナトリウムエチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)の吸入体は、血液貯蔵管から全血を抗凝固し、20mLのPBS-BSAを含むチューブに添加した。キャップをねじ込んでチューブを閉じます。管2倍を反転してやさしく混ぜます。
- 430 x gで4°Cで10分間チューブを遠心分離します。10 mLピペットを使用して上清を取り出し、廃棄します。優しく慎重なピペット処理により、上清の残留体積中のペレットを再懸濁します。
- ペレットを含むチューブに20 mLの冷たいPBS-BSA(4°C)を加えます。430 x gで4°Cで10分間チューブを遠心分離します。10 mLピペットを使用して上清を取り出し、廃棄します。
- ペレットを含むチューブに20 mLの冷たいPBS-BSA(4°C)を加えます。430 x gで4°Cで10分間チューブを遠心分離します。チューブを遠心分離機の4°Cに残し、セクション2に進みます。
2. 赤血球希釈
- 50 mLチューブに冷たいPBS-BSAのピペット3 mLを、氷の中のラックに4°Cで保管します。
- 赤血球を含む遠心チューブ(ステップ1.4)を氷の中に置かれたラックに置きます。
- ピペットを用いたペレット赤血球のピペット8μLを、PBS-BSAの3mLを含む50mLチューブに加え、赤血球希釈液を得た。チューブを手で軽く混ぜて、赤血球の均質な細胞懸濁液を得る。
3. 赤血球免疫染色
- ピペット100μLの赤血球希釈液(セクション4で得られる)を1.4 mLチューブに加える。
- 430 x gで 4 °C で 5 分間チューブを遠心分離します。遠心分離の間、PBS-BSAバッファー内の0.05 μg/μLの濃度でビオチン化抗CR1 J3D3抗体の希釈を調製します。
- 遠心が終わったら、上清を取り除いて捨てます。
- 20 μLのビオチン化抗CR1 J3D3をペレットに直接加えます。陰性制御を準備するには、代わりに20 μLのPBS-BSAバッファを追加します。チューブを軽く混ぜ、4°Cで45分間インキュベートします。
- 45分のインキュベーションの後、750 μLのPBS-BSAをチューブに加えます。430 x gで 4 °C で 5 分間チューブを遠心分離します。上清を取り除き、捨てます。繰り返します。
- その間、PBS-BSAバッファーで希釈したストレプトアビジン-フィコエリスリンの1:10希釈を調製する。ストレプトアビジン-フィコエリスリンの1:10希釈のピペット20 μLをチューブに加える。チューブを軽く混ぜ、4°Cで45分間インキュベートします。
- 750 μL の PBS-BSA バッファーをチューブに追加します。430 x g で 4 °C で 5 分間、よく遠心分離機を混ぜます。上清を取り除き、捨てます。繰り返します。
- 遠心分離の間、PBS-BSAバッファーで希釈したビオチン化抗ストレプトアビジン抗体の1:100希釈を調製する。
- 遠心が終わったら、上清を取り除いて捨てます。
- ピペット20 μLのビオチン化抗ストレプトアビジンをチューブに1:100希釈した。チューブを軽く混ぜます。4°Cで45分間チューブをインキュベートします。
- 45分のインキュベーションの後、ピペット750 μLのPBS-BSAバッファーをチューブに加えます。430 x gで 4 °C で 5 分間チューブを遠心分離します。上清を取り除き、捨てます。繰り返します。
- ストレプトアビジン-フィコエリスリンの1:10希釈のピペット20 μLをチューブに加えます。チューブを軽く混ぜます。4°Cで45分間チューブをインキュベートします。
- ピペット750 μLのPBS-BSAバッファーをチューブに加えます。430 x gで 4 °C で 5 分間よく混合し、遠心分離チューブ.上清を取り除き、捨てます。この手順を 2x 繰り返します。
4. 免疫染色赤血球固定
- 最後の遠心分離の間、1:100の固定バッファーを調製し、洗浄バッファーPBS-BSAを用いて37%ホルムアルデヒドの希釈液を調製する。
- ピペット450μLの固定バッファーを、5秒のボルテックス中に免疫染色赤血球チューブ(ステップ3.13から)に加えます。
- ピペットは5 mLの丸い底の管に全ての固定された細胞を、冷蔵庫に保管する。
注: プロトコルは、ここで最大 48 時間一時停止できます。
5. 染色赤血球のフローサイトメトリー解析
注意:サイトメトリックの読み取り値を実行する方法を知ってお勧めします。. Table of Materials以下の推奨パラメータは使用する計測器に適用され、各サイトメーターに最適化する必要があります。
- フローサイトメーターの電源を入れ、コンピュータの電源を入れます。光学系の温度を30分間オンにしたままにして安定させます。 Cytometer Connected
- バッファー コンテナーがいっぱいであり、廃棄物コンテナーが空であることを確認します。パージシステムを使用して、バッファフィルタとバッファラインの気泡を取り除きます。サイトメーターのコンソール上のPrimeボタンを押して流体システムをプライムします。インジケータランプが赤から緑に変わるまで待ちます。
- 流体を洗浄するには、3 mLの洗浄液を含むチューブをサンプル注入口に取り付け、洗浄液を高いサンプル流量で5分間実行させます。蒸留水でリンス溶液でこれを繰り返します。サンプル注入口に水を含む管を残します。
- キャリブレーションビーズを調製するために、PBSのピペット400 μLを丸底管の底部に入れた。30 sの渦を巻いてビーズストックを強く混ぜます。30sの渦で慎重に混ぜます。
- パフォーマンス チェックを実行します。ソフトウェアのサイトメーターのセットアップとトラッキングモジュールを開きます(図1A)。細胞メーター構成がPE免疫染色を用いた実験に適していることを確認します。構成に合った調整ビード バッチが正しいことを確認します。
- サンプルインジェクションポートにビーズチューブを取り付け、低サンプル流量で動かします。パフォーマンスチェックを実行します(所要時間は約5分)。パフォーマンスチェックが完了したら、サイトメーターのパフォーマンスが満足であることを確認します(図1B)。ソフトウェアのサイトメーターのセットアップとトラッキングモジュールを閉じます。
- 実験を設定してアプリケーション設定を作成するには、ブラウザーのツール バーの[新しい実験] ボタンをクリックし、新しいテストを開きます。実験のドロップダウン メニューから適切なサイトメーター設定(フォワード スキャッタ(FSC)、サイド スキャッタ(SSC)、および PEを選択して、パラメータを指定します (図 1C)。SSC および PE パラメータの場合は[FSC パラメータ]に[線形モード]を、パラメータの[対数モード]を選択します。
- 開いた実験で、[サイトメーターの設定] ( 図1D) を選択し、[アプリケーション設定]を選択して、グローバル ワークシートを作成します (図 1E)。最適化をガイドするには、グレーのボックスと十字線を使用します。
- 染色されていないコントロールチューブをサイトメーターにロードし、取得を実行します。FSC および SSC 電圧を最適化することにより、関心のある人口(つまり、RMC)が拡大縮小されていることを確認します。FSCしきい値を最適化して、関心のある人口に干渉することなく、デブリを排除します。
- FSC と SSC プロットの RMC の周囲にゲートを描画します。PE蛍光のドットプロットでRBC集団を表示する。必要に応じて、光増倍管(PMT)電圧の蛍光を上げ、グレーのボックス内に負の母集団を配置します。染色されていないコントロールチューブをサイトメーターからアンロードします。
- 正の母集団がスケールであることを確認します。染色されたコントロールチューブをサイトメーターにロードし、取得を実行します。正の母集団が完全にスケールで見られるまで、プラス集団がスケールから外れている場合は、正の母集団のPMT電圧を下げます。その後、染色されたサンプルをアンロードします。
- サンプルを記録して分析するには、新しいグローバルワークシートで、データをプレビューするための次のプロットを作成します: 1) FSC 対 SSC, および 2) PE蛍光ヒストグラム.最初のサンプルをサイトメーターにロードし、取得を実行します。
- FSC対SSCプロットの赤血球の周りにRBCゲートを描きます。PE蛍光ヒストグラムでRBC集団を表示する。統計ビューで、GR 集団の PE 蛍光パラメータの平均を選択します (図 1F)。
- 取得ダッシュボードで、停止ゲート内のすべてのイベントと記録する 10,000 イベントを選択します (図 1G)。[レコード データ ]をクリックします。イベント記録が完了したら、サイトメーターから最初のチューブを取り外します。グローバル ワークシートのプロットは、図 2のようになります。
- 以下のサンプルをロードして記録します。
6. 赤血球CR1の密度の決定
- 「低」被験者(図3、表I、RBCMFI)、中型の被験者(図4、表D、RBCMFI)、高い」被験者(図4、表I、RBCMFI)、およびFigure 4陰性対照サンプル(図3、表I、RBCMFI)に対応するサンプルの平均蛍光強度の値を取る。
- 平均蛍光強度をCR1の密度の関数として表すグラフ上に、負の対照に対応する4点を配置し、「低」被験者、「中」の被験者、および「高」対象(青色点、図6)を配置する。
- 回帰直線を描画して、キャリブレーションラインとその方程式を取得します。
- 密度が決定される被験者に対応するサンプルの平均蛍光強度の値を取る。(図 5、表 D および I、RBC MFI)。
- 平均蛍光強度の値を用いて「Y」を置換して式を得て、CR1/Eの密度を算出する(図6)。
- グラフ上で、平均蛍光強度値と決定されたCR1/E密度がキャリブレーションライン上の点に対応していることを確認します(図6)。
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Representative Results
CR1の密度が知られている3人の被験者の赤血球("低"被験者[180 CR1/E]、中型の被験者[646 CR1/E]、および「高」被験者[966 CR1/E])、およびCR1密度を決定する必要がある2つの被験者の赤血球は、フィロクロム系を用いて免疫染色された。初めに、低い高い範囲からの被験者のCR1密度は、放射線標識抗体を用いてScatchard法29によって決定された。測定された基準(低、中、高)は、較正曲線に使用され、サイトメトリー30の方法によって新しい基準または副標準を定量化することを可能にした。フローサイトメーターで免疫染色赤血球を通過した後、標識の強度を観察し、各被験者の平均蛍光強度(RBC MFI)として測定した(図3F、I;I図 4B,D,F,I,図 5B,D,F,I).赤血球CR1の既知の密度を有する被験者の値(「低」から「高」)を、平均蛍光強度の関数として報告することによって、曲線をプロットした。この曲線から得られた回帰線と他の被験者の平均蛍光強度の値との比較は、それらのCR1/E密度を決定した(図6)。図 7 は、ワークフロー全体を示しています。
図1:フローサイトメトリープロトコル中に表示されるサイトメーターコンソールとウィンドウ。(A) プロトコルのステップ 5.5 の適用後に表示されるウィンドウ。(B) プロトコルのステップ 5.6 の適用後に表示されるウィンドウ。(C)プロトコルのステップ 5.7 の適用後にウィンドウが表示されます。(D) プロトコルのステップ 5.8 の適用後に表示されるウィンドウ。(E) プロトコルのステップ 5.8 の適用後に表示されるウィンドウ。(F)プロトコルのステップ 5.13 の適用後に表示されるウィンドウ。(G)プロトコルのステップ5.14の適用後に表示されるウィンドウ。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2: グローバル ワークシート分析オブジェクトの外観プロトコルのステップ 5.14 の適用後のグローバルワークシート分析オブジェクトの外観。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:陰性対照に相当する赤血球の免疫染色のフローサイトメトリー解析の結果、低CR1密度(180 CR1/E)を発現した範囲("低"対象)から被験体に対する。各被験者について: (A,E) サイズと顆粒度パラメータに従って獲得したイベントの外観を示すドットブロット,(G)イベントの中で赤血球集団を選択するゲート、(B、F)標識の強度を表すヒストグラム、(C、H)赤血球に相当する事象の数とその割合を示す関連統計表HF、(D,I)I平均蛍光強度(RBC MFI)を与える関連テーブル。CDこの図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:対象に対応する赤血球の抗CR1免疫染色のフローサイトメトリー解析の結果:中CR1密度(646 CR1/E)を発現した「中」対象および高CR1密度(966 CR1/E)を発現した「高」対象。各被験者について: (A, E) サイズと顆粒度パラメータに従って獲得したイベントの外観を示すドットブロット,(G)イベントの中で赤血球集団を選択するゲート、(B、F)標識の強度を表すヒストグラム、(C、H)赤血球に相当する事象の数とその割合を示す関連統計表HF、(D,I)I平均蛍光強度(RBC MFI)を与える関連テーブル。CDこの図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:CR1濃度を決定する対象に対応する赤血球の抗CR1免疫染色のフローサイトメトリー解析の結果。各被験者について: (A, E) サイズと顆粒度パラメータに従って獲得したイベントの外観を示すドットブロット,(G)イベントの中で赤血球集団を選択するゲート、(B、F)標識の強度を表すヒストグラム、(C、H)赤血球に相当する事象の数とその割合を示す関連統計表HF、(D,I)I平均蛍光強度(RBC MFI)を与える関連テーブル。CDこの図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:CR1密度の測定を可能にする検量線と回帰線。(A)(B)範囲被験者の既知のCR1密度に従って描かれた較正曲線および回帰線(負の対照:0 CR1、「低」被験者[180 CR1/E]、中型被験者[646 CR1/E]、および「高」被験者[966 CR1/E])およびフローサイトーによって得られる平均蛍光強度のそれぞれの値。A(C), (D) この回帰直線の式から、平均蛍光強度がフローサイトメトリーによって定量化された被験者に対する赤血球CR1の密度を計算しました: オレンジ色の矢印, 主題 1 (平均蛍光強度 = 1,334;CR1/E密度 = 459)および対象2(平均蛍光強度= 2820;CR1/E密度 = 1,000)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図7:ヒト血液サンプルから赤血球CR1濃度を決定するプロトコルのフローチャート。ヒトの血液サンプルを収集します。遠心分離によってヒト血液サンプルを洗浄し、赤血球を得る。抗CR1抗体を用いて赤血球を染色する。フローサイトメトリーを使用して、検量線に従って赤血球CR1密度を決定します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
赤血球CR1(CR1/E)の密度を決定するためにいくつかの技術が利用可能です。第1の技術は、抗CR1抗体31による赤血球の凝集と、C3b32でコーティングされた赤血球の存在下でのロゼットの形成であった。32これらの初歩的な技術は、放射性標識抗CR1抗体11、3333を用いた免疫染色法によって迅速に置換された。また、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)34による膜抽出物中のCR1の濃度を測定することもできる。34正確ではあるが、これらの技術はCR1/E密度の平均値のみを提供する。赤血球集団全体にわたるCR1/E密度の分布は、免疫染色後のフローサイトメトリック分析によってのみ利用可能です。この技術はCR1/Eの低密度のため困難である。しかし、増幅法により、CR1/E30の密度を容易に測定することが可能になった。30
ここでは、免疫染色細胞の蛍光シグナルの増幅に基づいてフローサイトメトリーによりCR1/Eを定量する方法を提示する。増幅系は、ビオチン化抗CR1モノクローナル抗体J3D3を用いた4層の連続染色を伴う。フィコエリセリンストレプトアビジン;ビオチン化ヤギ抗ストレプトアビジン抗体;そして再びフィコエリスリンストレプトアビジン。J3D3はCR135上の3つの抗原部位を同時に1つ以下に認識する。ビオチン化ヤギ抗ストレプトアビジン抗体は、ストレプトアビジン上の複数のエピトープを認識し、ビオチンストレプトアビジン単独よりも2つのストレプトアビジン層間のより良い橋を提供するポリクローナル抗体です。このプロセスはまた、フィコエリスリン36の高い蛍光収率およびストレプトアビジン37の非特異的結合の低レベルからも恩恵を受けます。このような強力な増幅信号で、サイトメーターフォトマルチプライヤチューブの低い設定は完全な直線性を可能にします。この方法は、優れた感度と再現性を特徴とし、100未満のCR1/細胞の検出を可能にします。
しかし、この方法では、赤血球CR1の密度が知られている3つの被験者からのサンプルが必要です:低レベルの赤血球CR1(180 CR1/E)を発現する被験者1人、赤血球CR1(646 CR1/E)の中レベルを発現する被験者と、高レベルの赤血球CR1(9661/E)を発現する被験者1つ。いくつかの個体の赤血球CR1密度の最初の測定を行うことは可能であり、最初は我々の研究で使用される3つの被験者からの赤血球を使用して、我々が提供することができる。CR1に対して定量される範囲および被験者の血液サンプルを同時に採取し、4°Cで冷蔵庫に保存し、4°C38で取り扱う。EDTAチューブに引き込まれた血液は容易にルーティング可能であり、4°Cで5日間保存することができ、赤血球CR1の定量化に時間を与えます。この後、赤血球CR1の密度が低下し始め、特に高レベルの赤血球CR1を発現する被検体に対応する点で標準CR1曲線の崩壊がある。結果の回帰直線が歪んでいるため、CR1密度の測定は正確ではなくなります。なお、インビトロ保存、取り扱い条件、及び多層染色はCR1のクラスタリングとCR1分子数のわずかな過大評価を招く。それにもかかわらず、J3D3のような3つのエピトープを標的とする抗CR1抗体を増幅システムで使用することで、クラスタリングを完全に行うことができるので、CR1密度39の正しい測定が可能になる。
実際、赤血球40の寿命の間にCR1/Eの密度が低下する。これは、同じ個体におけるCR1/Eの密度の不均一性を説明するであろう。何人かの著者によると、CR1の異化の強度はCR1/E41の初期密度と相関していないが、他の41著者にとっては初期密度が高いほど、異化の強度は42である。赤血球の表面上のCR1の半減期は11-32日42である。
ここに示す方法には、いくつかの利点があります。第1は、フローサイトメトリーのおかげで、同じ血液サンプル内で研究される細胞亜集団を選択できることである。ゲート機能を用いて赤血球集団を選択することにより、赤血球密度の測定は排他的に保証される。白血球などの他の細胞亜集団の存在によって引き起こされる赤血球CR1の測定における偏りは避ける。この方法の第2の利点は、一次抗CR1抗体を、研究対象の受容体のエピトープに特異的に向けられた抗体に置き換えるだけで、密度が低い他の細胞受容体の定量化に適応できることである。また、低血球および試薬容積25、38,38を必要とする管の棚の代わりに96の井戸の版を使用することに適応可能である。この方法の第3の利点は、柔軟性が有る点である。CR1の非常に高密度の細胞に関する研究では、例えば、ヒトリンパ球(10,000CR1/細胞)、またはCR1密度がヒトのそれよりも10〜100倍大きい非ヒト霊長類赤血球(10,000-1000CR1/細胞)43、44、,44増幅数の増加が可能である、 ビオチン化抗CR1モノクローナル抗体、フィコエリスリンストレプトアビジンまたはビオチン化抗CR1モノクローナル抗体、ビオチン化抗マウス抗体、およびフィコエリスリンストレプトアビジンのみを使用して、蛍光レベルをCR11の高密度に適応させる。この方法の4番目の利点は、固定または凍結赤血球に使用できることであり、フローサイトメトリーの施設を欠いた領域で血液サンプルを採取し、CR138の後で正確な定量のために保存することができる。
より一般的には、新しい明るいフッ素色で、間接的な増幅のシステムを使用することがもはや必須ではないようです。また、フローサイトメトリーを用いて、細胞受容体の密度を評価し、測定単位(すなわちABC、または抗体結合能)で定量することを可能にする他の方法がある。また、細胞当たりのABCは、抗体および較正ビーズの飽和濃度を用いて決定することもできる。いくつかの商用システムが利用可能です。一部のキットは、ビーズ当たりPE結合などの既知のレベルのフルオロクロム分子を含む標準ビーズを事前校正しています。個々の患者標本と同じ器具の設定で同じ日にフローサイトメーターで獲得したビーズは、ビーズの既知のPE含有量に蛍光の幾何平均を比較する標準曲線を描くことを可能にする。回帰分析、傾き、切片、および相関係数が決定され、ABC値は、標準曲線45,46,46を用いて細胞の測定された幾何平均蛍光から算出される。
さらにタイプのビーズ試験は、フラグメントの結晶化可能な部分(Fc)を介して特異的な抗体結合能レベルを有するビーズに結合した抗体の結合に基づいている。ビーズは、抗原密度を測定する細胞にラベルを付けるために使用されるのと同じ抗体で標識されます。したがって、単一の実験において、任意の共役抗体を使用することができ、同じフルオロフォア/タンパク質比(F/P比)を有する同じバッチがビーズおよび細胞47の両方を染色するために使用される限りである。一部のキットは、間接免疫蛍光アッセイ48,49,を用いたフローサイトメトリーによる細胞表面抗原の定量的決定に適している。
結論として、我々の方法は、非常に敏感な検出を提供し、通常のフローサイトメトリー材料に実装することが容易であるという利点を有する。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
URCACyt、フローサイトメトリー技術プラットフォームのメンバー、免疫学科のスタッフ、およびプロトコルの最適化と検証に貢献した内科学・老年医学省のスタッフに感謝します。この研究はランス大学病院(助成金番号AOL11UF9156)によって資金提供されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1000E Barrier Tip | Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France | 2079E | sample pipetting |
| 1-100 µL Bevelled, filter tip | Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Germany | S1120-1840 | sample pipetting |
| Biotinylated anti-CR1 monoclonal antibody (J3D3) | Home production of non-commercial monoclonal antibody, courtesy of Dr J. Cook | immunostaining | |
| Blouse | protection | ||
| Bovin serum albumin (7,5%) | Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France | 15260037 | cytometry |
| Centrifuge | Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France | 11176917 | centrifugation |
| Clean Solution | BD, F-38801 Le Pont de Claix, France | 340345 | cytometry |
| Comorack-96 | Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath | 944060P | rack |
| Cytometer Setup & Tracking Beads Kit | BD, F-38801 Le Pont de Claix, France | 655051 | cytometry |
| Formaldehyde solution 36.5 % | Sigma Aldrich, F-38070 Saint Quentin Fallavier, France | F8775-25ML | Fixation |
| 10 µL Graduated, filter tip | Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Germany | S1121-3810 | sample pipetting |
| LSRFORTESSA Flow Cytometer | BD, F-38801 Le Pont de Claix, France | 647788 | cytometry |
| Microman Capillary Pistons | Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath | 067494 | sample pipetting |
| Micronic 1.40 mL round bottom tubes | Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath | MP32051 | mix |
| Micropipette Microman - type M25 - | Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath | 066379 | sample pipetting |
| Phosphate buffered Saline (PBS) | Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France | 10010031 | cytometry |
| Pipette PS 325 mm, 10 mL | Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath | 391952 | sample pipetting |
| powder-free Nitrile Exam gloves | Medline Industries, Inc, Mundelein, IL 60060, USA | 486802 | sample protection |
| Reference 2 pipette, 0,5-10 µL | Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France | 4920000024 | sample pipetting |
| Reference 2 pipette, 20-100 µL | Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France | 4920000059 | sample pipetting |
| Reference 2 pipette, 100-1000 µL | Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France | 4920000083 | sample pipetting |
| Rinse Solution | BD, F-38801 Le Pont de Claix, France | 340346 | cytometry |
| Round bottom tube | Sarstedt, F-70150 Marnay, France | 55.1579 | cytometry |
| Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France | 0030120086 | mix |
| streptavidin R-PE | Tebu Bio, F-78612 Le Perray-en-Yvelines, France | AS-60669 | immunostaining |
| Tapered Centrifuge Tubes 50 mL | Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France | 10203001 | mix |
| Vector anti streptavidin biotin | Eurobio Ingen, F-91953 Les Ulis, France | BA-0500 | immunostaining |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries, Inc, Bohemia, NY 111716, USA | SI-0236 | mix |
References
- Fearon, D. T. Identification of the membrane glycoprotein that is the C3b receptor of the human erythrocyte, polymorphonuclear leukocyte, B lymphocyte, and monocyte. Journal of Experimental Medicine. 152 (1), 20-30 (1980).
- Ross, G. D., Winchester, R. J., Rabellino, E. M., Hoffman, T. Surface markers of complement receptor lymphocytes. Journal of Clinical Investigation. 62 (5), 1086-1092 (1978).
- Reynes, M., et al. Human follicular dendritic cells express CR1, CR2, and CR3 complement receptor antigens. The Journal of Immunology. 135 (4), 2687-2694 (1985).
- Gasque, P., et al. Identification and characterization of complement C3 receptors on human astrocytes. The Journal of Immunology. 156 (6), 2247-2255 (1996).
- Pascual, M., et al. Identification of membrane-bound CR1 (CD35) in human urine: evidence for its release by glomerular podocytes. Journal of Experimental Medicine. 179 (3), 889-899 (1994).
- Fearon, D. T. Regulation of the amplification C3 convertase of human complement by an inhibitory protein isolated from human erythrocyte membrane. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (11), 5867-5871 (1979).
- Dobson, N. J., Lambris, J. D., Ross, G. D. Characteristics of isolated erythrocyte complement receptor type one (CR1, C4b-C3b receptor) and CR1-specific antibodies. The Journal of Immunology. 126 (2), 693-698 (1981).
- Schreiber, R. D., Pangburn, M. K., Muller-Eberhard, H. J. C3 modified at the thiolester site: acquisition of reactivity with cellular C3b receptors. Bioscience Reports. 1 (11), 873-880 (1981).
- Ross, G. D., et al. Generation of three different fragments of bound C3 with purified factor I or serum. II. Location of binding sites in the C3 fragments for factors B and H, complement receptors, and bovine conglutinin. Journal of Experimental Medicine. 158 (2), 334-352 (1983).
- Klickstein, L. B., Barbashov, S. F., Liu, T., Jack, R. M., Nicholson-Weller, A. Complement receptor type 1 (CR1, CD35) is a receptor for C1q. Immunity. 7 (3), 345-355 (1997).
- Ghiran, I., et al. Complement receptor 1/CD35 is a receptor for mannan-binding lectin. Journal of Experimental Medicine. 192 (12), 1797-1808 (2000).
- Cornacoff, J. B., et al. Primate erythrocyte-immune complex-clearing mechanism. Journal of Clinical Investigation. 71 (2), 236-247 (1983).
- Waxman, F. J., et al. Complement depletion accelerates the clearance of immune complexes from the circulation of primates. Journal of Clinical Investigation. 74 (4), 1329-1340 (1984).
- Waxman, F. J., et al. Differential binding of immunoglobulin A and immunoglobulin G1 immune complexes to primate erythrocytes in vivo. Immunoglobulin A immune complexes bind less well to erythrocytes and are preferentially deposited in glomeruli. Journal of Clinical Investigation. 77 (1), 82-89 (1986).
- Horgan, C., Taylor, R. P. Studies on the kinetics of binding of complement-fixing dsDNA/anti-dsDNA immune complexes to the red blood cells of normal individuals and patients with systemic lupus erythematosus. Arthritis & Rheumatology. 27 (3), 320-329 (1984).
- Pham, B. N., et al. Analysis of complement receptor type 1 expression on red blood cells in negative phenotypes of the Knops blood group system, according to CR1 gene allotype polymorphisms. Transfusion. 50 (7), 1435-1443 (2010).
- Wilson, J. G., et al. Identification of a restriction fragment length polymorphism by a CR1 cDNA that correlates with the number of CR1 on erythrocytes. Journal of Experimental Medicine. 164 (1), 50-59 (1986).
- Rodriguez de Cordoba, S., Rubinstein, P. Quantitative variations of the C3b/C4b receptor (CR1) in human erythrocytes are controlled by genes within the regulator of complement activation (RCA) gene cluster. Journal of Experimental Medicine. 164 (4), 1274-1283 (1986).
- Herrera, A. H., Xiang, L., Martin, S. G., Lewis, J., Wilson, J. G. Analysis of complement receptor type 1 (CR1) expression on erythrocytes and of CR1 allelic markers in caucasian and african american populations. Clinical Immunology and Immunopathology. 87 (2), 176-183 (1998).
- Birmingham, D. J., et al. A CR1 polymorphism associated with constitutive erythrocyte CR1 levels affects binding to C4b but not C3b. Immunology. 108 (4), 531-538 (2003).
- Dykman, T. R., Hatch, J. A., Aqua, M. S., Atkinson, J. P. Polymorphism of the C3b/C4b receptor (CR1): characterization of a fourth allele. The Journal of Immunology. 134 (3), 1787-1789 (1985).
- Moulds, J. M., Moulds, J. J., Brown, M., Atkinson, J. P. Antiglobulin testing for CR1-related (Knops/McCoy/Swain-Langley/York) blood group antigens: negative and weak reactions are caused by variable expression of CR1. Vox Sanguinis. 62 (4), 230-235 (1992).
- Cohen, J. H., Lutz, H. U., Pennaforte, J. L., Bouchard, A., Kazatchkine, M. D. Peripheral catabolism of CR1 (the C3b receptor, CD35) on erythrocytes from healthy individuals and patients with systemic lupus erythematosus (SLE). Clinical & Experimental Immunology. 87 (3), 422-428 (1992).
- Jouvin, M. H., Rozenbaum, W., Russo, R., Kazatchkine, M. D. Decreased expression of the C3b/C4b complement receptor (CR1) in AIDS and AIDS-related syndromes correlates with clinical subpopulations of patients with HIV infection. AIDS. 1 (2), 89-94 (1987).
- Waitumbi, J. N., Donvito, B., Kisserli, A., Cohen, J. H., Stoute, J. A. Age-related changes in red blood cell complement regulatory proteins and susceptibility to severe malaria. The Journal of Infectious Diseases. 190 (6), 1183-1191 (2004).
- Mahmoudi, R., et al. Alzheimer's disease is associated with low density of the long CR1 isoform. Neurobiology of Aging. 36 (4), 5-12 (2015).
- Mahmoudi, R., et al. Inherited and Acquired Decrease in Complement Receptor 1 (CR1) Density on Red Blood Cells Associated with High Levels of Soluble CR1 in Alzheimer's Disease. International Journal of Molecular Sciences. 19 (8), 2175 (2018).
- Zaitsev, S., et al. Human complement receptor type 1-directed loading of tissue plasminogen activator on circulating erythrocytes for prophylactic fibrinolysis. Blood. 108 (6), 1895-1902 (2006).
- Scatchard, G. The attractions of proteins for small molecules and ions. Annals of the New York Academy of Sciences. 51 (4), 660-672 (1949).
- Cohen, J. H., et al. Enumeration of CR1 complement receptors on erythrocytes using a new method for detecting low density cell surface antigens by flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 99 (1), 53-58 (1987).
- Minota, S., et al. Low C3b receptor reactivity on erythrocytes from patients with systemic lupus erythematosus detected by immune adherence hemagglutination and radioimmunoassays with monoclonal antibody. Arthritis & Rheumatology. 27 (12), 1329-1335 (1984).
- Miyakawa, Y., et al. Defective immune-adherence (C3b) receptor on erythrocytes from patients with systemic lupus erythematosus. The Lancet. 2 (8245), 493-497 (1981).
- Lida, K., Mornaghi, R., Nussenzweig, V. Complement receptor (CR1) deficiency in erythrocytes from patients with systemic lupus erythematosus. Journal of Experimental Medicine. 155 (5), 1427-1438 (1982).
- Tao, K., Nicholls, K., Rockman, S., Kincaid-Smith, P. Expression of complement 3 receptors (CR1 and CR3) on neutrophils and erythrocytes in patients with IgA nephropathy. Clinical Nephrology. 32 (5), 203-208 (1989).
- Nickells, M., et al. Mapping epitopes for 20 monoclonal antibodies to CR1. Clinical and Experimental Immunology. 112 (1), 27-33 (1998).
- Oi, V. T., Glazer, A. N., Stryer, L. Fluorescent phycobiliprotein conjugates for analyses of cells and molecules. The Journal of Cell Biology. 93 (3), 981-986 (1982).
- Chaiet, L., Wolf, F. J. The properties of streptavidin, a biotin-binding protein produced by streptomyces. Archives of Biochemistry and Biophysics. 20 (106), 1-5 (1964).
- Cockburn, I. A., Donvito, B., Cohen, J. H., Rowe, J. A. A simple method for accurate quantification of complement receptor 1 on erythrocytes preserved by fixing or freezing. Journal of Immunological Methods. 20 (271), 59-64 (2002).
- Chen, C. H., et al. Antibody CR1-2B11 recognizes a non-polymorphic epitope of human CR1 (CD35). Clinical & Experimental Immunology. 148 (3), 546-554 (2007).
- Ripoche, J., Sim, R. B. Loss of complement receptor type 1 (CR1) on ageing of erythrocytes. Studies of proteolytic release of the receptor. Biochemical Journal. 235 (3), 815-821 (1986).
- Moldenhauer, F., Botto, M., Walport, M. J. The rate of loss of CR1 from ageing erythrocytes in vivo in normal subjects and SLE patients: no correlation with structural or numerical polymorphisms. Clinical & Experimental Immunology. 72 (1), 74-78 (1988).
- Cohen, J. H., Lutz, H. U., Pennaforte, J. L., Bouchard, A., Kazatchkine, M. D. Peripheral catabolism of CR1 (the C3b receptor, CD35) on erythrocytes from healthy individuals and patients with systemic lupus erythematosus (SLE). Clinical & Experimental Immunology. 87 (3), 422-428 (1992).
- Nickells, M. W., Subramanian, V. B., Clemenza, L., Atkinson, J. P. Identification of complement receptor type 1-related proteins on primate erythrocytes. The Journal of Immunology. 154 (6), 2829-2837 (1995).
- Hebert, L. A., Birmingham, D. J., Shen, X. P., Cosio, F. G. Stimulating erythropoiesis increases complement receptor expression on primate erythrocytes. Clinical Immunology and Immunopathology. 62 (3), 301-306 (1992).
- Davis, K. A., Abrams, B., Iyer, S. B., Hoffman, R. A., Bishop, J. E. Determination of CD4 antigen density on cells: Role of antibody valency, avidity, clones, and conjugation. Cytometry. 33 (2), 197-205 (1998).
- Pannu, K. K., Joe, E. T., Iyer, S. B. Performance evaluation of QuantiBRITE phycoerythrin beads. Cytometry. 45 (4), 250-258 (2001).
- Barnett, D., Storie, I., Wilson, G. A., Granger, V., Reilly, J. T. Determination of leucocyte antibody binding capacity (ABC): the need for standardization. Clinical Laboratory Haematology. 20 (3), 155-164 (1998).
- Bikoue, A., et al. Quantitative analysis of leukocyte membrane antigen expression: normal adult values. Cytometry. 26 (2), 137-147 (1996).
- Serke, S., van Lessen, A., Huhn, D. Quantitative fluorescence flow cytometry: a comparison of the three techniques for direct and indirect immunofluorescence. Cytometry. 33 (2), 179-187 (1998).
