Summary
Das Protokoll stellt ein vollständig validiertes TNBS-induziertes murines Modell der Morbus Crohn und Methoden zur Visualisierung von Östrogenrezeptoren durch Immunhistochemie unter Verwendung der Immunfluoreszenz formalinfixierter Dickdarmabschnitte dar, die in Paraffin eingebettet sind.
Abstract
Morbus Crohn ist die am häufigsten diagnostizierte Art von entzündlicher Darmerkrankung. Chronische Entzündungen, die sich im Darm entwickeln, führen zu Peristalsienstörungen und Schäden an Darmschleimhaut und scheinen mit einem erhöhten Risiko einer neoplastischen Umwandlung des Dickdarms verbunden zu sein. Akkumulierende Beweise deuten darauf hin, dass Östrogene und Östrogen-Rezeptoren nicht nur hormonempfindliche Gewebe beeinflussen, sondern auch andere Gewebe, die nicht direkt mit Östrogenen verwandt sind, wie die Lunge oder dickdarm. Hier beschreiben wir das Protokoll für die erfolgreiche Immunfluoreszenzfärbung von Östrogenrezeptoren im Dickdarm, das aus einem murinen Modell der TNBS-induzierten Morbus Crohn gewonnen wurde. Ein detailliertes Protokoll zur Induktion der Morbus Crohn bei Mäusen und Darmpräparation ist sowie ein schrittweises immunhistochemisches Verfahren mit formalinfixierten Paraffin-eingebetteten Darmabschnitten vorgesehen. Die beschriebenen Methoden sind nicht nur nützlich für Östrogen-Rezeptor-Detektion und Östrogen-Signalisierung Untersuchung in vivo, sondern kann auch auf andere Proteine angewendet werden, die an der Entwicklung von Colitis beteiligt sein können.
Introduction
Morbus Crohn (CD) ist eine entzündliche Darmerkrankung (IBD), die sich als chronische Darmentzündung manifestiert. Die Ätiologie von CD ist schlecht verstanden, aber es gibt ein paar wichtige Faktoren, die für die CD-Entwicklung verantwortlich zu sein scheinen, einschließlich Darmmikrobiota, und genetische und Umweltfaktoren, wie Ernährung oder Stress1. Für ein besseres Verständnis der Pathogenese der Morbus Crohn wurden mehrere Modelle der Darmentzündung verwendet2,3,4,5,6,7. In diesem Artikel stellen wir Ergebnisse aus einem 2,4,6-Trinitrobenzol-Sulfonsäure (TNBS)-induzierten murinen Modell von CD.
Es wurde dokumentiert, dass Östrogene in der Lage sind, chronischeDarmentzündungen 8,9,10,11,12zu modulieren. Die biologische Aktivität von Östrogenen wird durch Cogat-Rezeptoren vermittelt, darunter kernnukleare Östrogenrezeptoren (ERs), d.h. ER (Gen ESR1) und ER (Gen ESR2), sowie G-Protein-gekoppelte Östrogenrezeptor, d.h. GPER (Gen GPER1), genannt als membrangebundener ER13,14. Es gibt mehrere Methoden zur Bestimmung des Niveaus der Östrogen-Rezeptoren, aber nur wenige können verwendet werden, um sie im Darm zu visualisieren.
Immunhistochemie (IHC) ist eine weit verbreitete Methode in klinischen und grundlegenden Studien zum Nachweis bestimmter Antigene in Zellen oder Geweben mit fluorchromkonjugierten Antikörpern. IHC scheint eine wichtige Methode in der Gewebestrukturvisualisierung zu sein, sowie bei der Identifizierung und Lokalisierung spezifischer Proteine, die für das Verständnis der Entwicklung von Kolitis entscheidend sein können. Hier stellen wir ein vollständiges und validiertes Protokoll zur immunhistochemischen Visualisierung von Östrogenrezeptoren im Darm unter Verwendung von Immunfluoreszenz vor.
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Protocol
Tierexperimentelle Studien wurden mit Zustimmung des Lokalen Ethikausschusses (28/B29/2016) gemäß der Richtlinie 2010/63/EU des Europäischen Parlaments und des Rates vom 22. September 2010 und institutionellen Empfehlungen durchgeführt.
1. TNBS-induziertes murines Modell der Morbus Crohn
HINWEIS: Dieses Protokoll verwendet männliche BALB/C-Mäuse mit einem Gewicht von 25-28 g. Tiere werden bei einer konstanten Temperatur (22-24 °C) und, relative Luftfeuchtigkeit 55 x 5 %, untergebracht und in einem 12 h Licht/Dunkel-Zyklus mit freiem Zugang zu Standard-Chow-Pellets und Leitungswasser ad libitumgehalten.
- Legen Sie die Maus in die Induktionskammer und schließen Sie den Deckel fest. Die Maus kurz mit Isofluran ansien (25%O2 mitO2-Durchfluss rate bei 1,5-2 L/min).
HINWEIS: Die Atemfrequenz sollte rhythmisch und langsamer als normal bleiben und sich nicht als Reaktion auf einen schädlichen Reiz ändern. - Instill4 mg TNBS in 0,1 ml 30% Ethanol in 0,9% NaCl oder 0,1 ml 30% Ethanol in 0,9% NaCl als Fahrzeugkontrolle in den distalen Dickdarm durch einen Katheter.
HINWEIS: Der Katheter sollte sorgfältig ca. 3 cm in den Anus eingeführt werden. - Überwachen Sie die Maus täglich vom zweiten bis achten Tag auf klinische Parameter wie Körpergewicht, rektale Blutungen, Stuhlkonsistenz und Mortalität.
- Am achten Tag die Maus durch Zervixverrenz einschläfern.
Abbildung 1: Zeitleiste für TNBS-induziertes murines Modell der Morbus Crohn. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
2. Trennung und makroskopische Beurteilung des Dickdarms
HINWEIS: Einen Tag vor der Dickdarmtrennung 100 l Antibiotikum in 1 ml Phosphatpuffer-Saline (PBS) verdünnen und bei 4 °C über Nacht verlassen.
- Reinigen Sie die Haut über dem Bauch mit 75% Ethanol und steriler Gaze.
- Schneiden Sie die Bauchwand vom Brustbein zum Anus mit steriler Schere und Pinzette.
- Schneiden Sie den Doppelpunkt so nah wie möglich an den Anus und Cecum ab.
- Legen Sie den Doppelpunkt auf die Petrischale. Schneiden Sie den Doppelpunkt vom Anus in das Cecum-Ende. Reinigen und waschen Sie den Dickdarm 2-4 Mal in kalter Antibiotika-PBS-Lösung.
- Makroskopische Auswertung mit einem Bremssattel gemäß Tabelle 1.
HINWEIS: Gewebehaftung* und Erythem/Hämorrblutung,Fäkalienblut# und Durchfallunterliegen einer visuellen Beurteilung. * Gewebehaftung mit einer Drei-Punkte-Skala (0: Dickdarm ohne Gewebehaftung, 1: Dickdarm mit mäßiger Gewebehaftung, 2: Dickdarm mit ausgedehnter Gewebehaftung); •basierend auf Abwesenheit (0) oder Vorhandensein (1) von Erythem/Hämorrblutung, Fäkalienblut und Durchfall.
| Haftung* | Erythem/Blutungen# | Fäkalblut# | Durchfall# | Länge des Geschwürs | Kolondicke | Colon-Länge |
| Punkte (0 – 2) | Punkte (0 – 1) | Punkte (0 – 1) | Punkte (0 – 1) | cm/Punkte | mm/Punkte | cm/Punkte |
| 0 – abwesend | 0 – abwesend | 0 – abwesend | 0 – abwesend | 0,5 cm = 0,5 Punkt | n mm = n Punkte | 0 – <10% kürzer als die Steuerung |
| 1 – mäßig | 1 – vorhanden | 1 – vorhanden | 0.5 – leichter/lockerer Hocker | 1 – von 10 bis 20% kürzer als die Steuerung | ||
| 2 – vorhanden | 1 – vorhanden | 2 – über 20% kürzer als die Steuerung |
Tabelle 1: Makroskopische Bewertung des Darms von Mäusen mit TNBS-induziertem Modell der Morbus Crohn.
- Konvertieren Sie die Länge des Geschwürs in Zentimeterin in eine Punktskala, d.h. jeder 0,5 cm Geschwür wird als 0,5 Punkt gezählt. Konvertieren Sie die Dicke des Doppelpunkts in Millimetern in eine Punktskala, d.h. jeder n mm entspricht n Punkten.
- Konvertieren Sie die Länge des Doppelpunkts in Zentimetern auf einer Drei-Punkte-Skala. Die Von jeder Maus mit TNBS-induzierter Morbus erhaltene Dickdarmlänge wird im Verhältnis zur durchschnittlichen Dickdarmlänge für die Kontrollgruppe (0: <10% kürzer als die Kontrolle, 1: 10 bis 20% kürzer als die Kontrolle, 2: über 20% kürzer als die Kontrolle).
- Berechnen Sie die makroskopische Gesamtpunktzahl nach der Gleichung: Gesamtmakroskopische Punktzahl = Haftung (Punkte) + Erythem/Hämorragodes (Punkte) + Fäkalienblut (Punkte) + Durchfall (Punkte) + Länge des Geschwürs (Punkte) + Doppelpunktdicke (Punkte) + Doppelpunktlänge (Punkte).
3. Colon-Probenvorbereitung
- Schneiden Sie den Doppelpunkt in 1-2 cm Fragmente und legen Sie jedes auf Schwamm in einer entsprechend beschrifteten histologischen Kassette.
HINWEIS: Schwämme für histologische Kassetten verhindern die Dickdarmfaltung während der Dehydrierung und Inkubation in flüssigem Paraffin. - Das Dickdarmfragment in 4% Formaldehyd geben und mindestens 24 h bei 4 °C brüten.
- Bereiten und programmieren Sie den Gewebeprozessor für 1 h Inkubation in 50%, 70%, 90%, 95%, 100% Ethanol, Xylol/100% Ethanol (1:1; v/v) und nur Xylol sowie für mindestens 3 h Inkubation in flüssigem Paraffin.
HINWEIS: Die Dehydrierung muss bei steigenden Konzentrationen von Ethanol und Xylol erfolgen, aber die Ethanolkonzentration kann modifiziert werden. Das Xylol/Ethanol-Gemisch wird empfohlen, ist aber nicht erforderlich. - Übertragen Sie das Doppelpunktfragment in eine histologische Box und legen Sie es in den vorprogrammierten Gewebeprozessor.
- Führen Sie den Gewebeprozessor aus.
- Nach inkubationsschritten das Doppelpunktfragment in eine Metallform geben, so dass sich die beiden Enden des Dickdarms in einer aufrechten Position befinden und ein Drittel der Form mit flüssigem Paraffin füllen.
- Legen Sie die Form für einige Sekunden in den Kühlbereich (-5 °C) und bewegen Sie die Form dann in den Wärmebereich (70 °C). Legen Sie im unteren Teil der histologischen Box und decken Sie das gesamte Doppelpunktfragment mit flüssigem Paraffin ab.
- Lassen Sie die Metallform mit dem Doppelpunktfragment in Paraffin für ein paar Minuten im Kühlbereich. Die Metallform aus dem Paraffinblock nehmen und mindestens 24 h bei 4 °C brüten.
- Entfernen Sie überschüssiges Paraffin aus dem Block und legen Sie es in ein vollautomatisches Drehmikrotom ein.
HINWEIS: Der Paraffinblock kann vor diesem Schritt einige Minuten bei -20 °C gelagert werden. - Schneiden Sie das Doppelpunktfragment in 5 m Abschnitte.
- Den Dickdarmabschnitt in ein auf 40 °C vorgeheiztes Wasserbad übertragen.
- Verwenden Sie die beschriftete Glasrutsche, um den Doppelpunktabschnitt aus dem Wasserbad zu entfernen.
HINWEIS: Die Doppelpunktabschnitte schweben auf dem Wasser. Legen Sie die beschriftete Glasrutsche unter dem Doppelpunktabschnitt ins Wasser und ziehen Sie die Glasrutsche vorsichtig zurück. - Lassen Sie die Glasrutsche für 24 h bei Raumtemperatur. Für eine langfristige Lagerung halten Sie die Glasrutsche bei 4 °C nach 24 h Inkubation bei Raumtemperatur.
4. Immunhistochemie mit Immunfluoreszenzfärbung
HINWEIS: Lassen Sie den Doppelpunktabschnitt während des Eingriffs nicht in schrittzueinem Schritt trocknen.
- Entfernen Sie Paraffin, indem Sie die Glasrutsche in Xylol für 5 min inkubieren. Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal.
- Legen Sie die Glasrutsche 5 min in Xylol/100% Ethanol (1:1; v/v). Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal.
- Rehydrieren Sie den Dickdarmabschnitt in einer Reihe von abnehmenden Ethanolkonzentrationen, d.h. 70%, 50%, 30% und 10% Ethanol für 5 min. Wiederholen Sie jeden Schritt dreimal.
- Spülen Sie die Glasrutsche unter fließendem Wasser für 5 min.
- Antigen-Rückgewinnungspuffer (10 mM Natriumcitrat; 0,05% Tween 20, pH 6,0) auf 95-98 °C vorheizen und den Glasschlitten in siedender Antigen-Retrievallösung für 10 min erhitzen.
HINWEIS: Der Antigen-Abrufschritt ist optional, wird jedoch empfohlen. Die Entlarvungslösung sollte in Abhängigkeit von dem im Experiment verwendeten Antikörper optimiert werden. - Zeichnen Sie einen Kreis um den Doppelpunktabschnitt mit einem hydrophoben Stift.
HINWEIS: Dieser Schritt ist optional, wird jedoch empfohlen. Der hydrophobe Stift verhindert die Verschwendung von Reagenzien, indem die Flüssigkeit in einem kleinen Volumen im Inneren gepoolt gehalten wird, das den Kreis markiert. - Inkubieren Sie den Abschnitt in 3% Wasserlösung von Wasserstoffperoxidase für 10 min.
- Waschlösung waschen (50 mM Tris-HCl, pH 7,4; 150 mM NaCl; 0,05% Tween 20) für 5 min.
- Inkubationslösung inkubieren (5% normales Ziegenserum; 50 mM Tris-HCl, pH 7,4; 150 mM NaCl; 0,05% Triton X-100) für 1 h bei Raumtemperatur.
HINWEIS: In der Blockierlösung muss das normale Serum von derselben Spezies wie der sekundäre Antikörper stammen. In Phasen, in denen eine Inkubation erforderlich ist, legen Sie die Glasrutsche in eine Feuchtigkeitskammer, um eine übermäßige Verdunstung zu verhindern. - Entfernen Sie die Blockierlösung und fügen Sie 20-50 L Primärantikörper gegen ER, ER oder GPER in 1% Rinderserumalbumin mit 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,05% Triton X-100, hinzu.
HINWEIS: Empfohlene Verdünnungen primärer Antikörper sind in Tabelle 2dargestellt.
| Antikörpertyp | Antikörper gegen | Clonalität | Wirtsarten | Artenreaktivität | Verdünnung |
| Primäre | ER | Polyclonal | Kaninchen | Menschlichen | 1:100 |
| Maus | |||||
| Schildkröte | |||||
| Capybara | |||||
| ER | Polyclonal | Kaninchen | Menschlichen | ||
| Affe | |||||
| Ratte | |||||
| Maus | |||||
| Schafe | |||||
| Schwein | |||||
| GPER | Polyclonal | Kaninchen | Menschlichen | ||
| Ratte | |||||
| Maus | |||||
| Sekundären | DyLight 650 | Polyclonal | Ziege | Kaninchen | 1:250 |
Tabelle 2: Merkmale von Antikörpern.
- Inkubieren Sie mit primärem Antikörper über Nacht bei 4 °C in der Dunkelheit.
- Die Antikörperlösung entfernen und in der Waschlösung (50 mM Tris-HCl, pH 7,4; 150 mM NaCl; 0,05% Tween 20) 5 min waschen. Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal.
- Fügen Sie 20-50 l DyLight 650 sekundären Antikörper in 1% Rinderserumalbumin verdünnt (enthält 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.05% Triton X-100). Inkubieren Sie mit sekundärem Antikörper, der bei Dunkelheit 1 h bei Raumtemperatur mit Farbstoff konjugiert wird.
ANMERKUNG: Die empfohlene Verdünnung des sekundären Antikörpers ist in Tabelle 2dargestellt. - Die Antikörperlösung entfernen und in der Waschlösung (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,05% Tween 20) 5 min waschen. Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal.
- Fügen Sie 2% DiOC6(3) in 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl verdünnt und 10 min bei Raumtemperatur bei Dunkelheit inkubieren.
- Entfernen Sie die Lösung und waschen Sie in Waschlösung (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,05% Tween 20) für 5 min. Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal.
- Fügen Sie ein paar Tropfen Glyzerin-basierte Flüssigkeit mit DAPI direkt auf dem Doppelpunkt-Abschnitt und decken Sie sorgfältig mit einem Abdeckungsschlitten. Inkubieren Sie den Doppelpunktabschnitt für mindestens 24 h bei 4 °C.
HINWEIS: Vermeiden Sie Luftblasen, wenn Sie das Gewebe mit dem Deckelschlitten bedecken. - Analysieren Sie den Dickdarmbereich unter konfokaler Mikroskop mit 20x oder 63x Objektiven und Öleintauchen mit spezieller Software.
ANMERKUNG: Tabelle 3 listet die Merkmale der in dieser Studie verwendeten Fluorchrome auf.
| Fluorochome-Typ | Wellenlänge (nm) | Farbstoff | |
| Anregung | Emission | ||
| Dapi | 405 | 460 – 480 | Blau |
| DiOC6 (3) | 485 | 538 – 595 | Grün |
| DyLight 650 | 654 | 660 – 680 | Rot |
Tabelle 3: Merkmale von Fluorchromen.
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Representative Results
Makroskopische Merkmale von Dickdarmerkrankungen bei Mäusen mit TNBS-induzierter Morbus Crohn
Repräsentative Bilder von Dickdarmen, die von der Kontrolle genommen wurden, und TNBS-behandelten Mäusen sind in Abbildung 2dargestellt. Bei Mäusen mit einem TNBS-induzierten Modell der Morbus Crohn wird die Länge des Dickdarms reduziert, während die Breite des Dickdarms erhöht wird.
Abbildung 2: Repräsentativer Dickdarm, der von den Kontrollmäusen (Kontrolle) und TNBS-behandelten Mäusen (TNBS) gewonnen wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Die ausgewerteten makroskopischen Parameter sind in Tabelle 1angegeben. Die Verabreichung von TNBS an Mäuse führt zu einer Erhöhung der gesamten makroskopischen Gesamtpunktzahl (Abbildung 3A) und einer Entzündungslänge (Abbildung 3B) im Verhältnis zu den Kontrollmäusen.
Abbildung 3: Gesamtmakroskopische Punktzahl des Dickdarms (A) und der gesamten Darmentzündungslänge (B) bei Kontrollmäusen (Kontrolle) und TNBS-behandelten Mäusen (TNBS). Zehn Mäuse pro Gruppe. Die statistische Analyse wurde mit One-Way ANOVA durchgeführt, gefolgt von Newman-Keuls Post-hoc-Test. Die Daten werden als Mittel dargestellt: SEM; pp < 0.001 TNBS vs. Steuerung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Östrogen-Rezeptor-Antikörper-Validierung
Die Validierung der Spezifität der in der Studie verwendeten Östrogenrezeptor-Antikörper wurde mit MCF-7-Zellen durchgeführt. MCF-7-Zellen wurden auf der Grundlage früherer Studien ausgewählt, wobei mehrere unabhängige Forscher herausfanden, dass Östrogenrezeptoren auf mRNA- und Proteinspiegel vorhanden sind. Wie in Abbildung 4dargestellt, ermöglichen die in der Studie verwendeten Antikörper den Nachweis beider kernatischer Östrogenrezeptoren, d. h. ER ( Abbildung4A) und ER (Abbildung 4B), sowie des membrangebundenen Östrogenrezeptors, d. h. GPER (Abbildung 4C) in MCF-7-Zellen. Kernöstrogenrezeptoren sind im Zytoplasma und Kerne lokalisiert, und das Signal von GPER Färbung ist nur im Zytoplasma von MCF-7-Zellen vorhanden.
Abbildung 4: Repräsentative Bilder der Immunfluoreszenzfärbung von ER (A), ER (B) und GPER (C) in den MCF-7-Zellen. Detaillierte Beschreibung oben auf den Bildern. Maßstabsbalken: 10 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Neben der Positivkontrolle wurde auch eine Negativkontrolle durchgeführt, bei der nur der sekundäre Antikörper verwendet wurde. Abbildung 5 zeigt ein Bild von MCF-7-Zellen, die nur mit sekundären Antikörpern mit Fluorchrom- und Glycerin-basierten Flüssigkeiten mit DAPI verfärbt sind.
Abbildung 5: Repräsentatives Bild der Immunfluoreszenzfärbung von DyLight 650 in den MCF-7-Zellen. Eine zusätzliche Beschreibung ist über dem Bild verfügbar. Maßstabsbalken: 20 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Östrogen-Rezeptor-Lokalisierung im TNBS-induzierten murinen Modell der Morbus Crohn
Im Dickdarmabschnitt, der von Kontrollmäusen und Mäusen mit TNBS-induzierter Morbus Crohn gewonnen wurde, wurde ein starkes zytoplasmatisches Signal von ER gefunden (Abbildung 6A). Es scheint jedoch, dass nur im Darm, der aus Kontrollmäusen gewonnen wurde, ER-Lokalisierung im Kelchenzell-Zytoplasma hatte. Die konfokale Mikroskopie zeigte auch die zytoplasmatische Lokalisation von ER im Dickdarmabschnitt sowohl von Kontroll- als auch von TNBS-behandelten Mäusen (Abbildung 6B). In ähnlicher Weise wurde die zytoplasmatische Lokalisation von GPER im Dickdarmabschnitt dokumentiert, der von Kontrollmäusen und TNBS-behandelten Mäusen gewonnen wurde (Abbildung 6C).
Abbildung 6: Repräsentative Bilder der Immunfluoreszenzfärbung von ER (A), ER (B) und GPER (C) im Dickdarmabschnitt, die von Kontrollmäusen (Kontrolle) und TNBS-behandelten Mäusen (TNBS) gewonnen wurden. Über jedem Bild finden Sie eine zusätzliche Beschreibung. Skalenbalken: 50 m; Zoom-Skala-Balken: 25 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Es gibt zahlreiche Tiermodelle für die IBD-Pathophysiologie-Untersuchung, einschließlich genetischer, immunologischer oder spontaner Modelle, sowie chemisch induzierte Modelle15. Unter den verschiedenen Arten von Tiermodellen von Colitis sind chemisch induzierte Modelle wie das in diesem Protokoll beschriebene TNBS-induzierte Modell relativ kostengünstig und leicht zu erhalten. Das TNBS-induzierte murine Modell der Kolitis hat mehrere klinische Symptome im Zusammenhang mit der pathologischen Basis von CD. Tiere mit induzierter Kolitis zeichnen sich durch inkonsistente Stuhlbildung, blutigen Durchfall und Gewichtsverlust des Körpers aus. Dies bedeutet jedoch nicht, dass dieses Modell ausschließlich zur Untersuchung der CD-Etiopathogenese verwendet werden kann. Das TNBS-induzierte Modell wird empfohlen und häufig beispielsweise für potenzielle therapeutische Screenings verwendet. Bei chemisch induzierter Kolitis müssen einige kritische Punkte hervorgehoben werden. Das TNBS muss in Ethanol verdünnt werden, was die Schleimhautbarriere stört und tNBS durch die Darmwand eindringen und mit hochmolekularen Proteinen interagieren kann, was zu einer zellulär vermittelten Immunantwort2,16,17führt. Sowohl die TNBS-Dosis als auch die Ethanolkonzentration sollten für die Mausdehnung und das Gewicht optimiert werden. Eine zu hohe TNBS-Dosis und Ethanolkonzentration können zu einer übermäßigen Sterblichkeit führen, was eine weitere Analyse verhindert. Andererseits kann eine zu niedrige TNBS-Dosis und Ethanolkonzentration zu einer schlechten Reaktion führen und das Experiment unnötig verlängern.
Der von Mäusen mit TNBS-induzierter Kolitis gewonnene Darm kann nicht nur auf makroskopischer Ebene, wie in diesem Protokoll beschrieben, untersucht werden, sondern kann auch für biochemische und molekulare Analysen verwendet werden. Ein nützlicher Ansatz für die Untersuchung sowohl der Expression als auch der Lokalisation ist eine immunhistochemische Technik unter Verwendung von Immunfluoreszenz. Allerdings müssen einige kritische Schritte in die Vorbereitung und Implementierung von IHC für formalinfixierte Paraffin-eingebettete murinische Dickdarmabschnitte einbezogen werden. Der erste entscheidende Schritt, d.h. die Vorbereitung des Dickdarms, bestimmt die Qualität der Ergebnisse. Die Fixierungszeit, die von der Gewebedicke abhängt, muss optimiert werden. Ein weiteres entscheidendes Stadium ist die Dehydrierung, die durch mehrfache Inkubationen in steigenden Ethanolkonzentrationen schonend durchgeführt werden sollte. Schließlich ist die korrekte Positionierung des Doppelpunkts in der Form unerlässlich, um die richtigen Querschnitte zu erzeugen. Die Gewebepräparation ist nicht das einzige wichtige Thema in der Immunhistochemie. Obwohl Antigen-Retrieval ein optionaler Schritt ist, scheint es in formal fixierten Paraffin-eingebetteten Abschnitten notwendig zu sein. Bei der Fixierung mit Formaldehyd werden Methylenbrücken zwischen Proteinen erzeugt und Proteinvernetzungsmasken Antigenstellen18. Es gibt zwei Hauptmethoden, basierend auf hitze- oder enzymatisch-induzierten (Trypsin, Pepsin oder Proteinase K) Antigen-Retrieval. Hitzeinduzierte Antigenabruf, durchgeführt in Natriumcitratpuffer, Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) Puffer oder Tris-EDTA Puffer, ist weiter verbreitet, weil es keine Auswirkungen auf Die zellmorphologie. Die Art der Antigenaufnahme und die Bedingungen sollten experimentell angepasst werden. Es sollte beachtet werden, dass manchmal die Antigen-Retrieval-Methode durch den antikörper in den Experimenten verwendet bestimmt wird. Permeabilisierung ist ein Zustand abhängig von dem untersuchten Antigen, und ist vor allem für intrazelluläre Proteine erforderlich. Es gibt mehrere Ansätze, die Lösungsmittel (Aceton oder Methanol) und harte (Triton X-100 oder NP-40) sowie milde (Tween 20 oder Saponin) Waschmittel verwenden. Im vorliegenden Protokoll wurden je nach Schritt zwei Waschmittel gleichzeitig verwendet, d.h. Triton X-100 und Tween 20. Es sollte betont werden, dass die Permeabilisierung in Abhängigkeit vom verwendeten Antikörper optimiert werden muss. Die Blockierung unspezifischer Bindungsstellen ist bei der immunhistochemischen Analyse besonders wichtig. Die Blockierlösungen umfassen normales Serum, Rinderserumalbumin oder sogar gebrauchsfertige Blockierungslösungen. Das vorliegende Protokoll empfiehlt die Verwendung von normalem Serum und Rinderserumalbumin. Wie bereits im Protokoll erwähnt, sollte die Sperrlösung normales Serum von derselben Spezies wie der sekundäre Antikörper enthalten.
Schließlich kann der IHC-Nachweis durch Immunfluoreszenz, wie in diesem Protokoll beschrieben, auf die Färbung anderer Proteine in Protein-Protein-Interaktionsstudien ausgedehnt werden. Bei der Suche nach einer Kolokalisierung ausgewählter Proteine müssen bestimmte Bedingungen erfüllt sein. Fluorchrome sollten auf der Grundlage von Anregungs- und Emissionsspektren ausgewählt werden. Dieser Schritt ist entscheidend, um spektrale Überschneidungen zu beseitigen und muss in der Planungsphase des Experiments durchgeführt werden. In diesem Protokoll werden drei Fluorchrome verwendet, d.h. DyLight 650 Sekundärantikörper, DAPI und DiOC6(3). Wie in Tabelle 3dargestellt, wird DyLight 650 zur Östrogenrezeptordetektion als roter Farbstoff mit 654 nm Anregung und Emission bei 660-680 nm beobachtet. Um Zellkerne und die innere Membran zu färben, wird DyLight 650 zusammen mit dem DAPI-Kernmarker und dem DiOC6 (3)-Membranmarker verwendet. DAPI wird als blauer Farbstoff mit 405 nm Anregung und Emission bei 460-480 nm beobachtet. DiOC6(3) wird wiederum als grüner Farbstoff mit 485 nm Anregung und Emission bei 538-595 nm beobachtet. Die Färbung des nächsten Proteins sollte nach Schritt 4.14. erfolgen, beginnend mit dem Sperrschritt (siehe Schritt 4.9.). Für zwei Proteine wird empfohlen, Färbeantikörper verschiedener Arten zu verwenden. Dieser Ansatz ermöglicht es, die Bindung des gefärbten Sekundärantikörpers an das zuvor gefärbte Protein auszuschließen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Die Arbeit wurde dank der finanziellen Unterstützung der Behörden der Universität Lodz veröffentlicht: Vizerektor für wissenschaftliche Forschung, Vizerektor für nationale und internationale Zusammenarbeit und Dekan der Fakultät für Biologie und Umweltschutz. Damian Jacenik wurde durch Stipendien (2017/24/T/NZ5/00045 und 2015/17/N/NZ5/00336) vom National Science Centre, Polen, unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animals | |||
| BALB/C mice | University of Lodz | NA | |
| Equipment | |||
| Caliper | VWR | 62379-531 | |
| Cardboard block | NA | NA | |
| Confocal microscope - TCS SP8 | Leica Biosystems | NA | |
| Fully automated rotary microtome - RM2255 | Leica Biosystems | NA | |
| Glass slide | Thermo Scientific | J1800BMNT | |
| Heated Paraffin Embedding Module - EG1150 H | Leica Biosystems | NA | |
| Histological box | Marfour | LN.138747 | |
| Hydrophobic pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | |
| Laboratory balance | Radwag | WL-104-0048 | |
| LAS X software | Leica Biosystems | NA | |
| Metal mold | Marfour | CP.5105 | |
| Sterile gauze | NA | NA | |
| Sterile scissor | NA | NA | |
| Sterile tweezer | NA | NA | |
| Tissue processor - TP1020 | Leica Biosystems | NA | |
| Reagents | |||
| 2, 4, 6-trinitrobenzene sulfonic acid | Sigma-Aldrich | 92822 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A3294 | |
| DiOC6 (3) | Sigma-Aldrich | 318426 | |
| DyLight 650 secondary antibody | Abcam | ab96886 | |
| ERα primary antibody | Abcam | ab75635 | |
| ERβ primary antibody | Abcam | ab3576 | |
| Ethanol | Avantor Performance Materials Poland | 396480111 | |
| Formaldehyde | Avantor Performance Materials Poland | 432173111 | |
| GPER primary antibody | Abcam | ab39742 | |
| Hydrochloric acid | Avantor Performance Materials Poland | 575283421 | |
| Hydrogen peroxidase | Avantor Performance Materials Poland | 885193111 | |
| isoflurane (forane) | Baxter | 1001936040 | |
| Normal goat serum | Gibco | 16210064 | |
| Paraffin | Leica Biosystems | 39602012 | |
| Petrie dish | Nest Scientific | 705001 | |
| Phosphate buffer saline | Sigma-Aldrich | P3813 | |
| Physiological saline | Sigma-Aldrich | 7982 | |
| Primocin (antibiotic) | Invitrogen | ant-pm-1 | |
| ProLong Diamond Antifage Mountant with DAPI (glycerol-based liquid with DAPI) | Invitrogen | P36971 | |
| Sodium chloride | Chempur | WE/231-598-3 | |
| Sodium citrate | Avantor Performance Materials Poland | 795780429 | |
| Tris | Avantor Performance Materials Poland | 853470115 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Xylene | Avantor Performance Materials Poland | BA0860119 |
References
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