Summary
O objetivo deste protocolo é avaliar se diferentes formulações artificiais podem proteger as células epiteliais da córnea humana da dessecação usando um modelo in vitro. Após a exposição a formulações artificiais de lágrimas e proficação, as células epiteliais da córnea humana são avaliadas para a atividade metabólica.
Abstract
Formulações de lágrimas artificiais contendo lipídios são desenvolvidas para reduzir a evaporação de lágrimas pela restauração de uma camada lipídica lacrimal deficiente. Formulações artificiais de lágrimas que previnem a dessecação celular resultarão em proteção da superfície ocular e manutenção da atividade metabólica celular. Durante a desidratação, as células passam pelo processo de perda de atividade metabólica e posterior morte celular. Este trabalho descreve um método para avaliar a eficácia das formulações artificiais de lágrimas. O corante metabólico (ou seja, alamarBlue) muda de uma molécula fluorescente baixa resazurina para uma molécula fluorescente resorufina em células viáveis. O desempenho biológico de uma formulação artificial de lágrimas é medido como a capacidade da formulação de (a) manter a viabilidade celular e (b) fornecer proteção celular contra a dessecação. A mídia de crescimento e a solução salina são usadas como controles para os testes de viabilidade/dessaciação celular. As células são incubadas com soluções de teste por 30 minutos e depois dessecadas por 0 ou 5 min a 37 °C e 45% de umidade relativa. A atividade metabólica celular após a exposição inicial e após a proficação celular é então determinada. Os resultados mostram os efeitos comparativos das formulações do olírio na atividade metabólica celular e na proteção contra a dessecação. Este método pode ser usado para testar formulações oculares secas que são projetadas para tratar indivíduos com olho seco evaporativo.
Introduction
Muitos ingredientes diferentes em soluções oftálmicas de múltiplas doses são necessários para manter a estabilidade, pH, osmolaridade e eficácia. No entanto, alguns produtos químicos, como conservantes ou surfactantes em soluções oculares, podem causar danos ao epitélio córnea1,2. Testes de viabilidade celular utilizando células epiteliais da córnea humana (HCEC) podem ser realizados para avaliar os danos potenciais causados por esses vários ingredientes em formulações oftálmicas. Um dos ensaios in vitro que é particularmente útil para avaliar danos celulares é o ensaio alamarblue3. Neste ensaio, o corante metabólico (ou seja, alamarBlue) contém resazurina, que funciona como um indicador de viabilidade celular. Durante a respiração celular, a resazurina é reduzida a resorufina aceitando elétrons4. A redução do resorufina causa uma mudança de uma molécula não fluorescente para uma molécula fluorescente que pode ser detectada usando um espectrofluorômetro5.
Esta investigação utiliza dois tratamentos diferentes das células epiteliais da córnea para determinar o desempenho dos produtos oculares secos em um modelo in vitro. Na primeira avaliação, as células são tratadas com esses produtos por 30 minutos. Após o tratamento, as células são então avaliadas para atividade metabólica imediatamente após a exposição aos produtos oculares secos e após um intervalo de tempo de recuperação. Esta avaliação determina o efeito desses produtos nas células antes da dessecação em uma câmara de umidade. Conservantes de solução, surfactantes ou tampões nessas soluções podem ter alguns efeitos citotóxicos nas células que podem ser detectados usando o corante metabólico.
A segunda avaliação determina a atividade metabólica das células após a exposição aos produtos oculares secos e a dessecação. Nesta avaliação, se o tratamento do produto oferecer proteção às células contra danos à dessecação, a atividade metabólica das células será mantida. A proteção celular contra os efeitos nocivos da dessecação pode ocorrer se o produto ocular seco puder revestir as células com lipídios ou o produto pode absorver líquido do ambiente adicionando umidade às células.
Este protocolo foi projetado para simular condições severas de estresse ambiental nas células. Outros estudos têm usado vários modelos para criar esse estresse externo. Alguns estudos secaram as células nas coifas de fluxo laminar6,7,8, enquanto outros utilizaram temperatura ambiente e vários valores de umidade relativa do ar (RH)9,10,11. Um método de simulação de condições oculares secas é aumentar a osmolaridade da solução incubadora12,13. Outro método in vitro para simular condições ambientais adversas é adicionar citocinas à mídia celular para simular o fluido lacrimal de pacientes de olho seco14. Embora esses testes sejam modelos interessantes que podem avaliar como os produtos químicos reduzem o estresse osmótico ou estimulam o sistema imunológico, esses modelos não mostram diretamente como as formulações químicas podem proteger as células do estresse de dessecação.
O modelo de proficação utiliza uma câmara de temperatura/umidade 37 °C e 45% RH. Simula condições ambientais que podem causar evaporação da superfície ocular. Simulações de outras condições ambientais extremas, como a baixa umidade encontrada nas cabines de avião15 ou em ambientes internos durante os meses de inverno16 também podem ser realizadas usando este método.
A modelagem da cultura celular é usada para simular o efeito do estresse de dessecação na córnea humana. Para detectar o estresse celular, são realizados testes de viabilidade celular para determinar o impacto na saúde celular. Vários diferentes testes fisiológicos podem ser realizados em células para determinar se estão estressados17. A análise realizada neste procedimento de teste utiliza o corante metabólico comercialmente disponível (Tabela de Materiais). Tem a vantagem sobre muitos outros testes de estresse celular, pois não é tóxico, solúvel em meios de crescimento e pode avaliar células sem fixaçãocelular 18. Neste procedimento, as células são testadas para atividade metabólica imediatamente após cada tratamento e um segundo conjunto de células são colocadas de volta em meios de crescimento e avaliadas após 18 h de recuperação. A razão para testar imediatamente e depois de um período de recuperação é identificar danos celulares que causam efeitos imediatos na atividade metabólica e danos celulares que causam efeitos atrasados. Além disso, oferece uma oportunidade de avaliar o impacto dessas formulações sobre danos de curto prazo versus longo prazo e a capacidade das formulações de se recuperar/não se recuperar do insulto inicial.
Esta investigação é usada para comparar vários produtos oculares secos contendo lipídios para seu efeito na atividade metabólica do HCEC com e sem dessecação. Os ingredientes dos produtos oculares secos testados estão descritos na Tabela de Materiais. Os ingredientes em solução #1 são o sódio carboximetilcelulose (0,5%), a glicerina (1%) e o polisorbato 80 (0,5%), em solução #2 são óleo mineral leve (1,0%) e óleo mineral (4,5%), e em solução #3 o lipídio é óleo mineral e propilenoglicol é o demulcento. Esses lipídios são os componentes de formulação que devem fornecer proteção do HCEC contra a dessecação.
Protocol
1. Cultura de células epiteliais da córnea humana
- Cresça hcec19 imortalizado em frascos de 75 cmrevestidos de colágeno com 20 mL da mistura de médio/nutrientes da Águia modificada de Dulbecco F-12 (DMEM/F12) contendo 10% de soro bovino fetal (FBS) e 1% penicilina/estreptomicina a 37 °C com 5% de CO2.
NOTA: Não é necessário tremer. - Mude a mídia a cada 2-3 dias.
2. Preparação de células para testes
- Depois que as células são quase confluentes remover a mídia cultural.
- Adicione 4-6 mL de solução de dissociação celular a cada frasco de 75 cm2. Incubar as células a 37 °C até que as células se desprendem (aproximadamente 20-30 min), verificando sob o microscópio periodicamente.
- Adicione 2−6 mL de DMEM/F12 contendo 10% de FBS a cada frasco de 75 cm2.
- Transfira o conteúdo do frasco para um tubo de centrífuga de 50 mL.
- Centrifugar as células a 450-500 x g por 5 min. Pipet para fora o supernasce e resuspend as células em mídia pré-aquecida.
- Conte as células usando um hemócito. Calcule o volume de mídia que contém um total de 1 x 105 células.
- Adicione 1 x 105 células a cada poço de uma placa de cultura revestida de colágeno-1 de 48 poços. Adicione mídia suficiente ao poço para que o volume final de mídia no poço seja de 0,5 mL de cultura DMEM/F12 com 10% de FBS.
NOTA: Uma formulação artificial de lágrimas pode causar citotoxicidade que pode ser medida por uma diminuição da atividade metabólica do HCEC. A consistência dos dados depende da adição do mesmo número de HCEC a cada poço ao semear. A concentração cultural recomendada para 48 placas de poço é 1 x 105. Como as células mamíferas podem se instalar no tubo de centrífuga após a reutilização, recomenda-se resuspendar as células por agitação com frequência enquanto semeia as placas com células para que a suspensão celular tenha o HCEC igualmente distribuído. - Incubar as células a 37 °C e 5% de CO2 por 24 h.
3. Sem protocolo de proficação
- Procedimento de controle
- Após a incubação de 24 horas remova a mídia cultural da placa.
- Trate imediatamente com 150 μL de uma solução de formulação de teste e controle de mídia.
- Incubar as células a 37 °C e 5% de CO2 por 30 min.
- Remova as soluções de teste das células.
- Adicione 0,5 mL de 10% de solução de corante metabólico para testar a atividade metabólica. Incubar as células por mais 4h a 37 °C e 5% de CO2.
- Após o período de incubação de 4 h, remova 100 μL de solução de corante metabólico de cada poço e coloque cada 100 μL em um poço de uma placa de 96 poços.
- Meça a fluorescência de cada poço utilizando um leitor de placas fluorescentes(Tabela de Materiais). Coloque o comprimento de onda de excitação em 540 nm e o comprimento de onda de emissão em 590 nm.
- Sem protocolo de proficação (procedimento de recuperação)
- Repetição de passos 3.1.1−3.1.4.
- Adicione 0,5 mL de mídia DMEM/F12 a cada poço.
- Incubar um conjunto de culturas por 18 h a 37 °C e 5% de CO2.
- Remova a mídia e adicione 0,5 mL de solução de corante metabólico de 10%. Repetir as etapas 3.1.6 e 3.1.7.
4. Protocolo de proficação
- Procedimento de controle
- Após a incubação de 24 horas (etapa 2.8), remova a mídia cultural da placa.
- Trate imediatamente com 150 μL de uma solução de formulação de teste e controle de mídia.
- Incubar as células a 37 °C e 5% de CO2 por 30 min.
- Remova as soluções de teste das células.
- Coloque as células em uma câmara de 37 °C e 45% de RH por 5 minutos para dessmacar as células.
- Adicione 0,5 mL de solução de corante metabólico de 10% para testar a atividade metabólica. Incubar as células por mais 4h a 37 °C e 5% de CO2.
- Após o período de incubação de 4 h, remova 100 μL de solução de corante metabólico de cada poço e coloque cada 100 μL em um poço de uma placa de 96 poços.
- Meça a fluorescência de cada poço usando um leitor de placa fluorescente. Coloque o comprimento de onda de excitação em 540 nm e o comprimento de onda de emissão em 590 nm.
- Procedimento de recuperação
- Repetição passos 4.1.1-4.1.5.
- Adicione 0,5 mL de mídia DMEM/F12 a cada poço.
- Incubar um conjunto de culturas por 18 h a 37 °C e 5% de CO2.
- Remova a mídia e adicione 0,5 mL de solução de corante metabólico de 10%. Repetir as etapas 4.1.7 e 4.1.8.
5. Análise de dados
- Calcule a fluorescência média do controle de mídia. Calcule a viabilidade percentual da amostra usando a fórmula a seguir:
Viabilidade percentual da amostra = fluorescência amostral/fluorescência de controle de mídia x 100
NOTA: A média de controle de mídia é 100% de viabilidade. O corante metabólico por si só tem uma pequena quantidade de fluorescência associada a ele. A fluorescência do reagente de corante metabólico pode ser subtraída do controle e testar a fluorescência da amostra antes de calcular a % de viabilidade das amostras de teste para o controle de mídia. - Realize um teste de normalidade e um teste para variâncias iguais nas amostras de controle e teste.
- Se o teste de normalidade passar e as variâncias forem iguais, execute um ANOVA unidirecional. Para identificar diferenças significativas entre grupos específicos, realize um teste pós-hoc de comparações pareiras (ou seja, os testes de comparações múltiplas de Tukey ou Dunnett).
- Se o teste de normalidade passar e as variâncias forem diferentes, então realize o ANOVA de Welch. Para identificar diferenças significativas entre grupos específicos, realize um teste pós-hoc de comparações pareiras (ou seja, testes de várias comparações de Dunnett ou Games-Howell).
- Se o teste de normalidade falhar, use um teste não paramétrico (ou seja, teste de Kruskal-Wallis). Para identificar diferenças significativas entre grupos específicos, faça comparações duplas pós-teste hoc (ou seja, teste de Dunn).
Representative Results
Os resultados de um estudo comparando três formulações oculares secas são mostrados na Figura 1. Este número mostra que há diferenças no efeito que os três produtos, solução #1, solução #2 e solução #3 (Tabela de Materiais) têm sobre a viabilidade do HCEC. A solução #1 e solução #2 teve um efeito significativo na atividade metabólica do HCEC antes da dessecação. Isso significa que existem componentes de formulação nesses produtos que podem interromper a atividade metabólica do HCEC. A queda adicional na atividade metabólica celular que ocorreu após a recuperação de 18h de células expostas à solução #1 mostra que o HCEC foi ferido inicialmente e após 18h a lesão não foi reparada. Em comparação, a solução #3 teve apenas um efeito leve sobre a atividade metabólica do HCEC.
A Figura 2 mostra o efeito dessas formulações oculares secas contendo lipídios na proteção celular. Com uma atividade metabólica de quase 0% de HCEC no intervalo de recuperação de 18 horas, a solução #1 e a solução #2 não protegeram as células do estresse de dissocção. A solução #3, no entanto, ofereceu alguma proteção contra o estresse de proficação.
Figura 1: Efeito de produtos lipídios de olho seco aprimorados na viabilidade celular. Viabilidade relativa medida pela atividade metabólica do HCEC após o tratamento com produtos oculares secos contendo lipídios. * = significância estatística (p < 0,05) relativa à solução #3, Δ = significância estatística (p < 0,05) em relação ao controle de mídia para o período de recuperação adequado. A altura da barra representa o valor médio, e as barras de erro são o SD. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Efeito de produtos lipídios de olho seco aprimorados na proteção contra dessecação. Efeito de formulações de olhos secos contendo lipídios na proteção celular. A solução #1 e a solução #2 não protegeram as células do estresse de proficação, e não se recuperaram dos efeitos de dissocição ao longo do tempo. Em contrapartida, a solução #3 ofereceu alguma proteção contra o estresse de dessacação. * = p < 0,05 relativo à solução #3, e Δ = p < 0,05 em relação às mídias não tratadas (controle) para o tempo de recuperação adequado. A altura da barra representa o valor médio, e as barras de erro são o SD. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
Este protocolo foi projetado para determinar os efeitos protetores das soluções artificiais contra a dessecação celular. Inicialmente, as células são expostas aos colírios secos para revestir as células. Em seguida, as células são secas, e a atividade metabólica é monitorada para avaliar se as formulações podem mitigar os efeitos prejudiciais do estresse de dessecação. Essas etapas são fundamentais para entender o impacto global que as formulações de olhos secos podem ter na viabilidade geral das células epiteliais córneas.
Depois que a maioria das formulações de olhos secos são removidas dos poços de cultura, a química das moléculas restantes que estão em contato com as células afetará a dessecação celular. Alguns produtos contêm micro-emulsões de óleos que minimizam a evaporação celular20. Estudo que avaliou a análise de atrito após a lavagem mostrou manutenção de baixo atrito para algumas formulações oculares secas que podem ser um indicador do tempo de residência aprimorado das formulações de olho seco21. Uma das limitações deste ensaio é que, embora a proteção contra a dessecação possa ser avaliada em comparação com outras formulações de olírio, a duração dessa proteção não pode ser determinada devido ao curto tempo de secagem avaliado. Tempos de secagem mais longos neste ensaio in vitro podem exigir o uso de culturas multicamadas que têm no geral mais conteúdo de umidade do que uma monocamada celular.
Os tempos específicos de incubação para as formulações nas células e a duração do tempo de secagem podem precisar ser ajustados se os valores de temperatura e umidade forem alterados. A seleção de um fluxo de temperatura, RH e ar para simular condições de estresse ambiental que podem contribuir para o olho seco pode ser difícil, pois as condições ambientais sazonais e locais são bastantevariáveis 21. As câmaras ambientais modernas para estudos humanos podem variar a temperatura entre 5 °C e 35 °C, e RH entre 5% e 95%22. Utilizando um evaporímetro e óculos bem equipados, foi determinado que em RH de 40-45% a taxa de evaporação da córnea foi de 0,037 μL/cm2/min e na RH de 20-25% a taxa de evaporação foi de 0,065 μL/cm2/min23. Se o modelo in vitro estiver olhando para o efeito protetor das formulações em condições de RH extremamente baixas, como em aviões15,desertos ou ambientes internos secos16,os tempos de incubação podem precisar ser reduzidos para acomodar as taxas de evaporação aprimoradas das células. No fluido lacrimal humano, uma variedade de lipídios derivados do meibomiano e outras glândulas estão presentes que protegem as lágrimas da evaporação. Estes lipídios têm diferentes pontos de fusão24. Mudanças de temperatura podem afetar a fluidez do fluido lacrimal, de modo que testes realizados à temperatura ambiente poderiam ter taxas de evaporação significativamente diferentes do que os testes realizados a 37 °C. Como a faixa média de temperatura da superfície ocular é de 32,9 a 36 °C25,recomenda-se a realização do teste perto desta faixa de temperatura.
Além do corante metabólico (alamarBlue) usado neste protocolo, existem outros reagentes químicos que podem ser usados para avaliar os efeitos das formulações do produto na atividade metabólica celular. Os sais de tetrazolium (MTT, XTT, MTS, WST) são produtos químicos alternativos que podem ser usados. A diferença nos sais de tetrazolium é que o MTT é uma molécula positivamente carregada para que possa entrar no citoplasma das células vivas26. O MTT torna-se insolúvel após sua redução por NAD(P)H27. Deve ser solubilizado antes de ler absorvância em um leitor de placas. Os outros sais de tetrazolium são carregados negativamente28. Elas devem ser reduzidas por moléculas secundárias fora da célula viva porque não podem entrar na célula e interagir diretamente com moléculas intracelulares29. Para os ensaios XTT, MTS e WST-1, a adição de um agente de acoplamento de elétrons 1-metoxi metossulfato de fenazina (PMS) pode melhorar o desempenho dos ensaios30. Em contraste com os ensaios metabólicos que usam sais de tetrazolium, a alamarBlue não requer um adicional de solubilização ou acoplamento de elétrons. Além disso, ao contrário de XTT, MTS ou WST-1, alamarBlue penetra membranas celulares e pode ser reduzido diretamente por enzimas celulares27,29. A comparação direta dos sais de alamarBlue com tetrazolium mostrou que a alamarBlue é mais sensível para avaliar a atividade metabólica de várias linhascelulares,incluindo HCEC3,27,31,32.
Outros pontos finais bioquímicos também podem ser considerados para avaliar a proteção das células epiteliais da córnea humana por dessecação. Corantes fluorescentes podem ser usados para detectar permeabilidade da membrana celular e atividade de esterásecelular 1. Além disso, a apoptose pode ser detectada por coloração para marcadores apoptóticos na superfície celular ou medindo para atividade caspase1,33. Outros ensaios determinaram os efeitos dos produtos oftálmicos nas junções apertadas do HCEC34. Esses ensaios poderiam ser incorporados em avaliações futuras utilizando os procedimentos de dessecação descritos neste artigo.
Há muitas causas de olho seco. O olho seco pode ser causado pela diminuição da secreção de lágrimas, aumento da inflamação da superfície ocular ou aumento da desidratação na superfície ocular. Para os indivíduos que têm o uso evaporativo do olho seco de um olírio seco que impede que suas células sequem durante as condições de dessecação podem aliviar os sintomas do olho seco. Um dos problemas em algumas formulações oculares secas é a presença de conservantes que podem prejudicar a superfície ocular. Ferir células não é útil para pacientes oculares secos, pois pode causar a morte de mais células, pois as células feridas são mais suscetíveis ao estresse de dessacação35.
Um artigo de revisão recente de Garrigue et al.36 fornece uma avaliação do conhecimento atual de como os produtos à base de lipídios agem para aliviar o olho seco evaporativo. Adicionar lipídios a lágrimas deficientes lipídicas pode impedir a evaporação, protegendo assim as células da dessecação. Além disso, os humectantes são moléculas que atraem e retêm água na superfície ocular37. Tanto glicerina em solução #1 quanto propilenoglicol em solução #3 são humectantes. A solução #3 mostrou maior efeito protetor do HCEC que pode ter sido devido às propriedades lipídicas e umectantes dos ingredientes de formulação.
Este protocolo é projetado para avaliar a atividade metabólica do HCEC após a exposição às formulações de olhos secos e ao estresse de dessecação. Utilizando os métodos descritos neste artigo, novos colírios não-estimulantes e protetores podem ser desenvolvidos para pessoas que sofrem de olho seco evaporativo.
Disclosures
Três autores (Rekha Rangarajan, Howard A. Ketelson, Lakshman Subbaraman) são funcionários da Alcon. A Alcon é a única fonte de financiamento e patrocinadora deste projeto. Lyndon W. Jones, nos últimos 3 anos, recebeu apoio de pesquisa ou palestras das seguintes empresas: Alcon, Allergan, Contamac, CooperVision, GL Chemtec, Inflamax Research, J&J Vision, Menicon, Nature's Way, Novartis, PS Therapy, Santen, Shire, SightGlass e Visioneering. Lyndon Jones também é consultor e/ou atua em um conselho consultivo para Alcon, CooperVision, J&J Vision, Novartis e Ophtecs. A seguinte lista de autores não tem nada a revelar: Richard Do, David J. McCanna, Adeline Suko, Daryl Enstone, Jaya Dantam.
Acknowledgments
Os autores agradecem à Alcon por fornecer apoio financeiro para esses estudos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 75 cm2 Vented Flask | Corning | 354485 | This is the BioCoat brand collagen coated |
| 96 well plate | costar | 3370 | |
| alamarBlue | Fisher Scientific | dal 1025 | |
| Corning 48 Well plates | Corning | 354505 | This is the BioCoat brand collagen coated |
| Cytation 5 | BioTek | CYT5MPV | Can read fluorescence from 280 - 700 nm (for assay 540/590) |
| DMEM/F12 with L-glutamine and 15 mM HEPES | Gibco | 11039-021 | There is No Phenol Red in this media |
| Fetal Bovine Serum | Hycone | SH30396.03 | |
| Human Corneal Epithelial Cells | University of Ottawa | N/A | SV40-immortalized human corneal epithelial cells from Dr. M. Griffith (Ottawa Eye Research Institute, Ottawa, Canada) and have been characterized Griffith M, Osborne R, Munger R, Xiong X, Doillon CJ, Laycock NL, Hakim M, Song Y, Watsky MA. Functional human corneal equivalents constructed from cell lines. Science. 1999;286:2169–72. |
| Humidity/Temperature Chamber | Associated Environmental Systems | LH-1.5 | Economy Line Humidity Chamber |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 100X concentration so add 1ml to each 99ml of media |
| Refresh Optive Advanced (solution #1) | Allergan, Inc | Carboxymethylcellulose Sodium (0.5%),Glycerin (1%),polysorbate 80 (0.5%),-Lubricants- Inactive ingredients-boric acid; carbomer copolymer type A; castor oil; erythritol; levocarnitine; purified water; Purite (stablized oxychloro complex)and may contain sodium hydroxide to adjust pH. | |
| Soothe XP (solution #2) | Bausch & Lomb | Light mineral oil (1.0%), Mineral Oil (4.5%)-emolients-Inactive ingredients-boric acid, edetate disodium, octoxynol-40, polyquaternium-1 (preservative), polysorbate 80, purified water, sodium borate decahydrate. May contain hydrochloric acid and/or sodium hydroxide (to adjust pH). | |
| Systane Complete (solution #3) | Alcon Inc. | Propylene Glycol 0.6% Lubricant Inactive ingredients- boric acid, dimyristoyl phosphatidylglycerol, edatate disodium, hydroxypropyl guar, mineral oil, polyoxl 40 stearate, POLYQUAD® (polyquaternium-1) 0.001% preservative, sorbitan tristearate, sorbitol and purified water. May contain hydrochloric acid and/or sodium hydroxide to adjust pH. | |
| TrypLE Express (cell disassociation solution) | Fisher Scientific | 12605036 |
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