Summary
Vi beskriver tillämpningen av en extracellulär Flux Analyzer för att övervaka realtids förändringar i glykolys och oxidativ fosforylering under mus spermie kapacitet.
Abstract
Spermier från däggdjur förvärvar fertiliseringsförmåga i de kvinnliga reproduktionsorganen i en process som kallas kapacitet. Kapacitet-associerade processer kräver energi. Det återstår en pågående debatt om de källor som genererar ATP som bränslen spermier progressiv motilitet, kapacitet, hyperaktivering, och acrosome reaktion. Här beskriver vi tillämpningen av en extracellulär Flux Analyzer som ett verktyg för att analysera förändringar i energimetabolism under mus spermie kapacitet. Med hjälp av H+-och O2-känsliga fluoroforer, denna metod gör det möjligt att övervaka glykolys och oxidativ fosforylering i realtid i icke-kondenserad kontra politiker spermier. Med hjälp av denna analys i närvaro av olika energisubstrat och/eller farmakologiska aktivatorer och/eller hämmare kan ge viktiga insikter i bidraget från olika metaboliska vägar och skärningspunkten mellan signalering kaskader och metabolism under sperma kapacitet.
Introduction
Tillämpningen av masspektrometri har revolutionerat studiet av metabolism. Riktad metabolisk profilering och metabolomiska spårning möjliggöra noggrann övervakning av förändringar i energimetabolism. Emellertid, utför metabolomik framgångsrikt kräver omfattande utbildning, erfaren personal, och dyra, mycket känsliga masspektrometrar inte lätt tillgängliga för varje laboratorium. Under de senaste åren, med hjälp av en extracellulär Flux Analyzer, såsom Seahorse XFe96 har vuxit populär som en surrogat metod för att mäta förändringar i energimetabolism i olika celltyper1,2,3,4,5.
Spermier är mycket specialiserade motila celler; vars uppgift är att leverera det faderliga genomet till äggocyten. Sperma som lämnar de manliga reproduktionsorganen efter utlösning är fortfarande funktionellt omogen och kan inte befrukta äggcell eftersom de inte kan tränga in i oocyters skruvor. Spermier förvärva fertilisering kompetens som de transitering genom den kvinnliga reproduktionsorganen i en mognande process som kallas capacitation6,7. Nyligen ejakulerade spermier eller spermier dissekeras från cauda bitestiklarna kan kapas in vitro genom inkubation i definierade kapacitet media som innehåller ca2 +, bikarbonat (HCO3-) eller en cell-permeable Camp analog (t. ex., dibutyryl-Camp), en kolesterol acceptor (t. ex., bovint serum albumin, BSA), och en energikälla (t. ex., glukos). Under kapacitet, spermier ändra deras motilitet mönster i en asymmetrisk flagellar Beat, som representerar en simning läge som kallas hyperaktivering8,9, och de blir behöriga att genomgå den acrosome reaktion7, där proteolytiska enzymer frigörs att smälta oocyterna ' s vestments. Dessa processer kräver energi, och liknar somatiska celler, spermier generera ATP och andra hög energi föreningar via glykolys samt mitokondriell TCA cykel och oxidativ fosforylering (oxfos)10. Medan flera studier visar att glykolys är nödvändig och tillräcklig för att stödja spermier kapacitet11,12,13,14, bidraget av oxfos är mindre tydlig. I motsats till andra celltyper där glykolys är fysiskt kopplad till TCA-cykeln, spermier är mycket uppdelade och tros upprätthålla dessa processer i separata flagellar utrymmen: den midpiece koncentrerar mitokondriella maskiner, medan de viktigaste enzymerna av glykolys verkar vara begränsad till den viktigaste pjäs15,16. Denna uppdelning resulterar i en pågående debatt om huruvida pyruvat produceras i huvuddelen av glykolys kan stödja mitokondriella oxfos i mittpunkten, och om ATP produceras av oxfos i mellanstycket skulle kunna sprida tillräckligt snabbt längs längden av flagellen se att stödja energibehovet i distala delar av det viktigaste pjäs17,18,19. Det finns också stöd för en roll för oxfos i spermie kapacitet. Inte bara oxfos mer energiskt gynnsam än glykolys, genererar 16 gånger mer ATP än glykolys, men midpiece volym och mitokondriellt innehåll är direkt korrelerade med reproduktiv kondition i däggdjursarter som uppvisar större grad av konkurrens mellan män för kompisar20. Att ta itu med dessa frågor kräver metoder för att undersöka de relativa bidragen från glykolys och oxfos under spermie kapacitet.
Tourmente et al. tillämpat en 24-brunn extracellulär Flux Analyzer för att jämföra energimetabolism av närbesläktade mus arter med betydligt olika spermie prestandaparametrar21. Istället för att rapportera de basala ECAR och OCR värden av icke-kondenserad sperma, här anpassar vi sin metod med hjälp av en 96-väl extracellulära Flux Analyzer för att övervaka förändringar i energimetabolism under mus spermier kapacitet i realtid. Vi utvecklade en metod som gör det möjligt att samtidigt övervaka glykolys och oxfos i realtid i spermier med att slå flageller i upp till tolv olika experimentella förhållanden genom att mäta flödet av syre (O2) och protoner (H+) (figur 1a). På grund av nedbrytningen av pyruvat till laktat under glykolys och produktion av CO2 via TCA-cykeln, icke-kondenserad och kondenserad sperma extrudera H+ in i analysen media som upptäcks av extracellulära Flux Analyzer via H+-känsliga fluoroforer immobiliserade till sonden spetsen av en sensor patron. Parallellt med detta upptäcks O2 -konsumtionen genom oxidativ fosforylering via O2-känsliga fluoroforer immobiliserade till samma sond spets (figur 1b). Effektiv detektering av den släppta H+ och konsumeras O2 kräver en modifierad spermie buffert med låg buffring kapacitet utan bikarbonat eller fenolrött. Sålunda, för att inducera kapacitet i avsaknad av bikarbonat, vi antog användningen av en cell-permeable cAMP analog injiceras tillsammans med brett spektrum PDE inhibitor IBMX22. Tre ytterligare oberoende injektions portar möjliggör injektion av farmakologiska aktivatorer och/eller hämmare, vilket underlättar realtidsdetektering av förändringar i cellandningen och glykolysfrekvens på grund av experimentell manipulation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Spermier samlas in från 8-16-veckors gamla CD-1 hanmöss. Djurförsök godkändes av Weill Cornell medicins institutionella djurvårds-och användnings kommitté (IACUC).
1. dag före analys
-
Beredning av sensor patron och extracellulär Flux Analyzer kalibrant
- För att återfukta sensor patronen, ta bort sensor patronen från XFe96 extracellulära Flux assay kit och Placera sensorn patronen upp och ner bredvid verktyget plattan.
- Fyll en lösning reservoar med 25 mL dubbeldestillerat H2o med hjälp av en multikanalpipett, tillsätt 200 μl av h2o till varje brunn av verktyget plattan. Placera sensor patronen tillbaka i bruks plattan och inkubera över natten i en 37 ° c icke-CO2 inkubator.
Obs: cylinderampullen måste vara hydrerad i minst 4 h. - Alikvot 25 mL av den extracellulära Flux Analyzer-kalibranten till ett 50 mL koniskt rör och inkubera den över natten i en inkubator på 37 ° c icke-CO2 .
-
Beredning av ConA-belagda mikroplattor
- Lös 2,5 mg ConA i 5 mL dubbeldestillerat H2O för att bereda en 0,5 mg/ml (w/v) lager.
- Använd en flerkanalspipett, Fyll varje brunn på en extracellulär Flux Analyzer 96-brunn tallrik med 50 μL av den 0,5 mg/mL Con en lösning. Lämna locket öppet och låt plattan torka över natten vid rumstemperatur.
Obs: flera plattor kan beläggas på en gång och förvaras vid 4 ° c i upp till fyra veckor tills de är färdiga att användas.
-
Beredning av spermier buffert
- Förbered 250 mL av extracellulär Flux Analyzer TYH buffert med låg Hepes innehållande 138 mm nacl, 4,7 mm kcl, 1,7 mm CaCl2, 1,2 mm KH2Po4, 1,2 mm MgSO4, 5,6 mm glukos, och 1 mm Hepes. Värm bufferten till 37 ° c och justera pH till 7,4.
2. dag för analysen
- Förberedelser för kalibrering av patron
- Byt ut H2O i bruks plattan med 200 μl XF-kalibrant per brunn och inkubera i minst 1 H i en inkubator som inte är CO2 37 ° c.
Anmärkning: i stället för kalibrerande, steril-filtrerad PBS, pH 7,4 kan användas. - Värm 50 mL TYH-buffert vid 37 ° c.
- Byt ut H2O i bruks plattan med 200 μl XF-kalibrant per brunn och inkubera i minst 1 H i en inkubator som inte är CO2 37 ° c.
- Generera en påfyllnadsmall för extracellulär Flux Analyzer
- Vrid på extracellulära Flux Analyzer och låt temperaturen stabiliseras till 37 ° c.
- Öppna Wave programvara och designa en ny mall genom att öppna en tom mall (se kompletterande fil 1, Wave mall).
- Öppna fliken gruppdefinitioner . definiera analysmedia som tyh; pH 7,4 och celltyp som mus spermier, lämna injektion strategier och förbehandlingar blank. Skapa olika grupper för varje assay villkor; i det här exemplet finns det 6 olika grupper (TYH, TYH + DB-cAMP/IBMX, 2-DG, 2-DG + DB-cAMP/IBMX, ANT/rot, ANT/rot + DB-cAMP/IBMX); dibutyryl Camp (DB-Camp) och 3-isobutyl-1-metylxantin (ibmx) att inducera kapacitet, 2-deoxyglukos (2-DG) som glykolysis hämmare, a a (antA) och Rotenon (röta) som hämmare av komplexa III och komplexa i i elektrontransportkedjan.
Anmärkning: för att redogöra för variationer mellan brunnar bör minst 7-8 brunnar per tillstånd mätas parallellt. - Öppna fliken plattkarta och definiera plattans karta genom att tilldela grupper till specifika brunnar.
Anmärkning: de fyra hörnen brunnar (a1, A12, H1, H12) kommer att fyllas med TYH buffert (ingen sperma) och kommer senare att användas för bakgrund subtraktion. - Öppna fliken protokoll , Lägg till 4 olika mätcykler, välj respektive port och redigera Mät detaljerna (figur 2, tabell 1). Markera måttet efter injektion och markera inte jämbrate.
- Spara analys mal len, Fyll i projektsammanfattningen och definiera sparplatsen för resultatfilen.
- Beredning av föreningar att lasta i sensor patron
- Förbered 2 mL 50 mM DB-cAMP genom att lösa upp 9,8 mg av substansen i TYH buffert och tillsätt IBMX till en slutlig koncentration av 5 mM.
Anmärkning: IBMX har en tendens att fällas ut efter att spädas i TYH buffert. Fällningen kan lösas genom att vortexera och inkuberar TYH/DB-cAMP/IBMX-lösningen i ett värmeblock på 37 ° c i 5 minuter. - Förbered 1 mL 500 mM 2-DG genom upplösning 82,1 mg av substansen i TYH buffert.
- Bered 1 mL av 5 μM av AntA/rot genom att späda båda läkemedlen i TYH buffert.
Anmärkning: föreningar späds 10 gånger genom injektion i den extracellulära Flux Analyzer patronen; Därför, se till att injektions lösningarna är 10X mer koncentrerad.
- Förbered 2 mL 50 mM DB-cAMP genom att lösa upp 9,8 mg av substansen i TYH buffert och tillsätt IBMX till en slutlig koncentration av 5 mM.
- Isolering av mus spermier
- Anesthetize 3 manliga möss mellan 8 och 16 veckor av isofluran och offra möss av cervikal dislokation efter inget svar på tå klämmande upptäcktes. Ta bort cauda bitestiklar och Vasa deferentia.
- Placera varje cauda i 500 μl av föruppvärmd tyh buffert i 24-brunn plattan väl, immobilisera cauda till botten av plattan med hjälp av ett par tång och öppna vävnaden genom att göra 5-7 små snitt med fjäder sax.
- Överför plattan omedelbart till en inkubator som inte är CO2 37 ° c och låt spermierna skingra i 15 minuter.
- Laddning av sensor patronen
- Två lastnings guider för port A och D samt Port B och C finns i extracellulära Flux kit. För att ladda en specifik port, ta bort locket från sensor patronen och justera bokstaven för respektive port laddnings guide med det övre vänstra hörnet av patronen. Medan du injicerar, Använd fingertopparna på den icke-injicera handen för att hålla port laddnings guiden på plats och sätt in pipettspetsarna vertikalt i Port laddnings styrens hål.
- Port A: Injicera 20 μL av TYH-bufferten i varje kolumn med hjälp av en flerkanalspipett.
- Port B: injicera 22 μL TYH-buffert i kolumn 1-4, injicera 22 μL 500 mM 2-DG i kolumn 5-8 och 25 μL av 5 μM AntA/rot i kolumn 9-12.
- Port C: injicera 25 μL av TYH-bufferten i varje kolumn med udda tal, injicera 25 μL 10 mM DB-cAMP/500 μM IBMX i varje kolumn med jämna tal.
- Placera sensor patronen med kalibrerings plattan i extracellulära Flux Analyzer och starta analysen. Kalibreringen tar 10-15 min.
- Beredning av sperma plattor
- Lös 45 mg BSA i 15 mL TYH-buffert (3 mg/mL w/v) och bered tre alikvoter med 3 mL BSA/TYH-lösning vardera i 5 mL centrifugrör.
- Kombinera två spermie brunnar vardera i en 1,5 mL Centrifugera röret, räkna spermier med en hematokytometer och späd spermier till en koncentration av 2 x 107 spermier/ml.
Obs: Använd skär pipettspetsar för pipettering spermier för att undvika att skada cellerna. - Centrifugera sperman i 3 min vid 700 x g, ta bort supernatanten och tillsätt 1 ml tyh buffert. Upprepa centrifugeringssteget, ta bort supernatanten och överför varje spermie suspension alikvot till ett 5 mL centrifugertub med 3 mL BSA/TYH.
- Placera 180 μL av TYH-bufferten i varje hörn brunn (a1, A12, H1, H12) på en ConA-belagd platta. Placera 180 μL av spermie suspensionen i varje tom brunn på den ConA-belagda plattan (1,2 x 106 spermier/brunn).
- Centrifugera sperma plattan på 250 x g i 1 min, rotera plattan med 180 °, och centrifugera igen vid 250 x g för 1 min (lägsta bromsningsgrad 1).
- Ta bort kalibrerings plattan från extracellulära Flux Analyzer och tillsätt sperma plattan. Fortsätt analysen.
- Data utvinning och analys
- Efter avslutad analysen, ta bort patronen, öppna resultatfilen, klicka på Exportera fliken och exportera den färdiga köra som en GraphPad Prism fil (kompletterande fil 2: primär exempeldata som används för bild 3).
- Duplicera den ECAR och OCR-fil genom att klicka på den nya fliken och sedan duplicera familj... Tab (figur 3A).
- Ta bort de första 7 raderna av data (figur 3B).
- Normalisera till datapunkten innan lägret/IBMX injektion av baseline subtrahera rad 1. Klicka på fliken analysera och sedan på fliken ta bort baslinje och kolumn matematik . Markera markerade rad (er): första raden, beräkning: förhållande: värde/baslinjeoch under kolumner: Ignorera under kolumn. Klicka på OK (figur 3C).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denna metod använder en extracellulär Flux Analyzer för att övervaka realtids förändringar i graden av glykolys och oxfos under mus spermie kapacitet. Figur 4 visar en exemplarisk experiment där spermier var kondenserad i närvaro av glukos som enda energisubstrat och 2-DG och a och Rotenon som farmakologiska modulatorer. Energi underlaget i den extracellulära Flux Analyzer TYH buffert och farmakologiska modulatorer kan väljas fritt beroende på målet med experimentet. Icke-kondenserad mus spermier i BSA/TYH fästes på botten av en ConA-belagd övergående mikrokammare via huvudet. I detta exempel var basala ECAR-och OCR-värden i genomsnitt mellan alla upptäckta brunnar 12,76 ± 2,75 mpH/min och 23,64 ± 2,78 pmol/min respektive.
Efter en mock injektion med TYH buffert, följt av injektion av 2-DG och Ant/rot för att hämma glykolys och oxidativ fosforylering, respektive, var spermie kapacitet induceras genom injektion av DB-cAMP/IBMX.
De representativa resultaten visar att i närvaro av glukos, är kapacitet åtföljs av en 7-faldig ökning av extracellulär syrning Rate (ECAR), som hämmas genom att blockera glykolys med 2-DG (figur 4a). Kondenserad sperma visar en 20-faldig ökning av syreförbrukning hastighet (OCR) jämfört med icke-kondenserad sperma (figur 4B), visar att mus spermier förbättra både glykolys och oxidativ fosforylering att stödja den ökande efterfrågan på energi under kapacitet. Ökningen i ECAR under spermie kapacitet hämmas av glykolysis inhibitor 2-DG, men påverkas inte av de oxidativa fosforylationshämmarna a a och Rotenon (figur 4C), vilket indikerar att förändringen i ECAR huvudsakligen drivs av H+ release från glykolys. Ökningen av OCR är, som förväntat, blockerad av a A och Rotenon (figur 4D), men det hämmas också av 2-DG (figur 4B) som avslöjar att ökningen av oxfos under spermie kapacitet är beroende av glykolytisk aktivitet.
Figur 1: princip för extracellulära Flux Analyzer. (A) på grund av nedbrytningen av glukos till laktat under glykolys och generering av co2 via TCA-cykeln åtföljs förändringar i glykolys och oxfos av H+ -utsöndring i det extracellulära mediet. Den XFe96 Analyzer upptäcker dessa förändringar i extracellulära H+ koncentration som ECAR. Parallellt mäts förändringar i koncentrationen av extracellulär O2 på grund av O2 förbrukning genom oxidativ FOSFORYLERING som OCR. Blockering glykolys med 2-deoxyglukos (2-DG) eller andning med komplexa i och komplexa III-hämmare Rotenon och a A avslöjar vilka metaboliska vägar stödja den ökande efterfrågan på energi under sperma kapacitet. B) mus spermier fästs via huvudet till botten av en ConA-belagd mikrokammare. deras flageller är fritt rörliga. Medan förändringar i den extracellulära H+ och o2 koncentrationen upptäcks av H+-och o2-känsliga fluoroforer immobiliserade till en sensor sond, kan upp till fyra olika föreningar injiceras sekventiellt. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: schematisk representation av det exemplariska experimentet. Förändringar i ECAR (mpH/min) och OCR (pmol O2/min) upptäcks i icke-kondenserad och kondensator sperma med hjälp av en extracellulär Flux Analyzer. Cykel 1: basala ECAR-och OCR-värden. Cykler 2-5: system stabilisering efter TYH mock-injektion. Cykler 6-8: drog inkubation. Cykler 9-27: spermie kapacitet. Pilar indikerar injektioner. 2-DG: slutkoncentration 50 mM, AntA/rot: slutlig koncentration 0,5 μM, DB-cAMP: slutkoncentration 1 mM, IBMX: slutlig koncentration 500 μM. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: data analys. (A) rådata om förändringar i ECAR under mus spermie kapacitet. B) uppgifter efter det att de första 7 datapunkterna har avlägsnats. (C) data normaliserade till datapunkten före Camp/ibmx injektion. Data visas som medelvärde av 7-8 brunnar ± S.E.M. injektioner indikeras med en pil. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: förändringar i glykolys och oxidativ fosforylering under musens spermie kapacitet. (A) NORMALISERADE ECAR i icke-kondenserad och kondenserande mus spermier i närvaro och frånvaro av 50 mm 2-DG. (B) NORMALISERAD OCR i icke-kondenserade och kondenserande mus spermier i närvaro och frånvaro av 50 mm 2-DG. (C) normaliserade ECAR i icke-kondenserad och kondenserande mus spermier i närvaro och frånvaro av 0,5 μm a A och Rotenon. (D) normaliserad OCR i icke-kondenserade och kondenserande mus spermier i närvaro och frånvaro av 0,5 μm a A och Rotenon. Data visas som medelvärdet ± S. E. M normaliserade till datapunkten före DB-cAMP/IBMX injektion; n = 6. Injektioner indikeras med en pil. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Port | Antal cykler | Blanda (min) | Vänta (min) | Mått (min) | |
| A: basala ECAR/OCR | ingen port | 1 | 2:00 | 0:00 | 3:00 |
| B: mock-injektion | 1 | 4 | 2:00 | 0:00 | 3:00 |
| C: injektion av läkemedel | 2 | 3 | 2:00 | 0:00 | 3:00 |
| D: kapacitet | 3 | 18 | 2:00 | 0:00 | 3:00 |
Tabell 1: Mät Detaljer.
Kompletterande figur 1: kapacitet för mus sperma i extracellulär Flux Analyzer TYH buffert. Fosforylering av tyrosin rester av mus spermier upptäcks vid olika tidpunkter under kapacitet (0-90 min) efter inkubering i (a) tyh med 25 mm HCO3-, 3 mg/ml BSA och 20 mm Heper eller i (B) extracellulär Flux Analyzer tyh med 5 mm DB-Camp, 500 μm ibmx, och 1 mm Hepes, detekteras med en α-fosfotyrosin antikropp. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande fil 1: Wave assay mall för att upptäcka förändringar i glykolys och oxidativ fosforylering under mus spermie kapacitet. Wave Desktop programvara kan laddas ner gratis efter att fylla i ett registreringsformulär (www.Agilent.com/en/Products/cell-Analysis/cell-Analysis-Software/Data-Analysis/Wave-Desktop-2-6) och installeras på Windows 7, 8 eller 10, (Mac OSX 10,11 (eller högre) med Parallels 12 (eller högre). Därmed kan Wave mallar genereras oberoende av extracellulära Flux Analyzer, exporteras och sedan importeras till Wave programvara för alla extracellulära Flux Analyzer. Vänligen klicka här för att se denna fil (Högerklicka för att ladda ner).
Kompletterande fil 2: graf pad Prism fil exporteras från Wave programvara med exemplarisk dataanalys. Vänligen klicka här för att se denna fil (Högerklicka för att ladda ner).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Förlusten av spermie kapacitet i avsaknad av vissa metaboliska substrat eller kritiska metaboliska enzymer avslöjade energimetabolism som en nyckelfaktor som stöder framgångsrik befruktning. En metabolisk switch under cell aktivering är ett väletablerat begrepp i andra celltyper, men vi är bara börjar förstå hur spermier anpassa sin metabolism till den ökande efterfrågan på energi under kapacitet. Med hjälp av en extracellulär Flux Analyzer utvecklade vi ett lätt tillämpligt verktyg för att övervaka förändringar i glykolys och oxidativ fosforylering i realtid under spermie kapacitet. Upptäckten av förändringar i extracellulära H+ och O2 med fluoroforer immobiliserade till en sensor sond är minimalt invasiva och de fyra individuellt manövrerade injektions portarna möjliggör manipulation med farmakologiska hämmare eller aktivatorer vid distinkta tidpunkter före eller under processen. Detta protokoll ger bara ett exempel på en mus spermier kapacitet experiment. För att förenkla tolkningen av resultaten valde vi showen ett exemplariskt experiment där glukos användes som enda energikälla. Villkoren varierar beroende på experimentets mål, och upp till 12 olika förhållanden (dvs. olika energikällor som glukos kontra glukos och pyruvat) kan mätas parallellt. Dessutom tillåter fyra oberoende injektions portar injektion av farmakologiska aktivatorer och/eller inhibitorer vid önskad tidpunkt före eller under kapacitet. Detta öppnar möjligheten att använda extracellulära Flux Analyzer som en semi hög genomflöde screening enhet. Liknar mus spermier, i andra arter som människor eller nötkreatur är det fortfarande gåtfull hur spermier ändra sin metabolism under kapacitet. Protokollet kan enkelt anpassas; Därför rekommenderar vi att du optimerar spermiekoncentrationen varje gång innan du påbörjar ett riktigt experiment.
Protokollets största begränsning är att högkvalitativa resultat endast kan uppnås i avsaknad av bikarbonat. Bikarbonat i sädesvätska är den fysiologiska signal som initierar spermiernas kapacitet signalering kaskad efter utlösning. Bikarbonat aktiverar den lösliga adenylylcyklasen (sAC; ADCY10), som katalyserar omvandlingen av ATP in i läger23. Ökningen i lägret kör sedan en signalering kaskad medierad av protein Kinas a, som i slutändan leder till nedströms tyrosin fosforylering av målproteiner (t. ex., jonkanaler, metabola enzymer, och strukturella proteiner24,25). Denna begränsning mot bikarbonat övervinnas genom att injicera produkten av bikarbonat-aktiverat sAC, cAMP. Vi använder 5 mM av cell-permeable cAMP analog DB-cAMP parallellt med den breda-specificitet fosfodiesterashämmare IBMX, som förhindrar snabb nedbrytning av DB-cAMP av fosfodiesteraser. Denna kombination initierar effektivt cAMP-reglerade capacitation signalering väg post sAC aktivering med en liknande Kinetic som bikarbonat (kompletterande figur 1). Parallellt med bikarbonat, en kolesterol acceptor (t. ex., BSA) används för att in vitro-capacitate nyligen ejakulerade spermier eller spermier dissekeras från cauda epididymis. Albumin kan inte injiceras eftersom det täpper till injektionsporten och, därför, måste läggas till spermier buffert innan plating cellerna. Utföra experimentet i närvaro eller frånvaro av BSA avslöjade att ökningen i ECAR och OCR under spermie kapacitet är oberoende av kolesterol acceptor. Närvaron av BSA i spermbufferten minskade dock fluktuationerna i de upptäckta ECAR-och OCR-värdena mellan olika brunnar och experiment. Sålunda, vi rekommenderar starkt inklusive BSA i spermier buffert för att öka reproducerbarhet.
Isolating spermier från cauda bitestiklarna resulterar i kontaminering av spermier med epididymal vätska. För att undvika artificiella resultat på grund av nyskapande vätska komponenter, rekommenderar vi tvätta spermier två gånger innan du använder dem för ett experiment. Spermiekoncentration och plätering är en annan kritisk faktor som avgör framgången för experimentet. För pålitliga resultat rekommenderar tillverkaren att initiala ECAR-värden blir större än 10 och OCR-värden är större än 20. Spermiekoncentrationen som användes i detta protokoll optimerades så att de genomsnittliga basala ECAR-och OCR-värdena för de 7-8 brunnar som mättes per tillstånd är över 10 respektive 20. Fritt rörliga spermier stör upptäckten av förändringar i extracellulära H+ och O2. Således är det viktigt att fästa alla spermier med huvudet till botten av plattan. Vi fann framgång följa spermier genom att belägga plattan med ConA, en växt lektin som specifikt interagerar med den yttre acrosomal membranet och används ofta för acrosome analyser26, och genom att försiktigt snurra plattan (se steg 2.7.3). Med denna metod, spermier är lokaliserade till botten av brunnen enbart via huvudet så att de kan fortfarande fritt flytta sin flageller och ändra sin flagellar stryk mönster under kapacitet.
Spermier extruderar ständigt H+ och O2 i båda, den icke-kondenserade och kondenserade tillstånd. För att bestämma den första ECAR och OCR så exakt som möjligt, är det viktigt att starta experimentet så fort du kan efter den sista tvättsteg. Detta kan åstadkommas genom att ladda sensor patronen medan spermierna simmar ut och genom att starta metoden i extracellulära Flux Analyzer före det första tvättsteget. Kalibreringen av instrumentet tar ungefär samma tid som att tvätta och plätera cellerna och snurra plattan. Tillverkaren rekommenderar en jämnings fas för att systemet ska kunna stabiliseras innan den första riktiga datapunkten mäts. Eftersom protokollet innehåller 8 mätcykler innan kapacitet påbörjas, för att spara tid, är jämningstesteget uteslutet från detta protokoll.
Förmågan att injicera lösningar under analysen och att iaktta deras effekter på andning och glykolytisk hastighet i realtid är ett centralt inslag i extracellulära Flux Analyzer. Laddning av sensor patronen är ett av de kritiska stegen i protokollet och bör utföras noggrant. För att säkerställa korrekt injektion i alla brunnar måste varje serieportar innehålla samma volym, inklusive bakgrunds brunnarna. Att ladda portarna med en flerkanalspipett kräver lite övning men minskar variabilitet och laddningstid avsevärt. Vi rekommenderar starkt att du använder portens laddnings guide, men att bara injicera fyra portar samtidigt. Det är också viktigt att uppskatta att injektions volymerna under lastning gradvis ökas för att kompensera för den ökande volymen i brunnen. När du laddar sensor patronen är det viktigt att inte helt sätta in tipsen i porten. Detta kan för tidigt skjuta injektionsvätska genom öppningen. Samtidigt fastställa metoden fann vi att injicera vätska i en sperma väl orsakar ovälkomna injektion artefakter, förmodligen på grund av utspädning av spermier i brunnen och/eller tränger spermier från brunnen botten. Den första injektionen orsakar den största injektion artefakten, så vi inkluderade en mock injektion med spermier buffert i alla brunnar i början av protokollet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill erkänna stöd från Dr Lavoisier Ramos-Espiritu på Rockefeller hög genomströmning och spektroskopi Resource Center.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| 2-Deoxy-D-glucose | Sigma-Aldrich | D8375 | 2-DG |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I7018 | IBMX; prepare a 500 mM stock solution in DMSO (111.1 mg/ml) and store in small aliquots |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | AntA; prepare a 5 mM stock solution in DMSO (2.7 mg/ml) and store in small aliquots |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A1470 | BSA |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | CaCl2 |
| Concanacalin A, Lectin from Arachis hypogaea (peanut) | Sigma-Aldrich | L7381 | ConA |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| Isothesia | Henry Schein Animal Health | 1169567761 | Isoflurane |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M2643 | MgSO4 |
| N6,2'-O-Dibutyryladenosine 3',5'-cyclic monophosphate sodium salt | Sigma-Aldrich | D0627 | db-cAMP |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | KCl |
| Potassium dihydrogen phosphate | Sigma-Aldrich | P5655 | KH2PO4 |
| Rotenone | Cayman Chemical Company | 13995 | Rot; prepare a 5 mM stock solution in DMSO (2mg/ml) and store in small aliquots |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | NaHCO3- |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | NaCl |
| Equipment and materials | |||
| 12 channel pipette 10-100 μL | eppendorf | ES-12-100 | |
| 12 channel pipette 50-300 μL | vwr | 613-5257 | |
| 37 °C, non-CO2 incubator | vwr | 1545 | |
| 5 mL cetrifuge tubes | eppendorf | 30119380 | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | vwr | 76211-286 | |
| Centrifuge with plate adapter | Thermo Scientific | IEC FL40R | |
| Dissection kit | World Precision Instruments | MOUSEKIT | |
| Inverted phase contrast microscope with 40X objective | Nikon | ||
| OctaPool Solution Reservoirs, 25 ml, divided | Thomas Scientific | 1159X93 | |
| OctaPool Solution Reservoirs, 25 mL, divided | Thomas Scientific | 1159X95 | |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | ||
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent | 102416-100 | Also sold as XFe96 FluxPak mini (102601-100) with 6 instead of 18 cartidges. |
References
- Wu, M., et al. Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 292 (1), C125-C136 (2007).
- Amo, T., Yadava, N., Oh, R., Nicholls, D. G., Brand, M. D. Experimental assessment of bioenergetic differences caused by the common European mitochondrial DNA haplogroups H and T. Gene. 411 (1-2), 69-76 (2008).
- Choi, S. W., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G. Bioenergetic analysis of isolated cerebrocortical nerve terminals on a microgram scale: spare respiratory capacity and stochastic mitochondrial failure. Journal of Neurochemistry. 109 (4), 1179-1191 (2009).
- de Groof, A. J., et al. Increased OXPHOS activity precedes rise in glycolytic rate in H-RasV12/E1A transformed fibroblasts that develop a Warburg phenotype. Molecular Cancer. 8, 54 (2009).
- Chao, L. C., et al. Insulin resistance and altered systemic glucose metabolism in mice lacking Nur77. Diabetes. 58 (12), 2788-2796 (2009).
- Chang, M. C. Fertilizing capacity of spermatozoa deposited into the fallopian tubes. Nature. 168 (4277), 697-698 (1951).
- Austin, C. R., Bishop, M. W. Role of the rodent acrosome and perforatorium in fertilization. Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 149 (935), 241-248 (1958).
- Ishijima, S., Baba, S. A., Mohri, H., Suarez, S. S. Quantitative analysis of flagellar movement in hyperactivated and acrosome-reacted golden hamster spermatozoa. Molecular Reproduction and Development. 61 (3), 376-384 (2002).
- Suarez, S. S. Control of hyperactivation in sperm. Human Reproduction Update. 14 (6), 647-657 (2008).
- Goodson, S. G., Qiu, Y., Sutton, K. A., Xie, G., Jia, W., O'Brien, D. A. Metabolic substrates exhibit differential effects on functional parameters of mouse sperm capacitation. Biology of Reproduction. 87 (3), 75 (2012).
- Travis, A. J., et al. Functional relationships between capacitation-dependent cell signaling and compartmentalized metabolic pathways in murine spermatozoa. Journal of Biological Chemistry. 276 (10), 7630-7636 (2001).
- Urner, F., Leppens-Luisier, G., Sakkas, D. Protein tyrosine phosphorylation in sperm during gamete interaction in the mouse: the influence of glucose. Biology of Reproduction. 64 (5), 1350-1357 (2001).
- Danshina, P. V., et al. Phosphoglycerate kinase 2 (PGK2) is essential for sperm function and male fertility in mice. Biology of Reproduction. 82 (1), 136-145 (2010).
- Miki, K., et al. Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase-S, a sperm-specific glycolytic enzyme, is required for sperm motility and male fertility. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (47), 16501-16506 (2004).
- Mori, C., et al. Mouse spermatogenic cell-specific type 1 hexokinase (mHk1-s) transcripts are expressed by alternative splicing from the mHk1 gene and the HK1-S protein is localized mainly in the sperm tail. Molecular Reproduction and Development. 49 (4), 374-385 (1998).
- Westhoff, D., Kamp, G. Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase is bound to the fibrous sheath of mammalian spermatozoa. Journal of Cell Science. 110 (15), 1821-1829 (1997).
- Nevo, A. C., Rikmenspoel, R. Diffusion of ATP in sperm flagella. Journal of Theoretical Biology. 26 (1), 11-18 (1970).
- Adam, D. E., Wei, J. Mass transport of ATP within the motile sperm. Journal of Theoretical Biology. 49 (1), 125-145 (1975).
- Tombes, R. M., Shapiro, B. M. Enzyme termini of a phosphocreatine shuttle. Purification and characterization of two creatine kinase isozymes from sea urchin sperm. Journal of Biological Chemistry. 262 (33), 16011-16019 (1987).
- Gomendio, M., Tourmente, M., Roldan, E. R. Why mammalian lineages respond differently to sexual selection: metabolic rate constrains the evolution of sperm size. Proceedings of the Royal Society of Biological Sciences. 278 (1721), 3135-3141 (2011).
- Tourmente, M., Villar-Moya, P., Rial, E., Roldan, E. R. Differences in ATP generation via glycolysis and oxidative phosphorylation and relationships with sperm motility in mouse species. Journal of Biological Chemistry. 290 (33), 20613-20626 (2015).
- Visconti, P. E., et al. Capacitation of mouse spermatozoa. II. Protein tyrosine phosphorylation and capacitation are regulated by a cAMP-dependent pathway. Development. 121 (4), 1139-1150 (1995).
- Buck, J., Sinclair, M. L., Schapal, L., Cann, M. J., Levin, L. R. Cytosolic adenylyl cyclase defines a unique signaling molecule in mammals. PNAS. 96 (1), 79-84 (1999).
- Visconti, P. E., Bailey, J. L., Moore, G. D., Pan, D., Olds-Clarke, P., Kopf, G. S. Capacitation of mouse spermatozoa. I. Correlation between the capacitation state and protein tyrosine phosphorylation. Development. 121 (4), 1129-1137 (1995).
- Morgan, D. J., et al. Tissue-specific PKA inhibition using a chemical genetic approach and its application to studies on sperm capacitation. PNAS. 105 (52), 20740-20745 (2008).
- Lybaert, P., Danguy, A., Leleux, F., Meuris, S., Lebrun, P. Improved methodology for the detection and quantification of the acrosome reaction in mouse spermatozoa. Histology and Histopathology. 24 (8), 999-1007 (2009).
