Summary
该协议提出了完整的经验证的克罗恩病TNBS诱导的鼠模型，以及利用嵌入在石蜡中的正式固定结肠部分的免疫荧光，通过免疫组织化学对雌激素受体进行可视化的方法。
Abstract
克罗恩病是诊断最多的炎症性肠病。肠道中发育的慢性炎症导致蠕动紊乱和肠道粘膜损伤，似乎与结肠肿瘤转化风险增加有关。累积证据表明，雌激素和雌激素受体不仅影响对激素敏感的组织，还影响与雌激素没有直接关系的其他组织，如肺或结肠。在这里，我们描述了从TNBS诱发的克罗恩病的鼠模型中获得结肠雌激素受体成功免疫荧光染色的规程。提供了小鼠和肠道制剂中克罗恩病诱导的详细方案，以及使用正式固定石蜡内嵌肠部分的逐步免疫组织化学程序。所述方法不仅可用于体内雌激素受体检测和雌激素信号研究，还可用于可能参与结肠炎发展的其他蛋白质。
Introduction
克罗恩病 （CD） 是一种炎症性肠病 （IBD），表现为慢性肠道炎症。CD的病因知之甚少，但似乎有几个主要因素导致CD发育，包括肠道微生物群，以及遗传和环境因素，如饮食或压力1。为了更好地理解克罗恩病的发病机制，使用了几种肠道炎症模型，2、3、4、5、6、7。2,3,4,5,6,7在本文中，我们介绍了从2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）诱导的CD的鼠模型中获得的结果。
据记载，雌激素能够调节慢性肠道炎症898，9，10，11，12。10,11,12,雌激素的生物活性由同源受体介导，其中包括核雌激素受体（ERs），即ER®（基因ESR1）和ER®（基因ESR2），以及G蛋白耦合雌激素受体，即G蛋白耦合雌激素受体，即GPER（基因GPER1），称为膜结合ER13，14。,14有几种方法可以确定雌激素受体的水平，但只有一些可用于在肠道中可视化它们。
免疫组织化学（IHC）是一种广泛用于临床和基础研究的方法，用于检测具有氟铬偶联抗体的细胞或组织中的某些抗原。IHC似乎是组织结构可视化以及特定蛋白质的识别和定位的重要方法，对于了解结肠炎的发展可能至关重要。在这里，我们提出了一个完整的和验证的方案，用于免疫荧光对肠道中雌激素受体的免疫组织化学可视化。
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Protocol
动物研究是根据欧洲议会和理事会2010年9月22日第2010/63/欧盟指令以及机构建议，在地方伦理委员会（28/[B29/2016）》同意下进行的。
1. 克罗恩病的TNBS诱导的鼠型
注：本协议使用雄性BALB/C小鼠体重25-28克。动物被安置在恒定温度（22-24 °C）和相对湿度55×5%，并保持在12小时光/暗周期，免费获得标准粒状物和自来水。
- 将鼠标放入感应室并紧紧闭盖子。用等氟拉涅对鼠标进行短暂麻醉（25% O2，O 2流速为 1.5-2 L/min）。
注：呼吸速率应保持有节奏，比正常速度慢，不应因刺激的刺激而改变。 - 在0.9%NaCl中注入0.1毫升30%乙醇的TNBS，在0.9%NaCl中注入0.1mL乙醇，在0.9%NaCl中注入0.1mL的30%乙醇，作为通过导管进入远端结肠的车辆控制。
注：导管应小心地引入约3厘米的anus。 - 每天从第二天到第八天监测小鼠的临床参数，包括体重、直肠出血、粪便一致性和死亡率。
- 第八天，通过宫颈错位对老鼠进行安乐死。
图1：克罗恩病TNBS诱导的鼠型的时间线。请点击此处查看此图形的较大版本。
2. 结肠的分离和宏观评价
注：结肠分离前一天，在1 mL磷酸盐缓冲盐水（PBS）中稀释100μL的抗生素，并在4°C下过夜。
- 使用 75% 乙醇和无菌纱布清洁腹部的皮肤。
- 使用无菌剪刀和钳子将腹壁从胸骨切到anus。
- 尽可能靠近anus和cecum的结肠被切断。
- 将结肠放在培养皿上。将冒号从Anus切入头端。在冷抗生素-PBS溶液中清洁和清洗结肠2-4次。
- 根据表 1使用卡钳执行宏镜评估。
注：组织粘附[和红斑/出血]、 粪便血*和腹泻*须接受视觉评估.*组织粘附评估使用三点刻度（0：结肠无组织粘附，1：结肠与中度组织粘附，2：结肠与广泛的组织粘附）;*基于红斑/出血、粪便血和腹泻的缺席 （0） 或存在 （1）。
| 附着力| | 埃里塞马/出血| | 粪血| | 腹泻| | 溃疡长度 | 结肠厚度 | 结肠长度 |
| 点 （0 + 2） | 点 （0 + 1） | 点 （0 + 1） | 点 （0 + 1） | 厘米/点 | 毫米/点 | 厘米/点 |
| 0 = 缺席 | 0 = 缺席 | 0 = 缺席 | 0 = 缺席 | 0.5 厘米 × 0.5 点 | n毫米 = n点 | 0 = +<10% 比控制短 |
| 1 = 中等 | 1 = 存在 | 1 = 存在 | 0.5 = 轻微/松弛凳子 | 1 = 比控制短 10 到 20% | ||
| 2 = 存在 | 1 = 存在 | 2 = 比控制短 20% 以上 |
表1：具有TNBS诱导克罗恩病模型小鼠肠道的宏观评分。
- 将溃疡的长度（以厘米为单位）转换为点刻度，即每 0.5 厘米溃疡计为 0.5 点。将冒号（以毫米为单位）的厚度转换为点刻度，即每n mm 对应于n点。
- 在三点刻度上转换冒号的长度（以厘米为单位）。从每只小鼠获得与TNBS引起的克罗恩病的结肠长度根据对照组的平均结肠长度进行评估（0：<10%比对照组短，1：比对照短10%至20%，2：超过20%短，然后控制）。
- 根据方程计算总宏观分数：总宏观分数 = 附着力（点） = 红斑/出血（点） • 粪便血 （点） • 腹泻（点） • 溃疡长度 （点） = 结肠厚度 （点） = 结肠长度 （点）。
3. 结肠样品制备
- 将结肠切成 1-2 厘米的片段，并将每个片段放在海绵上，放在贴有适当标记的组织学盒中。
注：用于组织盒的海绵可防止在脱水和液体石蜡中孵育期间结肠折叠。 - 将结肠片段放入4%甲醛中，并在4°C下孵育至少24小时。
- 仅制备和编程1小时孵育的组织处理器在50%、70%、90%、95%、100%乙醇、二甲苯/100%乙醇（1：1;v/v）和二甲苯中，以及液体石蜡中至少3小时的孵育。
注：脱水必须在乙醇和二甲苯浓度增加时进行，但乙醇的浓度可以改性。建议使用二甲苯/乙醇混合物，但不需要。 - 将结肠片段转移到组织学盒中，并放置在预编程的组织处理器中。
- 运行组织处理器。
- 孵化步骤后，将结肠碎片放入金属模具中，使结肠的两端处于直立位置，用液体石蜡填充三分之一的模具。
- 将模具置于冷却区域 （-5 °C） 中几秒钟，然后将模具移到加热区域 （70 °C）。放置在组织框的底部，用液体石蜡覆盖整个结肠碎片。
- 将金属模具与石蜡中的结肠碎片留在石蜡中几分钟。从石蜡块中取出金属模具，在4°C下孵育至少24小时。
- 从块中取出多余的石蜡，并将其插入全自动旋转微体中。
注：石蜡块可在 -20°C 下储存几分钟，然后此步骤。 - 将结肠碎片切成 5 μm 部分。
- 将结肠部分转移到预热到 40°C 的水浴。
- 使用标记的玻璃幻灯片从水浴中取出冒号部分。
注： 冒号部分浮在水面上。将贴有标签的玻璃滑板放入冒号部分下的水中，并小心地取出玻璃滑轨。 - 在室温下，将玻璃滑道保持 24 小时。对于长期储存，在室温下孵育24小时后，将玻璃滑动保持在4°C。
4. 免疫性作用化学与免疫荧光染色
注： 在过程中，不要让冒号部分在任何步骤下干燥。
- 将玻璃滑板孵育在二甲苯中 5 分钟，取出石蜡。重复此步骤三次。
- 将玻璃滑板放入二甲苯/100%乙醇（1：1;v/v）中 5 分钟。重复此步骤三次。
- 在一系列降低乙醇浓度（即70%、50%、30%和10%乙醇5分钟内）中对结肠部分进行再加水。
- 在自来水下冲洗玻璃滑道 5 分钟。
- 预热抗原回收缓冲液（10 mM柠度柠度钠;0.05%Tween 20，pH 6.0）至95-98°C，并在沸腾抗原回收溶液中加热玻璃滑片10分钟。
注： 抗原检索步骤是可选的，但建议执行。解罩溶液应根据实验中使用的抗体进行优化。 - 使用疏水笔在冒号部分周围画一个圆圈。
注： 此步骤是可选的，但建议执行。疏水笔通过将液体集中在小块内标记圆内，防止试剂的浪费。 - 在3%的水溶液中孵育过10分钟的过氧化氢。
- 洗涤液（50 mM Tris-HCl，pH 7.4;150 mM NaCl;0.05% 补间20）5分钟。
- 在阻滞溶液中孵育（5%正常山羊血清;50 mM Tris-HCl，pH 7.4;150 mM NaCl;0.05% Triton X-100），室温下1小时。
注：在阻断溶液中，正常血清必须来自与二次抗体相同的物种。在需要孵育的阶段，将玻璃滑板放在湿度室中，以防止过度蒸发。 - 去除阻滞溶液，在1%牛血清白蛋白中加入20-50μL的原抗体，对ER®、ER®或GPER稀释，50 mM Tris-HCl，pH 7.4，150 mM NaCl，0.05% Triton X-100。
注：表 2中显示了原抗体的推荐稀释。
| 抗体类型 | 抗体 | 克隆性 | 宿主物种 | 物种反应性 | 稀释 |
| 主要 | ER_ | 多克隆 | 兔 | 人类 | 1:100 |
| 鼠标 | |||||
| 海龟 | |||||
| 卡皮巴拉 | |||||
| ER+ | 多克隆 | 兔 | 人类 | ||
| 猴子 | |||||
| 大 鼠 | |||||
| 鼠标 | |||||
| 羊 | |||||
| 猪 | |||||
| GPER | 多克隆 | 兔 | 人类 | ||
| 大 鼠 | |||||
| 鼠标 | |||||
| 二 次 | DyLight 650 | 多克隆 | 山羊 | 兔 | 1:250 |
表2：抗体特性。
- 在黑暗中4°C下孵育原抗体过夜。
- 取出抗体溶液，洗涤液（50 mM Tris-HCl，pH 7.4;150 mM NaCl;0.05% Tween 20），5分钟。重复此步骤三次。
- 加入20-50 μL的DyLight 650二次抗体稀释在1%牛血清白蛋白（含有50 mM Tris-HCl，pH 7.4，150 mM NaCl，0.05%Triton X-100）。在黑暗中室温下与染料结合的二次抗体孵育1小时。
注：表 2显示了推荐稀释的二次抗体。 - 取出抗体溶液并在洗涤液中清洗（50 mM Tris-HCl，pH 7.4，150 mM NaCl，0.05% Tween 20），5 分钟。重复此步骤三次。
- 加入稀释在50 mM Tris-HCl中2%的DiOC6（3），pH 7.4，150 mM NaCl，在黑暗中室温下孵育10分钟。
- 取出溶液并在洗涤液中清洗（50 mM Tris-HCl，pH 7.4，150 mM NaCl，0.05% Tween 20），5 分钟。重复此步骤三次。
- 直接在结肠部分加入几滴含有DAPI的甘油液体，并小心地盖上盖板。在4°C下孵育结肠部分至少24小时。
注：使用盖板覆盖组织时，避免气泡。 - 在共聚焦显微镜下分析结肠部分，具有 20 倍或 63 倍的目标，并使用专用软件浸入油。
注：表3列出了本研究中使用的氟铬的特性。
| 氟霍米霍类型 | 波长（nm） | 染料 | |
| 励 磁 | 排放 | ||
| DAPI | 405 | 460 – 480 | 蓝色 |
| 迪奥克6 （3） | 485 | 538 – 595 | 绿色 |
| DyLight 650 | 654 | 660 – 680 | 红 |
表3：氟铬的特性。
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Representative Results
TNBS诱发克罗恩病小鼠结肠的宏观特征
图2显示了从对照和TNBS处理小鼠身上拍摄的结肠的代表性图像。在具有TNBS诱导的克罗恩病模型的小鼠中，结肠的长度减少，而结肠的宽度增加。
图2：从对照小鼠（对照）和TNBS治疗小鼠（TNBS）获得的代表性结肠。请点击此处查看此图形的较大版本。
计算的宏参数在表1中给出。TNBS对小鼠的管理导致总结肠宏观评分（图3A）和炎症长度（图3B）相对于对照小鼠增加。
图3：对照小鼠（对照）和TNBS治疗小鼠（TNBS）结肠（A）和结肠炎症总长度（B）的总宏观评分。每组10只老鼠。统计分析使用单向ANOVA进行，然后进行纽曼-库尔斯事后测试。数据以手段和 SEM 形式呈现;•p < 0.001 TNBS 与控制。请点击此处查看此图形的较大版本。
雌激素受体抗体验证
利用MCF-7细胞对研究中使用的雌激素受体抗体的特异性进行了验证。MCF-7细胞是根据先前的研究选择的，其中一些独立研究人员发现雌激素受体存在于mRNA和蛋白质水平。如图4所示，研究中使用的抗体允许检测两种核雌激素受体，即ER®（图4A）和ER+（图4B），以及MCF-7细胞中的膜结合雌激素受体，即GPER（图4C）。核雌激素受体在细胞质和核中局部化，GPER染色的信号只存在于MCF-7细胞的细胞质中。
图4：MCF-7细胞中ER®（A）、ER+（B）和GPER（C）免疫荧光染色的代表性图像。图像顶部的详细说明。刻度柱：10 μm.请点击这里查看此图形的较大版本。
除了正控制外，还进行了负控制，其中只使用二次抗体。图5显示了MCF-7细胞的图像，该细胞仅与二次抗体结合，与氟铬和基于甘油的液体与DAPI结合。
图5：MCF-7细胞中DyLight 650免疫荧光染色的代表性图像。图像上方提供其他说明。比例尺：20 μm.请点击这里查看此图形的较大版本。
克罗恩病TNBS诱导的鼠模型中雌激素受体定位
在从控制小鼠和患有TNBS诱发的克罗恩病的小鼠获得的结肠部分发现了ER®的强烈细胞质信号（图6A）。然而，似乎只有在从对照小鼠获得的肠道中，ER+在果子细胞细胞质中局部化。共聚焦显微镜还揭示了ER®在对照组和TNBS治疗小鼠结肠部分的细胞质定位（图6B）。同样，从对照小鼠和TNBS治疗小鼠获得的结肠部分记录了GPER的细胞质定位（图6CC）。
图6：从对照小鼠（对照组）和TNBS治疗小鼠（TNBS）获得的结肠部分ER®（A）、ER+（B）和GPER（C）免疫荧光染色的代表性图像。每个图像上方都有其他说明。刻度柱：50 μm;缩放比例尺：25 μm.请点击这里查看此图形的较大版本。
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Discussion
IBD病理生理学检查有许多动物模型，包括遗传、免疫或自发模型，以及化学诱导模型15。在几种类型动物模型中，如本协议中描述的TNBS诱导模型等化学诱导模型相对便宜且易于获得。TNBS诱导的结肠炎的鼠型具有与CD病理基础相关的几种临床症状。带诱导性结肠炎的动物的特点是粪便形成不一致，腹泻和体重减轻。然而，这并不意味着该模型可用于专门研究CD病因。TNBS诱导模型被推荐和常用，例如，用于潜在的治疗筛查。在化学诱发结肠炎的情况下，需要突出一些临界点。TNBS必须在乙醇中稀释，这扰乱了粘膜屏障，允许TNBS穿透肠壁，并与高分子量蛋白质相互作用，导致细胞介导免疫反应2,2，16，17。,17TNBS 剂量和乙醇浓度都应针对小鼠应变和重量进行优化。TNBS 剂量和乙醇浓度过高可能导致过度死亡，从而妨碍进一步分析。另一方面，TNBS剂量和乙醇浓度过低可能导致反应不良，不必要地延长实验。
根据本协议所述，不仅可以在宏观水平上检查从TNBS诱发结肠炎的小鼠获得的肠道，还可以用于生化和分子分析。研究表达和定位的一个有用方法是使用免疫荧光的免疫组织化学技术。然而，在正式固定石蜡嵌入的母体部分的IHC的制备和实施中必须包括一些关键步骤。第一个关键步骤，即结肠的准备决定结果的质量。固定时间，这取决于组织厚度必须优化。另一个关键阶段是脱水，应在乙醇浓度增加的多重孵育中轻轻进行。最后，在模具中正确定位结肠对于生成正确的横截面至关重要。组织准备不是免疫组织化学中唯一重要的问题。虽然抗原检索是一个可选的步骤，但在正式固定石蜡嵌入部分似乎是必要的。在甲醛固定过程中，蛋白质之间的亚甲桥产生，蛋白质交联掩比剂剂位点18。有两种主要方法，基于热或酶诱导（胰蛋白酶、肽或蛋白酶K）抗原检索。热诱导抗原回收，在柠分酸钠缓冲液、乙酰胺四乙酸（EDTA）缓冲液或Tris-EDTA缓冲液中进行，由于不影响细胞形态，使用范围更广。抗原吸收的类型和条件应进行实验调整。需要注意的是，抗原检索方法有时由实验中所使用的抗体确定。渗透是一种依赖于被检查的抗原的情况，尤其需要细胞内蛋白质。有几种方法使用溶剂（丙酮或甲醇）和苛刻（Triton X-100 或 NP-40）以及温和的 （Tween 20 或皂素） 洗涤剂。在本协议中，两种洗涤剂同时使用，即Triton X-100和Tween 20取决于步骤。应该强调的是，渗透性必须根据所使用的抗体进行优化。在免疫分析过程中，非特异性结合位点的阻断尤为重要。阻断溶液包括普通血清、牛血清白蛋白甚至即用阻断溶液。本议定书建议使用普通血清和牛血清白蛋白。正如协议中已经提到的，阻断溶液应含有与二次抗体相同的物种的正常血清。
最后，本协议所述的免疫荧光检测可以扩展到蛋白-蛋白质相互作用研究中染色其他蛋白质。当寻找所选蛋白质的共定位时，必须满足某些条件。应根据激励和发射光谱选择氟铬。此步骤对于消除光谱重叠至关重要，必须在实验的规划阶段执行。在此协议中使用了三种氟铬，即DyLight 650二次抗体、DAPI和DiOC6（3）。如表3所示，用于雌激素受体检测的DyLight 650被观察为红色染料，在660-680nm处激发和发射654nm。为了染色细胞核和内膜，DyLight 650 与DAPI核标记和DiOC6（3）膜标记一起使用。DAPI 被观察为蓝色染料，在 460-480 nm 时激发和发射 405 nm。反过来，DiOC6（3）被观察为绿色染料，在538-595nm时激发和发射485nm。下一种蛋白质的染色应在步骤 4.14 之后进行，从阻塞步骤开始（参见步骤 4.9. ）。对于两种蛋白质，建议使用不同物种的染色抗体。这种方法可以排除染料结合的二次抗体与先前染色的蛋白质结合。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
由于洛兹大学当局的财政支助，这项工作发表得有：科学研究副校长、国家和国际合作副校长和生物和环境保护学院院长。达米安·杰塞尼克得到波兰国家科学中心的赠款（2017/24/T/NZ5/00045和2015/17/N/NZ5/00336）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animals | |||
| BALB/C mice | University of Lodz | NA | |
| Equipment | |||
| Caliper | VWR | 62379-531 | |
| Cardboard block | NA | NA | |
| Confocal microscope - TCS SP8 | Leica Biosystems | NA | |
| Fully automated rotary microtome - RM2255 | Leica Biosystems | NA | |
| Glass slide | Thermo Scientific | J1800BMNT | |
| Heated Paraffin Embedding Module - EG1150 H | Leica Biosystems | NA | |
| Histological box | Marfour | LN.138747 | |
| Hydrophobic pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | |
| Laboratory balance | Radwag | WL-104-0048 | |
| LAS X software | Leica Biosystems | NA | |
| Metal mold | Marfour | CP.5105 | |
| Sterile gauze | NA | NA | |
| Sterile scissor | NA | NA | |
| Sterile tweezer | NA | NA | |
| Tissue processor - TP1020 | Leica Biosystems | NA | |
| Reagents | |||
| 2, 4, 6-trinitrobenzene sulfonic acid | Sigma-Aldrich | 92822 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A3294 | |
| DiOC6 (3) | Sigma-Aldrich | 318426 | |
| DyLight 650 secondary antibody | Abcam | ab96886 | |
| ERα primary antibody | Abcam | ab75635 | |
| ERβ primary antibody | Abcam | ab3576 | |
| Ethanol | Avantor Performance Materials Poland | 396480111 | |
| Formaldehyde | Avantor Performance Materials Poland | 432173111 | |
| GPER primary antibody | Abcam | ab39742 | |
| Hydrochloric acid | Avantor Performance Materials Poland | 575283421 | |
| Hydrogen peroxidase | Avantor Performance Materials Poland | 885193111 | |
| isoflurane (forane) | Baxter | 1001936040 | |
| Normal goat serum | Gibco | 16210064 | |
| Paraffin | Leica Biosystems | 39602012 | |
| Petrie dish | Nest Scientific | 705001 | |
| Phosphate buffer saline | Sigma-Aldrich | P3813 | |
| Physiological saline | Sigma-Aldrich | 7982 | |
| Primocin (antibiotic) | Invitrogen | ant-pm-1 | |
| ProLong Diamond Antifage Mountant with DAPI (glycerol-based liquid with DAPI) | Invitrogen | P36971 | |
| Sodium chloride | Chempur | WE/231-598-3 | |
| Sodium citrate | Avantor Performance Materials Poland | 795780429 | |
| Tris | Avantor Performance Materials Poland | 853470115 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Xylene | Avantor Performance Materials Poland | BA0860119 |
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