Summary
マウス精子容量中の糖質および酸化リン酸化のリアルタイム変化を監視する細胞外フラックス分析装置の応用について説明する。
Abstract
哺乳類の精子は、容量として知られているプロセスで女性の生殖管で受精能力を獲得します。容量関連プロセスにはエネルギーが必要です。精子の進行性運動性、容量、過活性化、およびアクロソーム反応を燃料とするATPを生成するソースに関する議論が続いています。ここでは、マウス精子容量のエネルギー代謝の変化を解析するツールとしての細胞外フラックス分析装置の応用について説明する。H+- および O2- 感受性蛍光体を使用して、この方法は、非容量化対容量性精子でリアルタイムでの糖和および酸化リン酸化を監視することを可能にします。異なるエネルギー基質および/または薬理活性剤および/または阻害剤の存在下でこのアッセイを使用すると、異なる代謝経路の寄与および精子の容量化中のシグナル伝達カスケードと代謝の交点に関する重要な洞察を提供することができる。
Introduction
質量分析法の応用は代謝の研究に革命をもたらした。標的代謝プロファイリングとメタボロミクストレースにより、エネルギー代謝の変化を正確にモニタリングできます。しかし、メタボロミクスを成功させるには、広範なトレーニング、経験豊富なスタッフ、および高価で機密性の高い質量分析計が必要です。近年、シーホースXFe96などの細胞外フラックス分析装置を用いて、種々の細胞型1、2、3、4、5のエネルギー代謝の変化を測定する代理法として普及している。
精子は高度に専門化された運動細胞です。その仕事は、卵母細胞に父性ゲノムを提供することです。射精後に男性の生殖管を離れる精子はまだ機能的に未熟であり、卵母細胞のベストを貫通できないため、卵母細胞を受精させることができない。精子は、容量6、7として知られている成熟プロセスで女性の生殖管を通過する時に受精能力を獲得する。カウダ精巣上体から解剖された新鮮に射精した精子または精子は、Ca2+、重炭酸塩(HCO3−)または細胞透過性cAMPアナログ(例えば、ジブチリルcAMP)、コレステロールアクセプター(例えば、ウシ血清アルブミン、BSA)、およびグルコース(例えば、ウシ血清アルブミン)を含む定義された容量媒体中のインキュベーションによってインビトロで容量化することができる。容量化の間、精子は運動パターンを非対称フラジェラ拍動に変え、過活性化8、9と呼ばれる水泳モードを表し、卵母細胞のベストを消化するタンパク質分解酵素が放出されるアクロソーム反応7を受ける能力を持つようになる。これらのプロセスは、エネルギーを必要とし、および体細胞と同様に、精子は、糖和を介してATPおよび他の高エネルギー化合物を生成するだけでなく、ミトコンドリアTCAサイクルおよび酸化リン酸化(oxphos)10を生成する。複数の研究は、糖質上昇が必要であり、精子の容量化を支するのに十分であることを示しているが、オックスフォスの寄与はあまり明らかではない。糖分解がTCAサイクルに物理的に結合されている他の細胞タイプとは対照的に、精子は非常に区画化され、これらのプロセスを別々の旗手コンパートメントに維持すると考えられている:ミッドピースはミトコンドリア機械を濃縮し、一方、糖分解の主要な酵素は主片15、16に制限されているように見える。この区画化は、グリコリシスによって主な部分で産生されるピルビン酸がミトコンドリアオックスホスを中間部分で支えることができるかどうか、そしてミッドピース中のオックスホスによって産生されるATPが、主片17、18、19の遠位部分のエネルギー要件をサポートするためにフラグラムの長さに沿って十分に迅速に拡散することができるかどうかについての議論を続ける。精子の容量におけるオックスホスの役割のサポートもあります。オックスホスは、糖酸化物よりも精力的に有利であるだけでなく、糖和よりも16倍多くのATPを生成するが、ミッドピース体積およびミトコンドリア含有量は、仲間20のための男性間のより大きな競争度を示す哺乳動物種における生殖適性と直接相関している。これらの質問に対処するには、精子の容量化中に糖質およびオックスホスの相対的な寄与を調べるための方法が必要です。
Tourmenteららは、24ウェル細胞外フラックス分析装置を適用し、有意に異なる精子性能パラメータ21と密接に関連するマウス種のエネルギー代謝を比較した。ここでは、非容量性精子の基底ECAR値とOCR値を報告する代わりに、96ウェルの細胞外フラックスアナライザを用いて、マウス精子容量のエネルギー代謝の変化をリアルタイムでモニタリングする方法を適応させます。酸素のフラックス(O2)とプロトン(H+)を測定することにより、最大12の異なる実験条件でフラゲラを打つ精子で糖質およびオックスホスをリアルタイムでリアルタイムにモニタリングできる方法を開発しました(図1A)。糖分解中の乳酸へのピルビン酸の分解とTCAサイクルを介したCO2の産生により、非容量および容量化された精子は、H+-感受性フルオロフォアを介して細胞外フラックスアナライザによって検出されるアッセイ媒体にH+を押し出し、センサカートリッジのプローブ先端に固定化します。並行して、酸化リン酸化によるO2消費は、同じプローブ先端に固定化されたO2感受性フルオロフォアを介して検出される(図1B)。放出されたH+および消費されたO2の効果的な検出は、重炭酸塩またはフェノール赤色なしで低い緩衝能を有する修飾精子緩衝液を必要とする。従って、重炭酸塩の非存在下で容量を誘導するために、広範囲PDE阻害剤IBMX22と共に注入された細胞透過性cAMPアナログの使用を採用した。3つの追加の独立した注入ポートは、薬理活性剤および/または阻害剤の注入を可能にし、実験的操作による細胞呼吸および糖上昇率の変化のリアルタイム検出を容易にする。
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Protocol
精子は8-16週齢のCD-1雄マウスから採取される。動物実験は、ワイル・コーネル医学の制度的動物ケア・利用委員会(IACUC)によって承認された。
1. アッセイの前日
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センサカートリッジおよび細胞外フラックスアナライザキャリブラントの調製
- センサーカートリッジを水和するには、XFe96細胞外フラックスアッセイキットからセンサーカートリッジを取り外し、ユーティリティプレートの横にセンサーカートリッジを逆さまに置きます。
- マルチチャンネルピペットを使用して25mLの二重蒸留H2Oで溶液貯留部を充填し、ユーティリティプレートの各ウェルに200 μLのH2Oを加えます。センサーカートリッジをユーティリティプレートに戻し、37°Cの非CO2インキュベーターで一晩インキュベートします。
メモ:カートリッジは少なくとも4時間は水和する必要があります。 - 細胞外フラックス分析装置のアリコート25mLを50mL円錐管に入れ、37°Cの非CO2インキュベーターで一晩インキュベートする。
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ConAコーティングマイクロプレートの調製
- 2.5mgのConAを二重蒸留H2Oの5mLに溶解し、0.5mg/mL(w/v)ストックを調製した。
- マルチチャンネルピペットを使用して、細胞外フラックスアナライザ96ウェルプレートの各ウェルを0.5 mg/mL Con A溶液の50°Lで充填します。蓋を開けたまま、プレートを室温で一晩乾かします。
注:複数のプレートを一度にコーティングし、使用できる状態になるまで4週間4°Cで保存することができます。
-
精子緩衝液の調製
- 138 mM NaCl、4.7 mM KCl、1.7 mM CaCl 2、1.2 mM KH2PO4、1.2mM MgSO4、5.6mM グルコース、および 1 mM HEPES を含む低 HEPESを使用して、250 mL の細胞外フラックスアナライザ TYH バッファーを準備します。バッファーを 37 °C に加熱し、pH を 7.4 に調整します。
2. アッセイの日
- カートリッジキャリブレーションの準備
- ユーティリティプレートのH2Oをウェル当たりのXFキャリブラントの200°Lに交換し、非CO2 37°Cのインキュベーターで少なくとも1時間インキュベートします。
メモ:キャリブラントの代わりに、無菌フィルタPBS、pH 7.4を使用することができます。 - 37°CでのTYH緩衝液の熱50mL。
- ユーティリティプレートのH2Oをウェル当たりのXFキャリブラントの200°Lに交換し、非CO2 37°Cのインキュベーターで少なくとも1時間インキュベートします。
- 細胞外フラックスアナライザのウェーブテンプレートの生成
- 細胞外フラックス分析装置をオンにし、温度が37°Cに安定するようにします。
- Wave ソフトウェアを開き、空のテンプレートを開いて新しいテンプレートをデザインします(補足ファイル 1、Wave テンプレートを参照)。
- [グループ定義] タブを開きます。pH 7.4およびマウス精子としての細胞型は、注射戦略と前処理を空白のままにします。アッセイ条件ごとに異なるグループを作成します。この例では、6 つの異なるグループがあります (TYH、TYH + db-cAMP/IBMX、2-DG、2-DG + db-cAMP/IBMX、アント/ロート、Ant/Rot + db-cAMP/IBMX)。ジブチリルcAMP(db-cAMP)および3-イソブチル-1-メチルキサンチン(IBMX)は、容量化を誘導し、グリコ分解阻害剤として2-デオキシグルコース(2-DG)、アンチマイシンA(antA)およびロテノン(rot)を電子輸送鎖の複合体IIIおよび複合体Iの阻害剤として挙げられる。
注:井戸間の変動性を考慮するために、条件ごとに少なくとも7〜8ウェルを並列に測定する必要があります。 - [プレート マップ]タブを開き、特定のウェルにグループを割り当てることによってプレート マップを定義します。
注:4つのコーナーウェル(A1、A12、H1、H12)はTYHバッファ(精子なし)で満たされ、後でバックグラウンド減算に使用されます。 - [プロトコル]タブを開き、4つの異なる測定サイクルを追加し、それぞれのポートを選択して測定の詳細を編集します(図2、表1)。注入後の測定値を強調表示し、平衡を強調しないでください。
- アッセイ テンプレートを保存し、プロジェクトのサマリーを入力し、結果ファイルの保存場所を定義します。
- センサーカートリッジにロードする化合物の調製
- TYHバッファーに9.8mgの化合物を溶解して50mM db-cAMPの2 mLを調製し、IBMXを5mMの最終濃度に添加します。
注: IBMX は、TYH バッファーで希釈された後に沈殿する傾向があります。沈殿物は、渦化してTYH/db-cAMP/IBMX溶液を37°Cのヒートブロックに5分間インキュベートすることによって溶解させることができる。 - 82.1mgの化合物をTYH緩衝液に溶解して500mM 2-DGの1mLを調製する。
- TYH緩衝液中の両方の薬剤を希釈して、AntA/Rotの5μMの1 mLを調製します。
注:化合物は、細胞外フラックスアナライザカートリッジへの注入によって10倍に希釈されます。したがって、注入溶液が10倍より濃縮されていることを確認してください。
- TYHバッファーに9.8mgの化合物を溶解して50mM db-cAMPの2 mLを調製し、IBMXを5mMの最終濃度に添加します。
- マウス精子の分離
- イソフルランにより8~16週間の間に3匹の雄マウスを麻酔し、つま先の挟み込み反応がなかった後に頸部脱臼によりマウスを犠牲にした。コーダ上分骨上膜と精巣を取り除く。
- 各カウダを24ウェルプレートウェルに500μLの前温TYH緩衝液に入れ、1対の鉗子を使用してプレートの底部にコーダを固定し、羽はさみで5-7小さな切開を行って組織を開きます。
- すぐに非CO2 37°Cのインキュベーターにプレートを移し、精子を15分間分散させます。
- センサーカートリッジのローディング
- ポート A と D およびポート B および C の 2 つのポートローディング ガイドが、セルラーフラックス キットに用意されています。特定のポートをロードするには、センサー・カートリッジからふたを取り外し、それぞれのポート・ローディング・ガイドの文字をカートリッジの左上隅に合わせます。注入中は、非注入手の指先を使用してポートローディングガイドを所定の位置に保持し、ピペット先端をポートローディングガイド穴に垂直に挿入します。
- ポート A: マルチチャネル ピペットを使用して、TYH バッファの 20 μL をすべての列に挿入します。
- ポート B: 22 μL の TYH バッファーを列 1 から 4 に注入し、500 mM 2-DG の 22 μL を列 5-8 に注入し、5-M AntA/Rot の 25 μL を列 9-12 に注入します。
- ポート C: 奇数を持つすべての列に 25 μL の TYH バッファーを注入し、偶数を持つすべての列に 10 mM db-cAMP/ 500 μM IBMX の 25 μL を注入します。
- キャリブレーションプレートを使用したセンサーカートリッジを細胞外フラックスアナライザに入れ、アッセイを開始します。キャリブレーションには10~15分かかります。
- 精子プレートの調製
- TYH緩衝液(3mg/mL w/v)の15 mLにBSAの45mgを溶解し、それぞれ5 mL遠心管に3 mL BSA/TYH溶液の3つのアリコートを調製する。
- 1つの1.5 mL遠心管にそれぞれ2つの精子井戸を組み合わせ、造光計を使用して精子をカウントし、精子を2 x 107精子/mLの濃度に希釈します。
注:細胞に損傷を与えないように、精子をピペットにするためのカットピペットの先端を使用してください。 - 700 x gで3分間精子を遠心分離し、上清を取り除き、TYH緩衝液を1mL加えます。遠心分離工程を繰り返し、上清を取り除き、各精子懸濁アリコートをBSA/TYHの3mLで1本の5mL遠心管に移します。
- 180 μLのTYHバッファーをConAコーティングプレートの各コーナーウェル(A1、A12、H1、H12)に入れます。180°Lの精子懸濁液をConAコーティングプレートの各空の井戸(1.2 x 106精子/ウェル)に入れます。
- 精子プレートを250 x gで1分間遠心分離し、プレートを180°回転させ、250 x gで再び1分間遠心分離機を1分間(最低制動速度1)行います。
- 細胞外フラックス分析装置からキャリブレーションプレートを取り出し、精子プレートを追加します。アッセイを続けます。
- データ抽出と分析
- アッセイが終了したら、カートリッジを取り出し、結果ファイルを開き、[エクスポート]タブをクリックして、完成した実行を GraphPad Prism ファイルとしてエクスポートします (補足ファイル 2:図 3で使用される主要なサンプル データ)。
- [新規作成] タブをクリックし、[ファミリの複製] タブ (図 3A)をクリックして、ECAR ファイルと OCR ファイルを複製します。
- データの最初の 7 行を削除します (図 3B)。
- ベースライン減算行 1 によって、cAMP/IBMX 注入の前のデータ・ポイントに正規化します。[分析] タブをクリックし、[ベースラインと列の数式の削除] タブで、[選択した行を強調表示] タブで、[最初の行]、[計算: 比率:値/ベースライン]、および [サブ列: サブ列を無視]をクリックします。[OK]をクリックします (図 3C)。
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Representative Results
この方法では、細胞外フラックスアナライザを使用して、マウス精子の容量中の糖質およびオックスフォスの速度のリアルタイム変化を監視します。図4は、精子が唯一のエネルギー基質としてグルコースの存在下で容量化し、薬理学的モジュレーターとして2-DGとアンチマイシンとロテノンを有する例示的な実験を示す。細胞外フラックス分析装置TYH緩衝液及び薬理調節器内のエネルギー基板は、実験の目的に応じて自由に選択することができる。BSA/TYHの非容量マウス精子は、頭部を介してConA被覆された一過性マイクロチャンバーの底部に取り付けられた。この例では、検出されたすべてのウェル間の平均ベースECAR値とOCR値は、それぞれ12.76±2.75 mpH/minおよび23.64±2.78 pmol/minであった。
TYH緩衝液を用いた模擬注射の後、それぞれ2-DGおよびant/rotの注射を行い、それぞれ、db-cAMP/IBMXの注射により精子の容量を誘導した。
代表的な結果は、グルコースの存在下で、容量が2次元Gで糖上昇を遮断することによって阻害される細胞外酸性化速度(ECAR)の7倍の増加を伴っていることを示す(図4A)。容量化精子は、非容量化精子(図4B)と比較して酸素消費率(OCR)の20倍の増加を示し、マウス精子が糖度および酸化リン酸化の両方を増強し、容量化時のエネルギー需要の増加をサポートすることを実証する。精子容量化時のECARの上昇は、糖化阻害剤2-DGによって阻害されるが、酸化リン酸化阻害剤の抗マイシンAおよびロテノン(図4C)の影響を受けず、ECARの変化が主に糖化からのH+放出によって駆動されることを示す。OCRの増加は、予想通り、抗マイシンAおよびロテノン(図4D)によって遮断されるが、精子容量化中のオックスホスの増加が糖分解活性に依存することを明らかにする2-DG(図4B)によっても阻害される。
図1:細胞外フラックス分析装置の原理(A)糖分解時の乳酸の分解とTCAサイクルを介したCO2の生成により、糖分解およびオックスホスの変化は細胞外媒体へのH+排泄を伴う。XFe96アナライザは、細胞外H+濃度のこれらの変化をECARとして検出します。並行して、酸化リン酸化によるO2消費による細胞外O2濃度の変化はOCRとして測定される。2-デオキシグルコース(2-DG)による糖分解を遮断するか、複合体Iおよび複合体III阻害剤ロテノンおよびアンチマイシンAによる呼吸は、どの代謝経路が精子の容量化中のエネルギー需要の増加を支えているかを明らかにする。(B)マウスの精子は、ConAコーティングされたマイクロチャンバーの底に頭を介して取り付けられます。彼らのフラッグラは自由に動いている。細胞外H+およびO2濃度の変化はH+-およびO2-感受性フルオロフォアをセンサプローブに固定することにより検出されるが、最大4種類の化合物を順次注入することができる。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:例示的な実験の概略表現。ECAR(mpH/min)およびOCR(pmol O2/min)の変化は、細胞外フラックスアナライザを使用して非容量および容量性精子で検出されます。サイクル 1: 基底 ECAR と OCR 値。サイクル2-5:TYHモック注入後のシステム安定化。サイクル 6-8: 薬物インキュベーション.サイクル9-27:精子の容量。矢印は注射を示します。2-DG:最終濃度50mM、AntA/Rot:最終濃度0.5μM、db-cAMP:最終濃度1mM、IBMX:最終濃度500μM.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3: データ分析(A)マウス精子容量中のECARの変化の生データ。(B)最初の7つのデータポイントを削除した後のデータ。(C) cAMP/IBMX 注入前のデータ・ポイントに正規化されたデータ。データは、7-8ウェル±S.E.M.注射の平均として示され、矢印で示されます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:マウス精子容量における糖質および酸化リン酸化の変化(A) 50 mM 2-DGの有無における非容量および容量性マウス精子における正規化されたECAR。(B) 50 mM MM 2-DGの有無における非容量性および容量性マウス精子における正規化されたOCR。(C)0.5μMアンチマイシンAおよびロテノンの有無において、非容量および容量化マウス精子における正常化されたECAR。(D) 0.5μMアンチマイシンAおよびロテノンの有無において、非容量および容量性マウス精子における正規化されたOCR。データは、db-cAMP/IBMX インジェクションの前にデータ・ポイントに正規化された平均 ± S.E.M として表示されます。n = 6。注射は矢印で示されます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| ポート | サイクル数 | ミックス(分) | 待機 (分) | 測定 (分) | |
| A: ベースル ECAR/OCR | ポートなし | 1 | 2:00 | 0:00 | 3:00 |
| B:モックインジェクション | 1 | 4 | 2:00 | 0:00 | 3:00 |
| C: 薬物注射 | 2 | 3 | 2:00 | 0:00 | 3:00 |
| D: 容量 | 3 | 18 | 2:00 | 0:00 | 3:00 |
表 1: 測定の詳細
補足図1:細胞外フラックス分析TYH緩衝液中のマウス精子の容量。(A) 25 mM HCO3-,3mg/mL BSA および 20 mM HEPES または(B) 5 mM db-cAMP でインキュベーションした後、容量(0 - 90 分)の容量(0 - 90 分)の間に検出されたマウス精子のチロシン残基のリン酸化 500μM IBMX、および1mM HEPESは、α-ホスホチロシン抗体で検出された。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足ファイル1:マウス精子容量中の糖質および酸化リン酸化の変化を検出する波アッセイテンプレート。ウェーブデスクトップソフトウェアは、登録フォーム(www.agilent.com/en/products/cell-analysis/cell-analysis-software/data-analysis/wave-desktop-2-6)に記入した後に無料でダウンロードでき、Windows 7、8、または10(Mac OSx 10.11(またはそれ以上)にパラレル12(またはそれ以上)にインストールできます。それにより、波テンプレートは、細胞外フラックス分析装置から独立して生成され、エクスポートされ、任意の細胞外フラックスアナライザの波ソフトウェアにインポートすることができる。このファイルを表示するには、ここをクリックしてください (右クリックしてダウンロードしてください)。
補足ファイル2:例示的なデータ分析と波のソフトウェアからエクスポートされたグラフパッドプリズムファイル。このファイルを表示するには、ここをクリックしてください (右クリックしてダウンロードしてください)。
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Discussion
特定の代謝基質または重要な代謝酵素がない場合の精子容量の喪失は、受精の成功を支える重要な要因としてエネルギー代謝を明らかにした。細胞活性化中の代謝スイッチは、他の細胞型では確立された概念ですが、精子が容量の増加するエネルギー需要にどのように代謝を適応させるかがわかり始めています。細胞外フラックス分析装置を用いて、精子の容量化中に糖質および酸化リン酸化の変化をリアルタイムで監視する容易に適用可能なツールを開発しました。センサプローブに固定化された蛍光色素を有する細胞外H+およびO2の変化の検出は、最小侵襲性であり、4つの個別に操作された注入ポートは、容量化プロセスの前または間に異なる時点で薬理学的阻害剤または活性化剤との操作を可能にする。このプロトコルは、マウス精子容量実験の一例のみを示す。結果の解釈を簡素化するために、グルコースが唯一のエネルギー源として使用された例示的な実験を示すことを選択した。条件は、実験の目標に応じて可変であり、最大12の異なる条件(すなわち、グルコース対グルコースおよびピルビン酸のような異なるエネルギー源)を並列に測定することができる。さらに、4つの独立した注入ポートは、容量化の前または間に任意の時点で薬理活性剤および/または阻害剤の注入を可能にする。これにより、細胞外フラックスアナライザを半ハイスループットスクリーニング装置として使用する可能性が開きます。マウスの精子と同様に、ヒトやウシのような他の種では、精子が容量の間にどのように代謝を変化させるかはまだ謎です。プロトコルは簡単に適合させることができます。したがって、実際の実験を開始する前に、毎回精子濃度を最適化することをお勧めします。
プロトコルの最大の制限は、高品質の結果は、重炭酸塩がない場合にのみ達成することができるということです。精液中の重炭酸塩は、射精後に精子の容量付けシグナリングカスケードを開始する生理学的信号である。重炭酸塩は、可溶性アデニリルシクラーゼ(sAC;ADCY10)、ATPのcAMP23への変換を触媒します。次いで、cAMPの増加はプロテインキナーゼAによって媒介されるシグナル伝達カスケードを駆動し、最終的には標的タンパク質の下流チロシンリン酸化につながる(例えば、イオンチャネル、代謝酵素、および構造タンパク質24、25)。重炭酸塩に対するこの制限は、重炭酸活性化sAC、cAMPの生成物を注入することによって克服される。細胞透過性cAMPアナログdb-cAMPの5mMを広範特異性ホスホジエステラーゼ阻害剤IBMXと並行して使用し、ホスホジエステラーゼによるdb-cAMPの急速な分解を防止します。この組み合わせは、重炭酸塩と同様の運動を伴うsAC活性化後のcAMP調節型容量伝達経路を効果的に開始する(補足図1)。重炭酸塩と並行して、コレステロールアクセプター(例えば、BSA)は、カウダ精巣上体から解剖された新鮮な射精精子または精子をインビトロ容量で使用される。アルブミンは注射口を詰まらせるので注入できないため、細胞をめっきする前に精子バッファーに添加する必要があります。BSAの有無で実験を行い、精子容量化時のECARおよびOCRの増加はコレステロールアクセプターとは無関係であることを明らかにした。しかし、精子バッファー内のBSAの存在は、異なる井戸と実験間で検出されたECARとOCR値の変動を減少させた。したがって、再現性を高めるために精子バッファーにBSAを含めることを強くお勧めします。
コーダ精巣上体ミスから精子を分離すると、精巣液による精子の汚染をもたらす。精液成分による人工的な結果を避けるために、実験に使用する前に精子を2回洗浄することをお勧めします。精子濃度とめっきは、実験の成功を決定するもう一つの重要な要因である。信頼性の高い結果を得るには、初期 ECAR 値を 10 より大きくし、OCR 値を 20 より大きくすることをお勧めします。このプロトコルで使用される精子濃度は、条件ごとに測定された7-8ウェルの平均基底ECARおよびOCR値がそれぞれ10および20を超するように最適化された。自由に移動する精子は、細胞外H+およびO2の変化の検出を妨げる。したがって、プレートの底に彼らの頭ですべての精子を付着することが重要です。我々は、外側のアクロソーム膜と特異的に相互作用し、アクロソームアッセイ26に一般的に使用される植物レクチンであるConAでプレートをコーティングし、プレートを穏やかに回転させることによって、精子を付着させることに成功した(ステップ2.7.3参照)。この方法では、精子は頭だけで井戸の底部に局在するので、彼らはまだ自由に彼らのフラゲラを移動し、容量の間に彼らの旗の鼓動パターンを変更することができます。
精子は、常にH+およびO2を両方で押し出し、非容量状態および容量化状態である。最初の ECAR と OCR をできるだけ正確に判断するには、最後の洗浄手順の後にできるだけ早く実験を開始することが重要です。これは、精子が泳いでいる間にセンサーカートリッジをロードし、最初の洗浄ステップの前に細胞外フラックスアナライザで方法を開始することによって達成することができます。器具のキャリブレーションは、細胞の洗浄とめっき、プレートの回転とほぼ同じ時間がかかります。製造元は、最初の実データ ポイントを測定する前にシステムを安定させるために平衡フェーズを推奨します。プロトコルは、容量が開始される前に8つの測定サイクルを含むので、時間を節約するために、平衡ステップはこのプロトコルから除外される。
アッセイ中に溶液を注入し、リアルタイムで呼吸および糖分解速度に及ぼす影響を観察する能力は、細胞外フラックス分析装置の重要な特徴である。センサーカートリッジのロードは、プロトコルの重要なステップの1つであり、慎重に実行する必要があります。すべての井戸に適切に注入されるようにするには、各一連のポートに背景ウェルを含む同じボリュームを含める必要があります。マルチチャネルピペットを使用してポートをロードするには、ある程度の練習が必要ですが、可変性と読み込み時間が大幅に短縮されます。ポートローディングガイドを使用することを強くお勧めしますが、同時に注入するのは4つのポートのみです。また、ローディング中に、井戸の増加量を補うために注入量が徐々に増加することを理解することも重要です。センサーカートリッジのロード中に、チップをポートに完全に挿入しないことが重要です。これは、ポートオリフィスを介して注入溶液を早期にプッシュする可能性があります。この方法を確立している間、精子に液体を注入すると、好ましくない注射アーティファクトが発生することがわかりました。最初の注射は最大の注射アーティファクトを引き起こすので、プロトコルの開始時にすべての井戸に精子バッファーを含む模擬注射を含めました。
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Disclosures
著者たちは何も開示する必要はない。
Acknowledgments
著者らは、ロックフェラーハイスループットと分光リソースセンターのラヴォワジエ・ラモス・エスピリトゥ博士の支援を認めたい。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| 2-Deoxy-D-glucose | Sigma-Aldrich | D8375 | 2-DG |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I7018 | IBMX; prepare a 500 mM stock solution in DMSO (111.1 mg/ml) and store in small aliquots |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | AntA; prepare a 5 mM stock solution in DMSO (2.7 mg/ml) and store in small aliquots |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A1470 | BSA |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | CaCl2 |
| Concanacalin A, Lectin from Arachis hypogaea (peanut) | Sigma-Aldrich | L7381 | ConA |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| Isothesia | Henry Schein Animal Health | 1169567761 | Isoflurane |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M2643 | MgSO4 |
| N6,2'-O-Dibutyryladenosine 3',5'-cyclic monophosphate sodium salt | Sigma-Aldrich | D0627 | db-cAMP |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | KCl |
| Potassium dihydrogen phosphate | Sigma-Aldrich | P5655 | KH2PO4 |
| Rotenone | Cayman Chemical Company | 13995 | Rot; prepare a 5 mM stock solution in DMSO (2mg/ml) and store in small aliquots |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | NaHCO3- |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | NaCl |
| Equipment and materials | |||
| 12 channel pipette 10-100 μL | eppendorf | ES-12-100 | |
| 12 channel pipette 50-300 μL | vwr | 613-5257 | |
| 37 °C, non-CO2 incubator | vwr | 1545 | |
| 5 mL cetrifuge tubes | eppendorf | 30119380 | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | vwr | 76211-286 | |
| Centrifuge with plate adapter | Thermo Scientific | IEC FL40R | |
| Dissection kit | World Precision Instruments | MOUSEKIT | |
| Inverted phase contrast microscope with 40X objective | Nikon | ||
| OctaPool Solution Reservoirs, 25 ml, divided | Thomas Scientific | 1159X93 | |
| OctaPool Solution Reservoirs, 25 mL, divided | Thomas Scientific | 1159X95 | |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | ||
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent | 102416-100 | Also sold as XFe96 FluxPak mini (102601-100) with 6 instead of 18 cartidges. |
References
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