Summary
Мы описываем применение внеклеточного анализатора потока для мониторинга изменений гликолиза в режиме реального времени и окислительного фосфорилирования во время конденсации спермы мыши.
Abstract
Сперматозоиды приобретают способность к оплодотворению в женском репродуктивном тракте в процессе, известном как емкости. Процессы, связанные с конденсацией, требуют энергии. Остается продолжающаяся дискуссия об источниках генерации АТФ, который питает прогрессивную подвижность спермы, емкости, гиперактивации и акросома реакции. Здесь мы описываем применение внеклеточного анализатора потока как инструмент для анализа изменений в энергетическом метаболизме во время конденсации спермы мыши. Используя Hq- и O2- чувствительные фторофоры, этот метод позволяет контролировать гликолиз и окислительный фосфорилирование в режиме реального времени в не-конденсированных против емкисперма спермы. Использование этого анализа в присутствии различных энергетических субстратов и/или фармакологических активаторов и/или ингибиторов может дать важное представление о вкладе различных метаболических путей и пересечении сигнальных каскадов и метаболизма во время конденсации спермы.
Introduction
Применение масс-спектрометрии произвело революцию в изучении метаболизма. Целенаправленное метаболическое профилирование и метаболомическое отслеживание позволяют точно контролировать изменения в энергетическом метаболизме. Тем не менее, выполнение метаболомики успешно требует обширной подготовки, опытный персонал, и дорогие, высокочувствительные масс-спектрометры не легко доступны для каждой лаборатории. В последние годы, используя внеклеточный анализатор потока, таких как Seahorse XFe96 стал популярным в качестве суррогатного метода для измерения изменений в энергетическом метаболизме в различных типах клеток1,2,3,4.
Сперма являются узкоспециализированными мотильные клетки; чья задача состоит в том, чтобы доставить отцовский геном к яйцеклетке. Сперматозоиды, покидающие мужской репродуктивный тракт после эякуляции, по-прежнему функционально незрелы и не могут оплодотворить яйцеклетки, потому что они не могут проникнуть в облачения яйцеклеток. Сперма приобретает компетенцию по оплодотворению, поскольку они проходят через женский репродуктивный тракт в процессе созревания, известном как конденсация6,7. Свежеэякуляция сперма или сперма, расчлененные из кауда эпидидимис может быть конденсирован в пробирке путем инкубации в определенных емчечных носителях, содержащих Ca2 ", бикарбонат (HCO3-) или клеточной проницаемой аналоге cAMP (например, dibutyryl-cAMP), принимая холестерин (например, буйный сывороточный альбомин, BSA) и источник энергии (например, глюкоза). Во время емкости, спермаизменить их шаблон подвижности в асимметричный флагельер бить, представляющий режим плавания называется гиперактивации8,9, и они становятся компетентными пройти акросома реакции7, где протеолитических ферментов освобождены, которые переваривают облачения яйцеклеток. Эти процессы требуют энергии, и аналогичные соматические клетки, сперматозоиды генерировать АТФ и других соединений высокой энергии с помощью гликолиза, а также митохондриальный цикл TCA и окислительного фосфорилирования (оксифос)10. Хотя многочисленные исследования показывают, что гликолиз необходим и достаточно для поддержки спермы емчебой11,12,13,14, вклад oxphos менее ясно. В отличие от других типов клеток, где гликолиз физически связан с циклом TCA, сперма сильно разобщена и, как полагают, поддерживает эти процессы в отдельных отсеках флагеллара: средний элемент концентратирует митохондриальную технику, в то время как ключевые ферменты гликолиза, как представляется, ограничены основной частью15,16. Это разобщенности приводит к продолжающейся дискуссии о том, pyruvate производится в основной кусок гликолизом может поддерживать митохондриальный oxphos в середине, и является ли АТФ производства oxphos в середине будет в состоянии рассеять достаточно быстро по длине flagellum для поддержки энергетических потребностей в дистальных частей основной части17,19. Существует также поддержка роли oxphos в емчеобразной сперме. Мало того, что oxphos более энергетически благоприятным, чем гликолиз, генерации 16 раз больше АТФ, чем гликолиз, но средний объем и митохондриальный содержание непосредственно коррелируют с репродуктивной пригодности у млекопитающих видов, которые демонстрируют большую степень конкуренции между мужчинами для товарищей20. Для решения этих вопросов требуются методы изучения относительного вклада гликолиза и оксифоса во время конденсации спермы.
Tourmente et al. применили 24-хорошо внеклеточный анализатор потока, чтобы сравнить энергетический метаболизм тесно связанных видов мышей со значительно отличаемыми параметрами производительности спермы21. Вместо того, чтобы сообщать о базальных значениях ECAR и OCR неконденционной спермы, здесь мы адаптируем их метод с помощью 96-хорошо внеклеточного анализатора потока потока для мониторинга изменений в энергетическом метаболизме во время емкостя спермы мыши в режиме реального времени. Мы разработали метод, который позволяет одновременно контролировать гликолиз и oxphos в режиме реального времени в сперме с избиением флагеллы в до двенадцати различных экспериментальных условиях путем измерения потока кислорода (O2) и протонов (H)(Рисунок 1A). В связи с разбивкой пировата лактата во время гликолиза и производства CO2 через Цикл TCA, неемные и емкие спермы экструдировать Hв анализ средств, которые обнаруживаются внеклеточного анализатора флюкса через H-чувствительные флюорофоры обездвижены к кончику зонда датчика. Параллельно, O2 потребление окислительного фосфорилирования обнаруживается через O2чувствительных флюорофоров обездвижены к тому же наконечник зонда (Рисунок 1B). Эффективное обнаружение высвобожденных Hи потребляемых O2 требует модифицированного буфера спермы с низкой буферной емкостью без бикарбоната или фенола красного цвета. Таким образом, чтобы вызвать емки при отсутствии бикарбоната, мы приняли использование клеточного аналога cAMP, введенного вместе с широкодиапазонным ингибитором PDE IBMX22. Три дополнительных независимых порта инъекций позволяют впрыски фармакологических активаторов и/или ингибиторов, что облегчает обнаружение в режиме реального времени изменений в клеточном дыхании и скорости гликолиза в связи с экспериментальными манипуляциями.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Сперма тона собрана у 8-16-недельных мышей CD-1. Эксперименты на животных были одобрены Комитетом по институциональному уходу и использованию животных Вейла Корнелла (IACUC).
1. День до ассеидов
-
Приготовление сенсорного картриджа и калибровщика внеклеточного анализаля потока
- Для увлажнения картриджа датчика, удалить картридж датчика из XFe96 Extracellular Flux Assay Kit и поместить картридж датчика с ног на голову рядом с утилитой пластины.
- Заполните резервуар раствора 25 мл двойной дистиллированной H2O с помощью многоканального пипетки, добавьте 200 Л Л H2O к каждой скважине утилиты пластины. Поместите картридж датчика обратно в утилиту пластины и инкубировать на ночь в 37 КК не-CO2 инкубатора.
ПРИМЕЧАНИЕ: Картридж должен быть гидратированных, по крайней мере 4 ч. - Aliquot 25 мл внеклеточного анализатора потока калибруется в 50 мл конической трубки и инкубировать его на ночь в 37 КС без CO2 инкубатора.
-
Приготовление микроплит с покрытием ConA
- Растворите 2,5 мг ConA в 5 мл двойной дистиллированной H2O, чтобы подготовить 0,5 мг/мл (w/v) бульон.
- Используя многоканальный пипетку, заполните каждую скважину внеклеточного анализатора потока 96-ну с 50 л раствора 0,5 мг/мл. Оставьте крышку открытой и дайте пластине высохнуть на ночь при комнатной температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: Несколько пластин могут быть покрыты одновременно и храниться при 4 градусах По Цельсию в течение четырех недель до готовности к использованию.
-
Подготовка буфера спермы
- Подготовьте 250 мл внеклеточного флюс-анализатора TYH с низким HEPES, содержащим 138 мМ NaCl, 4,7 мм KCl, 1,7 мм CaCl2, 1,2 мМ KH2PO4, 1,2 мМ MgSO4, 5,6 мм глюкозы, и 1 мМ HEPES. Нагрейте буфер до 37 градусов по Цельсию и отрегулируйте рН до 7,4.
2. День асссея
- Подготовка к калибровке картриджа
- Замените H2O в утилите пластины с 200 зл и l калибранта XF на скважину и инкубировать, по крайней мере 1 ч в не-CO237 C инкубатора.
ПРИМЕЧАНИЕ: Вместо калиброванного, стерильной фильтрованного PBS, рН 7.4 может быть использован. - Нагрейте 50 мл буфера TYH при температуре 37 градусов по Цельсию.
- Замените H2O в утилите пластины с 200 зл и l калибранта XF на скважину и инкубировать, по крайней мере 1 ч в не-CO237 C инкубатора.
- Создание шаблона волны для внеклеточного анализатора потока
- Включите внеклеточный анализатор потока и позвольте температуре стабилизироваться до 37 градусов по Цельсию.
- Откройте волновое программное обеспечение и разработайте новый шаблон, открыв пустой шаблон (см. Дополнительный файл 1,шаблон волны).
- Откройте вкладку определений группы. Определите медиа-информацию assay как TYH; рН 7.4 и тип клетки как сперма мыши, выходят стратегии впрыски и pretreatments пустые. Создание различных групп для каждого состояния асссея; в этом примере, есть 6 различных групп (TYH, TYH и db-cAMP/IBMX, 2-DG, 2-DG, db-cAMP/IBMX, Ant/Rot, Ant/Rot dibutyryl cAMP (db-cAMP) и 3-изобутил-1-метилксантин (IBMX) для индуцирования, 2-дезоксиглюкозы (2-DG) в качестве ингибитора гликолиза, антимицина А (анта) и ротенона (гнили) в качестве ингибитора III и комплекса I электросетевого транспорта.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для учета изменчивости между скважинами, по крайней мере 7-8 скважин на состояние должно быть измерено параллельно. - Откройте вкладку карты плиты и определите карту пластины, назначив группы к определенным скважинам.
ПРИМЕЧАНИЕ: Четыре угловые скважины (A1, A12, H1, H12) будут заполнены буфером TYH (без спермы) и позже будут использованы для фонового вычитания. - Откройте вкладку Протокола, добавьте 4 различных цикла измерения, выберите соответствующий порт и отсваивайте детали измерения(рисунок 2, таблица 1). Выделите меру после инъекции и не выделите равновесие.
- Сохраните шаблон ассеи, заполните резюме проекта и определите место сохранения для файла результатов.
- Приготовление соединений для загрузки в сенсорный картридж
- Приготовьте 2 мл 50 мм db-cAMP, растворив 9,8 мг соединения в буфере TYH и добавьте IBMX к конечной концентрации 5 мМ.
ПРИМЕЧАНИЕ: IBMX имеет тенденцию к осадок после того, как разбавленва в буфере TYH. Осадки могут быть растворены путем вихря и инкубации раствора TYH/db-cAMP/IBMX в тепловом блоке 37 градусов по Цельсию в течение 5 мин. - Приготовьте 1 мл 500 мМ 2-DG, растворив 82,1 мг соединения в буфере TYH.
- Приготовьте 1 мл из 5 мкм AntA/Rot, разбавив оба препарата в буфере TYH.
ПРИМЕЧАНИЕ: Соединения разбавляют сяречными 10 раз путем инъекций в картридж внеклеточного анализатора потока; поэтому убедитесь, что инъекционные растворы в 10 раз более концентрированы.
- Приготовьте 2 мл 50 мм db-cAMP, растворив 9,8 мг соединения в буфере TYH и добавьте IBMX к конечной концентрации 5 мМ.
- Изоляция мышиной спермы
- Анестезия 3 мышей мужского пола между 8 и 16 недель по изофлуран и принести в жертву мышей шейки матки дислокации после того, как не ответ на ноге щипать был обнаружен. Удалите кауда эпидидимиды и ваза поминания.
- Поместите каждую кауду в 500 л предогретого буфера TYH в 24-ну хорошо пластины хорошо, обездвижить кауда на дно пластины с помощью пары щипцов и открыть ткань, сделав 5-7 небольших разрезов с пером ножницы.
- Перенесите пластину сразу в инкубатор без CO2 37 градусов по Цельсию и дайте сперме разойтись в течение 15 минут.
- Загрузка сенсорного картриджа
- Два направляющих сярприза для портов A и D и портов B и C предусмотрены в комплекте Extracellular Flux. Для загрузки определенного порта снимите крышку с картриджа датчика и выровняем букву соответствующего руководства по загрузке порта с верхним левым углом картриджа. Во время инъекций, используйте кончики пальцев не инъекционных стороны держать порт погрузки руководство на месте и вставить пипетки советы вертикально в порт загрузки направляющих отверстий.
- Порт A: Используя многоканальный пипетки, введите в каждый столбец 20 кЛ буфера TYH.
- Порт B: Введите 22 qL буфера TYH в столбец 1-4, введите 22 мЛ 500 мМ 2-DG в колонку 5-8, и 25 qL 5 мкм AntA/Rot в колонку 9-12.
- Порт C: Введите 25 юл буфера TYH в каждый столбец с нечетными числами, введите 25 мКм 10 мМ db-cAMP/ 500 мкм IBMX в каждый столбец с четными числами.
- Поместите картридж датчика с калибровочной пластиной в внеклеточный анализатор потока и начните анализ. Калибровка занимает 10 - 15 мин.
- Приготовление сперматозоидов
- Растворите 45 мг BSA в 15 мл буфера TYH (3 мг/мл w/v) и подготовьте три аликота из 3 мл раствора BSA/TYH каждый в 5 мл центрифуговых труб.
- Смешайте две сперматозоиды в одной центрифуге 1,5 мл, посчитайте сперму с помощью гематоцитометра и разбавьте сперму до концентрации 2 х 107 сперматозоидов/мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте вырезать пипетки советы для пипетки спермы, чтобы избежать повреждения клеток. - Centrifuge спермы в течение 3 мин на 700 х г,удалить супернатант и добавить 1 мл буфера TYH. Повторите шаг центрифугации, удалите супернатант и перенесите каждый аликот подвески спермы в одну центрифугу 5 мл с 3 мл BSA/TYH.
- Поместите 180 юл буфера TYH в каждый угол окон хорошо (A1, A12, H1, H12) пластины с покрытием ConA. Поместите 180 л сперматозоидов в каждый пустой колодец пластины с покрытием ConA (1,2 x 106 сперматозоидов/хорошо).
- Центрифуга пластины спермы на 250 х г в течение 1 мин, поверните пластину на 180 ", и центрифуга снова на 250 х г в течение 1 мин (самый низкий коэффициент торможения 1).
- Удалите калибровочную пластину с внеклеточного анализатора потока и добавьте сперматозоидную пластину. Продолжить асссе.
- Извлечение и анализ данных
- После завершения анализа удалите картридж, откройте файл результатов, щелкните вкладку Экспорт и экспортите завершенный запуск в виде файла GraphPad Prism(Дополнительный файл 2:Первичные данные, используемые для рисунка 3).
- Дублировать eCAR и OCR файл, нажав на новую вкладку, а затем Дубликат семьи ...
- Удалите первые 7 строк данных(рисунок 3B).
- Нормализация к точке данных перед инъекцией cAMP/IBMX путем вычитания строки 1. Нажмите на вкладку Анализ, затем на базовой строке И колонке математики: Выделите выбранную строку (ы): Первый ряд, Расчет: Коэффициент:Значение/Базовый унимыслеи подколонки: Игнорировать подколонку. Нажмите OK (Рисунок 3C).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Этот метод использует внеклеточный анализатор потока для мониторинга в реальном времени изменения в скорости гликолиза и oxphos во время емки спермы мыши. На рисунке 4 показан образцовый эксперимент, в ходе котором сперма точника была вложена в присутствии глюкозы в качестве единственного энергетического субстрата и 2-DG и антимицина и ротенона в качестве фармакологических модуляторов. Энергетический субстрат в внеклеточном флюс-анализаторе TYH и фармакологических модуляторах может свободно побираться в зависимости от цели эксперимента. Сперма мыши, не входящая в конторитизированную мышь, в BSA/TYH была прикреплена к нижней части переходной микрокамеры с покрытием ConA через их голову. В этом примере базальные значения ECAR и OCR в среднем между всеми обнаруженными скважинами составляли 12,76 и 2,75 м/м и 23,64 и 2,78 пм.ч./мин, соответственно.
После инсценировки инъекции с буфером TYH, за которой последовала инъекция 2-DG и муравья/гнили для подавления гликолиза и окислительного фосфорилирования, соответственно, конденсация спермы была вызвана инъекцией db-cAMP/IBMX.
Репрезентативные результаты показывают, что при наличии глюкозы, емкость сопровождается 7-кратным увеличением внеклеточного уровня подкисления (ECAR), который ингибируется блокированием гликолиза с 2-DG(Рисунок 4A). Опанивные сперматозоиды показывают 20-кратное увеличение коэффициента потребления кислорода (OCR) по сравнению с не-конденсированной спермы(Рисунок 4B), демонстрируя, что мышь сперматозоидов повышения как гликолиза и окислительного фосфорилирования для поддержки увеличения спроса на энергию во время емачки. Рост eCAR во время емки спермы ингибируется ингибитором гликолиза 2-DG, но не зависит от окислительного фосфорилирования ингибиторы антимицин и ротенон (Рисунок 4C), указывая, что изменение в ECAR в основном обусловлено Hй релиз от гликолиза. Увеличение OCR, как и ожидалось, блокируется антимицином А и ротеноном(рисунок 4D),но он также ингибируется 2-DG (Рисунок 4B) показывая, что увеличение притока oxphos во время емки спермы зависит от гликолитической активности.
Рисунок 1: Принцип внеклеточного анализатора потока. (A) Из-за расщепления глюкозы лактата во время гликолиза и генерации CO2 через цикл TCA, изменения в гликолизе и быкфосе сопровождаются hи выделением во внеклеточные носители. Анализатор XFe96 обнаруживает эти изменения во внеклеточной концентрации Hи ECAR. Параллельно изменения в внеклеточной концентрации O2 в связи с потреблением O2 при окислительном фосфорилировании измеряются как OCR. Блокирование гликолиза с 2-дезоксиглюкозой (2-DG) или дыхание мворующими комплексом I и комплексом III ингибиторов ротенона и антимицина А показывает, какие метаболические пути поддерживают растущий спрос на энергию при емке спермы. (B) Мышь спермы прикрепляются через их головы на дно ConA покрытием микрокамер; их flagella свободно движущихся. В то время как изменения в внеклеточной концентрации Hи O2 обнаруживаются Hq- и O2-чувствительныхфлюорофоров обездвижены к датчику зонда, до четырех различных соединений могут быть введены последовательно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Схематическое представление образцового эксперимента. Изменения в ECAR (mpH/min) и OCR (pmol O 2/min) обнаруживаются в неконденционизированной и емкостирующей сперме с помощью внеклеточного анализатора потока. Цикл 1: Базальные значения ECAR и OCR. Циклы 2-5: Стабилизация системы после инъекции макета TYH. Циклы 6-8: Инкубация наркотиков. Циклы 9-27: Конденсация спермы. Стрелки указывают на инъекции. 2-DG: окончательная концентрация 50 мМ, AntA/Rot: конечная концентрация 0,5 мкм, db-cAMP: окончательная концентрация 1 мМ, IBMX: окончательная концентрация 500 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть более крупную версию этой цифры.
Рисунок 3: Анализ данных. (A) Необработанные данные об изменениях в ECAR во время емки спермы мыши. (B) Данные после удаления первых 7 точек данных. (C) Данные нормализовались до точки данных перед инъекцией cAMP/IBMX. Данные отображаются как средние 7-8 скважин, а впрыски S.E.M. показаны со стрелкаю. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Изменения гликолиза и окислительного фосфорилирования во время конденсации спермы мыши. (A) Нормализованная ECAR при неемном и емкостном сперме мыши при наличии и отсутствии 50 мМ 2-DG. (B) Нормализованный OCR в не-конденсированной и емкой мышиной спермы в присутствии и отсутствии 50 мМ 2-DG. (C) Нормализованная ECAR в не-конденсированной и емкой мышиной спермы в присутствии и отсутствии 0,5 мкм антимицина А и ротенона. (D) Нормализованный OCR в не-конденсированной и емкой мышиной спермы в присутствии и отсутствии 0,5 мкм антимицина А и ротенона. Данные отображались как средние s.E.M, нормализованные к точке данных перед инъекцией db-cAMP/IBMX; n No 6. Инъекции указаны стрелой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Порт | Количество циклов | Смешайте (мин) | Подождите (мин) | Мера (мин) | |
| A: Базаль ECAR/OCR | нет порта | 1 | 2:00 | 0:00 | 3:00 |
| B: Инъекция мока | 1 | 4 | 2:00 | 0:00 | 3:00 |
| C: Инъекция наркотиков | 2 | 3 | 2:00 | 0:00 | 3:00 |
| D: Емпа | 3 | 18 | 2:00 | 0:00 | 3:00 |
Таблица 1: Подробная информация о измерениях.
Дополнительная диаграмма 1: Емкочение спермы мыши во внеклеточном флюс-анализаторе TYH буфера. Фосфорилирование остатков тирозина спермы мыши, обнаруженных в разных временных точках во время емки (0 - 90 мин) после инкубации в (A) TYH с 25 мм HCO3-, 3 мг/мл BSA и 20 мм HEPES или в (B) Экстраклеточный анализатор флюкса TYH с 5 мм 500 ММ IBMX и 1 мМ HEPES, обнаруженные с антителом к фосфотирозину. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Дополнительный файл 1: Шаблон проверки волны для обнаружения изменений в гликолизе и окислительном фосфориле при емке спермы мыши. Программное обеспечение настольного на волне можно скачать бесплатно после заполнения регистрационной формы(www.agilent.com/en/products/cell-analysis/cell-analysis-software/data-analysis/wave-desktop-2-6)и установить на окнах 7, 8 или 10, (Mac OSx 10.11 (или выше) с Parallels 12 (или выше). Таким образом, волновые шаблоны могут быть созданы независимо от внеклеточного анализатора потока, экспортируются, а затем импортируются в волновое программное обеспечение любого внеклеточного анализатора потока. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть этот файл (Право нажмите, чтобы скачать).
Дополнительный файл 2: Граф колодки призма файл экспортируется из волнового программного обеспечения с образцовым анализом данных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть этот файл (Право нажмите, чтобы скачать).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Потеря емкостя спермы при отсутствии определенных метаболических субстратов или критических метаболических ферментов выявила энергетический обмен в качестве ключевого фактора, поддерживающего успешное оплодотворение. Метаболический переключатель во время активации клеток является устоявшейся концепцией в других типах клеток, однако, мы только начинаем понимать, как сперматозоиды адаптируют свой метаболизм к растущему спросу на энергию во время емки. Используя внеклеточный анализатор потока, мы разработали легко применимый инструмент для мониторинга изменений гликолиза и окислительного фосфорилирования в режиме реального времени во время емости спермы. Обнаружение изменений в внеклеточных Hи O2 с флюорофорами, обездвиженным к датчику зонда является минимально инвазивным и четыре индивидуально управляемых порта инъекций позволяют манипуляции с фармакологическими ингибиторами или активаторами в определенных временных точках до или во время процесса емки. Этот протокол дает только один пример эксперимента конденсации спермы мыши. Для упрощения интерпретации результатов мы выбрали шоу образцовый эксперимент, где глюкоза была использована в качестве единственного источника энергии. Условия изменяются в зависимости от цели эксперимента, и до 12 различных условий (т.е. различные источники энергии, такие как глюкоза против глюкозы и пирувата) могут быть измерены параллельно. Кроме того, четыре независимых порта инъекций позволяют впрыски фармакологических активаторов и/или ингибиторов в любой нужный момент времени до или во время емки. Это открывает возможность использовать внеклеточный анализатор потока в качестве полувысокой пропускной скрининговой системы. Подобно сперме мыши, в других видах, как человек или бык он по-прежнему загадочным, как сперма изменить их метаболизм во время емкостя. Протокол можно легко адаптировать; Таким образом, мы рекомендуем оптимизировать концентрацию спермы каждый раз, прежде чем начать настоящий эксперимент.
Самое большое ограничение протокола заключается в том, что высококачественные результаты могут быть достигнуты только при отсутствии бикарбоната. Бикарбонат в семенной жидкости является физиологическим сигналом, который инициирует емки спермы сигнализации каскада после эякуляции. Бикарбонат активирует растворимый аденилил циклаз (sAC; ADCY10), который катализает преобразование АТФ в cAMP23. Увеличение cAMP затем диски сигнальный каскад опосредованно белка Киназы А, что в конечном итоге приводит к вниз по течению тирозина фосфорилирования целевых белков (например, ионные каналы, метаболические ферменты, и структурные белки24,25). Это ограничение против бикарбоната преодолевается путем введения продукта бикарбоната активированного sAC, cAMP. Мы используем 5 мМ клеточной проницаемой cAMP аналоговой db-cAMP параллельно с ингибитором фосфодиэстеразы IBMX, который предотвращает быструю деградацию дбо-CAMP фосфодиестеразами. Эта комбинация эффективно инициирует cAMP-регулируемой емки сигнализации пути после sAC активации с аналогичным кинетической, как бикарбонат(Дополнительный рисунок 1). Параллельно с бикарбонатом, принимая холестерин (например, BSA) используется для пробирки кончатка свежеэкуляции спермы или спермы расчленены из кауда эпидидимис. Альбумин не может быть введен, потому что он забивает порт инъекций и, следовательно, должен быть добавлен в буфер спермы перед покрытием клеток. Выполнение эксперимента в присутствии или отсутствии BSA показало, что увеличение ECAR и OCR во время емки спермы не зависит от холестерина принимает. Однако наличие BSA в буфере спермы уменьшило колебания в обнаруженных значениях ECAR и OCR между различными скважинами и экспериментами; Таким образом, мы настоятельно рекомендуем включить BSA в буфер спермы для увеличения воспроизводимости.
Изолировать сперму от эпидидимиса кауда приводит к загрязнению спермы эпидидимальной жидкостью. Чтобы избежать искусственных результатов из-за компонентов семенной жидкости, мы рекомендуем мыть сперму два раза, прежде чем использовать их для эксперимента. Концентрация спермы и покрытие является еще одним критическим фактором, определяющим успех эксперимента. Для получения надежных результатов производитель рекомендует, чтобы начальные значения ECAR превышали 10, а значения OCR - больше 20. Концентрация спермы, используемая в этом протоколе, была оптимизирована таким образом, что средние базальные значения ECAR и OCR из 7-8 скважин, измеренных на состояние, превышают 10 и 20, соответственно. Свободно движущаяся сперматозоиды нарушают обнаружение изменений во внеклеточном Hи O2. Таким образом, очень важно придерживаться всех сперматозоидов с головой на дно пластины. Мы обнаружили успех придерживаясь спермы, покрывая пластины с ConA, растительный лектин, который специально взаимодействует с внешней акросомальной мембраны и обычно используется для акросомаанализы 26, и мягко спиннинг пластины (см. шаг 2.7.3). С помощью этого метода, спермалоиты локализованы в нижней части колодца исключительно через голову, чтобы они могли по-прежнему свободно перемещать их flagella и изменить их flagellar избиение картины во время емки.
Сперма постоянно выдавливаетH и O2 в обоих, не-конденсированного и емкой состояния. Чтобы определить начальные ECAR и OCR как можно точнее, очень важно начать эксперимент как можно быстрее после последнего шага стирки. Это может быть достигнуто путем загрузки картриджа датчика в то время как сперма плавают, и, начиная метод в внеклеточном анализаторпотока потока перед первым шагом стирки. Калибровка прибора занимает примерно то же время, что и мытье и покрытие клеток и спиннинг пластины. Производитель рекомендует фазу равновесия, чтобы система стабилизироваться до того, как будет измерена первая реальная точка данных. Поскольку протокол включает в себя 8 циклов измерения до начала емки, чтобы сэкономить время, шаг равновесия исключается из этого протокола.
Способность вводить растворы во время анализа и наблюдать их воздействие на дыхание и гликолитический курс в режиме реального времени является ключевой особенностью внеклеточного анализатора потока. Загрузка картриджа датчика является одним из важнейших шагов в протоколе и должна осуществляться осторожно. Для обеспечения надлежащей запрыгивания во все скважины каждая серия портов должна содержать один и тот же объем, включая фоновые скважины. Загрузка портов многоканальным пипеткой требует определенной практики, но значительно снижает изменчивость и время загрузки. Мы настоятельно рекомендуем использовать руководство по загрузке порта, но вводить только четыре порта одновременно. Важно также понимать, что во время погрузки объемы впрыска постепенно увеличиваются, чтобы компенсировать увеличивающийся объем скважины. При загрузке сенсорного картриджа важно не вставлять кончики в порт полностью. Это может преждевременно протолкнуть решение инъекций через портовое обивку. При создании метода мы обнаружили, что инъекционные жидкости в сперму хорошо вызывает нежелательные артефакты инъекции, вероятно, из-за разбавления спермы в колодце и / или вытеснения спермы из скважины дно. Первая инъекция вызывает самый большой артефакт инъекции, поэтому мы включили макет инъекции с буфером спермы во все скважины в начале протокола.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы выразить поддержку д-ра Лавуазье Рамоса-Эспириту в Центре ресурсов Рокфеллера и спектроскопии.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| 2-Deoxy-D-glucose | Sigma-Aldrich | D8375 | 2-DG |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I7018 | IBMX; prepare a 500 mM stock solution in DMSO (111.1 mg/ml) and store in small aliquots |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | AntA; prepare a 5 mM stock solution in DMSO (2.7 mg/ml) and store in small aliquots |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A1470 | BSA |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | CaCl2 |
| Concanacalin A, Lectin from Arachis hypogaea (peanut) | Sigma-Aldrich | L7381 | ConA |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| Isothesia | Henry Schein Animal Health | 1169567761 | Isoflurane |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M2643 | MgSO4 |
| N6,2'-O-Dibutyryladenosine 3',5'-cyclic monophosphate sodium salt | Sigma-Aldrich | D0627 | db-cAMP |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | KCl |
| Potassium dihydrogen phosphate | Sigma-Aldrich | P5655 | KH2PO4 |
| Rotenone | Cayman Chemical Company | 13995 | Rot; prepare a 5 mM stock solution in DMSO (2mg/ml) and store in small aliquots |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | NaHCO3- |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | NaCl |
| Equipment and materials | |||
| 12 channel pipette 10-100 μL | eppendorf | ES-12-100 | |
| 12 channel pipette 50-300 μL | vwr | 613-5257 | |
| 37 °C, non-CO2 incubator | vwr | 1545 | |
| 5 mL cetrifuge tubes | eppendorf | 30119380 | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | vwr | 76211-286 | |
| Centrifuge with plate adapter | Thermo Scientific | IEC FL40R | |
| Dissection kit | World Precision Instruments | MOUSEKIT | |
| Inverted phase contrast microscope with 40X objective | Nikon | ||
| OctaPool Solution Reservoirs, 25 ml, divided | Thomas Scientific | 1159X93 | |
| OctaPool Solution Reservoirs, 25 mL, divided | Thomas Scientific | 1159X95 | |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | ||
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent | 102416-100 | Also sold as XFe96 FluxPak mini (102601-100) with 6 instead of 18 cartidges. |
References
- Wu, M., et al. Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 292 (1), C125-C136 (2007).
- Amo, T., Yadava, N., Oh, R., Nicholls, D. G., Brand, M. D. Experimental assessment of bioenergetic differences caused by the common European mitochondrial DNA haplogroups H and T. Gene. 411 (1-2), 69-76 (2008).
- Choi, S. W., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G. Bioenergetic analysis of isolated cerebrocortical nerve terminals on a microgram scale: spare respiratory capacity and stochastic mitochondrial failure. Journal of Neurochemistry. 109 (4), 1179-1191 (2009).
- de Groof, A. J., et al. Increased OXPHOS activity precedes rise in glycolytic rate in H-RasV12/E1A transformed fibroblasts that develop a Warburg phenotype. Molecular Cancer. 8, 54 (2009).
- Chao, L. C., et al. Insulin resistance and altered systemic glucose metabolism in mice lacking Nur77. Diabetes. 58 (12), 2788-2796 (2009).
- Chang, M. C. Fertilizing capacity of spermatozoa deposited into the fallopian tubes. Nature. 168 (4277), 697-698 (1951).
- Austin, C. R., Bishop, M. W. Role of the rodent acrosome and perforatorium in fertilization. Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 149 (935), 241-248 (1958).
- Ishijima, S., Baba, S. A., Mohri, H., Suarez, S. S. Quantitative analysis of flagellar movement in hyperactivated and acrosome-reacted golden hamster spermatozoa. Molecular Reproduction and Development. 61 (3), 376-384 (2002).
- Suarez, S. S. Control of hyperactivation in sperm. Human Reproduction Update. 14 (6), 647-657 (2008).
- Goodson, S. G., Qiu, Y., Sutton, K. A., Xie, G., Jia, W., O'Brien, D. A. Metabolic substrates exhibit differential effects on functional parameters of mouse sperm capacitation. Biology of Reproduction. 87 (3), 75 (2012).
- Travis, A. J., et al. Functional relationships between capacitation-dependent cell signaling and compartmentalized metabolic pathways in murine spermatozoa. Journal of Biological Chemistry. 276 (10), 7630-7636 (2001).
- Urner, F., Leppens-Luisier, G., Sakkas, D. Protein tyrosine phosphorylation in sperm during gamete interaction in the mouse: the influence of glucose. Biology of Reproduction. 64 (5), 1350-1357 (2001).
- Danshina, P. V., et al. Phosphoglycerate kinase 2 (PGK2) is essential for sperm function and male fertility in mice. Biology of Reproduction. 82 (1), 136-145 (2010).
- Miki, K., et al. Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase-S, a sperm-specific glycolytic enzyme, is required for sperm motility and male fertility. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (47), 16501-16506 (2004).
- Mori, C., et al. Mouse spermatogenic cell-specific type 1 hexokinase (mHk1-s) transcripts are expressed by alternative splicing from the mHk1 gene and the HK1-S protein is localized mainly in the sperm tail. Molecular Reproduction and Development. 49 (4), 374-385 (1998).
- Westhoff, D., Kamp, G. Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase is bound to the fibrous sheath of mammalian spermatozoa. Journal of Cell Science. 110 (15), 1821-1829 (1997).
- Nevo, A. C., Rikmenspoel, R. Diffusion of ATP in sperm flagella. Journal of Theoretical Biology. 26 (1), 11-18 (1970).
- Adam, D. E., Wei, J. Mass transport of ATP within the motile sperm. Journal of Theoretical Biology. 49 (1), 125-145 (1975).
- Tombes, R. M., Shapiro, B. M. Enzyme termini of a phosphocreatine shuttle. Purification and characterization of two creatine kinase isozymes from sea urchin sperm. Journal of Biological Chemistry. 262 (33), 16011-16019 (1987).
- Gomendio, M., Tourmente, M., Roldan, E. R. Why mammalian lineages respond differently to sexual selection: metabolic rate constrains the evolution of sperm size. Proceedings of the Royal Society of Biological Sciences. 278 (1721), 3135-3141 (2011).
- Tourmente, M., Villar-Moya, P., Rial, E., Roldan, E. R. Differences in ATP generation via glycolysis and oxidative phosphorylation and relationships with sperm motility in mouse species. Journal of Biological Chemistry. 290 (33), 20613-20626 (2015).
- Visconti, P. E., et al. Capacitation of mouse spermatozoa. II. Protein tyrosine phosphorylation and capacitation are regulated by a cAMP-dependent pathway. Development. 121 (4), 1139-1150 (1995).
- Buck, J., Sinclair, M. L., Schapal, L., Cann, M. J., Levin, L. R. Cytosolic adenylyl cyclase defines a unique signaling molecule in mammals. PNAS. 96 (1), 79-84 (1999).
- Visconti, P. E., Bailey, J. L., Moore, G. D., Pan, D., Olds-Clarke, P., Kopf, G. S. Capacitation of mouse spermatozoa. I. Correlation between the capacitation state and protein tyrosine phosphorylation. Development. 121 (4), 1129-1137 (1995).
- Morgan, D. J., et al. Tissue-specific PKA inhibition using a chemical genetic approach and its application to studies on sperm capacitation. PNAS. 105 (52), 20740-20745 (2008).
- Lybaert, P., Danguy, A., Leleux, F., Meuris, S., Lebrun, P. Improved methodology for the detection and quantification of the acrosome reaction in mouse spermatozoa. Histology and Histopathology. 24 (8), 999-1007 (2009).
