Summary
Hensikten med denne protokollen er å vurdere om forskjellige kunstige tåreformuleringer kan beskytte humane hornhinnen epitelceller mot uttørking ved hjelp av en in vitro-modell. Etter eksponering for kunstige tåreformuleringer og uttørking vurderes humane hornhinnen epitelceller for metabolsk aktivitet.
Abstract
Kunstig lipidholdige tåreformuleringer er utviklet for å redusere tårefordampning ved restaurering av et mangelfullt tårelipidlag. Kunstige tåreformuleringer som forhindrer celletørking vil resultere i okulær overflatebeskyttelse og vedlikehold av cellemetabolistisk aktivitet. Under dehydrering gjennomgår celler prosessen med tap av metabolsk aktivitet og deretter celledød. Dette arbeidet beskriver en metode for å vurdere effekten av kunstige tåreformuleringer. Det metabolske fargestoffet (dvs. alamarBlue) endres fra et lavt fluorescerende molekyl resazurin til et fluorescerende molekyl resorufin i levedyktige celler. Den biologiske ytelsen til en kunstig tåreformulering måles som formuleringens evne til å (a) opprettholde celle levedyktighet og (b) gi cellebeskyttelse mot uttørking. Vekstmedier og saltvann brukes som kontroller for celle levedyktighets-/uttørkingstestene. Celler inkuberes med testløsninger i 30 min og desiccated deretter i 0 eller 5 min ved 37 °C og 45% relativ fuktighet. Cellemetabolistisk aktivitet etter første eksponering og etter celletørking bestemmes deretter. Resultatene viser de komparative effektene av øyedråpeformuleringer på cellemetabolistisk aktivitet og uttørkingsbeskyttelse. Denne metoden kan brukes til å teste tørre øyeformuleringer som er designet for å behandle personer med fordampende tørre øyne.
Introduction
Mange forskjellige ingredienser i flerdose oftalmiske løsninger er nødvendig for å opprettholde stabilitet, pH, osmolaritet og effekt. Noen kjemikalier som konserveringsmidler eller overflateaktive midler i okulære løsninger kan imidlertid forårsake skade på hornhinnen epitel1,2. Celle levedyktighet tester ved hjelp av humane hornhinnen epitelceller (HCEC) kan utføres for å vurdere potensiell skade forårsaket av disse ulike ingrediensene i oftalmiske formuleringer. En av in vitro-analysene som er spesielt nyttige for å vurdere celleskade, er alamarBlue-analysen3. I denne analysen inneholder det metabolske fargestoffet (dvs. alamarBlue) resazurin, som fungerer som en celle levedyktighetsindikator. Under cellulær respirasjon reduseres resazurin til resorufin ved å akseptere elektroner4. Reduksjonen av resorufin forårsaker en endring fra et ikke-fluorescerende molekyl til et fluorescerende molekyl som kan oppdages ved hjelp av et spektrofluorometer5.
Denne undersøkelsen bruker to forskjellige behandlinger av hornhinnen epitelceller for å bestemme hvordan tørre øyeprodukter kan utføre i en in vitro-modell. I den første evalueringen behandles cellene med disse produktene i 30 min. Etter behandling blir cellene deretter evaluert for metabolsk aktivitet umiddelbart etter eksponering for de tørre øyeproduktene og etter et utvinningstidsintervall. Denne vurderingen bestemmer effekten av disse produktene på celler før uttørking i et fuktighetskammer. Konserveringsmidler, overflateaktive stoffer eller buffere i disse løsningene kan ha noen cytotoksiske effekter på cellene som kan oppdages ved hjelp av metabolsk fargestoff.
Den andre evalueringen bestemmer cellenes metabolske aktivitet etter eksponering for tørre øyeprodukter og uttørking. I denne vurderingen, hvis produktbehandlingen gir beskyttelse til cellene mot uttørkingsskader, vil cellenes metabolske aktivitet opprettholdes. Cellebeskyttelse mot skadelige effekter av uttørking kan oppstå hvis det tørre øyeproduktet kan belegge cellene med lipider, eller produktet kan absorbere væske fra omgivelsene og tilføre fuktighet til cellene.
Denne protokollen er utformet for å simulere alvorlige forhold for miljøstress på celler. Andre studier har brukt ulike modeller for å skape dette eksterne stresset. Noen studier har tørket cellene i laminære strømningshetter6,7,8, mens andre har brukt romtemperatur og ulike relative fuktighetsverdier (RH)9,10,11. En metode for å simulere tørre øyeforhold er å øke osmolariteten til inkuberingsløsningen12,13. En annen in vitro-metode for å simulere ugunstige miljøforhold er å legge cytokiner til cellemediene for å simulere tårevæsken til tørre øyepasienter14. Selv om disse testene er interessante modeller som kan evaluere hvordan kjemikalier reduserer osmotisk stress eller stimulerer immunforsvaret, viser disse modellene ikke direkte hvordan kjemiske formuleringer kan beskytte celler mot uttørkingsstress.
Uttørkingsmodellen bruker et temperatur-/fuktighetskammer 37 °C og 45 % relativ fuktighet. Det simulerer miljøforhold som kan forårsake fordampning fra okulær overflate. Simuleringer av andre ekstreme miljøforhold som lav luftfuktighet som finnes i flykabiner15 eller i innemiljøer i vintermånedene16, kan også utføres ved hjelp av denne metoden.
Cellekulturmodellering brukes til å simulere effekten av uttørkingsstress på den menneskelige hornhinnen. For å oppdage cellestress utføres celle levedyktighetstesting for å bestemme virkningen på cellehelsen. Flere forskjellige fysiologiske tester kan utføres på celler for å avgjøre om de er stresset17. Analysen som utføres i denne testprosedyren, bruker det kommersielt tilgjengelige metabolske fargestoffet (Tabell over materialer). Den har fordelen i forhold til mange andre cellestresstester ved at den er giftfri, løselig i vekstmedier og kan evaluere celler uten cellefiksering18. I denne prosedyren testes cellene for metabolsk aktivitet umiddelbart etter hver behandling, og et annet sett med celler plasseres tilbake i vekstmedier og evalueres etter 18 timers gjenoppretting. Årsaken til testing umiddelbart og deretter etter en gjenopprettingsperiode er å identifisere celleskader som forårsaker umiddelbare effekter på metabolsk aktivitet og celleskade som forårsaker forsinkede effekter. Det gir også en mulighet til å evaluere effekten av disse formuleringene på kortsiktig kontra langsiktig skade og formuleringenes evne til å gjenopprette / ikke gjenopprette fra den første fornærmelsen.
Denne undersøkelsen brukes til å sammenligne ulike lipidholdige tørre øyeprodukter for deres effekt på HCEC metabolsk aktivitet med og uten uttørking. Ingrediensene i de testede tørrøyeproduktene er beskrevet i Materialliste. Ingrediensene i oppløsning #1 er karboksymetylcellulosenatrium (0,5%), glyserin (1%), og polysorbat 80 (0,5%), i løsning #2 de er lett mineralolje (1,0%) mineralolje (4,5%), og i løsning #3 lipiden er mineralolje og propylenglykol er demulcent. Disse lipidene er formuleringskomponentene som forventes å gi beskyttelse av HCEC mot uttørking.
Protocol
1. Menneskelig hornhinnen epitelcellekultur
- Vokse udødeliggjort HCEC19 i kollagen-belagt 75 cm2 kolber med 20 ml Dulbecco modifisert Eagle medium / næringsblanding F-12 (DMEM / F12) som inneholder 10% foster bovint serum (FBS) og 1% penicillin / streptomycin ved 37 ° C med 5% CO2.
MERK: Risting er ikke nødvendig. - Bytt mediet hver 2-3 dager.
2. Forberedelse av celler for testing
- Etter at cellene er nesten sammenfallende, fjern kulturmedier.
- Tilsett 4-6 ml celledisassosiasjonsløsning til hver 75 cm2 kolber. Inkuber cellene ved 37 °C til cellene løsner (ca. 20-30 min), kontroller under mikroskopet med jevne mellomrom.
- Tilsett 2-6 ml DMEM/F12 som inneholder 10% FBS i hver 75 cm2 kolbe.
- Overfør innholdet i kolben til et 50 ml sentrifugerør.
- Sentrifuger cellene ved 450-500 x g i 5 min. Rør ut supernatanten og resuspend cellene i forvarmede medier.
- Tell cellene ved hjelp av et hemocytometer. Beregn medievolumet som inneholder totalt 1 x 105 celler.
- Tilsett 1 x 105 celler i hver brønn av en 48 brønn kollagen-1 belagt kulturplate. Legg nok medier til brønnen slik at det endelige medievolumet i brønnen er 0,5 ml kultur DMEM/F12 med 10% FBS.
MERK: En kunstig tåreformulering kan forårsake cytotoksisitet som kan måles ved en reduksjon i HCECs metabolske aktivitet. Konsistensen av dataene er avhengig av å legge til samme antall HCEC i hver brønn ved såing. Kulturkonsentrasjonen som anbefales for 48 brønnplater er 1 x 105. Fordi pattedyrceller kan bosette seg i sentrifugerøret etter resuspending, anbefales det å resuspendere cellene ved agitasjon ofte mens du sår platene med celler slik at cellefjæringen har HCEC like fordelt. - Inkuber cellene ved 37 °C og 5 % CO2 i 24 timer.
3. Ingen uttørkingsprotokoll
- Kontrollprosedyre
- Etter 24 timers inkubasjon fjern kulturmediet fra platen.
- Behandle umiddelbart med 150 μL av en testformulerings- og mediekontrollløsning.
- Inkuber cellene ved 37 °C og 5 % CO2 i 30 minutter.
- Fjern testløsningene fra cellene.
- Tilsett 0,5 ml 10% metabolsk fargestoffløsning for å teste for metabolsk aktivitet. Inkuber cellene i ytterligere 4 timer ved 37 °C og 5 % CO2.
- Etter 4 h inkubasjonsperioden, fjern 100 μL metabolsk fargestoffløsning fra hver brønn og legg hver 100 μL i en brønn på en 96 brønnplate.
- Mål fluorescensen til hver brønn ved hjelp av en fluorescerende plateleser (Tabell over materialer). Sett eksitasjonsbølgelengden på 540 nm og utslippsbølgelengden på 590 nm.
- Ingen uttørkingsprotokoll (gjenopprettingsprosedyre)
- Gjenta trinn 3.1.1−3.1.4.
- Tilsett 0,5 ml DMEM/F12-medier i hver brønn.
- Inkuber ett sett med kulturer i 18 timer ved 37 °C og 5 % CO2.
- Fjern mediet og tilsett 0,5 ml 10% metabolsk fargestoffløsning. Gjenta trinn 3.1.6 og 3.1.7.
4. Uttørkingsprotokoll
- Kontrollprosedyre
- Etter 24 timers inkubasjon (trinn 2.8), fjern kulturmediet fra platen.
- Behandle umiddelbart med 150 μL av en testformulerings- og mediekontrollløsning.
- Inkuber cellene ved 37 °C og 5 % CO2 i 30 minutter.
- Fjern testløsningene fra cellene.
- Plasser cellene i et 37 °C og et 45 % RH-kammer i 5 minutter for å desiccate cellene.
- Tilsett 0,5 ml 10% metabolsk fargestoffløsning for å teste metabolsk aktivitet. Inkuber cellene i ytterligere 4 timer ved 37 °C og 5 % CO2.
- Etter 4 h inkubasjonsperioden, fjern 100 μL metabolsk fargestoffløsning fra hver brønn og legg hver 100 μL i en brønn på en 96 brønnplate.
- Mål fluorescensen til hver brønn ved hjelp av en fluorescerende plateleser. Sett eksitasjonsbølgelengden på 540 nm og utslippsbølgelengden på 590 nm.
- Prosedyre for gjenoppretting
- Gjenta trinn 4.1.1-4.1.5.
- Tilsett 0,5 ml DMEM/F12-medier i hver brønn.
- Inkuber ett sett med kulturer i 18 timer ved 37 °C og 5 % CO2.
- Fjern mediet og tilsett 0,5 ml 10% metabolsk fargestoffløsning. Gjenta trinn 4.1.7 og 4.1.8.
5. Dataanalyse
- Beregn den gjennomsnittlige fluorescensen til mediekontrollen. Beregn prosent levedyktigheten til utvalget ved hjelp av følgende formel:
Prosent levedyktighet av prøven = testprøvefluorescens/mediekontrollfluorescens x 100
MERK: Mediekontrollgjennomsnittet er 100 % levedyktighet. Det metabolske fargestoffet i seg selv har en liten mengde fluorescens forbundet med det. Fluorescensen til det metabolske fargestoffreagenset kan trekkes fra kontroll- og testprøvefluorescensen før du beregner % levedyktighet av testprøvene til mediekontrollen. - Utfør en normalitetstest og en test for like varianser i kontroll- og testprøvene.
- Hvis normalitetstesten består og variansene er like, utfører du en enveis ANOVA. For å identifisere signifikante forskjeller mellom bestemte grupper utfører du en parvis sammenligning etter hoc-test (dvs. Tukey eller Dunnetts flere sammenligningstester).
- Hvis normalitetstesten består og variansene er forskjellige, utfører du Welchs ANOVA. For å identifisere signifikante forskjeller mellom bestemte grupper, utfør en parvis sammenligning etter hoc-test (dvs. Dunnetts eller Games-Howell flere sammenligningstester).
- Hvis normalitetstesten mislykkes, bruk en ikke-parametrisk test (dvs. Kruskal-Wallis-test). For å identifisere signifikante forskjeller mellom bestemte grupper utfører du en parvis sammenligning etter hoc-test (dvs. Dunns test).
Representative Results
Resultater fra en studie som sammenligner tre tørre øyeformuleringer er vist i figur 1. Denne figuren viser at det er forskjeller i effekten de tre produktene, løsningen #1, løsning #2 og løsning #3 (Materialliste) har på levedyktigheten til HCEC. Løsning #1 og løsning #2 hadde en betydelig effekt på HCECs metabolske aktivitet før uttørking. Dette betyr at det er formuleringskomponenter i disse produktene som kan forstyrre HCECs metabolske aktivitet. Den ekstra nedgangen i celle metabolsk aktivitet som skjedde etter 18 h utvinning av celler utsatt for løsning #1 viser at HCEC ble skadet i utgangspunktet og etter 18 h skaden ble ikke reparert. Til sammenligning hadde løsning #3 bare en mild effekt på HCECs metabolske aktivitet.
Figur 2 viser effekten av disse lipidholdige tørre øyeformuleringene på cellebeskyttelse. Med en nesten 0% HCEC metabolsk aktivitet ved 18 h utvinning intervall, løsning #1 og løsning #2 ikke beskytte celler mot uttørking stress. Løsning #3 tilbød imidlertid noe beskyttelse mot uttørkingsstress.
Figur 1: Effekt av tørre øyne lipid forbedrede produkter på celle levedyktighet. Relativ levedyktighet målt ved HCEC metabolsk aktivitet etter behandling med lipidholdige tørre øyeprodukter. * = statistisk signifikans (p < 0,05) i forhold til løsning #3, Δ = statistisk signifikans (p < 0,05) i forhold til mediekontrollen for riktig gjenopprettingsperiode. Høyden på linjen representerer gjennomsnittsverdien, og feilfeltene er SD. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Effekt av tørrøyelipidforbedrede produkter på uttørkingsbeskyttelse. Effekt av lipidholdige tørre øyeformuleringer på cellebeskyttelse. Løsning #1 og løsning #2 beskyttet ikke celler mot uttørkingsstress, og de kom seg ikke fra uttørkingseffekter over tid. I motsetning #3 løsningen gitt litt beskyttelse mot uttørkingsstress. * = p < 0,05 i forhold til løsning #3, og Δ = p < 0,05 i forhold til ubehandlede (kontroll) medier for riktig gjenopprettingstid. Høyden på linjen representerer gjennomsnittsverdien, og feilfeltene er SD. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
Denne protokollen er designet for å bestemme de beskyttende effektene av kunstige tåreløsninger mot celletørking. I utgangspunktet blir cellene utsatt for de tørre øyedråpene for å belegge cellene. Deretter tørkes cellene, og den metabolske aktiviteten overvåkes for å vurdere om formuleringene kan redusere de skadelige effektene av uttørkingsstress. Disse trinnene er avgjørende for å forstå den samlede effekten de tørre øyeformuleringene kan ha på den generelle levedyktigheten til hornhinnen epitelceller.
Etter at de fleste av de tørre øyeformuleringene er fjernet fra kulturbrønnene, vil kjemien til de resterende molekylene som er i kontakt med cellene påvirke celletørking. Noen produkter inneholder mikroemulsjoner av oljer som minimerer cellefordampning20. En studie som evaluerte friksjonsanalyse etter skylling viste vedlikehold av lav friksjon for noen tørre øyeformuleringer som kan være en indikator på den forbedrede oppholdstiden for de tørre øyeformuleringene21. En av begrensningene i denne analysen er at selv om uttørkingsbeskyttelse kan evalueres i forhold til andre øyedråpeformuleringer, kan ikke varigheten av denne beskyttelsen bestemmes på grunn av den korte tørketiden som vurderes. Lengre tørketider i denne in vitro-analysen kan kreve bruk av flerlagskulturer som generelt har mer fuktighetsinnhold enn et cellemonolag.
De spesifikke inkubasjonstidene for formuleringene på cellene og varigheten av tørketiden må kanskje justeres hvis temperatur- og fuktighetsverdiene endres. Å velge temperatur, RH og luftstrøm for å simulere miljøbelastningsforhold som kan bidra til tørre øyne, kan være vanskelig, da de sesongmessige og lokale miljøforholdene er ganske variable21. Moderne miljøkamre for menneskelige studier kan variere temperaturen mellom 5 °C og 35 °C, og RH mellom 5 % og 95 %22. Ved hjelp av et evaporimeter og tett monterte briller ble det fastslått at ved RH på 40-45% var fordampningshastigheten fra hornhinnen 0,037 μL / cm2/ min og ved RH på 20-25% var fordampningshastigheten 0,065 μL / cm2/ min23. Hvis in vitro-modellen ser på den beskyttende effekten av formuleringer under ekstremt lave RH-forhold som i fly15, ørkener eller tørre innemiljøer16, kan inkubasjonstider måtte reduseres for å imøtekomme de forbedrede fordampningshastighetene fra cellene. I den menneskelige tårevæsken er en rekke lipider avledet fra meibomian og andre kjertler til stede som beskytter tårene mot fordampning. Disse lipidene har forskjellige smeltepunkter24. Temperaturendringer kan påvirke væsken i tårevæsken, slik at tester utført ved omgivelsestemperatur kan ha betydelig forskjellige fordampningshastigheter enn tester utført ved 37 °C. Siden det gjennomsnittlige okulære overflatetemperaturområdet er fra 32,9 til 36 °C25, anbefales det å utføre testen i nærheten av dette temperaturområdet.
I tillegg til metabolsk fargestoff (alamarBlue) som brukes i denne protokollen, er det andre kjemiske reagenser som kan brukes til å vurdere effekten av produktformuleringer på cellemetabolisk aktivitet. Tetrazoliumsaltene (MTT, XTT, MTS, WST) er alternative kjemikalier som kan brukes. Forskjellen i tetrazolium salter er at MTT er et positivt ladet molekyl slik at det kan komme inn i cytoplasma av levende celler26. MTT blir uoppløselig etter reduksjonen med NAD(P)H27. Det må solubiliseres før du leser absorbans på en plateleser. De andre tetrazolium saltene er negativt ladet28. De må reduseres av sekundære molekyler utenfor levende celle fordi de ikke kan komme inn i cellen og samhandle direkte med intracellulæremolekyler 29. For XTT-, MTS- og WST-1-analysene kan tilsetningen av et elektronkoblingsmiddel 1-metoksy fenazinmetosulfat (PMS) forbedre ytelsen til analysene30. I motsetning til metabolske analyser som bruker tetrazolium salter, alamarBlue krever ikke en ekstra solubilizing eller elektron koblingsmidler. Også, i motsetning til XTT, MTS eller WST-1, alamarBlue penetrerer cellemembraner og kan reduseres direkte av cellulære enzymer27,29. Direkte sammenligning av alamarBlue til tetrazolium salter har vist at alamarBlue er mer følsom for evaluering av metabolsk aktivitet av ulike cellelinjer, inkludert HCEC3,27,31,32.
Andre biokjemiske endepunkter kan også vurderes for å evaluere beskyttelsen av humane hornhinnen epitelceller ved uttørking. Fluorescerende fargestoffer kan brukes til å oppdage cellemembrangjennomtrengelighet og cellesteraseaktivitet1. Også apoptose kan oppdages ved farging for apoptotiske markører på celleoverflaten eller ved å måle for caspase aktivitet1,33. Andre analyser har bestemt effekten av oftalmiske produkter på HCEC tette veikryss34. Disse analysene kan innlemmes i fremtidige vurderinger ved hjelp av uttørkingsprosedyrene beskrevet i denne artikkelen.
Det er mange årsaker til tørt øye. Tørre øyne kan skyldes redusert sekresjon av tårer, økt okulær overflatebetennelse eller økt dehydrering på okulær overflate. For personer som har fordampende tørr øyebruk av en tørr øyedråpe som forhindrer at cellene tørker under tørkeforhold, kan lindre symptomene på tørre øyne. Et av problemene i noen tørre øyeformuleringer er tilstedeværelsen av konserveringsmidler som kan skade okulær overflate. Skadeceller er ikke nyttig å tørke øyepasienter, da det kan føre til at flere celler dør, da skadede celler er mer utsatt for uttørkingsstress35.
En nylig gjennomgangsartikkel av Garrigue et al.36 gir en vurdering av den nåværende kunnskapen om hvordan lipidbaserte produkter virker for å lindre fordampende tørre øyne. Å legge lipider til lipidmangel tårer kan forhindre fordampning, og dermed beskytte cellene mot uttørking. I tillegg er humectants molekyler som tiltrekker og beholder vann på okulær overflate37. Både glyserin i løsning #1 og propylenglykol i løsning #3 er humectants. Løsning #3 viste en større beskyttende effekt av HCEC som kan ha vært på grunn av lipid- og fuktegenskapene til formuleringsingrediensene.
Denne protokollen er designet for å evaluere den metabolske aktiviteten til HCEC etter eksponering for de tørre øyeformuleringene og for å tørke stress. Ved å bruke metodene beskrevet i denne artikkelen, kan nye ikke-irriterende og beskyttende øyedråper utvikles for personer som lider av fordampende tørre øyne.
Disclosures
Tre forfattere (Rekha Rangarajan, Howard A. Ketelson, Lakshman Subbaraman) er ansatte i Alcon. Alcon er den eneste kilden til finansiering og sponsor av dette prosjektet. Lyndon W. Jones har i løpet av de siste 3 årene mottatt forskningsstøtte eller forelesning honoraria fra følgende selskaper: Alcon, Allergan, Contamac, CooperVision, GL Chemtec, Inflamax Research, J&J Vision, Menicon, Nature's Way, Novartis, PS Therapy, Santen, Shire, SightGlass og Visioneering. Lyndon Jones er også konsulent og/eller sitter i et rådgivende styre for Alcon, CooperVision, J&J Vision, Novartis og Ophtecs. Følgende liste over forfattere har ingenting å avsløre: Richard Do, David J. McCanna, Adeline Suko, Daryl Enstone, Jaya Dantam.
Acknowledgments
Forfatterne takker Alcon for å gi økonomisk støtte til disse studiene.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 75 cm2 Vented Flask | Corning | 354485 | This is the BioCoat brand collagen coated |
| 96 well plate | costar | 3370 | |
| alamarBlue | Fisher Scientific | dal 1025 | |
| Corning 48 Well plates | Corning | 354505 | This is the BioCoat brand collagen coated |
| Cytation 5 | BioTek | CYT5MPV | Can read fluorescence from 280 - 700 nm (for assay 540/590) |
| DMEM/F12 with L-glutamine and 15 mM HEPES | Gibco | 11039-021 | There is No Phenol Red in this media |
| Fetal Bovine Serum | Hycone | SH30396.03 | |
| Human Corneal Epithelial Cells | University of Ottawa | N/A | SV40-immortalized human corneal epithelial cells from Dr. M. Griffith (Ottawa Eye Research Institute, Ottawa, Canada) and have been characterized Griffith M, Osborne R, Munger R, Xiong X, Doillon CJ, Laycock NL, Hakim M, Song Y, Watsky MA. Functional human corneal equivalents constructed from cell lines. Science. 1999;286:2169–72. |
| Humidity/Temperature Chamber | Associated Environmental Systems | LH-1.5 | Economy Line Humidity Chamber |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 100X concentration so add 1ml to each 99ml of media |
| Refresh Optive Advanced (solution #1) | Allergan, Inc | Carboxymethylcellulose Sodium (0.5%),Glycerin (1%),polysorbate 80 (0.5%),-Lubricants- Inactive ingredients-boric acid; carbomer copolymer type A; castor oil; erythritol; levocarnitine; purified water; Purite (stablized oxychloro complex)and may contain sodium hydroxide to adjust pH. | |
| Soothe XP (solution #2) | Bausch & Lomb | Light mineral oil (1.0%), Mineral Oil (4.5%)-emolients-Inactive ingredients-boric acid, edetate disodium, octoxynol-40, polyquaternium-1 (preservative), polysorbate 80, purified water, sodium borate decahydrate. May contain hydrochloric acid and/or sodium hydroxide (to adjust pH). | |
| Systane Complete (solution #3) | Alcon Inc. | Propylene Glycol 0.6% Lubricant Inactive ingredients- boric acid, dimyristoyl phosphatidylglycerol, edatate disodium, hydroxypropyl guar, mineral oil, polyoxl 40 stearate, POLYQUAD® (polyquaternium-1) 0.001% preservative, sorbitan tristearate, sorbitol and purified water. May contain hydrochloric acid and/or sodium hydroxide to adjust pH. | |
| TrypLE Express (cell disassociation solution) | Fisher Scientific | 12605036 |
References
- Xu, M., Sivak, J. G., McCanna, D. J. Comparison of the effects of ophthalmic solutions on human corneal epithelial cells using fluorescent dyes. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 29 (9), 794-802 (2013).
- Maurer, J. K., et al. Quantitative measurement of acute corneal injury in rabbits with surfactants of different type and irritancy. Toxicology and Applied Pharmacology. 158 (1), 61-70 (1999).
- Xu, M. L., McCanna, D. J., Sivak, J. G. Use of the viability reagent PrestoBlue in comparison with alamarBlue and MTT to assess the viability of human corneal epithelial cells. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 71, 1-7 (2015).
- Slaughter, M. R., Bugelski, P. J., O'Brien, P. J. Evaluation of alamar blue reduction for the in vitro assay of hepatocyte toxicity. Toxicology in Vitro. 13 (4-5), 567-569 (1999).
- Hakkarainen, J. J., et al. Acute cytotoxic effects of marketed ophthalmic formulations on human corneal epithelial cells. International Journal of Pharmaceutics. 511 (1), 73-78 (2016).
- Paulsen, K., Maile, S., Giebel, J., Tost, F. Lubricating agents differ in their protection of cultured human epithelial cells against desiccation. Medical Science Monitor. 14 (6), 12-16 (2008).
- Tost, F., Keiss, R., Grossjohann, R., Jurgens, C., Giebel, J. Effect of different artificial tears against desiccation in cultured human epithelial cells. Medical Science Monitor. 18 (5), 188-192 (2012).
- Ubels, J. L., et al. Pre-clinical investigation of the efficacy of an artificial tear solution containing hydroxypropyl-guar as a gelling agent. Current Eye Research. 28 (6), 437-444 (2004).
- Hovakimyan, M., et al. Evaluation of protective effects of trehalose on desiccation of epithelial cells in three dimensional reconstructed human corneal epithelium. Current Eye Research. 37 (11), 982-989 (2012).
- Zheng, X., Goto, T., Shiraishi, A., Ohashi, Y. In vitro efficacy of ocular surface lubricants against dehydration. Cornea. 32 (9), 1260-1264 (2013).
- Matsuo, T. Trehalose protects corneal epithelial cells from death by drying. British Journal of Ophthalmology. 85 (5), 610-612 (2001).
- Zheng, Q., et al. Reactive oxygen species activated NLRP3 inflammasomes initiate inflammation in hyperosmolarity stressed human corneal epithelial cells and environment-induced dry eye patients. Experimental Eye Research. 134, 133-140 (2015).
- Hua, X., et al. Protective Effects of L-Carnitine Against Oxidative Injury by Hyperosmolarity in Human Corneal Epithelial Cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (9), 5503-5511 (2015).
- Schulze, U., et al. Trefoil factor family peptide 3 (TFF3) is upregulated under experimental conditions similar to dry eye disease and supports corneal wound healing effects in vitro. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (5), 3037-3042 (2014).
- Giaconia, C., Orioli, A., Di Gangi, A. Air quality and relative humidity in commercial aircrafts: An experimental investigation on short-haul domestic flights. Building and Environment. 67, 69-81 (2013).
- van Setten, G., Labetoulle, M., Baudouin, C., Rolando, M. Evidence of seasonality and effects of psychrometry in dry eye disease. Acta Ophthalmologica. 94 (5), 499-506 (2016).
- Valtink, M., Donath, P., Engelmann, K., Knels, L. Effect of different culture media and deswelling agents on survival of human corneal endothelial and epithelial cells in vitro. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 254 (2), 285-295 (2016).
- Zachari, M. A., et al. Evaluation of the Alamarblue Assay for Adherent Cell Irradiation Experiments. Dose-Response. 12 (2), 246-258 (2014).
- Griffith, M., et al. Functional human corneal equivalents constructed from cell lines. Science. 286 (5447), 2169-2172 (1999).
- Benelli, U. Systane lubricant eye drops in the management of ocular dryness. Clinical Ophthalmology. 5, 783-790 (2011).
- Davis, R. E., McGregor, G. R., Enfield, K. B. Humidity: A review and primer on atmospheric moisture and human health. Environmental Research. 144 (Pt A), 106-116 (2016).
- Calonge, M., et al. Controlled Adverse Environment Chambers in Dry Eye Research. Current Eye Research. 43 (4), 445-450 (2018).
- McCulley, J. P., Uchiyama, E., Aronowicz, J. D., Butovich, I. A. Impact of evaporation on aqueous tear loss. Transactions of the American Ophthalmological Society. 104, 121-128 (2006).
- Bron, A. J., Tiffany, J. M., Gouveia, S. M., Yokoi, N., Voon, L. W. Functional aspects of the tear film lipid layer. Experimental Eye Research. 78 (3), 347-360 (2004).
- Purslow, C., Wolffsohn, J. S. Ocular surface temperature: a review. Eye & Contact Lens. 31 (3), 117-123 (2005).
- Stepanenko, A. A., Dmitrenko, V. V. Pitfalls of the MTT assay: Direct and off-target effects of inhibitors can result in over/underestimation of cell viability. Gene. 574 (2), 193-203 (2015).
- Stockert, J. C., Horobin, R. W., Colombo, L. L., Blazquez-Castro, A. Tetrazolium salts and formazan products in Cell Biology: Viability assessment, fluorescence imaging, and labeling perspectives. Acta Histochemica. 120 (3), 159-167 (2018).
- Berridge, M. V., Herst, P. M., Tan, A. S. Tetrazolium dyes as tools in cell biology: new insights into their cellular reduction. Biotechnology Annual Review. 11, 127-152 (2005).
- Rampersad, S. N. Multiple Applications of Alamar Blue as an Indicator of Metabolic Function and Cellular Health in Cell Viability Bioassays. Sensors. 12 (9), 12347-12360 (2012).
- Li, J., Zhang, D. L., Ward, K. M., Prendergast, G. C., Ayene, I. S. Hydroxyethyl disulfide as an efficient metabolic assay for cell viability in vitro. Toxicology in Vitro. 26 (4), 603-612 (2012).
- Koyanagi, M., Kawakabe, S., Arimura, Y. A comparative study of colorimetric cell proliferation assays in immune cells. Cytotechnology. 68 (4), 1489-1498 (2016).
- Uzunoglu, S., et al. Comparison of XTT and Alamar blue assays in the assessment of the viability of various human cancer cell lines by AT-101 (-/- gossypol). Toxicology Mechanisms and Methods. 20 (8), 482-486 (2010).
- McIlwain, D. R., Berger, T., Mak, T. W. Caspase functions in cell death and disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (4), a026716 (2015).
- McCanna, D. J., Harrington, K. L., Driot, J. Y., Ward, K. W., Tchao, R. Use of a human corneal epithelial cell line for screening the safety of contact lens care solutions in vitro. Eye & Contact Lens. 34 (1), 6-12 (2008).
- Puhlev, I., Guo, N., Brown, D. R., Levine, F. Desiccation tolerance in human cells. Cryobiology. 42 (3), 207-217 (2001).
- Garrigue, J. S., Amrane, M., Faure, M. O., Holopainen, J. M., Tong, L. Relevance of Lipid-Based Products in the Management of Dry Eye Disease. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 33 (9), 647-661 (2017).
- Lievens, C., et al. Evaluation of an enhanced viscosity artificial tear for moderate to severe dry eye disease: A multicenter, double-masked, randomized 30-day study. Contact Lens & Anterior Eye. 42 (4), 443-449 (2019).
