Summary
Fare sperm kapamanı sırasında glikoliz ve oksidatif fosforilasyondaki gerçek zamanlı değişiklikleri izlemek için hücre dışı akı analizörü uygulamasını tanımladık.
Abstract
Memeli spermleri kapacitation olarak bilinen bir süreç içinde kadın üreme sisteminde döllenme kapasitesi elde. Kapacitation ile ilişkili süreçler enerji gerektirir. Sperm progresif hareketliliği, kapasitasyon, hiperaktivasyon ve akrozom reaksiyonunu besleyen ATP'yi üreten kaynaklar hakkında devam eden tartışmalar devam etmektedir. Burada, fare sperm kapamanı sırasında enerji metabolizmasındaki değişiklikleri analiz etmek için bir araç olarak hücre dışı akı analizörü uygulaması açıklar. H+ve O2- hassas floropores kullanarak, bu yöntem glikoliz ve oksidatif fosforilasyon un kapasitif olmayan ve kapasitif sperm gerçek zamanlı olarak izlenmesine olanak sağlar. Farklı enerji yüzeyleri ve/veya farmakolojik aktivatörler ve/veya inhibitörlerin varlığında bu titreşmenin kullanılması, farklı metabolik yolların katkısı ve sperm kapacitation sırasında sinyal basamakları ile metabolizma arasındaki kesişim hakkında önemli bilgiler sağlayabilir.
Introduction
Kütle spektrometresi uygulaması metabolizma çalışmalarında devrim yarattı. Hedeflenen metabolik profilleme ve metabolomik izleme, enerji metabolizmasındaki değişikliklerin hassas bir şekilde izlenmesine olanak sağlar. Ancak, metabolomik performans başarıyla kapsamlı eğitim gerektirir, deneyimli personel, ve pahalı, son derece hassas kütle spektrometreler her laboratuvar için hazır değil. Son yıllarda, bir hücre dışı akı analizörü kullanarak, Seahorse XFe96 gibi çeşitli hücre tiplerinde enerji metabolizmasında ki değişiklikleri ölçmek için bir vekil yöntemi olarak popüler büyüdü1,2,3,4,5.
Sperm son derece özel hareketli hücrelerdir; kimin görevi yumurta için baba genomu teslim etmektir. Boşaldıktan sonra erkek üreme sisteminden ayrılan spermler hala işlevsel olarak olgunlaşmamış durumdadır ve yumurtaların yeleklerine giremedikleri için yumurtayı dölleyemezler. Onlar kapacitation6,7olarak bilinen bir olgunlaşma sürecinde kadın üreme sistemi ile transit olarak Sperm döllenme yetkinliği elde . Cauda epididimisinden yeni boşalan sperm veya sperm, Ca2+içeren tanımlanmış kapasitasyon ortamlarında inkübasyon veya hücregeçirgen cAMP analogu (örn. dibutyryl-cAMP), kolesterol kabul verici (örneğin, sığır serum albumini, BSA) ve bir enerji kaynağı (örneğin, glikoz). Kapacitation sırasında, sperm asimetrik kamçı ritmi içine hareketlilik deseni değiştirmek, hiperaktivasyon denilen bir yüzme modu temsil 8,9, ve onlar akrozom reaksiyonu geçmesi için yetkili hale7, proteolitik enzimler yumurtaların vestments sindirmek serbest bırakılır. Bu süreçler enerji gerektirir ve somatik hücrelere benzer, sperm glikoliz yanı sıra mitokondriyal TCA döngüsü ve oksidatif fosfor (oksfos)10yoluyla ATP ve diğer yüksek enerjibileşikleri üretmek . Birden fazla çalışma glikoli gerekli ve sperm kapacitation desteklemek için yeterli olduğunu göstermek iken11,12,13,14, okfos katkısı daha az açıktır. Glikolisfiziksel TCA döngüsü ile birleştiğinde diğer hücre türlerinin aksine, sperm son derece bölümlere ayrılmıştır ve ayrı kamer bölmelerinde bu süreçleri korumak için düşünülmektedir: midpiece mitokondriyal makine konsantreleri, glikoli anahtar enzimleri ana parça 15 ile sınırlı gibi görünür ise16. Bu bölümleme, glikoliz tarafından ana parçada üretilen pirüvatın orta parçadaki mitokondriyal okfosu destekleyip desteklemeyeceği ve orta parçada oxphos tarafından üretilen ATP'nin anaparçanın 17,18,19'undistal kısımlarındaki enerji gereksinimlerini desteklemek için kamçının uzunluğu boyunca yeterince hızlı bir şekilde yayılıp dağıtılamayacağı konusunda devam eden bir tartışmayla sonuçlanır. Ayrıca sperm kapasitasyonunda oksfos rolü desteklenir. Sadece oxphos glikoliz daha enerjik olumlu, glikoliz daha 16 kat daha fazla ATP üreten, ancak orta hacim ve mitokondriyal içerik doğrudan eşleri için erkekler arasında rekabet daha büyük derece sergileyen memeli türlerinde üreme fitness ile ilişkilidir20. Bu soruların ele alınması, sperm kapanizasyonu sırasında glikoli ve okfosun göreceli katkılarını incelemek için yöntemler gerektirir.
Tourmente ve ark. 24-iyi ekstrasellüler akı analizörü uygulanan önemli ölçüde farklı sperm performans parametreleri ile yakından ilişkili fare türlerinin enerji metabolizmasını karşılaştırmak için21. Kapasitif olmayan spermin bazal ECAR ve OCR değerlerini raporlamak yerine, fare sperm kapaizasyonu sırasında ki enerji metabolizmasındaki değişiklikleri gerçek zamanlı olarak izlemek için 96 kuyulu hücre dışı akı analizörü kullanarak metodlarını uyarlıyoruz. Oksijen (O2) ve proton (H+)(Şekil 1A)akını ölçerek, spermde glikoliz ve okfosların on iki farklı deneysel koşullarda kamçıyı yenerek gerçek zamanlı olarak izlenmesini sağlayan bir yöntem geliştirdik. Glikoliz sırasında laktat için piruvat ın bozulması ve TCA-döngüsü ile CO2 üretimi nedeniyle, kapasite olmayan ve kapasitasyonlu sperm ekstrüzyonu H+ ispret media içine h+-hassas floropores ile algılanan bir sensör kartuşunun prob ucuna hareketsiz. Buna paralel olarak, oksidatif fosforilasyon ile O2 tüketimi aynı prob ucuna hareketsiz hale getirilen O2-duyarlı florofores ile tespit edilir(Şekil 1B). Serbest bırakılan H+ ve tüketilen O2 etkili tespiti bikarbonat veya fenol kırmızı olmadan düşük tamponlama kapasitesi ile değiştirilmiş bir sperm tampon gerektirir. Böylece, bikarbonat yokluğunda kapacitation indüklemek için, geniş menzilli PDE inhibitörü IBMX22ile birlikte enjekte bir hücre geçirgen cAMP analog kullanımını kabul etti. Üç ek bağımsız enjeksiyon portu farmakolojik aktivatörlerin ve/veya inhibitörlerin enjeksiyonuna izin verir, bu da deneysel manipülasyon nedeniyle hücresel solunum ve glikoliz hızındaki değişikliklerin gerçek zamanlı olarak algılanmasını kolaylaştırır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Spermler 8-16 haftalık CD-1 erkek farelerden toplanır. Hayvan deneyleri Weill Cornell Medicine'in Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.
1. Tsamadan önceki gün
-
Sensör kartuşunun ve hücre dışı akı analizörü kallibrantının hazırlanması
- Sensör kartuşunu nemlendirmek için sensör kartuşunu XFe96 Hücre Dışı Akı Çıkış Kiti'nden çıkarın ve sensör kartuşunu servis plakasının yanına ters yerleştirin.
- Çok kanallı pipet kullanarak 25 mL çift distile H2O ile bir çözelti haznesini doldurun, yardımcı plakanın her kuyuya 200 μL H2O ekleyin. Sensör kartuşu tekrar yardımcı plakaya yerleştirin ve bir gecede 37 °C'likCO 2 kuluçka makinesine yerleştirin.
NOT: Kartuşun en az 4 saat süreyle sulu olması gerekir. - Aliquot 25 mL hücre dışı akı analizörü calibrant 50 mL konik tüp içine ve bir gecede 37 ° C non-CO2 kuluçka kuluçka.
-
ConA kaplamalı mikroplakaların hazırlanması
- 0,5 mg/mL (w/v) stok hazırlamak için 5 mL'lik çift distile H2O'da 2,5 mg ConA'yı çözün.
- Çok kanallı bir pipet kullanarak, 0,5 mg/mL Con A çözeltisinin 50 μL'si ile hücre dışı akı analizörü 96 kuyulu bir plakanın her bir kuyuyu doldurun. Kapağı açık bırakın ve oda sıcaklığında bir gecede tabağı kurutun.
NOT: Birden fazla plaka aynı anda kaplanabilir ve kullanıma hazır olana kadar dört hafta boyunca 4 °C'de saklanabilir.
-
Sperm tamponunun hazırlanması
- 138 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 1.7 mM CaCl2, 1.2 mM KH2PO4, 1.2 mM MgSO4, 5.6 mM glukoz ve 1 mM HEPES içeren düşük HEPES içeren 250 mL ekstrasellüler akı analizörü TYH tampon hazırlayın. Tamponu 37 °C'ye ısıtın ve pH'ı 7,4'e ayarlayın.
2. Teşekkün günü
- Kartuş kalibrasyonu için hazırlık
- Yardımcı plakadaki H2O'yu kuyu başına 200°L XF kallibrant ile değiştirin ve CO2 37 °C'li olmayan bir kuluçka makinesinde en az 1 saat inkübatör.
NOT: Kalibran yerine steril filtreli PBS, pH 7.4 kullanılabilir. - 37 °C'de 50 mL TYH tamponu ısıtın.
- Yardımcı plakadaki H2O'yu kuyu başına 200°L XF kallibrant ile değiştirin ve CO2 37 °C'li olmayan bir kuluçka makinesinde en az 1 saat inkübatör.
- Hücre dışı akı çözümleyicisi için dalga şablonu oluşturma
- Hücre dışı akı analizörü açın ve sıcaklığın 37 °C'ye sabitlemesine izin verin.
- Dalga yazılımını açın ve boş bir şablon açarak yeni bir şablon tasarlayın (Bkz. Ek Dosya 1, dalga şablonu).
- Grup tanımları sekmesini aç. Assay ortamını TYH olarak tanımlayın; pH 7.4 ve fare spermi olarak hücre tipi, enjeksiyon stratejileri ve ön tedaviler boş bırakın. Her bir atama koşulu için farklı gruplar oluşturun; Bu örnekte 6 farklı grup bulunmaktadır (TYH, TYH + db-cAMP/IBMX, 2-DG, 2-DG + db-cAMP/IBMX, Ant/Rot, Ant/Rot + db-cAMP/IBMX); dibutyryl cAMP (db-cAMP) ve 3-Izobutyl-1-metilxanthine (IBMX) kapacitation indüklemek için, 2-deoksiglukoz (2-DG) glikoliz inhibitörü olarak, antimisin A (antA) ve rotenon (rot) karmaşık III ve elektron taşıma zincirinin kompleks I inhibitörü olarak.
NOT: Kuyular arasındaki değişkenliği hesaba katmak için, her koşul da en az 7-8 kuyu paralel olarak ölçülmelidir. - Plaka haritası sekmesini açın ve belirli kuyulara gruplar atayarak plaka haritasını tanımlayın.
NOT: Dört köşe kuyusu (A1, A12, H1, H12) TYH tamponu (sperm yok) ile doldurulacak ve daha sonra arka plan çıkarma için kullanılacaktır. - Protokol sekmesini açın, 4 farklı ölçüm döngüsü ekleyin, ilgili bağlantı noktasını seçin ve ölçüm ayrıntılarını edin(Şekil 2, Tablo 1). Enjeksiyondan sonra ölçüvurgulayın ve dengeyi vurgulamayın.
- Tahsin şablonu kaydedin, proje özetini doldurun ve sonuç dosyası için kaydetme konumunu tanımlayın.
- Sensör kartuşuna yüklemek için bileşiklerin hazırlanması
- TYH tamponunda 9,8 mg bileşiğin eritilmesi yle 50 mM db-cAMP'ın 2 mL'sini hazırlayın ve IBMX'i 5 mM'lik son konsantrasyona ekleyin.
NOT: IBMX, TYH arabelleği nde seyreltildikten sonra çökelme eğilimine sahiptir. Çökeltiler, TYH/db-cAMP/IBMX çözeltisinin 5 dakika boyunca 37 °C'lik bir ısı bloğunda girdap ve kuluçkaya yatırılarak çözülebilir. - TYH tamponundaki 82.1 mg bileşiği eriterek 500 mM 2-DG'nin 1 mL'sini hazırlayın.
- HER iki ilacı da TYH tamponunda seyrelterek 1 mL 5 M AntA/Rot hazırlayın.
NOT: Bileşikler hücre dışı akı analizörü kartuşuna enjekte edilerek 10 kat seyreltilir; bu nedenle, enjeksiyon çözeltilerinin 10 kat daha konsantre olduğundan emin olun.
- TYH tamponunda 9,8 mg bileşiğin eritilmesi yle 50 mM db-cAMP'ın 2 mL'sini hazırlayın ve IBMX'i 5 mM'lik son konsantrasyona ekleyin.
- Fare sperminin izolasyonu
- 8 ile 16 hafta arasında 3 erkek fareyi izofluran e-posta ile anesteleştirin ve parmak sıkışmasına yanıt alınamadıktan sonra servikal çıkık ile fareleri kurban edin. Kauda epididamids ve vasa deferentia kaldırın.
- Her kauda'yı 24 kuyulu plakaya 500 μL önceden ısıtılmış TYH tamponuna yerleştirin, bir çift çalgılar kullanarak kauda'yı tabağın dibine yerleştirin ve tüy makası ile 5-7 küçük kesi yaparak dokuyu açın.
- Plakayı hemen CO2 37 °C'li olmayan bir kuluçka makinesine aktarın ve spermin 15 dakika boyunca dağılmasını sağlar.
- Sensör kartuşunun yüklenmesi
- Hücre dışı Akı kitinde A ve D portu ile B ve C bağlantı noktası için iki bağlantı noktası yükleme kılavuzu bulunur. Belirli bir bağlantı noktasını yüklemek için, sensörün kartuşundan kapağı çıkarın ve ilgili bağlantı noktası yükleme kılavuzunun harfini kartuşun sol üst köşesine hizalayın. Enjekte ederken, bağlantı noktası yükleme kılavuzunu yerinde tutmak için enjekte etmeyen elin parmak uçlarını kullanın ve pipet uçlarını bağlantı noktası yükleme kılavuzu deliklerine dikey olarak yerleştirin.
- Port A: Çok kanallı bir pipet kullanarak, her sütuna 20 μL TYH tampon enjekte edin.
- Port B: 22 μL TYH tamponu 1-4 sütununa enjekte edin, 22 μL 500 mM 2-DG'yi 5-8 sütununa ve 25 μL 5 μM AntA/Rot'u 9-12 no'lu kolona enjekte edin.
- Port C: Her sütuna tek sayılarla 25 μL TYH arabellek enjekte edin, 25 μL 10 mM db-cAMP/ 500 μM IBMX'i eşit sayılarla her sütuna enjekte edin.
- Sensör kartuşunu kalibrasyon plakalı hücre dışı akı analizörüne yerleştirin ve tayı başlatın. Kalibrasyon 10 - 15 dk sürer.
- Sperm plakalarının hazırlanması
- 45 mg BSA'yı 15 mL TYH tamponunda (3 mg/mL w/v) çözün ve 5 mL santrifüj tüpte her biri 3 mL BSA/TYH çözeltisi üç ertaminek hazırlayın.
- Her biri 1,5 mL'lik santrifüj tüpünde iki sperm kuyusu birleştirin, hematositometre kullanarak spermi sayın ve spermi 2 x 107 sperm/mL konsantrasyonuna seyreltin.
NOT: Hücrelere zarar vermemek için sperm borulamak için kesme pipet uçlarını kullanın. - 700 x g3 dakika sperm santrifüj, supernatant kaldırmak ve TYH tampon 1 mL ekleyin. Santrifüj adımını tekrarlayın, süpernatantı çıkarın ve her sperm süspansiyonu 3 mL BSA/TYH ile 5 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.
- 180 μL TYH tamponu her köşeye cona kaplamalı bir plakanın (A1, A12, H1, H12) yerleştirin. ConA kaplı plakanın her boş kuyusunun içine 180 μL sperm süspansiyonu yerleştirin (1.2 x 106 sperm/kuyu).
- Sperm plakasını 1 dk için 250 x g'de santrifüj edin, plakayı 180°'ye döndürün ve 1 dk için 250 x g'de tekrar santrifüj edin (en düşük frenleme oranı 1).
- Ekstrasellüler akı analizöründen kalibrasyon plakasını çıkarın ve sperm plakasını ekleyin. Taramaya devam et.
- Veri ayıklama ve analiz
- Tahkikatı tamamladıktan sonra kartuşun kaldırılmasını, sonuç dosyasını açın, Dışa Aktar sekmesini tıklatın ve tamamlanan çalıştırmayı GraphPad Prizma dosyası olarak dışa aktarın (Ek Dosya 2: Şekil 3için kullanılan birincil örnek veriler).
- ECAR ve OCR dosyasını Yeni sekmesine ve ardından Yinelenen Aile sekmesine tıklayarak çoğaltma ... ( Şekil3A).
- İlk 7 veri satırını silin (Şekil 3B).
- CAMP/IBMX enjeksiyonundan önceki veri noktasına temel satır 1'i çıkararak normalleştirin. Analyze sekmesine tıklayın, ardından Taban Çizgisi ve Sütun Matematik sekmesini kaldır. İlk Satır, Hesaplama: Oran:Değer/Taban Çizgisive Alt Sütunlar: Alt Sütunu Yokla. Tamam 'ı tıklatın (Şekil 3C).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu yöntem, fare sperm kapamansırasında glikoliz ve oksfos oranındaki gerçek zamanlı değişiklikleri izlemek için hücre dışı akı analizörü kullanır. Şekil 4, farmakolojik modülatörler olarak tek enerji substratı ve 2-DG ve antimisin ve rotenon olarak glikoz varlığında spermin kapasitif olduğu örnek bir deney göstermektedir. Ekstrasellüler akı analizörü TYH tamponundaki enerji substratı ve farmakolojik modülatörler deneyin amacına bağlı olarak serbestçe seçilebilir. BSA/TYH'de kapasitif olmayan fare spermleri kafaları aracılığıyla ConA kaplı geçici mikrohazonun altına bağlandı. Bu örnekte, saptakedilen tüm kuyular arasında bazal ECAR ve OCR değerleri sırasıyla 12.76 ± 2.75 mpH/dk ve 23.64 ± 2.78 pmol/dak idi.
TYH tamponu ile yapılan sahte enjeksiyondan sonra, sırasıyla glikoliz ve oksidatif fosforilasyoninin inhibesi için 2-DG ve karınca/rot enjeksiyonu yapıldıktan sonra, sperm kapajesisi db-cAMP/IBMX enjeksiyonu ile indüklendi.
Temsili sonuçlar, glikoz varlığında, kapasitasyon un ekstrasellüler asitleşme hızında (ECAR) 7 kat artışla eşlik ettiğini göstermektedir, bu da glikoli 2-DG ile bloke ederek inhibe edilir(Şekil 4A). Kapasitif sperm, kapasitasyonsuz sperme(Şekil 4B)göre Oksijen Tüketim Hızında (OCR) 20 kat artış gösterir ve fare sperminin kapasiasyon sırasında artan enerji talebini desteklemek için hem glikoliz hem de oksidatif fosforilasyon olduğunu gösterir. Sperm kapaizasyonu sırasında ECAR'daki artış glikoliz inhibitörü 2-DG tarafından inhibe edilir, ancak oksidatif fosforilasyon inhibitörleri antimisin A ve rotenone etkilenmez(Şekil 4C),ECAR'daki değişimin esas olarak Glikoliz'den Kaynaklanan H+ salınımı ile hareket ettiğini gösterir. OCR artışı, beklendiği gibi, antimisin A ve rotenon tarafından bloke edilir(Şekil 4D), ama aynı zamanda 2-DG tarafından inhibe edilir (Şekil 4B) sperm kapacitation sırasında oksfos artış glikolitik aktiviteye bağlı olduğunu ortaya koymaktadır.
Şekil 1: Hücre dışı akı analizörü prensibi. (A) Glikoliz sırasında laktat glikozun bozulması ve TCA döngüsü ile CO2 üretimi nedeniyle, glikoliz ve okfos değişiklikleri ekstrasellüler ortama H+ atılım eşlik eder. XFe96 Analyzer ecar olarak ekstrasellüler H+ konsantrasyonbu değişiklikleri algılar. Buna paralel olarak oksidatif fosforilasyon ile O2 tüketimine bağlı ekstrasellüler O2 konsantrasyonundaki değişiklikler OCR olarak ölçülür. 2-deoksiglukoz (2-DG) veya kompleks I ve kompleks III inhibitörleri rotenon ve antimisin A ile solunum ile glikoliz bloke hangi metabolik yollar sperm kapaji sırasında artan enerji talebini desteklemek ortaya koymaktadır. (B) Fare spermi, cona kaplı bir mikrohazonun altına başları ile bağlanır; onların flagella serbestçe hareket ediyor. Hücre dışı H+ ve O2 konsantrasyonundaki değişiklikler H+ve O2duyarlı florofores bir sensör sondasına hareketsiz olarak tespit edilirken, sırayla en fazla dört farklı bileşik enjekte edilebilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Örnek deneyin şematik gösterimi. ECAR (mpH/min) ve OCR 'de (pmol O2/dk) hücre dışı akı analizörü kullanılarak kapasitasyonsuz ve kapasitasyonlu spermde değişiklikler saptanır. Döngü 1: Bazal ECAR ve OCR değerleri. Döngüler 2-5: TYH sahte enjeksiyon sonrası sistem stabilizasyonu. Döngüler 6-8: İlaç kuluçka. Döngüler 9-27: Sperm kapasitasyonu. Oklar iğneleri gösteriyor. 2-DG: son konsantrasyon 50 mM, AntA/Rot: son konsantrasyon 0.5 m, db-cAMP: son konsantrasyon 1 mM, IBMX: son konsantrasyon 500 μM. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Veri analizi. (A) Fare sperm kapasasyonu sırasında ECAR'daki değişikliklerin ham verileri. (B) İlk 7 veri noktasının kaldırılmasından sonra veri. (C) Veriler cAMP/IBMX enjeksiyonundan önce veri noktasına normalleştirildi. Veriler ortalama olarak 7-8 kuyu ± S.E.M. enjeksiyonları bir ok ile gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Fare sperm kapasasyonu sırasında glikoliz ve oksidatif fosforilasyondeğişiklikleri. (A) 50 mM 2-DG varlığında ve yokluğunda, kapasitülize olmayan ve kapasitülize edici fare sperminde normalleştirilmiş ECAR. (B) 50 mM 2-DG varlığında ve yokluğunda, kapasitülize olmayan ve kapasitülize edici fare sperminde normalleştirilmiş OCR. (C) 0.5 μM antimisin A ve rotenone varlığında ve yokluğunda, kapasitülize olmayan ve kapasitize edici fare sperminde normalleştirilmiş ECAR. (D) 0.5 μM antimisin A ve rotenone varlığında ve yokluğunda, kapasitülolmayan ve kapasitize edici fare sperminde normalleştirilmiş OCR. Veriler db-cAMP/IBMX enjeksiyonundan önce veri noktasına normalleştirilmiş ortalama ± S.E.M olarak gösterilir; n = 6 olarak Enjeksiyonlar bir ok ile gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Bağlantı noktası | Döngü sayısı | Mix (dk) | Bekleyin (dk) | Ölçü (dk) | |
| A: Bazal ECAR/OCR | bağlantı noktası yok | 1 | 2:00 | 0:00 | 3:00 |
| B: Sahte enjeksiyon | 1 | 4 | 2:00 | 0:00 | 3:00 |
| C: İlaç enjeksiyonu | 2 | 3 | 2:00 | 0:00 | 3:00 |
| D: Capacitation | 3 | 18 | 2:00 | 0:00 | 3:00 |
Tablo 1: Ölçüm Ayrıntıları.
Ek Şekil 1: Hücre dışı akı analizörü TYH tamponunda fare sperminin kapitalasyonu. (A) TYH'de kuluçka sonrası 25 mM HCO3-3 mg/mL BSA ve 20 mM HEPES veya (B) Hücre dışı flux analizörü TYH'de 5 mM db-cAMP ile kapitalasyon sırasında farklı zaman noktalarında tespit edilen fare sperminin tirozin artıklarının fosforilasyonunu, 500 μM IBMX ve 1 mM HEPES, α-fosfotirozin antikor ile tespit edildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Dosya 1: Fare sperm kapasiasyonu sırasında glikoliz ve oksidatif fosforilasyon değişiklikleri tespit etmek için dalga tsay şablonu. Dalga masaüstü yazılımı bir kayıt formu doldurduktan sonra ücretsiz olarak indirilebilir(www.agilent.com/en/products/cell-analysis/cell-analysis-software/data-analysis/wave-desktop-2-6)ve Windows 7, 8 veya 10 yüklü, (Mac OSx 10.11 (veya daha yüksek) Parallels 12 (veya daha yüksek). Böylelikle, dalga şablonları hücre dışı akı çözümleyicisinden bağımsız olarak oluşturulabilir, ihraç edilebilir ve daha sonra herhangi bir hücre dışı akı çözümleyicisinin dalga yazılımına aktarılabilir. Bu dosyayı görüntülemek için lütfen buraya tıklayın (İndirmek için sağ tıklatın).
Ek Dosya 2: Örnek veri analizi ile dalga yazılımından dışa aktarılan grafik ped prizma dosyası. Bu dosyayı görüntülemek için lütfen buraya tıklayın (İndirmek için sağ tıklatın).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bazı metabolik substratların veya kritik metabolik enzimlerin yokluğunda sperm kapaizatif kaybı başarılı döllenmeyi destekleyen önemli bir faktör olarak enerji metabolizmasını ortaya koymuştur. Hücre aktivasyonu sırasında bir metabolik geçiş diğer hücre tiplerinde köklü bir kavramdır, ancak, biz sadece nasıl sperm kapasiasyon sırasında artan enerji talebine metabolizmaadapte anlamaya başlıyor. Hücre dışı akı analizörü kullanarak, sperm kapasitasyonu sırasında glikoliz ve oksidatif fosforilasyondaki değişiklikleri gerçek zamanlı olarak izlemek için kolayca uygulanabilir bir araç geliştirdik. Bir sensör probuna hareketsiz hale getirilen floroporlarla hücre dışı H+ ve O2'deki değişikliklerin tespiti minimal invazivdir ve ayrı ayrı işletilen dört enjeksiyon portu, kapasiasyon işleminden önce veya sırasında farklı zaman noktalarında farmakolojik inhibitörler veya aktivatörlerle manipülasyona olanak sağlar. Bu protokol, fare sperm kapasitasyon deneyinin yalnızca bir örneğini verir. Sonuçların yorumlanmasını kolaylaştırmak için, tek enerji kaynağı olarak glikozun kullanıldığı örnek bir deney ibretlik bir deney ibretledik. Koşullar deneyin amacına bağlı olarak değişkendir ve 12 farklı koşula kadar (yani glikoz ve pirüuvat gibi farklı enerji kaynakları) paralel olarak ölçülebilir. Ayrıca, dört bağımsız enjeksiyon portu, farmakolojik aktivatörlerin ve/veya inhibitörlerin kapasiasyondan önce veya sırasında istenilen herhangi bir zamanda enjeksiyonuna izin verir. Bu yarı yüksek iş letimli tarama cihazı olarak ekstrasellüler akı analizörü kullanma imkanı açılır. Fare spermine benzer şekilde, insan veya büyükbaş gibi diğer türlerde de, kapsülasyon sırasında spermin metabolizmasını nasıl değiştirdiği hala esrarengizdir. Protokol kolayca uyarlanabilir; bu nedenle, gerçek bir deneye başlamadan önce her seferinde sperm konsantrasyonu optimize öneririz.
Protokolün en büyük sınırlaması, yüksek kaliteli sonuçların ancak bikarbonat yokluğunda elde edilebiliyor olmasıdır. Meni sıvısındaki bikarbonat, boşalma sonrasında spermin kapasiasyon sinyalini başlatan fizyolojik sinyaldir. Bikarbonat çözünür adenylyl siklaz (sAC; ADCY10), hangi cAMP23içine ATP dönüşüm katalizler . CAMP artış sonra protein Kinaz A aracılı bir sinyal çağlayan sürücüler, sonuçta hedef proteinlerin downstream tirozin fosforilasyon yol açar (örneğin, iyon kanalları, metabolik enzimler, ve yapısal proteinler24,25). Bikarbonata karşı bu kısıtlama bikarbonat-aktive sAC, cAMP ürünü enjekte edilerek aşılır. Geniş özgüllüklü fosfodiesteraz inhibitörü IBMX'e paralel olarak hücre geçirgen cAMP analog db-cAMP'ın 5 mM'sini kullanıyoruz ve bu da fosfodiesterazlar tarafından db-cAMP'ın hızlı bir şekilde bozulmasını önler. Bu kombinasyon, bikarbonat gibi benzer bir kinetik ile cAMP-regüle kapacitation sinyal yolu sonrası sAC aktivasyonunu etkin bir şekilde başlatır (Ek Şekil 1). Bikarbonat paralel olarak, bir kolesterol kabul eden (örneğin, BSA) in vitro kapasitate için kullanılır taze boşalan sperm veya sperm kauda epididim den diseksiyon. Albumin enjekte edilemez çünkü enjeksiyon bağlantı noktasını tıkadığı için ve bu nedenle hücreleri kaplamadan önce sperm tamponuna eklenmesi gerekir. Deneyi BSA varlığında veya yokluğunda yapmak, sperm kapasasyonu sırasında ECAR ve OCR'deki artışın kolesterol üten bağımsız olduğunu ortaya koymuştur. Ancak sperm tamponunda BSA varlığı farklı kuyular ve deneyler arasında saptanan ECAR ve OCR değerlerindeki dalgalanmaları azaltmıştır; bu nedenle, tekrarlanabilirliği artırmak için sperm tamponuna BSA'yı dahil etmeyi önemle tavsiye ediyoruz.
Kauda epididimisinden sperm izole etmek spermin epididimal sıvı ile kirlenmesine neden oltır. Meni sıvısı bileşenleri nedeniyle yapay sonuçlardan kaçınmak için, spermleri bir deney için kullanmadan önce iki kez yıkamanızı öneririz. Sperm konsantrasyonu ve kaplama deneyin başarısını belirleyen bir diğer kritik faktördür. Güvenilir sonuçlar için üretici, ilk ECAR değerlerinin 10'dan büyük, OCR değerlerinin ise 20'den büyük olmasını önerir. Bu protokolde kullanılan sperm konsantrasyonu, her koşulda ölçülen 7-8 kuyunun ortalama bazal ECAR ve OCR değerlerinin sırasıyla 10 ve 20'nin üzerinde olması için optimize edildi. Serbestçe hareket eden sperm ler hücre dışı H+ ve O2'dekideğişikliklerin algılanmasını bozar. Bu nedenle, tüm spermleri kafalarını tabağın dibine yapıştırmak çok önemlidir. Biz ConA, özellikle dış akrobasi membran ile etkileşim edebilen ve yaygın akrozom tahliller için kullanılan bir bitki lektin conA ile plaka kaplama tarafından sperm yapıştırma başarı bulundu26, ve yavaşça plaka iplik tarafından (adım 2.7.3 bakınız). Bu yöntemle spermler sadece kafalarıyla kuyunun dibine lokalize olurlar, böylece kamçılarını serbestçe hareket ettirebilir ve kapasiasyon sırasında kamçılı dayak paternini değiştirebilirler.
Sperm sürekli her ikisinde de H+ ve O2 ekstrüzyon, kapasite olmayan ve kapasitatlı durumda. İlk ECAR ve OCR'yi mümkün olduğunca doğru bir şekilde belirlemek için, deneye son yıkama adımından sonra olabildiğince hızlı bir şekilde başlamak çok önemlidir. Bu sperm dışarı yüzme sırasında sensör kartuşuna yükleyerek ve ilk yıkama adımı ndan önce ekstrasellüler akı analizörü yöntemi başlatarak gerçekleştirilebilir. Cihazın kalibresi, hücreleri yıkamak, kaplamak ve plakayı döndürmekle yaklaşık olarak aynı zaman alır. Üretici, ilk gerçek veri noktası ölçülmeden önce sistemin stabilize olmasını sağlamak için bir denge aşaması önerir. Protokol, zaman kazanmak için kapayolasyon başlamadan önce 8 ölçüm döngüsü içerdiğinden, denge adımı bu protokolden çıkarılır.
Tetkik sırasında çözelti enjekte etme ve solunum ve glikolitik hız üzerindeki etkilerini gerçek zamanlı olarak gözlemleme yeteneği hücre dışı akı analizörünün önemli bir özelliğidir. Sensör kartuşunun yüklenmesi protokolün kritik adımlarından biridir ve dikkatli bir şekilde yapılmalıdır. Tüm kuyulara uygun enjeksiyon sağlamak için, her bir bağlantı noktası serisinin arka plan kuyuları da dahil olmak üzere aynı hacmi içermesi gerekir. Bağlantı noktalarını çok kanallı pipetle yüklemek bazı alıştırmalar gerektirir, ancak değişkenlik ve yükleme süresini önemli ölçüde azaltır. Bağlantı noktası yükleme kılavuzunu kullanmanızı ancak aynı anda yalnızca dört bağlantı noktası enjekte etmenizi öneririz. Yükleme sırasında, enjeksiyon hacimlerinin kuyudaki artan hacmi telafi etmek için kademeli olarak arttırılmasının da takdir etmesi önemlidir. Sensör kartuşu yüklenirken, uçları bağlantı noktasına tam olarak takmamak önemlidir. Bu, enjeksiyon çözeltisini liman delikten erken itebilir. Yöntemi belirlerken, sperm kuyusu içine sıvı enjekte edilmesinin, muhtemelen kuyudaki spermin seyreltilmesi ve/veya spermin alttan yer değiştirmesi nedeniyle istenmeyen enjeksiyon eserlerine neden olduğunu bulduk. İlk enjeksiyon en büyük enjeksiyon artifakı neden olur, bu yüzden protokolün başında tüm kuyulara sperm tamponu ile sahte bir enjeksiyon dahil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Yazarlar Rockefeller Yüksek Throughput ve Spektroskopi Kaynak Merkezi'nde Dr Lavoisier Ramos-Espiritu destek kabul etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| 2-Deoxy-D-glucose | Sigma-Aldrich | D8375 | 2-DG |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I7018 | IBMX; prepare a 500 mM stock solution in DMSO (111.1 mg/ml) and store in small aliquots |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | AntA; prepare a 5 mM stock solution in DMSO (2.7 mg/ml) and store in small aliquots |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A1470 | BSA |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | CaCl2 |
| Concanacalin A, Lectin from Arachis hypogaea (peanut) | Sigma-Aldrich | L7381 | ConA |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| Isothesia | Henry Schein Animal Health | 1169567761 | Isoflurane |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M2643 | MgSO4 |
| N6,2'-O-Dibutyryladenosine 3',5'-cyclic monophosphate sodium salt | Sigma-Aldrich | D0627 | db-cAMP |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | KCl |
| Potassium dihydrogen phosphate | Sigma-Aldrich | P5655 | KH2PO4 |
| Rotenone | Cayman Chemical Company | 13995 | Rot; prepare a 5 mM stock solution in DMSO (2mg/ml) and store in small aliquots |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | NaHCO3- |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | NaCl |
| Equipment and materials | |||
| 12 channel pipette 10-100 μL | eppendorf | ES-12-100 | |
| 12 channel pipette 50-300 μL | vwr | 613-5257 | |
| 37 °C, non-CO2 incubator | vwr | 1545 | |
| 5 mL cetrifuge tubes | eppendorf | 30119380 | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | vwr | 76211-286 | |
| Centrifuge with plate adapter | Thermo Scientific | IEC FL40R | |
| Dissection kit | World Precision Instruments | MOUSEKIT | |
| Inverted phase contrast microscope with 40X objective | Nikon | ||
| OctaPool Solution Reservoirs, 25 ml, divided | Thomas Scientific | 1159X93 | |
| OctaPool Solution Reservoirs, 25 mL, divided | Thomas Scientific | 1159X95 | |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | ||
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent | 102416-100 | Also sold as XFe96 FluxPak mini (102601-100) with 6 instead of 18 cartidges. |
References
- Wu, M., et al. Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 292 (1), C125-C136 (2007).
- Amo, T., Yadava, N., Oh, R., Nicholls, D. G., Brand, M. D. Experimental assessment of bioenergetic differences caused by the common European mitochondrial DNA haplogroups H and T. Gene. 411 (1-2), 69-76 (2008).
- Choi, S. W., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G. Bioenergetic analysis of isolated cerebrocortical nerve terminals on a microgram scale: spare respiratory capacity and stochastic mitochondrial failure. Journal of Neurochemistry. 109 (4), 1179-1191 (2009).
- de Groof, A. J., et al. Increased OXPHOS activity precedes rise in glycolytic rate in H-RasV12/E1A transformed fibroblasts that develop a Warburg phenotype. Molecular Cancer. 8, 54 (2009).
- Chao, L. C., et al. Insulin resistance and altered systemic glucose metabolism in mice lacking Nur77. Diabetes. 58 (12), 2788-2796 (2009).
- Chang, M. C. Fertilizing capacity of spermatozoa deposited into the fallopian tubes. Nature. 168 (4277), 697-698 (1951).
- Austin, C. R., Bishop, M. W. Role of the rodent acrosome and perforatorium in fertilization. Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 149 (935), 241-248 (1958).
- Ishijima, S., Baba, S. A., Mohri, H., Suarez, S. S. Quantitative analysis of flagellar movement in hyperactivated and acrosome-reacted golden hamster spermatozoa. Molecular Reproduction and Development. 61 (3), 376-384 (2002).
- Suarez, S. S. Control of hyperactivation in sperm. Human Reproduction Update. 14 (6), 647-657 (2008).
- Goodson, S. G., Qiu, Y., Sutton, K. A., Xie, G., Jia, W., O'Brien, D. A. Metabolic substrates exhibit differential effects on functional parameters of mouse sperm capacitation. Biology of Reproduction. 87 (3), 75 (2012).
- Travis, A. J., et al. Functional relationships between capacitation-dependent cell signaling and compartmentalized metabolic pathways in murine spermatozoa. Journal of Biological Chemistry. 276 (10), 7630-7636 (2001).
- Urner, F., Leppens-Luisier, G., Sakkas, D. Protein tyrosine phosphorylation in sperm during gamete interaction in the mouse: the influence of glucose. Biology of Reproduction. 64 (5), 1350-1357 (2001).
- Danshina, P. V., et al. Phosphoglycerate kinase 2 (PGK2) is essential for sperm function and male fertility in mice. Biology of Reproduction. 82 (1), 136-145 (2010).
- Miki, K., et al. Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase-S, a sperm-specific glycolytic enzyme, is required for sperm motility and male fertility. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (47), 16501-16506 (2004).
- Mori, C., et al. Mouse spermatogenic cell-specific type 1 hexokinase (mHk1-s) transcripts are expressed by alternative splicing from the mHk1 gene and the HK1-S protein is localized mainly in the sperm tail. Molecular Reproduction and Development. 49 (4), 374-385 (1998).
- Westhoff, D., Kamp, G. Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase is bound to the fibrous sheath of mammalian spermatozoa. Journal of Cell Science. 110 (15), 1821-1829 (1997).
- Nevo, A. C., Rikmenspoel, R. Diffusion of ATP in sperm flagella. Journal of Theoretical Biology. 26 (1), 11-18 (1970).
- Adam, D. E., Wei, J. Mass transport of ATP within the motile sperm. Journal of Theoretical Biology. 49 (1), 125-145 (1975).
- Tombes, R. M., Shapiro, B. M. Enzyme termini of a phosphocreatine shuttle. Purification and characterization of two creatine kinase isozymes from sea urchin sperm. Journal of Biological Chemistry. 262 (33), 16011-16019 (1987).
- Gomendio, M., Tourmente, M., Roldan, E. R. Why mammalian lineages respond differently to sexual selection: metabolic rate constrains the evolution of sperm size. Proceedings of the Royal Society of Biological Sciences. 278 (1721), 3135-3141 (2011).
- Tourmente, M., Villar-Moya, P., Rial, E., Roldan, E. R. Differences in ATP generation via glycolysis and oxidative phosphorylation and relationships with sperm motility in mouse species. Journal of Biological Chemistry. 290 (33), 20613-20626 (2015).
- Visconti, P. E., et al. Capacitation of mouse spermatozoa. II. Protein tyrosine phosphorylation and capacitation are regulated by a cAMP-dependent pathway. Development. 121 (4), 1139-1150 (1995).
- Buck, J., Sinclair, M. L., Schapal, L., Cann, M. J., Levin, L. R. Cytosolic adenylyl cyclase defines a unique signaling molecule in mammals. PNAS. 96 (1), 79-84 (1999).
- Visconti, P. E., Bailey, J. L., Moore, G. D., Pan, D., Olds-Clarke, P., Kopf, G. S. Capacitation of mouse spermatozoa. I. Correlation between the capacitation state and protein tyrosine phosphorylation. Development. 121 (4), 1129-1137 (1995).
- Morgan, D. J., et al. Tissue-specific PKA inhibition using a chemical genetic approach and its application to studies on sperm capacitation. PNAS. 105 (52), 20740-20745 (2008).
- Lybaert, P., Danguy, A., Leleux, F., Meuris, S., Lebrun, P. Improved methodology for the detection and quantification of the acrosome reaction in mouse spermatozoa. Histology and Histopathology. 24 (8), 999-1007 (2009).
