Summary
הפרוטוקול מציג מודל מאומת TNBS המושרה מלאה של מחלת קרוהן ושיטות עבור ויזואליזציה של קולטני אסטרוגן על ידי אימונוהיסטוכימיה באמצעות immunofluorescence מקטעים נקודתיים קבוע מוטבע פרפין.
Abstract
קרוהן היא הסוג האובחן ביותר של מחלת המעי הדלקתית. דלקת כרונית המתפתחת במעי מוביל להפרעה הפריסטלזיס ולנזק של רירית המעי ונראה להיות משויך לסיכון מוגבר של שינוי המעי הגס הנאופלסטי. צבירת ראיות עולה כי אסטרוגנים וקולטנים אסטרוגן להשפיע לא רק רקמות הורמונלי רגיש, אלא גם רקמות אחרות לא קשור ישירות אסטרוגנים, כגון הריאות או המעי הגס. כאן, אנו מתארים את הפרוטוקול לצביעת החיסונית מוצלחת של קולטני אסטרוגן במעי הגס המתקבל ממודל murine של מחלת קרוהן המושרה. פרוטוקול מפורט אינדוקציה של מחלת קרוהן בעכברים והכנה למעיים מסופק, כמו גם צעד אחר צעד אימונוהיסטוכימיקלים הליך באמצעות formalin קבוע-מקטעים המעי מוטבע. השיטות שתוארו הם לא רק שימושי לזיהוי קולטן אסטרוגן החקירה איתות אסטרוגן ב vivo אבל יכול גם להיות מיושם על חלבונים אחרים אשר עשויים להיות מעורבים בפיתוח של קוליטיס.
Introduction
קרוהן (CD) היא מחלת מעיים דלקתית (IBD) הנראית כמו דלקת המעי כרונית. האטיולוגיה של תקליטור הוא הבין בצורה גרועה, אבל יש כמה גורמים עיקריים שנראים להיות אחראי על פיתוח תקליטורים, כולל microbiota המעי, וגורמים גנטיים וסביבתיים, כגון דיאטה או מתח1. להבנה טובה יותר של הפתוגנזה של מחלת קרוהן, מודלים שונים של דלקת במעיים שימשו2,3,4,5,6,7. במאמר זה, אנו מציגים את התוצאות שהתקבלו מ 2, 4, 6-trinitrobenzene נזן חומצה sulfonic (TNBS)-מודל murine המושרה של תקליטור.
זה תועד כי אסטרוגנים מסוגלים למודולט דלקת מעיים כרונית8,9,10,11,12. הפעילות הביולוגית של אסטרוגנים מתווכת על ידי קולטנים קנצוני, ביניהם הם קולטני אסטרוגן גרעיני (ERs), כלומר, erα (ג ' ין ESR1) ו ERβ (גנים ESR2), כמו גם G חלבון מצמידים קולטן אסטרוגן, כלומר, gper (גנים GPER1), המכונה ממברנה מאוגד ER13,14. ישנן מספר שיטות לקביעת רמת קולטני אסטרוגן, אבל רק מעטים יכולים לשמש כדי להמחיש אותם במעי.
אימונוהיסטוכימיה (IHC) היא שיטה נפוצה במחקרים קליניים ובסיסיים לאיתור אנטיגנים מסוימים בתאים או ברקמות עם נוגדנים מצוונים fluorochrome. IHC נראה שיטה חשובה הדמיית מבנה רקמות, כמו גם זיהוי ולוקליזציה של חלבונים ספציפיים, אשר עשוי להיות קריטי להבנת ההתפתחות של קוליטיס. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מלא ומאומת עבור הדמיה אימונוהיסטוכימיה של קולטני אסטרוגן במעי באמצעות immunofluorescence.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
מחקרי בעלי חיים נערכו בהסכמת הוועדה האתית המקומית (28/ל2016) בהתאם לצו 2010/63/האיחוד האירופי של הפרלמנט האירופי ולמועצת ספטמבר 22, 2010 והמלצות מוסדיים.
1. TNBS המושרה מודל מורטין של מחלת קרוהן
הערה: פרוטוקול זה משתמש בעכברים מסוג BALB/C ששוקל 25-28 g. בעלי חיים שוכנו בטמפרטורה קבועה (22-24 ° c) ו, לחות יחסית 55 ± 5%, ומתוחזק 12 h אור/כהה מחזור עם גישה חופשית כדורי אוכל רגיל ברז מים לחות המודעה.
- הניחו את העכבר לתוך חדר האינדוקציה וסגרו את המכסה בחוזקה. בקיצור העכבר בקצרה עם isofלוריאן (25% O2 עם o2 שיעור זרימה ב 1.5-2 L/דקות).
הערה: קצב הנשימה צריך להישאר קצבי ואיטי מהרגיל, ולא לשנות תגובה לגירוי רעילים. - להחדיר 4 מ"ג של TNBS ב 0.1 mL של 30% אתנול ב 0.9% הנאל או 0.1 mL של 30% אתנול בשנת 0.9% בתור שליטה ברכב לתוך המעי הגס דרך קטטר.
הערה: הקטטר צריך להיות הציג בקפידה כ 3 ס מ לתוך פי הטבעת. - נטר את העכבר מדי יום מהיום השני עד שמונה עבור פרמטרים קליניים כולל משקל הגוף, דימום רקטלי, שרפרף עקביות ותמותה.
- ביום השמיני, המתת החסד. של העכבר על ידי נקע בצוואר הרחם
איור 1: ציר הזמן עבור המודל המושרה TNBS של מחלת קרוהן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
2. הפרדת המעי הגס והפקרוסקופי
הערה: יום אחד לפני הפרדת המעי הגס, לדלל 100 μL של אנטיביוטיקה ב 1 מ ל של המלח מאגר פוספט (PBS) ולצאת ב 4 ° c הלילה.
- נקה את העור מעל הבטן באמצעות 75% אתנול וגזה סטרילית.
- חותכים את קיר הבטן מעצם החזה לפי הטבעת באמצעות מספריים ופינצטה סטרילית.
- לחתוך את המעי הגס קרוב ככל האפשר פי הטבעת ו cecum.
- מניחים את המעי הגס על צלחת פטרי. חותכים את המעי הגס לאורך פי הטבעת לסוף מעי. נקה ושטוף את המעי הגס 2-4 פעמים בפתרון אנטיביוטי-PBS קר.
- בצע הערכה מאקרוסקופית באמצעות קליבר לפי לוח 1.
הערה: הדבקה רקמות* ואודם/דימום,דם צואה ושלשול כפופים להערכה חזותית.# # * הדבקה רקמות להעריך באמצעות סולם שלוש נקודות (0: נקודתיים ללא הדבקה רקמות, 1: קולון עם הדבקה רקמת בינונית, 2: קולון עם הדבקה רקמה נרחבת); מבוססעל היעדרות (0) או נוכחות (1) של אריתמה/דימום, דם צואה ושלשול.
| הדבקה* | שאריתמה/דימום | דם צואה | שלשול | אורך הכיב | עובי נקודתיים | אורך נקודתיים |
| נקודות (0 – 2) | נקודות (0 – 1) | נקודות (0 – 1) | נקודות (0 – 1) | ס מ/נקודות | mm/נקודות | ס מ/נקודות |
| 0 – נעדר | 0 – נעדר | 0 – נעדר | 0 – נעדר | 0.5 ס"מ = 0.5 נקודה | n מ"מ = n נקודות | 0 – < 10% קצר יותר מהפקד |
| 1 – בינוני | 1 – הווה | 1 – הווה | 0.5 – שרפרף קל/רופף | 1 – מ-10 עד 20% קצר יותר מהפקד | ||
| 2 – הווה | 1 – הווה | 2 – מעל 20% קצר יותר מאשר הפקד |
טבלה 1: מקרוסקופי הניקוד של המעי של עכברים עם מודל המושרה TNBS של מחלת קרוהן.
- להמיר את אורך הכיב בסנטימטרים לסולם נקודה, כלומר, כל 0.5 ס מ של כיב הוא נספר כנקודת 0.5. להמיר את עובי המעי הגס במילימטרים לסולם נקודה, כלומר, כל n mm מתאים n נקודות.
- המר את אורך הנקודתיים בסנטימטרים בקנה מידה של שלוש נקודות. אורך המעי הגס שהושג מכל עכבר עם tnbs המושרה מחלת קרוהן מוערך ביחס לאורך המעי הגס הממוצע עבור קבוצת הביקורת (0: < 10% קצר יותר מאשר הפקד, 1: מ 10 עד 20% קצר יותר מאשר הפקד, 2: מעל 20% קצר מכן ה שליטה).
- לחשב את הציון המקקרוסקופי הכולל על פי המשוואה: ציון כולל מאקרוסקופי = הדבקה (נקודות) + אריתמה/דימום (נקודות) + דם בצואה (נקודות) + שלשול (נקודות) + אורך של כיב (נקודות) + נקודתיים עובי (נקודות) + המעי הגס אורך (נקודות).
3. הכנה לדגימת קולון
- חותכים את המעי הגס לתוך 1-2 ס מ קטעי ומניחים כל על ספוג בקלטת היסטולוגית הנכונה המסומנת.
הערה: ספוגים לקלטות היסטולוגית מונעות קיפול קולון במהלך התייבשות ודגירה של פרפין נוזלי. - מניחים את מקטע המעי הגס 4% פורמלדהיד ו הדגירה לפחות 24 h ב 4 ° c.
- להכין ולתכנת את מעבד הרקמה עבור 1 h של דגירה ב 50%, 70%, 90%, 95%, 100% אתנול, קסילן/100% אתנול (1:1; v/v), ו קסילן בלבד, כמו גם עבור לפחות 3 h של דגירה בפרפין נוזלי.
הערה: התייבשות יש לבצע בריכוזים גוברת של אתנול ו xylene, אבל את הריכוז של אתנול ניתן לשנות. תערובת קסילן/אתנול מומלצת אך אינה נדרשת. - העבר את קטע המעי הגס לתיבה היסטולוגית ומקום במעבד הרקמה המתוכנת מראש.
- . תריץ את מעבד הרקמה
- לאחר שלבי דגירה, מניחים את רסיס המעי הגס בתבנית מתכת, כך שני הקצוות של המעי הגס הם בתנוחה זקופה ולמלא שליש העובש עם פרפין נוזלי.
- מניחים את העובש באזור הקירור (5 ° c) לכמה שניות, ולאחר מכן מזיז את התבנית לאזור ההתחממות (70 ° c). מקום בחלק התחתון של התיבה היסטולוגית ולכסות את שבר המעי הגס כולו עם פרפין נוזלי.
- השאירו את עובש המתכת עם רסיס המעי הגס בפרפין לכמה דקות באזור הקירור. להסיר את תבנית המתכת מבלוק פרפין ו הדגירה לפחות 24 h ב 4 ° c.
- להסיר פרפין עודף מן הבלוק ולהכניס אותו לתוך מיקרוטומה אוטומטית לחלוטין.
הערה: בלוק הפרפין עשוי להיות מאוחסן ב-20 ° c לכמה דקות לפני שלב זה. - חותכים את קטע המעי הגס לתוך 5 יקרומטר סעיפים.
- העבר את חתך המעי הגס לאמבט מים מחומם עד 40 ° c.
- השתמש בשקופית הזכוכית המסומנת כדי להסיר את מקטע הנקודתיים מאמבט המים.
הערה: מקטעי המעי הגס צפים על המים. שימו את שקופית הזכוכית המסומנת במים מתחת לסעיף המעי הגס ולמשוך את שקופית הזכוכית בזהירות. - השאירו את מגלשת הזכוכית 24 שעות בטמפרטורת החדר. לאחסון לטווח ארוך, שמרו על שקופית הזכוכית ב -4 ° c לאחר 24 שעות של דגירה בטמפרטורת החדר.
4. אימונוהיסטוכימיה עם מכתים מאימונולובורנציה
הערה: אל תאפשר למקטע הנקודתיים להתייבש בכל שלב במהלך השגרה.
- הסרת פרפין על ידי דגירה את שקופית הזכוכית קסילן עבור 5 דקות. חזור על שלב זה שלוש פעמים.
- מניחים את שקופית הזכוכית xylene/100% אתנול (1:1; v/v) עבור 5 דקות. חזור על שלב זה שלוש פעמים.
- מחדש את מקטע המעי הגס בסדרה של ריכוזי אתנול הפחתת, כלומר, 70%, 50%, 30% ו 10% אתנול עבור 5 דקות.. חזור על כל שלב שלוש פעמים
- לשטוף את שקופית הזכוכית תחת מים זורמים עבור 5 דקות.
- מחממים מאגר אחזור אנטיגן (10 מ"מ נתרן ציטראט; 0.05% רצף 20, pH 6.0) עד 95-98 ° צ' ומחממים את שקופית הזכוכית בתמיסה הרתיחה של האנטיגן במשך 10 דקות.
הערה: שלב אחזור האנטיגן הוא אופציונלי אך מומלץ. פתרון ללא מיסוך צריך להיות ממוטב בהתאם לנוגדן המשמש את הניסוי. - ציירו עיגול סביב מקטע המעי הגס בעזרת עט הידרופובי.
הערה: שלב זה הוא אופציונלי אך מומלץ. העט ההידרופובי מונע בזבוז של ריאגנטים על ידי שמירה על נוזלי במאגר בנפח קטן בתוך מסומן במעגל. - מודטה את הסעיף ב 3% המים פתרון של מימן peroxidase עבור 10 דקות.
- לשטוף את הפתרון כביסה (50 mM טריס-HCl, pH 7.4; 150 mM הנאל; 0.05% רצף 20) עבור 5 דקות.
- דגירה בפתרון חסימה (5% סרום עז רגיל; 50 mM טריס-HCl, pH 7.4; 150 mM הנאל; 0.05% טריטון X-100) עבור 1 h בטמפרטורת החדר.
הערה: בפתרון החסימה, הנסיוב הרגיל חייב להיות מאותו זן כמו הנוגדן המשני. בשלבים שבהם נדרשת דגירה, הניחו את שקופית הזכוכית בחדר לחות כדי למנוע התאיידות מוגזמת. - להסיר את הפתרון חסימה ולהוסיף 20-50 μL של הנוגדן העיקרי נגד ERα, ERβ או GPER מדולל ב 1% בסרום פרה אלבומין עם 50 mM טריס-HCl, pH 7.4, 150 mM הנאל, 0.05% טריטון X-100.
הערה: דילול מומלץ של נוגדנים ראשוניים מוצגים בטבלה 2.
| סוג נוגדן | נוגדן נגד | Clonality | מין מארח | פעילות מחודשת במינים | דילול |
| ראשי | מיכל שלמה | פוליבטיים | ארנב | אדם | 1:100 |
| עכבר | |||||
| צב | |||||
| קפיברה | |||||
| ERβ | פוליבטיים | ארנב | אדם | ||
| קוף | |||||
| עכברוש | |||||
| עכבר | |||||
| כבשים | |||||
| חזיר | |||||
| מיכל הגופר | פוליבטיים | ארנב | אדם | ||
| עכברוש | |||||
| עכבר | |||||
| שני | דילייט 650 | פוליבטיים | עז | ארנב | 1:250 |
שולחן 2: מאפייני הנוגדנים.
- מודלת עם נוגדן ראשוני לילה ב 4 ° c בחשיכה.
- הסר את פתרון נוגדן ולשטוף בפתרון כביסה (50 mM טריס-HCl, pH 7.4; 150 מ"מ הנאל; 0.05% רצף 20) עבור 5 דקות. חזור על שלב זה שלוש פעמים.
- הוסף 20-50 μL של DyLight 650 נוגדן משני מדולל ב 1% בסרום שור אלבומין (המכיל 50 mM טריס-HCl, pH 7.4, 150 מ"מ הנאל, 0.05% טריטון X-100). דגירה עם נוגדן משני מעלה עם צבע עבור 1 h בטמפרטורת החדר בחשכה.
הערה: הדילול המומלץ של הנוגדן המשני מוצג בטבלה 2. - הסר את פתרון נוגדן ולשטוף בפתרון כביסה (50 mM טריס-HCl, pH 7.4, 150 mM הנאל, 0.05% רצף 20) עבור 5 דקות. חזור על שלב זה שלוש פעמים.
- הוסף 2% DiOC6 (3) מדולל 50 mM טריס-HCl, pH 7.4, 150 mM הנאל ו דגירה עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר בחשכה.
- הסר את הפתרון ולשטוף בתמיסה כביסה (50 mM טריס-HCl, pH 7.4, 150 mM הנאל, 0.05% רצף 20) עבור 5 דקות. חזור על שלב זה שלוש פעמים.
- הוסיפו כמה טיפות מנוזל גליצרול המבוסס על DAPI ישירות על החלק הנקודתיים וכיסו בזהירות בשקופית כיסוי. מחלקת המעי הגס לפחות 24 שעות ב -4 ° c.
הערה: הימנע מבועות אוויר בעת כיסוי הרקמה עם שקופית המכסה. - לנתח את מקטע המעי הגס תחת מיקרוסקופ קונפוקלית וקד שמציעות 20x או 63 מטרות וטבילה שמן באמצעות תוכנה ייעודית.
הערה: טבלה 3 רשימות מאפיינים של fluorochromes בשימוש זה מחקר.
| סוג פלואורואוכדום | אורך הגל (nm) | צבע | |
| עירור | פליטה | ||
| דאפי | 405 | 460 – 480 | כחול |
| DiOC6 (3) | 485 | 538 – 595 | ירוק |
| דילייט 650 | 654 | 660 – 680 | אדום |
שולחן 3: מאפייני fluorochromes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
המאפיינים המקסקופיים של נקודתיים בעכברים עם מחלת קרוהן הנגרמת על ידי TNBS
תמונות מייצגות של נקודתיים שנלקחו מהפקד ועכברים שטופלו ב-TNBS מוצגים באיור 2. בעכברים עם מודל TNBS המושרה של מחלת קרוהן, אורך המעי הגס מופחת בעוד רוחב המעי הגס הוא גדל.
איור 2: נקודתיים מייצגים שהתקבלו מעכברי הבקרה (בקרה) ועכברים שטופלו על-ידי tnbs (TNBS). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
הפרמטרים המוקרוסקופיים הוערכו מקבלים בטבלה 1. המינהל של TNBS לעכברים מוביל להגדיל את הציון הכולל חוקן מאקרוסקופי (איור 3A) ואת אורך הדלקת (איור 3ב). ביחס לעכברי השליטה
איור 3: הציון הכולל המקקרוסקופי של הנקודתיים (A) ואורך לדלקת המעי הגס (ב) בעכברים שליטה (בקרה) ועכברים שטופלו tnbs (TNBS). . עשרה עכברים לכל קבוצה אנליזה סטטיסטית בוצעה באמצעות ANOVA חד כיוון ואחריו מבחן ניומן-קלס לאחר-הוק. נתונים מוצגים כאמצעי ± SEM; * * *p < 0.001 tnbs לעומת שליטה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
ואלידציה של נוגדנים לקולטן אסטרוגן
אימות של הספציפיות של נוגדנים לקולטן אסטרוגן בשימוש במחקר בוצע באמצעות מק -7 תאים. MCF-7 תאים נבחרו בהתבסס על מחקרים קודמים שבו כמה חוקרים עצמאיים מצאו כי קולטני אסטרוגן נמצאים ב mRNA ורמות החלבון. כפי שמוצג באיור 4, הנוגדנים המשמשים במחקר לאפשר זיהוי של שני קולטני אסטרוגן גרעיני, כלומר, erα(איור 4A) ו ERβ (איור 4ב), כמו גם את קולטן אסטרוגן מאוגד, כלומר, gper (איור 4ג) ב mcf-7 תאים. קולטני אסטרוגן גרעיני מותאמים לציטופלסמה וגרעינים, והאות מ GPER כתמים נמצא רק בציטופלסמה של תאים MCF-7.
איור 4: תמונות מייצגות של כתמים אימונולוגלואוורנציה של ERα (א), ERβ (ב) ו-GPER (C) בתאים MCF-7. תיאור מפורט בחלק העליון של התמונות. סרגלי קנה מידה: 10 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
בנוסף לשליטה חיובית, בוצעה גם שליטה שלילית, בה נעשה שימוש רק בנוגדן המשני. איור 5 מראה תמונה של mcf-7 תאים מוכתם רק עם נוגדן משני מצועם מבוסס fluorochrome ו גליצרול מבוססי נוזל עם dapi.
איור 5: דמות מייצגת של כתמים אימונואופלואונציה של DyLight 650 בתאים MCF-7. תיאור נוסף זמין מעל התמונה. סרגלי קנה מידה: 20 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
לוקליזציה של קולטן אסטרוגן ב-TNBS המושרה המודל של מחלת קרוהן
אות cytoplasmic חזק של ERα נמצאה בסעיף המעי הגס המתקבל עכברים שליטה ועכברים עם מחלת קרוהן המושרה (איור 6א). עם זאת, נראה כי רק במעיים שהתקבלו מעכברים שליטה היה ERα מקומי בתוך הקיפלסמה תא גביע. מיקרוסקופ confocal וקד חשף גם לוקליזציה cytoplasmic של ERβ בסעיף המעי הגס של שני שליטה ו-TNBS מטופלים עכברים (איור 6ב). באופן דומה, לוקליזציה cytoplasmic של GPER תועדה בסעיף המעי הגס המתקבל עכברים שליטה ו-TNBS מטופלים עכברים (איור 6ג).
איור 6: תמונות מייצגות של כתמים immunofluorescence של ERα (א), ERβ (ב) ו-GPER (ג) בסעיף המעי הגס המתקבל עכברים שליטה (שליטה) ו-tnbs מטופלים עכברים (tnbs). תיאור נוסף זמין מעל כל תמונה. סרגלי קנה מידה: 50 μm; סרגלי גודל תצוגה: 25 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ישנם מודלים רבים של בעלי חיים עבור בדיקה פתופסולוגיה IBD, כולל גנטי, מודלים אימונולוגיים או ספונטנית, כמו גם דגמים המושרה כימית15. בין מספר סוגים של מודלים בעלי חיים של קוליטיס, כימית המושרה מודלים כגון מודל TNBS המושרה המתואר בפרוטוקול זה, הם זולים יחסית וקל להשיג. המודל המושרה TNBS של קוליטיס יש כמה תסמינים קליניים הקשורים בסיס פתולוגי של תקליטור. בעלי חיים בעלי קוליטיס מושרה מאופיינים בהיווצרות צואה לא עקבית, שלשול מדמם ואובדן משקל הגוף. עם זאת, אין זה אומר כי מודל זה ניתן להשתמש כדי ללמוד CD etiopathogenesis בלעדית. הדגם TNBS המושרה מומלץ בשימוש נפוץ, למשל, עבור הקרנה טיפולית פוטנציאלית. במקרה של קוליטיס כימית המושרה כמה נקודות קריטיות צריך להיות מודגש. Tnbs יש להיות מדולל באתנול, אשר מפריעה מכשול רירית ומאפשר tnbs לחדור דרך הקיר המעי ואינטראקציה עם חלבונים משקל מולקולרי גבוה, המוביל לתגובה החיסונית בתיווך הסלולר2,16,17. הן המינון TNBS ואת ריכוז האתנול צריך להיות אופטימיזציה למתח את העכבר ואת המשקל. גבוה מדי המינון TNBS וריכוז אתנול עלול לגרום לתמותה מוגזמת, אשר מונע ניתוח נוסף. מצד שני, נמוך מדי המינון TNBS וריכוז אתנול עלול לגרום לתגובה ירודה ולהאריך לצורך המשך הניסוי.
המעי המתקבל מעכברים עם קוליטיס המושרה tnbs ניתן לבחון לא רק ברמה מאקרוסקופי, כפי שמתואר בפרוטוקול זה, אבל יכול לשמש גם עבור ניתוח ביוכימיים ומולקולרי. גישה שימושית אחת ללימוד הן ביטוי והן לוקליזציה היא טכניקה אימונוהיסטוכימיה עם שימוש באימונוכימיקלים. עם זאת, חלק מהשלבים הקריטיים חייבים להיכלל בהכנה וביישום של IHC עבור מקטעי המעי הגס קבוע של formalin-מוטבע. הצעד העיקרי הראשון, כלומר, הכנת המעי הגס קובע את איכות התוצאות. זמן הקיבעון, אשר תלוי בעובי הרקמה צריך להיות אופטימיזציה. שלב מכריע נוסף הוא התייבשות, אשר צריך להתבצע בעדינות על ידי incubations מרובים בריכוזים גוברת של אתנול. לבסוף, את המיקום הנכון של המעי הגס בתבנית חיונית כדי ליצור את החלקים הנכונים. הכנת הרקמה אינה הסוגיה החשובה היחידה באימונוהיסטוכימיה. למרות שאחזור אנטיגן הוא צעד אופציונלי, ב-formalin-קבוע מקטעים מוטבעים הוא נראה צורך. במהלך קיבעון עם פורמלדהיד, גשרים מתילן בין חלבונים מופקים וחלבונים מרובי קישור מסכות אנטיגן האתרים18. ישנן שתי שיטות עיקריות, המבוססות על שליפה באמצעות חום או אנזימטית (טריפסין, פנסין או פרוטטינואז K). מחממים לאחזור אנטיגן, בוצע במאגר הנתרן ציטראט, ethylenediam, חומצה אצטית (EDTA) מאגר או טריס-EDTA מאגר, הוא נפוץ יותר משום שהוא לא משפיע על מורפולוגיה של התא. סוג ספיגת אנטיגן ואת התנאים צריך להיות מותאם בניסויים. יצוין כי לפעמים את שיטת אחזור אנטיגן נקבעת על ידי הנוגדן המשמש את הניסויים. הפרפיקציה היא מצב התלוי אנטיגן נבדק, והוא נדרש במיוחד עבור חלבונים תאיים. ישנן מספר גישות המשתמשות בממיסים (אצטון או מתנול) וקשים (טריטון X-100 או NP-40), כמו גם מתון (שימוש בחומרי ניקוי 20 או saponin). בפרוטוקול הנוכחי שני חומרי ניקוי, שימשו בו זמנית, כלומר, טריטון X-100 ו-"רצף 20" בהתאם לשלב. יודגש כי החדירות חייבת להיות ממוטבת בהתאם לנוגדן המשמש. חסימת אתרי איגוד לא ספציפיים חשובה במיוחד במהלך ניתוח אימונוהיסטוכימיה. הפתרונות חסימת כוללים סרום רגיל, סרום בשור או אפילו מוכן לשימוש פתרונות חסימה. הפרוטוקול הנוכחי ממליץ על שימוש הן בסרום רגיל ובאלבומין סרום בשור. כפי שהוזכר כבר בפרוטוקול, פתרון חסימת צריך להכיל סרום נורמלי מאותו זן כמו הנוגדן המשני.
לבסוף, זיהוי IHC על ידי immunofluorescence כפי שמתואר בפרוטוקול זה ניתן להרחיב כדי להכתים חלבונים אחרים בלימודי אינטראקציה חלבון-חלבון. כאשר מחפשים לוקליזציה של חלבונים נבחרים, יש לקיים תנאים מסוימים. Fluorochromes יש לבחור מבוסס על עירור ספקטרום הפליטה. צעד זה חיוני כדי לחסל חופפים ספקטרלי והוא חייב להופיע בשלב התכנון של הניסוי. בפרוטוקול זה שלושה fluorochromes, כלומר, DyLight 650 נוגדן משני, DAPI ו-DiOC6 (3) משמשים. כפי שמוצג בטבלה 3, dylight 650 משמש לאיתור קולטן אסטרוגן הוא נצפתה כצבע אדום עם 654 בעלי ריגוש nm ו פליטה ב 660-680 nm. כדי להכתים את גרעיני התא ואת הקרום הפנימי, DyLight 650 משמש יחד עם סמן הגרעין DAPI ו DiOC6 (3) סמן ממברנה. DAPI הוא נצפתה כצבע כחול עם 405 העירור nm ו פליטה ב 460-480 nm. בתורו, DiOC6 (3) הוא הבחין כצבע ירוק עם 485 העירור nm ו פליטה ב 538-595 nm. יש לבצע כתמים של החלבון הבא לאחר שלב 4.14., החל בשלב החסימה (ראה שלב 4.9.). עבור שני חלבונים, מומלץ להשתמש בנוגדנים ממינים שונים. גישה זו מאפשרת להוציא את הכריכה של נוגדן משני צבע מצותת לחלבון מוכתם בעבר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
העבודה פורסמה בזכות התמיכה הכספית של הרשויות באוניברסיטת לודז ': סגן הרקטור למחקר מדעי, סגן הרקטור לשיתוף פעולה לאומי ובינלאומי ודיקן הפקולטה לביולוגיה והגנת הסביבה. דמיאן ז'זניק נתמך על ידי מענקים (2017/24/T/NZ5/00045 ו-2015/17/N/NZ5/00336) מהמרכז הלאומי למדעים, פולין.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animals | |||
| BALB/C mice | University of Lodz | NA | |
| Equipment | |||
| Caliper | VWR | 62379-531 | |
| Cardboard block | NA | NA | |
| Confocal microscope - TCS SP8 | Leica Biosystems | NA | |
| Fully automated rotary microtome - RM2255 | Leica Biosystems | NA | |
| Glass slide | Thermo Scientific | J1800BMNT | |
| Heated Paraffin Embedding Module - EG1150 H | Leica Biosystems | NA | |
| Histological box | Marfour | LN.138747 | |
| Hydrophobic pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | |
| Laboratory balance | Radwag | WL-104-0048 | |
| LAS X software | Leica Biosystems | NA | |
| Metal mold | Marfour | CP.5105 | |
| Sterile gauze | NA | NA | |
| Sterile scissor | NA | NA | |
| Sterile tweezer | NA | NA | |
| Tissue processor - TP1020 | Leica Biosystems | NA | |
| Reagents | |||
| 2, 4, 6-trinitrobenzene sulfonic acid | Sigma-Aldrich | 92822 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A3294 | |
| DiOC6 (3) | Sigma-Aldrich | 318426 | |
| DyLight 650 secondary antibody | Abcam | ab96886 | |
| ERα primary antibody | Abcam | ab75635 | |
| ERβ primary antibody | Abcam | ab3576 | |
| Ethanol | Avantor Performance Materials Poland | 396480111 | |
| Formaldehyde | Avantor Performance Materials Poland | 432173111 | |
| GPER primary antibody | Abcam | ab39742 | |
| Hydrochloric acid | Avantor Performance Materials Poland | 575283421 | |
| Hydrogen peroxidase | Avantor Performance Materials Poland | 885193111 | |
| isoflurane (forane) | Baxter | 1001936040 | |
| Normal goat serum | Gibco | 16210064 | |
| Paraffin | Leica Biosystems | 39602012 | |
| Petrie dish | Nest Scientific | 705001 | |
| Phosphate buffer saline | Sigma-Aldrich | P3813 | |
| Physiological saline | Sigma-Aldrich | 7982 | |
| Primocin (antibiotic) | Invitrogen | ant-pm-1 | |
| ProLong Diamond Antifage Mountant with DAPI (glycerol-based liquid with DAPI) | Invitrogen | P36971 | |
| Sodium chloride | Chempur | WE/231-598-3 | |
| Sodium citrate | Avantor Performance Materials Poland | 795780429 | |
| Tris | Avantor Performance Materials Poland | 853470115 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Xylene | Avantor Performance Materials Poland | BA0860119 |
References
- Zhang, Y. Z., Li, Y. Y. Inflammatory bowel disease: pathogenesis. World Journal of Gastroenterology. 20 (1), 91-99 (2014).
- Morris, G. P., et al. Hapten-induced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon. Gastroenterology. 96 (3), 795-803 (1989).
- Okayasu, I., et al. A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice. Gastroenterology. 98 (3), 694-702 (1990).
- Boirivant, M., Fuss, I. J., Chu, A., Strober, W. Oxazolone colitis: a murine model of T helper cell type 2 colitis treatable with antibodies to interleukin 4. Journal of Experimental Medicine. 188 (10), 1929-1939 (1998).
- Morrissey, P. J., Charrier, K., Braddy, S., Liggitt, D., Watson, J. D. CD4+ T cells that express high levels of CD45RB induce wasting disease when transferred into congenic severe combined immunodeficient mice. Disease development is prevented by cotransfer of purified CD4+ T cells. Journal of Experimental Medicine. 178 (1), 237-244 (1993).
- Kühn, R., Löhler, J., Rennick, D., Rajewsky, K., Müller, W. Interleukin-10-deficient mice develop chronic enterocolitis. Cell. 75 (2), 263-274 (1993).
- Sundberg, J. P., Elson, C. O., Bedigian, H., Birkenmeier, E. H. Spontaneous, heritable colitis in a new substrain of C3H/HeJ mice. Gastroenterology. 107 (6), 1726-1735 (1994).
- Harnish, D. C., et al. Beneficial effects of estrogen treatment in the HLA-B27 transgenic rat model of inflammatory bowel disease. American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology. 286 (1), 118-125 (2004).
- Pierdominici, M., et al. Linking estrogen receptor β expression with inflammatory bowel disease activity. Oncotarget. 6 (38), 40443-40451 (2015).
- Włodarczyk, M., et al. G protein-coupled receptor 30 (GPR30) expression pattern in inflammatory bowel disease patients suggests its key role in the inflammatory process. A preliminary study. Journal of Gastrointestinal and Liver Diseases. 26 (1), 29-35 (2017).
- Mohammad, I., et al. Estrogen receptor α contributes to T cell-mediated autoimmune inflammation by promoting T cell activation and proliferation. Science Signaling. 11 (526), eaap9415 (2018).
- Jacenik, D., et al. G protein-coupled estrogen receptor mediates anti-inflammatory action in Crohn's disease. Scientific Reports. 9 (1), 6749 (2019).
- Prossnitz, E. R., Barton, M. The G protein-coupled estrogen receptor GPER in health and disease. Nature Review Endocrinology. 7 (12), 715-726 (2011).
- Yaşar, P., Ayaz, G., User, S. D., Güpür, G., Muyan, M. Molecular mechanisms of estrogen-estrogen receptor signaling. Reproductive Medicine and Biology. 16 (1), 4-20 (2016).
- Pizarro, T. T., Arseneau, K. O., Bamias, G., Cominelli, F. Mouse models for the study of Crohn's disease. Trends in Molecular Medicine. 9 (5), 218-222 (2003).
- Neurath, M. F., Fuss, I., Kelsall, B. L., Stüber, E., Strober, W. Antibodies to interleukin 12 abrogate established experimental colitis in mice. Journal of Experimental Medicine. 182 (5), 1281-1290 (1995).
- Ikeda, M., et al. Simvastatin attenuates trinitrobenzene sulfonic acid-induced colitis, but not oxazalone-induced colitis. Digestive Diseases and Sciences. 53 (7), 1869-1875 (2007).
- Thavarajah, R., Mudimbaimannar, V. K., Elizabeth, J., Rao, U. K., Ranganathan, K. Chemical and physical basics of routine formaldehyde fixation. Journal of Oral Maxillofacial Pathology. 16 (3), 400-405 (2012).
