Summary
Describimos la aplicación de un analizador de flujo extracelular para monitorear los cambios en tiempo real en la glucólisis y la fosforilación oxidativa durante la capacitación del esperma del ratón.
Abstract
Los espermatozoides mamíferos adquieren capacidad de fertilización en el tracto reproductivo femenino en un proceso conocido como capacitación. Los procesos asociados a la capacitación requieren energía. Sigue habiendo un debate en curso sobre las fuentes que generan el ATP que alimenta la motilidad progresiva de los espermatozoides, la capacitación, la hiperactivación y la reacción acrosoma. Aquí, describimos la aplicación de un analizador de flujo extracelular como una herramienta para analizar los cambios en el metabolismo energético durante la capacitación del esperma del ratón. Usando fluoróforos sensibles H+- y O2,este método permite monitorear la glucólisis y la fosforilación oxidativa en tiempo real en espermatozoides no capacitados frente a capacitantes. El uso de este ensayo en presencia de diferentes sustratos energéticos y/o activadores farmacológicos y/o inhibidores puede proporcionar información importante sobre la contribución de diferentes vías metabólicas y la intersección entre las cascadas de señalización y el metabolismo durante la capacitación de espermatozoides.
Introduction
La aplicación de la espectrometría de masas ha revolucionado el estudio del metabolismo. El perfilado metabólico dirigido y el rastreo metabolómico permiten un seguimiento preciso de los cambios en el metabolismo energético. Sin embargo, realizar metabolómicas requiere con éxito una amplia formación, personal experimentado y espectrómetros de masas caros y altamente sensibles que no están fácilmente disponibles para todos los laboratorios. En los últimos años, el uso de un analizador de flujo extracelular, como el Seahorse XFe96 se ha popularizando como método sustituto para medir los cambios en el metabolismo energético en varios tipos de células1,2,3,4,5.
Los espermatozoides son células móviles altamente especializadas; cuya tarea es entregar el genoma paterno al ovocitos. Los espermatozoides que salen del tracto reproductivo masculino después de la eyaculación siguen siendo funcionalmente inmaduros y no pueden fertilizar el ovocitos porque son incapaces de penetrar las vestiduras de los ovocitos. Los espermatozoides adquieren competencia de fertilización a medida que transitan por el tracto reproductivo femenino en un proceso de maduración conocido como capacitación6,7. Los espermatozoides o espermatozoides recién eyaculados diseccionados del epidídimo cauda pueden ser capacitados in vitro por incubación en medios de capacitación definidos que contengan Ca2+,bicarbonato (HCO3-) o un análogo de campo permeable a las células (por ejemplo, dibutiryl-cAMP), un aceptador de colesterol (por ejemplo, albúmina de suero de la bolina bovina, BSA) y una fuente de energía (por ejemplo, glucosa). Durante la capacitación, los espermatozoides modifican su patrón de motilidad en un latido flagelante asimétrico, representando un modo de natación llamado hiperactivación8,9, y se vuelven competentes para someterse a la reacción acrosomesa7, donde se liberan enzimas proteolíticas que digieren las vestiduras de los ovocitos. Estos procesos requieren energía, y similar a las células somáticas, espermatozoides generan ATP y otros compuestos de alta energía a través de la glucólisis, así como ciclo de TCA mitocondrial y fosforilación oxidativa (oxfos)10. Mientras que múltiples estudios demuestran que la glucólisis es necesaria y suficiente para apoyar la capacitación de espermatozoides11,12,13,14, la contribución de la oxfos es menos clara. A diferencia de otros tipos de células donde la glucólisis está físicamente acoplada al ciclo TCA, los espermatozoides están altamente compartimentados y se cree que mantienen estos procesos en compartimentos flagelantes separados: la pieza media concentra la maquinaria mitocondrial, mientras que las enzimas clave de la glucólisis parecen limitarse a la pieza principal15,16. Esta compartimentación da lugar a un debate en curso sobre si el piruvato producido en la pieza principal por glicólisis puede soportar oxfos mitocondriales en la pieza media, y si la ATP producida por los buperos en la pieza media sería capaz de difundirse lo suficientemente rápidamente a lo largo de la longitud del flagelo para apoyar los requisitos energéticos en partes distales de la pieza principal17,18,19. También hay apoyo de un papel para el oxfos en la capacitación de espermatozoides. El oxfos no sólo es más favorable energéticamente que la glucólisis, generando 16 veces más ATP que la glucólisis, sino que el volumen de la pieza media y el contenido mitocondrial están directamente relacionados con la aptitud reproductiva en las especies de mamíferos que presentan mayores grados de competencia entre los machos por las parejas20. Abordar estas preguntas requiere métodos para examinar las contribuciones relativas de la glucólisis y el oxfos durante la capacitación de los espermatozoides.
Tourmente et al. aplicaron un analizador de flujo extracelular de 24 polos para comparar el metabolismo energético de especies de ratones estrechamente relacionadas con parámetros de rendimiento de espermatozoides significativamente diferentes21. En lugar de reportar los valores basales de ECAR y OCR de espermatozoides no capacitados, aquí, adaptamos su método usando un analizador de flujo extracelular de 96 polos para monitorear los cambios en el metabolismo energético durante la capacitación de espermatozoides de ratón en tiempo real. Desarrollamos un método que permite monitorear simultáneamente la glucólisis y el oxfos en tiempo real en esperma con la batida flagelos en hasta doce condiciones experimentales diferentes midiendo el flujo de oxígeno (O2)y protones (H+) (Figura 1A). Debido a la descomposición del piruvato para lactato durante la glucólisis y la producción de CO2 a través del ciclo TCA, los espermatozoides no capacitados y capacitados extruyen H+ en los medios de ensayo que son detectados por el analizador de flujo extracelular a través de fluoróforos sensibles A+-inmovilizados a la punta de la sonda de un cartucho de sensor. Paralelamente, el consumo de O2 por fosforilación oxidativa se detecta a través de fluoróforos sensibles a O2inmovilizados a la misma punta de sonda(Figura 1B). La detección efectiva del H+ liberado y o2 consumido requiere un búfer de espermatozoides modificado con baja capacidad de amortiguación sin bicarbonato o fenol rojo. Por lo tanto, para inducir la capacitación en ausencia de bicarbonato, adoptamos el uso de un campo analógico permeable a la célula inyectado junto con el inhibidor de PDE de amplio rango IBMX22. Tres puertos de inyección independientes adicionales permiten la inyección de activadores farmacológicos y/o inhibidores, lo que facilita la detección en tiempo real de los cambios en la respiración celular y la tasa de glucólisis debido a la manipulación experimental.
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Protocol
Los espermatozoides se recogen de ratones machos CD-1 de 8-16 semanas de edad. Los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC, por sus) de Weill Cornell Medicine.
1. Día antes del ensayo
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Preparación del cartucho del sensor y calibrador del analizador de flujo extracelular
- Para hidratar el cartucho del sensor, retire el cartucho del sensor del kit de ensayo de flujo extracelular XFe96 y coloque el cartucho del sensor boca abajo junto a la placa de servicios públicos.
- Llene un depósito de solución con 25 ml de Doble Destilado H2O utilizando una pipeta multicanal, agregue 200 ml de H2O a cada pocal de la placa de servicio. Vuelva a colocar el cartucho del sensor en la placa de servicios públicos e incubar durante la noche en una incubadora de 37 oC que no seaCO2.
NOTA: El cartucho debe hidratarse durante al menos 4 horas. - Aliquot 25 ml del calibrador de flujo extracelular en un tubo cónico de 50 ml e incubarlo durante la noche en una incubadora no CO2 de 37oC.
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Preparación de microplacas recubiertas con ConA
- Disolver 2,5 mg de ConA en 5 ml de Doble destilado H2O para preparar un stock de 0,5 mg/ml (p/v).
- Con una pipeta multicanal, llene cada pocal de una placa de 96 polos de flujo extracelular con 50 ml de la solución de 0,5 mg/ml con A. Deje la tapa abierta y deje que la placa se seque durante la noche a temperatura ambiente.
NOTA: Se pueden recubrir varias placas de inmediato y almacenarse a 4 oC durante un máximo de cuatro semanas hasta que estén listas para su uso.
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Preparación del tampón de esperma
- Preparar 250 mL de analizador de flujo extracelular TYH tampón con HEPES bajos que contienen 138 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,7 mM CaCl2, 1,2 mM KH2PO4, 1,2 mM MgSO4, 5,6 mM de glucosa y 1 mM HEPES. Caliente el tampón a 37 oC y ajuste el pH a 7,4.
2. Día del ensayo
- Preparación para la calibración del cartucho
- Sustituya el H2O en la placa de servicios públicos por 200 ml de calibrador XF por pozo e incubar durante al menos 1 h en una incubadora no CO2 37 oC.
NOTA: En lugar de calibrador, PBS filtrado estérilmente, pH 7.4 se puede utilizar. - Calentar 50 mL de tampón TYH a 37oC.
- Sustituya el H2O en la placa de servicios públicos por 200 ml de calibrador XF por pozo e incubar durante al menos 1 h en una incubadora no CO2 37 oC.
- Generación de una plantilla de onda para el analizador de flujo extracelular
- Encienda el analizador de flujo extracelular y permita que la temperatura se estabilice a 37 oC.
- Abra el software de oleada y diseñe una nueva plantilla abriendo una plantilla en blanco (consulte Archivo suplementario 1, plantilla de oleada).
- Abra la pestaña Definiciones de grupo. Definir medios de ensayo como TYH; pH 7.4 y el tipo de célula como espermatozoides de ratón, deje las estrategias de inyección y los pretratamientos en blanco. Crear grupos diferentes para cada condición de ensayo; en este ejemplo, hay 6 grupos diferentes (TYH, TYH + db-cAMP/IBMX, 2-DG, 2-DG + db-cAMP/IBMX, Ant/Rot, Ant/Rot + db-cAMP/IBMX); dibutyryl cAMP (db-cAMP) y 3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) para inducir la capacitación, 2-desoxiglucosa (2-DG) como inhibidor de la glucólisis, antimicina A (antA) y rotenona (rotena) como inhibidor del complejo III y complejo I de la cadena de transporte de electrones.
NOTA: Para tener en cuenta la variabilidad entre los pozos, se deben medir paralelamente al menos 7-8 pozos por condición. - Abra la pestaña Mapa de placas y defina el mapa de placas asignando grupos a pozos específicos.
NOTA: Los cuatro pozos de esquina (A1, A12, H1, H12) se llenarán con tampón TYH (sin espermatozoides) y más tarde se utilizarán para la resta de fondo. - Abra la pestaña Protocolo, agregue 4 ciclos de medición diferentes, seleccione el puerto respectivo y edite los detalles de medición(Figura 2, Tabla 1). Resalte la medida después de la inyección y no resalte el equilibrio.
- Guarde la plantilla de ensayo, rellene el resumen del proyecto y defina la ubicación de guardado para el archivo de resultados.
- Preparación de compuestos para cargar en el cartucho del sensor
- Preparar 2 mL de 50 mM db-cAMP disolviendo 9,8 mg de compuesto en el búfer TYH y añadir IBMX a una concentración final de 5 mM.
NOTA: IBMX tiene la tendencia a precipitarse después de ser diluido en el búfer TYH. Los precipitados se pueden disolver vórtice e incubando la solución TYH/db-cAMP/IBMX en un bloque de calor de 37 oC durante 5 min. - Preparar 1 mL de 500 mM 2-DG disolviendo 82,1 mg de compuesto en tampón TYH.
- Preparar 1 mL de 5 m de AntA/Rot diluyendo ambos fármacos en el tampón TYH.
NOTA: Los compuestos se diluyen 10 veces por inyección en el cartucho analizador de flujo extracelular; por lo tanto, asegúrese de que las soluciones de inyección están 10 veces más concentradas.
- Preparar 2 mL de 50 mM db-cAMP disolviendo 9,8 mg de compuesto en el búfer TYH y añadir IBMX a una concentración final de 5 mM.
- Aislamiento de espermatozoides de ratón
- Anestesiar 3 ratones machos entre 8 y 16 semanas por isoflurano y sacrificar a los ratones por luxación cervical después de que no se detectó respuesta al pellizco del dedo del dedo del dedo. Retire las epididimides cauda y la deferentia vasa.
- Coloque cada cauda en 500 l de tampón TYH precalentado en un pozo de placa de 24 pocillos, inmovilice el cauda en la parte inferior de la placa usando un par de fórceps y abra el tejido haciendo 5-7 pequeñas incisiones con tijeras de plumas.
- Transfiera la placa inmediatamente a una incubadora no CO2 37 oC y deje que los espermatozoides se dispersen durante 15 minutos.
- Carga del cartucho del sensor
- El kit Extracellular Flux proporciona dos guías de carga de puertos para los puertos A y D y los puertos B y C. Para cargar un puerto específico, retire la tapa del cartucho del sensor y alinee la letra de la guía de carga del puerto correspondiente con la esquina superior izquierda del cartucho. Durante la inyección, utilice las yemas de los dedos de la mano no inyectable para mantener la guía de carga del puerto en su lugar e inserte las puntas de la pipeta verticalmente en los orificios de la guía de carga del puerto.
- Puerto A: Con una pipeta multicanal, inyecte 20 l del búfer TYH en cada columna.
- Puerto B: Inyectar 22 sL de tampón TYH en la columna 1-4, inyectar 22 ml de 500 mM 2-DG en la columna 5-8, y 25 l de 5 m anta/Rot en la columna 9-12.
- Puerto C: Inyecte 25 sL de búfer TYH en cada columna con números impares, inyecte 25 sL de 10 mM db-cAMP/ 500 m IBMX en cada columna con números pares.
- Coloque el cartucho del sensor con la placa de calibración en el analizador de flujo extracelular e inicie el ensayo. La calibración tarda de 10 a 15 minutos.
- Preparación de placas de esperma
- Disolver 45 mg de BSA en 15 ml de tampón TYH (3 mg/ml p/v) y preparar tres alícuotas de 3 ml de solución BSA/TYH cada una en tubos de centrífuga de 5 ml.
- Combine dos pozos de esperma cada uno en un tubo de centrífuga de 1,5 ml, cuente los espermatozoides usando un hematitómetro y diluya el esperma a una concentración de 2 x 107 espermatozoides/ml.
NOTA: Utilice puntas de pipeta cortadas para pipetear espermatozoides para evitar dañar las células. - Centrifugar el esperma durante 3 min a 700 x g,eliminar el sobrenadante y añadir 1 ml de tampón TYH. Repita el paso de centrifugación, retire el sobrenadante y transfiera cada alícuota de suspensión de espermatozoides a un tubo centrífugo de 5 ml con 3 ml de BSA/TYH.
- Coloque 180 l de tampón TYH en cada pozo de esquina (A1, A12, H1, H12) de una placa recubierta de ConA. Coloque 180 l de suspensión de espermatozoides en cada pozo vacío de la placa recubierta con consa (1,2 x 106 espermatozoides/pozo).
- Centrifugar la placa de esperma a 250 x g durante 1 min, girar la placa 180o y volver a centrifugar a 250 x g durante 1 min (velocidad de frenado más baja 1).
- Retire la placa de calibración del analizador de flujo extracelular y agregue la placa de esperma. Continúe el ensayo.
- Extracción y análisis de datos
- Después de finalizar el ensayo, retire el cartucho, abra el archivo de resultados, haga clic en la pestaña Exportar y exporte la ejecución completada como un archivo GraphPad Prism (Archivo suplementario 2:Datos de ejemplo primarios utilizados para la Figura 3).
- Duplica el archivo ECAR y OCR haciendo clic en la pestaña Nuevo y luego en la pestaña Duplicar familia... (Figura 3A).
- Elimine las primeras 7 filas de datos(Figura 3B).
- Normalice el punto de datos antes de la inyección de cAMP/IBMX por línea base restando la fila 1. Haga clic en la pestaña Analizar y, a continuación, en la ficha Eliminar línea base y columna matemáticas. Haga Click en Ok (Figura 3C).
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Representative Results
Este método utiliza un analizador de flujo extracelular para monitorear los cambios en tiempo real en la tasa de glucólisis y oxfos durante la capacitación del esperma del ratón. La Figura 4 muestra un experimento ejemplar donde los espermatozoides fueron capacitados en presencia de glucosa como el único sustrato de energía y 2-DG y antimicina y rotenona como moduladores farmacológicos. El sustrato de energía en el tampón de flujo extracelular TYH y los moduladores farmacológicos se pueden seleccionar libremente dependiendo del objetivo del experimento. Los espermatozoides de ratón no capacitados en BSA/TYH se unieron a la parte inferior de una microcámara transitoria recubierta de ConA a través de su cabeza. En este ejemplo, los valores basales de ECAR y OCR en promedio entre todos los pozos detectados fueron de 12,76 a 2,75 mpH/min y 23,64 a 2,78 pmol/min, respectivamente.
Después de una inyección simulada con tampón TYH, seguido de la inyección de 2-DG y hormiga/rot para inhibir la glucólisis y la fosforilación oxidativa, respectivamente, la capacitación de espermatozoides fue inducida por inyección de db-cAMP/IBMX.
Los resultados representativos muestran que, en presencia de glucosa, la capacitación va acompañada de un aumento de 7 veces en la tasa de acidificación extracelular (ECAR), que se inhibe bloqueando la glucólisis con 2-DG(Figura 4A). Los espermatozoides capacitados muestran un aumento de 20 veces en la tasa de consumo de oxígeno (OCR) en comparación con los espermatozoides no capacitados(Figura 4B),lo que demuestra que los espermatozoides de ratón mejoran la glucólisis y la fosforilación oxidativa para apoyar la creciente demanda de energía durante la capacitación. El aumento de ECAR durante la capacitación esperma es inhibido por el inhibidor de la glucólisis 2-DG, pero no afectado por los inhibidores de la fosforilación oxidativa antimicina A y rotenona(Figura 4C),lo que indica que el cambio en ECAR es impulsado principalmente por H+ liberación de glucólisis. El aumento de la OCR está, como se esperaba, bloqueado por la antimicina A y la rotenona(Figura 4D),pero también se inhibe por 2-DG(Figura 4B) revelando que el aumento de oxfos durante la capacitación esperma depende de la actividad glucolítica.
Figura 1: Principio del analizador de flujo extracelular. (A) Debido a la descomposición de la glucosa a lactato durante la glucólisis y la generación de CO2 a través del ciclo TCA, los cambios en la glucólisis y el oxfos se acompañan de h+ excreción en los medios extracelulares. El analizador XFe96 detecta estos cambios en la concentración extracelular H+ como ECAR. Paralelamente, los cambios en la concentración extracelular de O2 debido al consumo de O2 por fosforilación oxidativa se miden como OCR. El bloqueo de la glucólisis con 2-desoxiglucosa (2-DG) o respiración con los inhibidores complejos I y III complejos rotenona y antimicina A revela qué vías metabólicas apoyan la creciente demanda de energía durante la capacitación esperma. (B) Los espermatozoides del ratón se unen a través de sus cabezas a la parte inferior de una microcámara recubierta de ConA; su flagela se mueven libremente. Mientras que los cambios en la concentración extracelular H+ y O2 son detectados por H+- y O2-fluoroforos sensibles inmovilizados a una sonda del sensor, hasta cuatro compuestos diferentes se pueden inyectar secuencialmente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Representación esquemática del experimento ejemplar. Los cambios en ECAR (mpH/min) y OCR (pmol O2/min) se detectan en espermatozoides no capacitados y capacitantes utilizando un analizador de flujo extracelular. Ciclo 1: Valores basales de ECAR y OCR. Ciclos 2-5: Estabilización del sistema después de la inyección simulada tYH. Ciclos 6-8: Incubación de drogas. Ciclos 9-27: Capacitación de espermatozoides. Las flechas indican inyecciones. 2-DG: concentración final 50 mM, AntA/Rot: concentración final 0,5 m, db-cAMP: concentración final 1 mM, IBMX: concentración final 500 M. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.
Figura 3: Análisis de datos. (A) Datos sin procesar de los cambios en ECAR durante la capacitación del esperma del ratón. (B) Datos después de la eliminación de los primeros 7 puntos de datos. (C) Datos normalizados al punto de datos antes de la inyección de cAMP/IBMX. Los datos se muestran como la media de 7-8 pozos - S.E.M. Las inyecciones se indican con una flecha. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Cambios en la glucólisis y la fosforilación oxidativa durante la capacitación del esperma del ratón. (A) ECAR normalizado en espermatozoides de ratón no capacitados y capacitantes en presencia y ausencia de 50 mM 2-DG. (B) OCR normalizado en espermatozoides de ratón no capacitados y capacitadores en presencia y ausencia de 50 mM 2-DG. (C) ECAR normalizado en espermatozoides de ratón no capacitados y capacitantes en presencia y ausencia de antimicina A y rotenona de 0,5 m. (D) OCR normalizado en espermatozoides de ratón no capacitados y capacitadores en presencia y ausencia de antimicina A y rotenona de 0,5 m. Los datos se muestran como media s.M normalizada en el punto de datos antes de la inyección de db-cAMP/IBMX; n a 6. Las inyecciones se indican con una flecha. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Puerto | Número de ciclos | Mezcla (min) | Espera (min) | Medida (min) | |
| A: Basal ECAR/OCR | sin puerto | 1 | 2:00 | 0:00 | 3:00 |
| B: Inyección simulada | 1 | 4 | 2:00 | 0:00 | 3:00 |
| C: Inyección de drogas | 2 | 3 | 2:00 | 0:00 | 3:00 |
| D: Capacitación | 3 | 18 | 2:00 | 0:00 | 3:00 |
Tabla 1: Detalles de la medición.
Figura suplementaria 1: Capacitación de espermatozoides de ratón en el tampón TYH del analizador de flujo extracelular. Fosforilación de residuos de tirosina de espermatozoides de ratón detectados en diferentes momentos de tiempo durante la capacitación (0 - 90 min) después de la incubación en (A) TYH con 25 mM HCO3-, 3 mg/mL BSA y 20 mM HEPES o en (B) Analizador de flujo extracelular TYH con 5 mM db-cAMP, 500 M IBMX, y 1 mM HEPES, detectados con un anticuerpo de fosfotirosina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Archivo suplementario 1: Plantilla de ensayo de ondas para detectar cambios en la glucólisis y la fosforilación oxidativa durante la capacitación del esperma del ratón. El software de escritorio wave se puede descargar de forma gratuita después de rellenar un formulario de registro (www.agilent.com/en/products/cell-analysis/cell-analysis-software/data-analysis/wave-desktop-2-6) e instalar en Windows 7, 8 o 10, (Mac OSx 10.11 (o superior) con Parallels 12 (o superior). De este caso, las plantillas de onda se pueden generar independientemente del analizador de flujo extracelular, exportarse y luego importarse en el software de onda de cualquier analizador de flujo extracelular. Haga clic aquí para ver este archivo (haga clic con el botón derecho para descargar).
Archivo Suplementario 2: Archivo de prisma de pad gráfico exportado desde el software de ondas con análisis de datos ejemplares. Haga clic aquí para ver este archivo (haga clic con el botón derecho para descargar).
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Discussion
La pérdida de capacitación espermática en ausencia de ciertos sustratos metabólicos o enzimas metabólicas críticas reveló el metabolismo energético como un factor clave que apoya la fertilización exitosa. Un cambio metabólico durante la activación celular es un concepto bien establecido en otros tipos de células, sin embargo, estamos empezando a entender cómo los espermatozoides adaptan su metabolismo a la creciente demanda de energía durante la capacitación. Utilizando un analizador de flujo extracelular, desarrollamos una herramienta fácilmente aplicable para monitorear los cambios en la glucólisis y la fosforilación oxidativa en tiempo real durante la capacitación de espermatozoides. La detección de cambios en H+ y O2 extracelulares con fluoróforos inmovilizados en una sonda de sensor es mínimamente invasiva y los cuatro puertos de inyección operados individualmente permiten la manipulación con inhibidores farmacológicos o activadores en diferentes momentos antes o durante el proceso de capacitación. Este protocolo solo da un ejemplo de un experimento de capacitación de espermatozoides de ratón. Para simplificar la interpretación de los resultados elegimos el espectáculo un experimento ejemplar donde la glucosa se utilizó como la única fuente de energía. Las condiciones son variables dependiendo del objetivo del experimento, y hasta 12 condiciones diferentes (es decir, diferentes fuentes de energía como glucosa frente a glucosa y piruvato) se pueden medir en paralelo. Además, cuatro puertos de inyección independientes permiten la inyección de activadores farmacológicos y/o inhibidores en cualquier momento deseado antes o durante la capacitación. Esto abre la posibilidad de utilizar el analizador de flujo extracelular como un dispositivo de cribado de semi alto rendimiento. Similar a los espermatozoides de ratón, en otras especies como humana o bovina sigue siendo enigmática cómo los espermatozoides cambian su metabolismo durante la capacitación. El protocolo se puede adaptar fácilmente; por lo tanto, recomendamos optimizar la concentración de espermatozoides cada vez antes de comenzar un experimento real.
La mayor limitación del protocolo es que los resultados de alta calidad sólo se pueden lograr en ausencia de bicarbonato. El bicarbonato en el fluido seminal es la señal fisiológica que inicia la cascada de señalización de capacitación de los espermatozoides después de la eyaculación. El bicarbonato activa la adenilil ciclasa soluble (sAC; ADCY10), que cataliza la conversión de ATP en cAMP23. El aumento del campo impulsa entonces una cascada de señalización mediada por la proteína quinasa A, que en última instancia conduce a la fosforilación de tirosina aguas abajo de las proteínas diana (por ejemplo, canales iónicos, enzimas metabólicas y proteínas estructurales24,25). Esta restricción contra el bicarbonato se supera inyectando el producto de sAC activado por bicarbonato, campo. Utilizamos 5 mM del campo de campo permeable a la célula, en paralelo con el inhibidor de la fosfodiesterasa de amplia especificidad IBMX, que evita la degradación rápida del db-cAMP por fosfodiesterasas. Esta combinación inicia eficazmente la vía de señalización de capacitación regulada por el campo después de la activación del sAC con una cinética similar al bicarbonato(Figura suplementaria 1). Paralelamente al bicarbonato, se utiliza un aceptador de colesterol (por ejemplo, BSA) para capacitar in vitro esperma recién eyaculado o espermatozoides diseccionados del epidídilo cauda. La albúmina no se puede inyectar porque obstruye el puerto de inyección y, por lo tanto, debe agregarse al búfer de espermatozoides antes de enchapar las células. Realizar el experimento en presencia o ausencia de BSA reveló que el aumento en ECAR y OCR durante la capacitación de espermatozoides es independiente del aceptador de colesterol. Sin embargo, la presencia de BSA en el búfer de espermatozoides disminuyó las fluctuaciones en los valores de ECAR y OCR detectados entre diferentes pozos y experimentos; por lo tanto, recomendamos incluir la BSA en el tampón de espermatozoides para aumentar la reproducibilidad.
Aislar los espermatozoides del epidídilo cauda resulta en la contaminación de los espermatozoides con líquido epidímico. Para evitar resultados artificiales debido a componentes de líquido sin seminales, recomendamos lavar los espermatozoides dos veces antes de usarlos para un experimento. La concentración y el revestimiento de espermatozoides es otro factor crítico que determina el éxito del experimento. Para obtener resultados fiables, el fabricante recomienda que los valores iniciales de ECAR sean mayores que 10 y que los valores de OCR sean mayores que 20. La concentración de espermatozoides utilizada en este protocolo se optimizó para que los valores promedio basales de ECAR y OCR de los 7-8 pozos medidos por condición estén por encima de 10 y 20, respectivamente. Los espermatozoides que se mueven libremente perturban la detección de cambios en H+ y O2extracelulares. Por lo tanto, es crucial adherir todos los espermatozoides con su cabeza a la parte inferior de la placa. Encontramos éxito adhiriendo espermatozoides al recubrir la placa con ConA, una lectina vegetal que interactúa específicamente con la membrana acrosomal externa y se utiliza comúnmente para los ensayos acrosanos26,y girando suavemente la placa (ver paso 2.7.3). Con este método, los espermatozoides se localizan en la parte inferior del pozo únicamente a través de su cabeza para que todavía puedan mover libremente su flagelo y cambiar su patrón de paliza flagelante durante la capacitación.
Los espermatozoides extruyen constantemente H+ y O2 en ambos, el estado no capacitado y el capacitado. Para determinar el ECAR inicial y el OCR con la mayor precisión posible, es crucial iniciar el experimento lo más rápido posible después del último paso de lavado. Esto se puede lograr cargando el cartucho del sensor mientras los espermatozoides están nadando y iniciando el método en el analizador de flujo extracelular antes del primer paso de lavado. Calibrar el instrumento toma aproximadamente el mismo tiempo que lavar y enchapar las células y girar la placa. El fabricante recomienda una fase de equilibrio para permitir que el sistema se estabilice antes de medir el primer punto de datos real. Puesto que el protocolo incluye 8 ciclos de medición antes de que se inicie la capacitación, para ahorrar tiempo, el paso de equilibrio se excluye de este protocolo.
La capacidad de inyectar soluciones durante el ensayo y observar sus efectos sobre la respiración y la tasa glucolítica en tiempo real es una característica clave del analizador de flujo extracelular. La carga del cartucho del sensor es uno de los pasos críticos del protocolo y debe llevarse a cabo con cuidado. Para garantizar una inyección adecuada en todos los pozos, cada serie de puertos debe contener el mismo volumen, incluidos los pozos de fondo. Cargar los puertos con una pipeta multicanal requiere cierta práctica, pero disminuye considerablemente la variabilidad y el tiempo de carga. Recomendamos encarecidamente usar la guía de carga de puertos, pero para inyectar sólo cuatro puertos simultáneamente. También es importante apreciar que durante la carga, los volúmenes de inyección se incrementan gradualmente para compensar el aumento del volumen en el pozo. Al cargar el cartucho del sensor, es importante no insertar completamente las puntas en el puerto. Esto podría empujar prematuramente la solución de inyección a través del orificio del puerto. Al establecer el método encontramos que inyectar líquido en un pozo de esperma causa artefactos de inyección no deseados, probablemente debido a la dilución de los espermatozoides en el pozo y / o desplazar los espermatozoides desde el fondo del pozo. La primera inyección causa el artefacto de inyección más grande, por lo que incluimos una inyección simulada con búfer de espermatozoides en todos los pozos al principio del protocolo.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores desean reconocer el apoyo del Dr. Lavoisier Ramos-Espiritu en el Rockefeller High Throughput and Spectroscopy Resource Center.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| 2-Deoxy-D-glucose | Sigma-Aldrich | D8375 | 2-DG |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I7018 | IBMX; prepare a 500 mM stock solution in DMSO (111.1 mg/ml) and store in small aliquots |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | AntA; prepare a 5 mM stock solution in DMSO (2.7 mg/ml) and store in small aliquots |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A1470 | BSA |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | CaCl2 |
| Concanacalin A, Lectin from Arachis hypogaea (peanut) | Sigma-Aldrich | L7381 | ConA |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| Isothesia | Henry Schein Animal Health | 1169567761 | Isoflurane |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M2643 | MgSO4 |
| N6,2'-O-Dibutyryladenosine 3',5'-cyclic monophosphate sodium salt | Sigma-Aldrich | D0627 | db-cAMP |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | KCl |
| Potassium dihydrogen phosphate | Sigma-Aldrich | P5655 | KH2PO4 |
| Rotenone | Cayman Chemical Company | 13995 | Rot; prepare a 5 mM stock solution in DMSO (2mg/ml) and store in small aliquots |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | NaHCO3- |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | NaCl |
| Equipment and materials | |||
| 12 channel pipette 10-100 μL | eppendorf | ES-12-100 | |
| 12 channel pipette 50-300 μL | vwr | 613-5257 | |
| 37 °C, non-CO2 incubator | vwr | 1545 | |
| 5 mL cetrifuge tubes | eppendorf | 30119380 | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | vwr | 76211-286 | |
| Centrifuge with plate adapter | Thermo Scientific | IEC FL40R | |
| Dissection kit | World Precision Instruments | MOUSEKIT | |
| Inverted phase contrast microscope with 40X objective | Nikon | ||
| OctaPool Solution Reservoirs, 25 ml, divided | Thomas Scientific | 1159X93 | |
| OctaPool Solution Reservoirs, 25 mL, divided | Thomas Scientific | 1159X95 | |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | ||
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent | 102416-100 | Also sold as XFe96 FluxPak mini (102601-100) with 6 instead of 18 cartidges. |
References
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