Summary
Het protocol presenteert een volledig gevalideerd TNBS-geïnduceerde murine model van de ziekte van Crohn en methoden voor visualisatie van oestrogeenreceptoren door immunohistochemie met behulp van immunofluorescentie van formaline-vaste darm secties ingebed in paraffine.
Abstract
De ziekte van Crohn is het meest gediagnosticeerde type inflammatoire darmziekte. Chronische ontsteking zich ontwikkelt in de darm leidt tot peristtiek stoornis en schade van intestinale slijmvlies en lijkt te worden geassocieerd met een verhoogd risico op darmneoplastische transformatie. Accumuleren bewijs geeft aan dat oestrogenen en oestrogeen receptoren invloed hebben op niet alleen hormoon-gevoelige weefsels, maar ook andere weefsels niet direct gerelateerd aan oestrogenen, zoals de longen of dikke darm. Hier beschrijven we het protocol voor de succesvolle immunofluorescentie kleuring van oestrogeenreceptoren in de dikke darm verkregen uit een murinemodel van de ziekte van TNBS-geïnduceerde ziekte van Crohn. Een gedetailleerd protocol voor de inductie van de ziekte van Crohn bij muizen en darmpreparaat wordt verstrekt, evenals een stapsgewijze immunohistochemische procedure met behulp van formaline-vaste paraffine-ingebedde darmsecties. De beschreven methoden zijn niet alleen nuttig voor oestrogeen receptor detectie en oestrogeen signalering onderzoek in vivo, maar kan ook worden toegepast op voor andere eiwitten die betrokken kunnen zijn bij de ontwikkeling van colitis.
Introduction
De ziekte van Crohn (CD) is een inflammatoire darmziekte (IBD) die zich manifesteert als chronische darmontsteking. De etiologie van CD is slecht begrepen, maar er zijn een paar belangrijke factoren die verantwoordelijk lijken te zijn voor de ontwikkeling van cd's, waaronder darmmicrobiota, en genetische en omgevingsfactoren, zoals dieet of stress1. Voor een beter begrip van de pathogenese van de ziekte van Crohn zijn verschillende modellen van darmontsteking gebruikt2,3,4,5,6,7. In dit artikel presenteren we resultaten verkregen uit een 2,4,6-trinitrobenzeensulfoonzuur (TNBS)-geïnduceerde murinemodel van CD.
Het is gedocumenteerd dat oestrogenen in staat zijn om chronische darmontsteking te moduleren8,,9,10,11,12. De biologische activiteit van oestrogenen wordt bemiddeld door cognate receptoren, waaronder nucleaire oestrogeenreceptoren (ERs), d.w.z. ERα (gen ESR1) en ERβ (gen ESR2), evenals G-eiwit-gekoppeldoestrogeenreceptor, d.w.z. GPER (gen GPER1),aangeduid als membraangebonden ER13,14. Er zijn verschillende methoden voor het bepalen van het niveau van oestrogeen receptoren, maar slechts een paar kunnen worden gebruikt om ze te visualiseren in de darm.
Immunohistochemie (IHC) is een veelgebruikte methode in klinische en basisstudies voor de detectie van bepaalde antigenen in cellen of weefsels met fluorchroom-geconjugeerde antilichamen. IHC lijkt een belangrijke methode in weefselstructuur visualisatie, evenals in de identificatie en lokalisatie van specifieke eiwitten, die van cruciaal belang kunnen zijn voor het begrijpen van de ontwikkeling van colitis. Hier presenteren we een compleet en gevalideerd protocol voor immunohistochemische visualisatie van oestrogeenreceptoren in de darm met behulp van immunofluorescentie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dierstudies werden uitgevoerd met toestemming van het Lokaal Ethisch Comité (28/ŁB29/2016) overeenkomstig Richtlijn 2010/63/EU van het Europees Parlement en de Raad van 22 september 2010 en institutionele aanbevelingen.
1. TNBS-geïnduceerde murine model van de ziekte van Crohn
OPMERKING: Dit protocol maakt gebruik van mannelijke BALB/C muizen met een gewicht van 25-28 g. Dieren zijn gehuisvest bij een constante temperatuur (22-24 °C) en, relatieve vochtigheid 55 ± 5%, en onderhouden in een 12 uur licht/donker cyclus met gratis toegang tot standaard chow pellets en kraanwater ad libitum.
- Plaats de muis in de inductiekamer en sluit het deksel stevig. Verdoven de muis kort met isoflurane (25% O2 met O2-stroomsnelheid bij 1,5-2 L/min).
OPMERKING: Ademhalingsfrequentie moet ritmisch en langzamer blijven dan normaal en mag niet veranderen in reactie op een schadelijke stimulus. - Breng 4 mg TNBS in 0,1 mL van 30% ethanol in 0,9% NaCl of 0,1 mL van 30% ethanol in 0,9% NaCl als voertuigcontrole in de distale dikke darm via een katheter.
OPMERKING: De katheter moet zorgvuldig worden ingevoerd ongeveer 3 cm in de anus. - Controleer de muis dagelijks van dag twee tot acht op klinische parameters, waaronder lichaamsgewicht, rectale bloedingen, ontlastingconsistentie en mortaliteit.
- Op dag acht, euthanaseren de muis door cervicale dislocatie.
Figuur 1: Tijdlijn voor TNBS-geïnduceerde murine model van de ziekte van Crohn. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
2. Scheiding en macroscopische evaluatie van de dikke darm
LET OP: Verdun een dag voor de scheiding van de dikke darm 100 μL antibioticum in 1 mL fosfaatbufferzout (PBS) en laat bij 4 °C 's nachts.
- Reinig de huid over de buik met 75% ethanol en steriel gaas.
- Snijd de buikwand van borstbeen tot anus met behulp van steriele schaar en pincet.
- Snijd de dikke darm zo dicht mogelijk bij de anus en cecum.
- Leg de dikke darm op de petrischaal. Snijd de dikke darm mee van de anus in het cecum einde. Reinig en was de dikke darm 2-4 keer in koude antibioticum-PBS oplossing.
- Macroscopische evaluatie uitvoeren met behulp van een remklauw volgens tabel 1.
OPMERKING: Weefselhechting* en erythema / bloeding#, fecale bloed# en diarree# zijn onderworpen aan visuele beoordeling. * Weefselhechting evalueren met behulp van een drie-puntschaal (0: dikke darm zonder weefselhechting, 1: dikke darm met matige weefselhechting, 2: dikke darm met uitgebreide weefselhechting); #gebaseerd op afwezigheid (0) of aanwezigheid (1) van erythema / bloeding, fecale bloed en diarree.
| Hechting* | Erythema/ bloeding# | Fecale bloed# | Diarree# | Lengte van de zweer | Dikke darmdikte | Colonlengte |
| punten (0 – 2) | punten (0 – 1) | punten (0 – 1) | punten (0 – 1) | cm/punten | mm/punten | cm/punten |
| 0 – afwezig | 0 – afwezig | 0 – afwezig | 0 – afwezig | 0,5 cm = 0,5 punt | n mm = n punten | 0 – <10% korter dan de besturing |
| 1 – matig | 1 – aanwezig | 1 – aanwezig | 0,5 – lichte/losse ontlasting | 1 – van 10 tot 20% korter dan de controle | ||
| 2 – aanwezig | 1 – aanwezig | 2 – meer dan 20% korter dan de controle |
Tabel 1: Macroscopische score van de darm van muizen met TNBS-geïnduceerd model van de ziekte van Crohn.
- Zet de lengte van de zweer in centimeters om in een puntschaal, d.w.z. elke 0,5 cm zweer wordt geteld als 0,5 punt. Zet de dikte van de dikke darm in millimeters om in een puntschaal, d.w.z. elke n mm komt overeen met n punten.
- Zet de lengte van de dikke darm in centimeters op een schaal van drie punten. De lengte van de dikke darm verkregen van elke muis met TNBS-geïnduceerde ziekte van Crohn wordt geëvalueerd in relatie tot de gemiddelde dubbele puntlengte voor de controlegroep (0: <10% korter dan de controle, 1: van 10 tot 20% korter dan de controle, 2: meer dan 20% korter dan de controle).
- Bereken de totale macroscopische score volgens de vergelijking: Totale macroscopische score = hechting (punten) + erythema/bloeding (punten) + fecal bloed (punten) + diarree (punten) + lengte van de zweer (punten) + dikke darmdikte (punten) + colonlengte (punten).
3. Colon monster voorbereiding
- Snijd de dikke darm in fragmenten van 1-2 cm en leg ze elk op spons in een passend gelabelde histologische cassette.
LET OP: Sponzen voor histologische cassettes voorkomen dat dikke darm vouwen tijdens uitdroging en incubatie in vloeibare paraffine. - Plaats het darmfragment in 4% formaldehyde en uitbroed gedurende ten minste 24 uur bij 4 °C.
- Bereid en programmeer de weefselprocessor op 1 uur incubatie in 50%, 70%, 90%, 95%, 100% ethanol, xyleen/100% ethanol (1:1; v/v), en xyleen alleen, evenals voor ten minste 3 uur incubatie in vloeibare paraffine.
OPMERKING: Uitdroging moet worden uitgevoerd in toenemende concentraties ethanol en xyleen, maar de concentratie ethanol kan worden gewijzigd. Het xyleen/ethanolmengsel wordt aanbevolen, maar niet vereist. - Breng het dikke darmfragment over naar een histologische doos en plaats in de voorgeprogrammeerde weefselverwerker.
- Voer de weefselprocessor uit.
- Na incubatiestappen, plaats de dikke darm fragment in een metalen mal, zodat de twee uiteinden van de dikke darm zijn in een rechte positie en vul een derde van de mal met vloeibare paraffine.
- Plaats de mal in het koelgebied (-5 °C) gedurende een paar seconden en verplaats de mal naar het opwarmende gebied (70 °C). Plaats in het onderste deel van de histologische doos en bedek het hele dikke darmfragment met vloeibare paraffine.
- Laat de metalen mal met de dikke darm fragment in paraffine voor een paar minuten in het koelgebied. Verwijder de metalen mal uit het paraffineblok en uitbroed gedurende ten minste 24 uur bij 4 °C.
- Verwijder overtollige paraffine uit het blok en steek het in een volledig geautomatiseerde roterende microtoom.
LET OP: Het paraffineblok kan enkele minuten voor deze stap bij -20 °C worden opgeslagen. - Snijd het dikke darmfragment in secties van 5 μm.
- Breng de puntsectie over op een voorverwarmd waterbad tot 40 °C.
- Gebruik de gelabelde glazen schuif om de puntsectie uit het waterbad te verwijderen.
LET OP: De dikke darm secties drijven op het water. Zet de gelabelde glazen schuif in het water onder de puntsectie en trek de glazen schuif voorzichtig terug. - Laat de glazen glijbaan 24 uur bij kamertemperatuur. Voor langdurige opslag houdt u de glazen schuif na 24 uur incubatie bij kamertemperatuur op 4 °C.
4. Immunohistochemie met immunofluorescentiekleuring
OPMERKING: Laat de puntsectie niet in de loop van de procedure drogen.
- Verwijder paraffine door het uitbroeden van de glazen schuif in xyleen gedurende 5 min. Herhaal deze stap drie keer.
- Plaats de glasplaat in xyleen/100% ethanol (1:1; v/v) gedurende 5 min. Herhaal deze stap drie keer.
- Rehydrateer de puntsectie in een reeks afnemende ethanolconcentraties, d.w.z. 70%, 50%, 30% en 10% ethanol gedurende 5 minuten. Herhaal elke stap drie keer.
- Spoel de glazen schuif 5 min onder stromend water.
- Verwarm antigeenterugwinningsbuffer (10 mM natriumcitraat; 0,05% Tween 20, pH 6,0) tot 95-98 °C en verwarm de glasplaat in kokende antigeenophaaloplossing gedurende 10 min.
OPMERKING: De antigeen ophaalstap is optioneel, maar aanbevolen. De ontmaskeringsoplossing moet worden geoptimaliseerd, afhankelijk van het antilichaam dat in het experiment wordt gebruikt. - Teken een cirkel rond de puntpuntsectie met behulp van een hydrofobe pen.
OPMERKING: Deze stap is optioneel, maar aanbevolen. De hydrofobe pen voorkomt verspilling van reagentia door de vloeistof in een klein volume binnen te houden, de cirkel gemarkeerd. - Incubeer de sectie in 3% wateroplossing van waterstofperoxidase gedurende 10 min.
- Was in wasoplossing (50 mM Tris-HCl, pH 7.4; 150 mM NaCl; 0,05% Tween 20) gedurende 5 min.
- Incubeer in blokkerende oplossing (5% normaal geitenserum; 50 mM Tris-HCl, pH 7,4; 150 mM NaCl; 0,05% Triton X-100) voor 1 uur bij kamertemperatuur.
OPMERKING: In de blokkeringsoplossing moet het normale serum van dezelfde soort zijn als het secundaire antilichaam. Plaats de glazen schuif in een vochtigheidskamer in fasen waar incubatie nodig is om overmatige verdamping te voorkomen. - Verwijder de blokkeringsoplossing en voeg 20-50 μL primair antilichaam toe tegen ERα, ERβ of GPER verdund in 1% runderserumalbumine met 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0,05% Triton X-100.
OPMERKING: Aanbevolen verdunningen van primaire antilichamen worden weergegeven in tabel 2.
| Antilichaamtype | Antilichaam tegen | Clonaliteit | Gastheersoorten | Reactiviteit van soorten | Verdunning |
| Primaire | ERα ERα | Polyclonal | Konijn | Menselijke | 1:100 |
| Muis | |||||
| Turtle | |||||
| Capibara Capibara | |||||
| ERβ ERβ | Polyclonal | Konijn | Menselijke | ||
| Aap | |||||
| Rat | |||||
| Muis | |||||
| Schapen | |||||
| Varken | |||||
| GPER | Polyclonal | Konijn | Menselijke | ||
| Rat | |||||
| Muis | |||||
| Secundaire | DyLight 650 | Polyclonal | Geit | Konijn | 1:250 |
Tabel 2: Kenmerken van antilichamen.
- Incubeer met primair antilichaam 's nachts bij 4 °C in duisternis.
- Verwijder de antilichaamoplossing en was in wasoplossing (50 mM Tris-HCl, pH 7.4; 150 mM NaCl; 0,05% Tween 20) gedurende 5 min. Herhaal deze stap drie keer.
- Voeg 20-50 μL DyLight 650 secundaire antilichaam verdund in 1% runderserumalbumine toe (met 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,05% Triton X-100). Incubeer met secundaire antilichaam geconjugeerd met kleurstof voor 1 uur bij kamertemperatuur in het donker.
OPMERKING: De aanbevolen verdunning van het secundaire antilichaam wordt weergegeven in tabel 2. - Verwijder de antilichaamoplossing en was in wasoplossing (50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0,05% Tween 20) gedurende 5 min. Herhaal deze stap drie keer.
- Voeg 2% DiOC6(3) verdund in 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl en incubeer gedurende 10 min bij kamertemperatuur in het donker.
- Verwijder de oplossing en was in wasoplossing (50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0,05% Tween 20) gedurende 5 min. Herhaal deze stap drie keer.
- Voeg een paar druppels glycerol-gebaseerde vloeistof met DAPI direct op de dikke darm sectie en zorgvuldig bedekken met een cover slide. Bebroed de puntsectie gedurende ten minste 24 uur bij 4 °C.
LET OP: Vermijd luchtbellen bij het bedekken van het weefsel met de dekselschuif. - Analyseer de dubbele punt sectie onder confocale microscoop met 20x of 63x doelstellingen en olie onderdompeling met behulp van speciale software.
OPMERKING: Tabel 3 bevat kenmerken van de fluorchroom die in deze studie wordt gebruikt.
| Fluorochome type | Golflengte (nm) | Kleurstof | |
| Excitatie | Emissie | ||
| DAPI DAPI | 405 | 460 – 480 | Blauwe |
| DiOC6 (3) | 485 | 538 – 595 | Groene |
| DyLight 650 | 654 | 660 – 680 | Rode |
Tabel 3: Kenmerken van fluorchroom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Macroscopische kenmerken van dikke darmen bij muizen met tnbs-geïnduceerde ziekte van Crohn
Representatieve beelden van de uit de controle genomen dikke darmen en met TNBS behandelde muizen worden weergegeven in figuur 2. Bij muizen met een TNBS-geïnduceerd model van de ziekte van Crohn wordt de lengte van de dikke darm verminderd terwijl de breedte van de dikke darm wordt verhoogd.
Figuur 2: Representatieve dikke darm verkregen uit de controlemuizen (controle) en met TNBS behandelde muizen (TNBS). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
De geëvalueerde macroscopische parameters worden gegeven in tabel 1. Toediening van TNBS aan muizen leidt tot een toename van de totale colonische macroscopische score(figuur 3A) en ontstekingslengte (figuur 3B) ten opzichte van de controlemuizen.
Figuur 3: Totale macroscopische score van de dikke darm (A) en de totale colonische ontstekingslengte (B) bij controlemuizen (controle) en met TNBS behandelde muizen (TNBS). Tien muizen per groep. Statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van One-Way ANOVA gevolgd door Newman-Keuls post-hoc test. Gegevens worden gepresenteerd als middelen ± SEM; ***p < 0,001 TNBS vs. control. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Oestrogeen receptor antilichaam validatie
Validatie van de specificiteit van de oestrogeen receptor antilichamen gebruikt in de studie werd uitgevoerd met behulp van MCF-7 cellen. MCF-7 cellen werden gekozen op basis van eerdere studies waarin verschillende onafhankelijke onderzoekers vonden dat oestrogeen receptoren aanwezig zijn op het mRNA en eiwitniveaus. Zoals blijkt uit figuur 4, maken de antilichamen die in het onderzoek worden gebruikt, de detectie van beide nucleaire oestrogeenreceptoren mogelijk, d.w.z. ERα(figuur 4A) en ERβ (figuur 4B), evenals de membraangebonden oestrogeenreceptor, d.w.z. GPER (figuur 4C) in MCF-7-cellen. Nucleaire oestrogeenreceptoren zijn gelokaliseerd in het cytoplasma en kernen, en het signaal van GPER-kleuring is alleen aanwezig in het cytoplasma van MCF-7 cellen.
Figuur 4: Representatieve beelden van immunofluorescentievlekken van ERα (A), ERβ (B) en GPER (C) in de MCF-7 cellen. Gedetailleerde beschrijving aan de bovenkant van de afbeeldingen. Schaalbalken: 10 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Naast de positieve controle werd ook een negatieve controle uitgevoerd, waarbij alleen het secundaire antilichaam werd gebruikt. Figuur 5 toont een afbeelding van MCF-7 cellen die alleen zijn gekleurd met secundaire antilichaamvervoeging met fluorchroom en glycerol-gebaseerde vloeistof met DAPI.
Figuur 5: Representatief beeld van immunofluorescentiekleuring van DyLight 650 in de MCF-7 cellen. Aanvullende beschrijving is beschikbaar boven de afbeelding. Schaalbalken: 20 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Oestrogeen receptor lokalisatie in de TNBS-geïnduceerde murine model van de ziekte van Crohn
Een sterk cytoplasma-signaal van ERα werd gevonden in de darmsectie verkregen van controlemuizen en muizen met de ziekte van Crohn(figuur 6A). Echter, het lijkt erop dat alleen in de darm verkregen uit controle muizen had ERα gelokaliseerd in de beker cel cytoplasma. Confocale microscopie onthulde ook cytoplasmalokische lokalisatie van ERβ in het darmgedeelte van zowel controle- als TNBS-behandelde muizen(figuur 6B). Op dezelfde manier werd cytoplasmische lokalisatie van GPER gedocumenteerd in de puntpuntsectie verkregen van controlemuizen en met TNBS behandelde muizen(figuur 6C).
Figuur 6: Representatieve beelden van immunofluorescentievlekken van ERα (A), ERβ (B) en GPER (C) in de puntpuntsectie verkregen uit controlemuizen (controle) en met TNBS behandelde muizen (TNBS). Aanvullende beschrijving is beschikbaar boven elke afbeelding. Schaalstaven: 50 μm; zoomschaalbalken: 25 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Er zijn tal van diermodellen voor IBD pathofysiologie onderzoek, met inbegrip van genetische, immunologische of spontane modellen, evenals chemisch geïnduceerde modellen15. Onder de verschillende soorten diermodellen van colitis, chemisch geïnduceerde modellen zoals de TNBS-geïnduceerde model beschreven in dit protocol, zijn relatief goedkoop en gemakkelijk te verkrijgen. Het tnbs-geïnduceerde murinemodel van colitis heeft verschillende klinische symptomen gerelateerd aan de pathologische basis van CD. Dieren met geïnduceerde colitis worden gekenmerkt door inconsistente ontlastingvorming, bloederige diarree en verlies van lichaamsgewicht. Dit betekent echter niet dat dit model kan worden gebruikt om cd-etiopathogenese uitsluitend te bestuderen. Het tnbs-geïnduceerde model wordt aanbevolen en wordt vaak gebruikt, bijvoorbeeld voor mogelijke therapeutische screening. In het geval van chemisch geïnduceerde colitis moeten enkele kritische punten worden benadrukt. De TNBS moet worden verdund in ethanol, die de slijmvliesbarrière verstoort en tnbs in staat stelt door de darmwand te dringen en te interageren met eiwitten met een hoog moleculair gewicht, wat leidt tot een cellulaire gemedieerde immuunrespons2,16,17. Zowel de TNBS dosis als de ethanolconcentratie moeten worden geoptimaliseerd voor de muisstam en het gewicht. Een te hoge TNBS-dosis en ethanolconcentratie kunnen overmatige sterfte veroorzaken, wat verdere analyse voorkomt. Aan de andere kant kan een te lage TNBS-dosis en ethanolconcentratie een slechte respons veroorzaken en het experiment onnodig verlengen.
De darm verkregen van muizen met TNBS-geïnduceerde colitis kan niet alleen op macroscopisch niveau worden onderzocht, zoals beschreven in dit protocol, maar kan ook worden gebruikt voor biochemische en moleculaire analyse. Een nuttige benadering voor het bestuderen van zowel expressie als lokalisatie is een immunohistochemische techniek met behulp van immunofluorescentie. Echter, een aantal kritische stappen moeten worden opgenomen in de voorbereiding en uitvoering van IHC voor formaline-vaste paraffine-embedded murine dikke darm secties. De eerste cruciale stap, dat wil zeggen, de voorbereiding van de dikke darm bepaalt de kwaliteit van de resultaten. De fixatietijd, die afhankelijk is van de weefseldikte, moet worden geoptimaliseerd. Een andere cruciale fase is uitdroging, die voorzichtig moet worden uitgevoerd door meerdere incubaties in toenemende concentraties ethanol. Ten slotte is de juiste positionering van de dikke darm in de mal essentieel om de juiste dwarsdoorsnedes te genereren. Weefselbereiding is niet het enige belangrijke probleem in immunohistochemie. Hoewel het ophalen van antigeen een optionele stap is, lijkt het in formaline-vaste paraffine-ingebedde secties noodzakelijk. Tijdens fixatie met formaldehyde worden methyleenbruggen tussen eiwitten gegenereerd en eiwitcrosslinking maskers antigeen sites18. Er zijn twee belangrijke methoden, gebaseerd op warmte- of enzymatische geïnduceerde (trypsine, pepsine of proteinase K) antigeen ophalen. Warmte-geïnduceerde antigeen terugwinning, uitgevoerd in natriumcitrate buffer, ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) buffer of Tris-EDTA buffer, wordt vaker gebruikt omdat het geen invloed heeft op de celmorfologie. Het type antigeenopname en de omstandigheden moeten experimenteel worden aangepast. Opgemerkt moet worden dat soms de antigeen retrieval methode wordt bepaald door het antilichaam gebruikt in de experimenten. Permeabilisatie is een aandoening die afhankelijk is van het onderzochte antigeen en is vooral vereist voor intracellulaire eiwitten. Er zijn verschillende benaderingen die oplosmiddelen (aceton of methanol) en harde (Triton X-100 of NP-40) gebruiken, evenals milde (Tween 20 of saponine) detergenten. In het huidige protocol werden twee detergenten gelijktijdig gebruikt, d.w.z. Triton X-100 en Tween 20, afhankelijk van de stap. Er moet worden benadrukt dat permeabilisatie moet worden geoptimaliseerd, afhankelijk van het gebruikte antilichaam. Het blokkeren van niet-specifieke bindingsplaatsen is bijzonder belangrijk tijdens immunohistochemische analyse. De blokkeringsoplossingen omvatten normale serum, runderserumalbumine of zelfs kant-en-klare blokkeringsoplossingen. Het onderhavige protocol beveelt het gebruik aan van zowel normale serum als runderserumalbumine. Zoals reeds in het protocol is vermeld, moet de blokkeringsoplossing normaal serum van dezelfde soort bevatten als het secundaire antilichaam.
Ten slotte kan IHC-detectie door immunofluorescentie zoals beschreven in dit protocol worden uitgebreid tot het bevlekken van andere eiwitten in eiwit-eiwit interactiestudies. Bij het zoeken naar colokalisatie van geselecteerde eiwitten, moet aan bepaalde voorwaarden worden voldaan. Fluorchroom moet worden geselecteerd op basis van excitatie- en emissiespectra. Deze stap is cruciaal om spectrale overlappingen te elimineren en moet worden uitgevoerd in de planningsfase van het experiment. In dit protocol worden drie fluorchroomgebruikt, d.w.z. DyLight 650 secundaire antilichamen, DAPI en DiOC6(3). Zoals getoond in tabel 3, dylight 650 gebruikt voor oestrogeen receptor detectie wordt waargenomen als een rode kleurstof met 654 nm excitatie en emissie op 660-680 nm. Om celkernen en het interne membraan te bevlekken, wordt DyLight 650 gebruikt samen met DAPI-kernmarker en DiOC6 (3) membraanmarker. DAPI wordt waargenomen als een blauwe kleurstof met 405 nm excitatie en emissie op 460-480 nm. DiOC6(3) wordt op zijn beurt waargenomen als een groene kleurstof met 485 nm excitatie en emissie bij 538-595 nm. Kleuring van het volgende eiwit moet worden uitgevoerd na stap 4.14., te beginnen met de blokkeringsstap (zie stap 4.9.). Voor twee eiwitten wordt aanbevolen om vlekkenantilichamen van verschillende soorten te gebruiken. Deze aanpak maakt het mogelijk om binding van het geconjugeerde secundaire antilichaam uit te sluiten aan het eerder gekleurde eiwit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Het werk werd gepubliceerd dankzij de financiële steun van de autoriteiten van de Universiteit van Lodz: vicerector wetenschappelijk onderzoek, vicerector nationale en internationale samenwerking en decaan van de faculteit Biologie en Milieubescherming. Damian Jacenik werd ondersteund door subsidies (2017/24/T/NZ5/00045 en 2015/17/N/NZ5/00336) van National Science Centre, Polen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animals | |||
| BALB/C mice | University of Lodz | NA | |
| Equipment | |||
| Caliper | VWR | 62379-531 | |
| Cardboard block | NA | NA | |
| Confocal microscope - TCS SP8 | Leica Biosystems | NA | |
| Fully automated rotary microtome - RM2255 | Leica Biosystems | NA | |
| Glass slide | Thermo Scientific | J1800BMNT | |
| Heated Paraffin Embedding Module - EG1150 H | Leica Biosystems | NA | |
| Histological box | Marfour | LN.138747 | |
| Hydrophobic pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | |
| Laboratory balance | Radwag | WL-104-0048 | |
| LAS X software | Leica Biosystems | NA | |
| Metal mold | Marfour | CP.5105 | |
| Sterile gauze | NA | NA | |
| Sterile scissor | NA | NA | |
| Sterile tweezer | NA | NA | |
| Tissue processor - TP1020 | Leica Biosystems | NA | |
| Reagents | |||
| 2, 4, 6-trinitrobenzene sulfonic acid | Sigma-Aldrich | 92822 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A3294 | |
| DiOC6 (3) | Sigma-Aldrich | 318426 | |
| DyLight 650 secondary antibody | Abcam | ab96886 | |
| ERα primary antibody | Abcam | ab75635 | |
| ERβ primary antibody | Abcam | ab3576 | |
| Ethanol | Avantor Performance Materials Poland | 396480111 | |
| Formaldehyde | Avantor Performance Materials Poland | 432173111 | |
| GPER primary antibody | Abcam | ab39742 | |
| Hydrochloric acid | Avantor Performance Materials Poland | 575283421 | |
| Hydrogen peroxidase | Avantor Performance Materials Poland | 885193111 | |
| isoflurane (forane) | Baxter | 1001936040 | |
| Normal goat serum | Gibco | 16210064 | |
| Paraffin | Leica Biosystems | 39602012 | |
| Petrie dish | Nest Scientific | 705001 | |
| Phosphate buffer saline | Sigma-Aldrich | P3813 | |
| Physiological saline | Sigma-Aldrich | 7982 | |
| Primocin (antibiotic) | Invitrogen | ant-pm-1 | |
| ProLong Diamond Antifage Mountant with DAPI (glycerol-based liquid with DAPI) | Invitrogen | P36971 | |
| Sodium chloride | Chempur | WE/231-598-3 | |
| Sodium citrate | Avantor Performance Materials Poland | 795780429 | |
| Tris | Avantor Performance Materials Poland | 853470115 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Xylene | Avantor Performance Materials Poland | BA0860119 |
References
- Zhang, Y. Z., Li, Y. Y. Inflammatory bowel disease: pathogenesis. World Journal of Gastroenterology. 20 (1), 91-99 (2014).
- Morris, G. P., et al. Hapten-induced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon. Gastroenterology. 96 (3), 795-803 (1989).
- Okayasu, I., et al. A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice. Gastroenterology. 98 (3), 694-702 (1990).
- Boirivant, M., Fuss, I. J., Chu, A., Strober, W. Oxazolone colitis: a murine model of T helper cell type 2 colitis treatable with antibodies to interleukin 4. Journal of Experimental Medicine. 188 (10), 1929-1939 (1998).
- Morrissey, P. J., Charrier, K., Braddy, S., Liggitt, D., Watson, J. D. CD4+ T cells that express high levels of CD45RB induce wasting disease when transferred into congenic severe combined immunodeficient mice. Disease development is prevented by cotransfer of purified CD4+ T cells. Journal of Experimental Medicine. 178 (1), 237-244 (1993).
- Kühn, R., Löhler, J., Rennick, D., Rajewsky, K., Müller, W. Interleukin-10-deficient mice develop chronic enterocolitis. Cell. 75 (2), 263-274 (1993).
- Sundberg, J. P., Elson, C. O., Bedigian, H., Birkenmeier, E. H. Spontaneous, heritable colitis in a new substrain of C3H/HeJ mice. Gastroenterology. 107 (6), 1726-1735 (1994).
- Harnish, D. C., et al. Beneficial effects of estrogen treatment in the HLA-B27 transgenic rat model of inflammatory bowel disease. American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology. 286 (1), 118-125 (2004).
- Pierdominici, M., et al. Linking estrogen receptor β expression with inflammatory bowel disease activity. Oncotarget. 6 (38), 40443-40451 (2015).
- Włodarczyk, M., et al. G protein-coupled receptor 30 (GPR30) expression pattern in inflammatory bowel disease patients suggests its key role in the inflammatory process. A preliminary study. Journal of Gastrointestinal and Liver Diseases. 26 (1), 29-35 (2017).
- Mohammad, I., et al. Estrogen receptor α contributes to T cell-mediated autoimmune inflammation by promoting T cell activation and proliferation. Science Signaling. 11 (526), eaap9415 (2018).
- Jacenik, D., et al. G protein-coupled estrogen receptor mediates anti-inflammatory action in Crohn's disease. Scientific Reports. 9 (1), 6749 (2019).
- Prossnitz, E. R., Barton, M. The G protein-coupled estrogen receptor GPER in health and disease. Nature Review Endocrinology. 7 (12), 715-726 (2011).
- Yaşar, P., Ayaz, G., User, S. D., Güpür, G., Muyan, M. Molecular mechanisms of estrogen-estrogen receptor signaling. Reproductive Medicine and Biology. 16 (1), 4-20 (2016).
- Pizarro, T. T., Arseneau, K. O., Bamias, G., Cominelli, F. Mouse models for the study of Crohn's disease. Trends in Molecular Medicine. 9 (5), 218-222 (2003).
- Neurath, M. F., Fuss, I., Kelsall, B. L., Stüber, E., Strober, W. Antibodies to interleukin 12 abrogate established experimental colitis in mice. Journal of Experimental Medicine. 182 (5), 1281-1290 (1995).
- Ikeda, M., et al. Simvastatin attenuates trinitrobenzene sulfonic acid-induced colitis, but not oxazalone-induced colitis. Digestive Diseases and Sciences. 53 (7), 1869-1875 (2007).
- Thavarajah, R., Mudimbaimannar, V. K., Elizabeth, J., Rao, U. K., Ranganathan, K. Chemical and physical basics of routine formaldehyde fixation. Journal of Oral Maxillofacial Pathology. 16 (3), 400-405 (2012).
