Summary
इस लेख में, हम मुख्य माउस न्यूरोजेनिक निकस से प्राप्त प्रसवोत्तर माउस तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं से न्यूरोस्फीयर संस्कृतियों की पीढ़ी के लिए एक प्रोटोकॉल का विस्तार से वर्णन करते हैं। न्यूरोस्फीयर का उपयोग मस्तिष्क के ऊतकों से तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं की पहचान करने के लिए किया जाता है जो अग्रदूत कोशिका संख्याओं के अनुमान की अनुमति देता है। इसके अलावा, इन 3 डी संरचनाओं को विभेदक परिस्थितियों में चढ़ाया जा सकता है, न्यूरॉन्स, ओलिगोडेन्ट्रोसाइट्स और एस्ट्रोसाइट्स को जन्म देते हुए, सेल भाग्य के अध्ययन की अनुमति देता है।
Abstract
न्यूरोस्फीयर परख प्रसार, आत्म-नवीकरण और बहुशक्ति सहित तंत्रिका स्टेम/जनक कोशिकाओं (एनएसपीसी) के अंतर्निहित गुणों का अध्ययन करने के लिए एक अत्यंत उपयोगी इन विट्रो तकनीक है । प्रसवोत्तर और वयस्क मस्तिष्क में, एनएसपीसी मुख्य रूप से दो न्यूरोजेनिक निकस में मौजूद हैं: सबवेंट्रिकुलर जोन (एसवीजेड) पार्श्व वेंट्रिकल्स और हिप्पोकैम्पल डेनटेट जाइरस (डीजी) के उपकणीय क्षेत्र को अस्तर। प्रसवोत्तर मस्तिष्क से न्यूरोजेनिक निकस का अलगाव उच्च पैदावार के परिणामस्वरूप लाभ के साथ संस्कृति में एनएसपीसी की उच्च मात्रा प्राप्त करने की अनुमति देता है। प्रत्येक न्यूरोस्फीयर के भीतर कोशिकाओं के बीच घनिष्ठ संपर्क एक सूक्ष्म वातावरण बनाता है जो न्यूरोजेनिक निकस जैसा हो सकता है। यहां, हम विस्तार से वर्णन करते हैं कि न्यूरोस्फीयर विस्तार के लिए 1−3 दिन पुराने (पी1−3) चूहों से एसवीजेड और डीजी-व्युत्पन्न न्यूरोस्फीयर संस्कृतियों को कैसे उत्पन्न किया जाए, साथ ही पासिंग िंग करें। यह एक लाभप्रद दृष्टिकोण है क्योंकि न्यूरोस्फीयर परख एनएसपीसी क्लोन (6−12 दिनों) की तेज पीढ़ी की अनुमति देता है और पशु उपयोग की संख्या में महत्वपूर्ण कमी करने में योगदान देता है। अंतर परिस्थितियों में न्यूरोस्फीयर चढ़ाना करके, हम एनएसपीसी से बनी कोशिकाओं और विभिन्न तंत्रिका वंशों (न्यूरॉन्स, एस्ट्रोसाइट्स और ओलिगोडेन्ट्रोसाइट्स) की विभेदित कोशिकाओं की एक छद्म मोनोलेयर प्राप्त कर सकते हैं, जो एनएसपीसी प्रसार, अंतर, कोशिका अस्तित्व और न्यूरिस्टोजेनेसिस पर आंतरिक या एक्सट्रंसिक कारकों के कार्यों के अध्ययन की अनुमति देते हैं।
Introduction
न्यूरोस्फीयर परख (एनएसए) सबसे पहले 19921,,2 में वर्णित किया गया था और अभी भी तंत्रिका स्टेम सेल (एनएससी) अनुसंधान में एक अद्वितीय और शक्तिशाली उपकरण बना हुआ है। मुख्य न्यूरोजेनिक क्षेत्रों से एनएससी के अलगाव में चुनौतीपूर्ण मुद्दे हैं क्योंकि शारीरिक परिस्थितियों में इन कोशिकाओं को बनाए रखने की आवश्यकताएं खराब समझमें आती हैं । एनएसए में, कोशिकाओं को एक रासायनिक रूप से परिभाषित सीरम-मुक्त माध्यम में एपिडर्मल विकास कारक (ईजीएफ) और मूल फाइब्रोब्लास्ट विकास कारक (बीएफजीएफ)1,,2,,3सहित विकास कारकों की उपस्थिति के साथ सुसंस्कृत किया जाता है। इन माइटोजन का उपयोग करके तंत्रिका अग्रदूत कोशिकाओं (स्टेम और जनक) का चयन किया जाता है क्योंकि ये कोशिकाएं ईजीएफ और एफजीएफ-उत्तरदायी सक्रिय प्रसार की अवधि में प्रवेश करती हैं जबकि अन्य कोशिकाएं, अर्थात् विभेदित कोशिकाएं,4मर जाती हैं। तंत्रिका अग्रदूत कोशिकाएं न्यूरोस्फीयर के रूप में बढ़ती हैं, जिन्हें इन कोशिकाओं5के पूल को और विस्तारित करने के लिए पारित किया जा सकता है। महत्वपूर्ण बात, चूंकि ये तंत्रिका स्टेम जनक कोशिकाएं (एनएसपीसी) बहुशक्तिशाली हैं, इसलिए वे केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) के तीन प्रमुख कोशिका प्रकारों में अंतर करने में सक्षम हैं: न्यूरॉन्स, ओलिगोडेन्ट्रोसाइट्स और एस्ट्रोसाइट्स5।
एनएसए अविभेदित सीएनएस अग्रदूतका एक नवीकरणीय स्रोत प्रदान करता है, जिसका उपयोग शारीरिक और रोग दोनों संदर्भ में एनएससी प्रसार और आत्म-नवीकरण, और न्यूरोनल और ग्लियल भेदभाव सहित कई प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है । इसके अलावा, इन विट्रो अध्ययनों का उपयोग विकास के दौरान तंत्रिका अग्रदूतों में मौजूद आंतरिक विशिष्टता की डिग्री का मूल्यांकन करने के साथ-साथ कोशिकाओं की पूरी क्षमता का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है, साथ ही उनके सामान्य वातावरण से जुड़े बाह्य संकेतों को हटाकर6। न्यूरोस्फीयर मॉडल ख्यात नियामकों का मूल्यांकन करने के लिए मूल्यवान है क्योंकि सीरम से रहित माध्यम में कोशिकाओं को बनाए रखकर, पर्यावरणीय संकेत केवल आसपास की कोशिकाओं द्वारा प्रदान किए जाते हैं6। इसके अलावा, एनएसए में, एनएसपीसी को आसानी से संस्कृति में विस्तारित किया जाता है, प्रति क्षेत्र कोशिकाओं का घनत्व अधिक होता है और न्यूरोस्फीयर की विषम संरचना में वीवो निकस6में कुछ समानता होती है। ये अच्छी तरह से स्थापित लाभ कारण है कि इस पद्धति व्यापक रूप से कई शोधकर्ताओं द्वारा इस्तेमाल किया गया है ।
निम्नलिखित प्रोटोकॉल दो मुख्य न्यूरोजेनिक क्षेत्रों, उपवेंट्रिकुलर जोन (एसवीजेड) और हिप्पोकैम्पल डेनटेट जायरस (डीजी) से प्रसवोत्तर एनएसपीसी आबादी के अलगाव से सभी प्रक्रियाओं का विस्तार करता है, न्यूरोस्फीयर के रूप में उन कोशिकाओं के विस्तार के साथ-साथ न्यूरॉन्स, एस्ट्रोसाइट्स और ओलिगोडेन्ट्रोसाइट्स में अंतर के लिए। अंत में, एसवीजेड और डीजी-व्युत्पन्न एनएसपीसी के स्टेमनेस और मल्टीपोटेंसी गुणों तक पहुंचने के लिए विभिन्न परखों का भी वर्णन किया गया है ।
Protocol
सभी प्रयोग यूरोपीय समुदाय (86/609/ईईसी; 2010/63/ईयू; 2012/707/ईयू) और पुर्तगाली (डीएल 113/2013) कानून के अनुसार वैज्ञानिक प्रयोजनों के लिए इस्तेमाल किए जाने वाले पशुओं की सुरक्षा के लिए किए गए थे । प्रोटोकॉल को "आईएमएम के संस्थागत पशु कल्याण निकाय - ओरबीए-आईएमएम और राष्ट्रीय सक्षम प्राधिकरण - DGAV (Direcção गेरल डी एलिमेंटाकाओ ई वेटेरिनारिया) द्वारा अनुमोदित किया गया था।
1. बुनियादी सेटअप और संस्कृति माध्यम की तैयारी
- विच्छेदन के दिन, डुल्बेकको के संशोधित ईगल माध्यम ((DMEM)/F12 से बना सीरम-मुक्त माध्यम (SFM) के अनुरूप विकास माध्यम की उचित मात्रा तैयार करें, एल-ग्लूटामाइन के साथ (सामग्री की तालिका)100 यू/एमएल पेनिसिलिन और 100 μg/mL sttomycin (कलम/strep), 1% B27, B27, साथ ही 10 एनजी/एमएल ईजीएफ और 5 एनजी/एमएल बीएफजीएफ के साथ । पानी के स्नान में संस्कृति माध्यम को 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।
नोट: विकास माध्यम की मात्रा पिल्ले की संख्या पर निर्भर करती है, क्योंकि 5 पिल्ले ~ 100 मीटर (एसवीजेड के लिए 50 एमएल और डीजी के लिए 50 एमएल) तैयार करते हैं; हालांकि, कोशिकाओं की संख्या (चरण 5.1) की गणना के बाद सटीक मात्रा को समायोजित करना होगा। - एसवीजेड और डीजी के माइक्रोडिसेक्शन के लिए कैल्शियम और मैग्नीशियम-फ्री हैंक्स के बैलेंस्ड लवलाइन सॉल्यूशन (एचबीएसएसएस) को १०० यू/एमएल पेन/स्ट्रेप के साथ सप्लीमेंट ्ड सेक्शन मीडियम तैयार करें ।
नोट: विच्छेदन माध्यम के 50−100 मीटर तैयार करें। - एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप स्थापित करें और मस्तिष्क (कैंची और छोटे स्पैटुला) को हटाने के लिए आवश्यक उपकरण तैयार करें और एसवीजेड और डीजी माइक्रोडिसेक्शन (डुमोंट छोटी कैंची, #7 संदंश, #5 संदंश, #5S संदंश) के लिए 70% इथेनॉल में भिगोकर।
2. पोस्टनेटल (पी1−3) माउस दिमाग और एसवीजेड/डीजी माइक्रोडिसेक्शन की कटाई
- 60 मिमी पेट्री व्यंजन (विकास क्षेत्र 21 सेमी2)एचबीएस के साथ कलम/स्ट्रेप और 2 नमूना ट्यूब (एसवीजेड के लिए एक और डीजी के लिए एक) के साथ पूरक एचबीएसएसएस के 500 माइक्रोन तैयार करें।
- संस्थागत पशु देखभाल सुविधा/दिशा-निर्देशों द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार चूहों के पिल्ले (पी1−3) को इच्छामृत्यु दें । ब्रेनस्टेम के आधार पर तेज कैंची के साथ एक चीरा के साथ डेपुटेशन करें।
- सिर के आधार पर शरीर के वेंट्रल हिस्से को पकड़ना और छोटी नुकीली कैंची का उपयोग करना, सिर की पूरी लंबाई पर त्वचा में एक मिडलाइन चीरा बनाएं, इस प्रकार खोपड़ी की सतह का खुलासा करें।
- खोपड़ी के आधार पर एक देशांश चीरा बनाएं और मस्तिष्क संरचनाओं को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए एक कोण उथले के साथ छोटे कैंची का उपयोग करके सागताल सीवन के साथ काटना जारी रखें।
- घुमावदार संदंश का उपयोग करके खोपड़ी को साइडों में छीलें और मस्तिष्क को बेनकाब करें।
सावधानी: सुनिश्चित करें कि विच्छेदन उपकरण मस्तिष्क को छूने से पहले इथेनॉल से मुक्त हैं। - मस्तिष्क के आधार से जुड़े कपाल नसों और रक्त वाहिकाओं को काटने के लिए मस्तिष्क के आधार के नीचे फिसलने से, एक छोटे स्पैटुला का उपयोग करके खोपड़ी से मस्तिष्क को अलग करें, और मस्तिष्क को कोल्ड सप्लीमेंट्ड एचबीएसएस समाधान युक्त पेट्री डिश में स्थानांतरित करें।
- पेट्री डिश को कम आवर्धन पर विच्छेदन माइक्रोस्कोप के नीचे मस्तिष्क युक्त रखें और मस्तिष्क को अपनी पृष्ठीय सतह पर रखें।
- ठीक संदंश का उपयोग करके, मस्तिष्क के वेंट्रल साइड और घ्राण बल्बों से मेनिंग्स को हटा दें, जबकि मस्तिष्क को सेरिबैलम द्वारा स्थिति में पकड़े हुए। मस्तिष्क को वेंट्रल पहलू पर घुमाएं और बाकी मेनिंग्स को छील दें।
नोट: पृष्ठीय मेनिंग्स को हटाना सही मस्तिष्क टुकड़ा करने की क्रिया सुनिश्चित करने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है। - संदंश का उपयोग करके कटौती करने वाले सेरिबैलम को त्यागें। एक ऊतक हेलिकॉप्टर(सामग्री की मेज)पर 11 माइक्रोन के एक ताकना आकार के साथ एक फिल्टर कागज रखें और घुमावदार नुकीले संदंश का उपयोग कर फिल्टर पेपर पर मस्तिष्क सेट करें । मस्तिष्क को 450 माइक्रोन कोरोनल वर्गों में काट लें और कोल्ड सप्लीमेंट्ड एचबीएसएस से भरे एक नए पेट्री डिश में खंडित मस्तिष्क को इकट्ठा करने के लिए गीले लेमिना का उपयोग करें।
- एसवीजेड को विच्छेदन करने के लिए, एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत पार्श्व वेंट्रिकल्स के साथ स्लाइस तक पहुंचने तक पूर्वकाल-से-पीछे के फैशन में कोरोनल स्लाइस को अलग करने के लिए संदंश का उपयोग करें।
- स्ट्रेटल पैरान्चिमा और कॉर्पस कैलोसम को छोड़कर, ठीक संदंश के साथ वेंट्रिकल्स (जो एसवीजेड से मेल खाती है) की पार्श्व दीवार के आसपास के ऊतकों की पतली परत को काटें। पार्श्व वेंट्रिकल के पार्श्व कोनों में संदंश की नोक रखकर एसवीजेड को अलग करें: एक तुरंत कॉर्पस कैलोसम के नीचे और दूसरा ऊतक में तुरंत पार्श्व वेंट्रिकल के वेंट्रल क्षेत्र से सटे। फिर, पार्श्व वेंट्रिकल के आसपास के ऊतकों की एक छोटी सी लाइन काट ें।
- पहले एसवीजेड के रूप में पहचाने गए पूरक एचबीएसएस समाधान के साथ विच्छेदित ऊतक को एक नमूना ट्यूब में एकत्र करें।
नोट: स्लाइस में एसवीजेड को बाहर करें जहां पार्श्व वेंट्रिकल्स और हिप्पोकैम्पल गठन दोनों दिखाई देने लगते हैं। - एक पूर्वकाल से पीछे फैशन में SVZ माइक्रोडिसेक्शन के बाद सभी स्लाइस के माध्यम से जाओ और हिप्पोकैम्पस गठन तक पहुंचने। संदंश का उपयोग हिप्पोकैम्पस के साथ पहला टुकड़ा त्यागें जहां डीजी अभी भी पहचानने योग्य नहीं है।
- डीजी को हटाने के लिए सबसे पहले हिप्पोकैम्पस को स्लाइस से अलग करें। डीजी के आसपास की सीमाओं की कल्पना करने के लिए माइक्रोस्कोप को फिर से फोकस करें ।
- डीजी और सीए1 क्षेत्र के बीच कटौती करके डीजी भाग को विच्छेदन करें और उसके बाद महानिदेशक और सीए3 क्षेत्र के बीच संदंश का उपयोग करके एक ऊर्ध्वाधर कटौती की गई । फिम्ब्रिया और किसी भी आसन्न ऊतक को हटा दें।
नोट: P1−3 जानवरों में, डीजी अमोन के सींग से लगभग अविवेच्य है, लेकिन एक छोटी सी टिप प्रदर्शित करता है। - विच्छेदित ऊतक को एक नमूना ट्यूब में एकत्र करें जिसमें पूरक एचबीएसएसएस समाधान पहले डीजी के रूप में पहचाने जाते थे।
नोट: हिप्पोकैम्पस या आसपास के क्षेत्र में समग्र चोट से डीजी को अलग-थलग करना अधिक कठिन हो जाएगा। प्रसवोत्तर माउस मस्तिष्क के एटलस का उपयोग करना आवश्यक है जब उपयोगकर्ता कोरोनल वर्गों से एसवीजेड और डीजी ऊतक के अलगाव से परिचित नहीं होता है।
3. ऊतक विच्छेदन
- अपने-अपने ट्यूबमें मौजूद एसवीजेड और डीजी टिश्यू को अलग करने के लिए, एचबीएसएस में ट्राइप्सिन-ईटीए 0.05% की अंतिम एकाग्रता के लिए ट्राइप्सिन-ईडीटीए 0.05% जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर लगभग 15 सीन के लिए इनक्यूबेट, जब तक ऊतक एक साथ झुका हुआ है।
- मीडिया को हटाकर और लगातार 4 बार नए एचबीएसके पूरक समाधान के 1 मिलील को जोड़कर ट्राइप्सिन से ऊतक को धोएं।
- एचबीएसएस को हटा दें और एसएफएम के 1 एमएल में पचाए गए ऊतकों को 10 एनजी/एमएल ईजीएफ और 5 एनजी/एमएल बीएफजीएफ के साथ पूरक किया जाए । एक समरूप कोशिका समाधान प्राप्त करने तक, P1000 पिपेट का उपयोग करके लगभग 7−10x को धीरे-धीरे पाइपिंग करके गोली को धीरे से अलग करके पैलेट को अलग करें।
सावधानी: अत्यधिक यांत्रिक वियोजन से कोशिका मृत्यु में वृद्धि हो सकती है और बाद में कोशिका वृद्धि को नकारात्मक रूप से प्रभावित किया जा सकता है।
4. सेल-जोड़ी परख सेल भाग्य का अध्ययन करने के लिए
- प्रयोग से पहले, 8-10 वर्गों के अनुसार अनुयायी मोनोलेयर संस्कृतियों के लिए लेपित 24-अच्छी तरह से प्लेटें तैयार करें।
- चढ़ाया जा करने के लिए एसवीजेड या डीजी कोशिकाओं (धारा 3 में प्राप्त) की संख्या गिनने के लिए, 0.2% ट्राइपैन नीले रंग वाले समाधान का उपयोग करें और हेमेटोसाइटोमीटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें।
- एसएफएम में विसोशिएटेड सेल निलंबन को कमजोर करें 5 एनजी/एमएल ईजीएफ और २.५ एनजी/एमएल बीएफजीएफ (कम ईजीएफ/बीएफएफएफएफ) के साथ ११,३०० कोशिकाओं/सेमी2 के घनत्व पर पूरक और उन्हें लेपित ग्लास कवरस्लिप पर प्लेट करें ।
- 24 घंटे के बाद, एनएससी मार्कर के खिलाफ इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री के लिए कोशिकाओं को ठीक करें जैसे सेक्स निर्धारक क्षेत्र वाई-बॉक्स 2 (Sox2) और नेटिन के साथ-साथ न्यूरोनल वंश के मार्कर के साथ (अर्थात् डबलकॉर्टिन [डीसीएक्स], अपरिपक्व न्यूरॉन्स के लिए) (धारा 14 देखें)।
नोट: Sox2 एनएससी का एक मार्कर है जो माइटोसिस से गुजरता है। Sox2+/+ सेल-जोड़े एक ही जनक सेल डिवीजन के परिणामस्वरूप स्टेम सेल विस्तार7को दर्शाता है ।
5. न्यूरोस्फीयर के रूप में प्रसवके बाद तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं का विस्तार
- विसोसिएटेड एसवीजेड या डीजी सेल निलंबन (धारा 3 में प्राप्त) के घनत्व का निर्धारण करने के लिए, हेमेटोसाइटोमीटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें।
- एसएफएम में 2 x 104 कोशिकाओं/mL के घनत्व पर तनु एसवीजेड और डीजी सिंगल सेल निलंबन 10 एनजी/एमएल ईजीएफ और 5 एनजी/एमएल बीएफजीएफ के साथ पूरक हैं । बीज एसवीजेड और डीजी कोशिकाओं में अनकोटेड ६० मिमी पेट्री व्यंजन 5 mL/पेट्री डिश की अंतिम मात्रा के साथ ।
- प्राथमिक न्यूरोस्फीयर बनाने के लिए क्रमशः 6−8 दिनों और 10−12 दिनों के लिए इनक्यूबेट एसवीजेड और डीजी सेल, 5% सीओ2के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर।
नोट: इनक्यूबेशन दिन से अधिक उल्लेख किया न्यूरोस्फीयर के एकत्रीकरण और न्यूरोस्फीयर के केंद्र में सेल मौत के उच्च स्तर को बढ़ावा कर सकते हैं । - जब अधिकांश न्यूरोस्फीयर का व्यास 150−200 माइक्रोन होता है, तो न्यूरोस्फीयर मार्ग को अंजाम देते हैं।
नोट: जब उनके पास उपयुक्त व्यास नहीं होता है तो न्यूरोस्फीयर को पास करना अगले सभी चरणों से समझौता करता है।
6. न्यूरोस्फीयर की पासिंग
नोट: निम्नलिखित प्रोटोकॉल एसवीजेड और डीजी न्यूरोस्फीयर दोनों का विस्तार करने के लिए लागू किया जा सकता है।
- न्यूरोस्फीयर पारित करने के लिए, 60 मिमी पेट्री डिश (ईएस) से न्यूरोस्फीयर युक्त विकास कारकों के साथ एसएफएम एकत्र करें और 300 x ग्रामपर 5 मिन के लिए अपकेंद्री।
- निर्माता के निर्देशों(सामग्रीकी तालिका) के अनुसार रासायनिक विच्छेदन किट (माउस) का उपयोग करके न्यूरोस्फीयर पैलेट को त्यागें और फिर से निलंबित करें।
नोट: इनक्यूबेशन बार ठीक निरीक्षण के रूप में वे प्रदर्शन के लिए महत्वपूर्ण हैं । - 300 x ग्रामपर 5 मिन के लिए सेंट्रलाइज, सुपरनेटेंट को हटा दें और 10 एनजी/एमएल ईजीएफ और 5 एनजी/एमएल बीएफजीएफ के साथ पूरक एसएफएम के 1 एमएल जोड़ें।
- न्यूरोस्फीयर को अलग करने के लिए पी1000 पिपेट के साथ लगभग 10x ऊपर और नीचे की कोशिश करें।
- 0.2% ट्राइपैन ब्लू और हेमेटोसाइटोमीटर वाले समाधान का उपयोग करके कोशिकाओं की संख्या गिनें।
- अनकोटेड 60 एमएम पेट्री डिश में 2 x 104 कोशिकाओं/mL के घनत्व पर रीसीड कोशिकाएं।
- 5% सीओ2के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर, माध्यमिक न्यूरोस्फीयर प्राप्त करने के लिए क्रमशः 6−8 दिनों और 10−12 दिनों के लिए इनक्यूबेट एसवीजेड और डीजी सेल।
नोट: एसवीजेड और डीजी-व्युत्पन्न एनएसपीसी की स्व-नवीकरण क्षमता प्रोटोकॉल अनुभाग 5 और 6 का पालन करके प्राप्त की जा सकती है। उसके लिए, बीज एसवीजेड और डीजी कोशिकाओं के घनत्व पर १.० x १०४ कोशिकाओं/mL (अनकोटेड 24-अच्छी प्लेटों में) विकास एसएफएम माध्यम में 5 एनजी/mL EGF और २.५ एनजी/mL bFGF (कम EGF/bFGF) युक्त । परिणामस्वरूप प्राथमिक और माध्यमिक न्यूरोस्फीयर की संख्या गिनें।
7. न्यूरोस्फीयर का भंडारण
- 60 मिमी पेट्री व्यंजनों से न्यूरोस्फीयर (चरण 5.3 और 6.7 से प्राप्त) वाले माध्यम को एकत्र करें।
- 300 x ग्राम पर 5 मिन के लिए अपकेंद्रित्र और अतिशयोक्ति त्यागें।
- कोशिकाओं 2x को एचबीएसएस के 1 एमएल (300 x ग्रामपर 5 मिन) से धोएं।
- 300 x ग्रामपर 5 मिन के लिए सेंट्रलाइज, सुपरनेटेंट को त्यागें और आणविक जीव विज्ञान विश्लेषण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर न्यूरोस्फीयर की गोली स्टोर करें।
8. पीडीएल कोटिंग प्लेट प्रक्रिया
- समाधान 1 (0.1 एम बोरेट बफर) तैयार करने के लिए, 3.92 ग्राम बोरिक एसिड का वजन और उच्च शुद्धता वाले पानी के 400 मीटर में पतला होता है। पीएच को 8.2 तक समायोजित करें और उच्च शुद्धता वाले पानी के साथ 500 मीटर तक बनाएं।
- समाधान तैयार करने के लिए 2 (0.167 एम बोरेट बफर), 10.3 ग्राम बोरिक एसिड का वजन और उच्च शुद्धता वाले पानी के 900 मीटर में पतला होता है। पीएच को 8.2 तक समायोजित करें और उच्च शुद्धता वाले पानी के साथ 1,000 मीटर तक बनाएं।
- पोली-डी-लिसिन (पीडीएल) (0.1 एम बोरेट बफर में 1 मिलीग्राम/एमएल) का पुनर्गठन करने के लिए, समाधान 1 के 100 मिलीग्राम में पीडीएल के 100 मिलीग्राम को पतला करें।
- 10 mL का एलिकोश बनाएं ताकि तुरंत उपयोग किया जा सके या फ्रीज कर सके और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर किया जा सके।
- लैमिनार प्रवाह के तहत, प्रति अच्छी तरह से 1 कवरस्लिप जोड़ें और 15 मिन के लिए यूवी लाइट के नीचे स्टरलाइज करें।
- पुनर्गठित पीडीएल या गल जमे हुए पुनर्गठित पीडीएल का उपयोग करें।
- 0167 एम बोरेट बफर में 100 माइक्रोन/एमएल पीडीएल का अंतिम समाधान समाधान 2 के 90 मीटर में पुनर्गठित पीडीएल के 10 एमएल जोड़कर तैयार करें।
- 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर के लिए एक न्यूनतम 2 घंटे के लिए कुओं के लिए अंतिम समाधान जोड़ें।
नोट: 24-अच्छी प्लेटों के लिए, प्रत्येक कुएं में 500 माइक्रोन की मात्रा जोड़ें। - घोल निकालें और उच्च शुद्धता वाले पानी से 3x धो लें।
- लैमिनार फ्लो हुड में कवरस्लिप को सूखने दें।
- मल्टी वेल कल्चर प्लेट्स को 4 डिग्री सेल्सियस पर छोड़ दें।
9. पीडीएल/लेमिनिन कोटिंग प्लेट प्रक्रिया
- 1 दिन, धारा 8 में वर्णित के रूप में पीडीएल के साथ प्लेटों कोट ।
- 2 दिन पीडीएल घोल निकालें और 3x को उच्च शुद्धता वाले पानी से धो लें। सूखने दें।
- विकास कारकों से रहित ठंड में 5 μg/mL टुकड़े टुकड़े तैयार करें।
- कवरस्लिप में घुले हुए लेमिनिन डालें और रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
नोट: 24-अच्छी प्लेटों के लिए, प्रत्येक कुएं में 500 माइक्रोन की मात्रा जोड़ें। - एक पिपेट का उपयोग कर टुकड़े टुकड़े निकालें।
नोट: लैमिनिन से कवरस्लिप न धोएं। - तुरंत उपयोग करें या -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
10. पॉली-एल-ऑर्निथिन (पीईओ) /लेमिनिन कोटिंग प्रक्रिया
- लैमिनार प्रवाह के तहत, प्रति अच्छी तरह से एक कवरस्लिप जोड़ें और 15 मिन के लिए यूवी लाइट के नीचे स्टरलाइज करें।
- कमरे के तापमान (आरटी) पर 20 न्यूनतम के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से 0.01% पीलो समाधान जोड़ें।
नोट: 24-अच्छी प्लेटों के लिए, प्रत्येक कुएं में 500 माइक्रोन की मात्रा जोड़ें। - समाधान निकालें और निष्फल 1x पीबीएस के साथ 3x धोलें। सूखने दें।
- बाँझ 1x पीबीएस में 5 μg/mL लैमिनिन तैयार करें।
- 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट।
- लेमिनिन निकालें।
नोट: लैमिनिन से कवरस्लिप न धोएं। - तुरंत उपयोग करें।
नोट: सुनिश्चित करें कि कवरस्लिप पूरी तरह से पीएलओ समाधान द्वारा धीरे से एक पिपेट टिप के साथ कवरस्लिप को टैप करके कवरस्लिप द्वारा कवर किया जाता है। हिलने पर मल्टी वेल प्लेट्स को कोई आवाज नहीं करनी चाहिए ।
11. कोशिका के विभेदित मोनोलेयर उत्पन्न करके नेयूरिटोजेनेसिस का मूल्यांकन
- 60 मिमी पेट्री व्यंजन (धारा 5 से प्राप्त) से न्यूरोस्फीयर युक्त मीडिया को इकट्ठा करें और आरटी पर 300 x ग्राम पर 5 मिन के लिए अपकेंद्री।
- अधिनायक को त्यागें और डिस्सोशन पीबीएस (यानी, 1 mL में न्यूरोस्फीयर की गोली को अलग करें एमजी2 +/Ca2 + के बिना पीबीएस और EDTA के साथ [2.7 एमएम केसीएल, 1.5 एमएम KH 2 पीओ4,137 एमएम एनसीएल, 8.1 mM Na2HPO4 और 0.5 m EDTA 4Na, पीएच = 7.40]) के लिए इनक्यूबेटिंग द्वारा 15 मिन के लिए इनक्यूबेटिंग द्वारा यांत्रिक विसोशन के बाद।2 वैकल्पिक रूप से, रासायनिक विसोशन किट (माउस)(सामग्री की तालिका)का उपयोग करके न्यूरोस्फीयर को अलग करें।
- आरटी पर 300 x ग्राम पर 5 मिन के लिए अपकेंद्रित्र और अतिशयोक्ति त्यागें।
- विकास कारकों से रहित एसएफएम के 1 mL में सेल पैलेट को फिर से निलंबित करें।
- हेमेटोसाइटोमीटर का उपयोग करके सेल घनत्व निर्धारित करें।
- एसएफएम में विसोशिएटेड सेल निलंबन को 3,766 कोशिकाओं/सेमी2 के घनत्व पर विकास कारकों से रहित और 24-अच्छी प्लेटों में लेपित ग्लास कवरस्लिप पर प्लेट कोशिकाओं को पतला करें।
- 1−3 दिनों के बाद, साइटोस्केलेटन के प्रोटीन के खिलाफ इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री के लिए कोशिकाओं को ठीक करें (धारा 14 देखें)।
12. न्यूरोस्फीयर संस्कृतियों का भेदभाव
नोट: कोशिका विस्तार से प्राप्त न्यूरोस्फीयर, या तो प्राथमिक या मार्गित न्यूरोस्फीयर (5 या 6 खंडों में प्राप्त) से विभिन्न तंत्रिका वंशों से कोशिकाओं में अंतर किया जा सकता है।
- जब न्यूरोस्फीयर का व्यास 150−200 माइक्रोन होता है, तो 24-अच्छी प्लेटों में लेपित ग्लास कवरस्लिप पर न्यूरोस्फीयर सस्पेंशन मीडियम और प्लेट के 25 माइक्रोन इकट्ठा करें।
नोट: अधिक न्यूरोस्फीयर इकट्ठा करने के लिए, धीरे-धीरे पेट्री डिश को केंद्र में न्यूरोस्फीयर को केंद्रित करने के लिए घुमाएं। फिर, केंद्र से पिपेट। - प्लेटों को 15 मिन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में रखें ताकि न्यूरोस्फीयर सब्सट्रेट का पालन करें। बाद में, विकास कारकों (विभेदक स्थितियों) से रहित एसएफएम के 500 माइक्रोन जोड़ें।
- 24 घंटे के बाद, विकास कारकों से रहित ताजा एसएफएम के साथ माध्यम की जगह।
- विभिन्न समय बिंदुओं (जैसे, 2 और 7 दिन इन विट्रो, DIV2 और DIV7, क्रमशः) के लिए अंतर 5% सीओ2 और 95% वायुमंडलीय हवा के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर।
नोट: सेल अस्तित्व, प्रसार और भेदभाव विभिन्न सेल परखों का उपयोग कर विश्लेषण किया जा सकता है।
13. सेल जीव विज्ञान परख
- सेल अस्तित्व परख
- 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में सेल निर्धारण से पहले 30 मिन के लिए 3 μg/mL प्रोपिडियम आयोडाइड (पीआई) के लिए चढ़ाया न्यूरोस्फीयर बेनकाब करें ।
नोट: पीआई एक ऑटोफ्लोरोसेंट एजेंट है जो केवल समझौता झिल्ली अखंडता8के साथ कोशिकाओं में प्रवेश करने में सक्षम है। सेल सर्वाइवल का विश्लेषण करने के अन्य तरीकों का उपयोग किया जा सकता है जैसे कि कैस्पास 3 धुंधला या टर्मिनल डिऑक्सीन्यूक्लियोटिटल ट्रांसफरेज़ डीयूटीपी निक-एंड लेबलिंग (ट्यूनल) परख।
- 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में सेल निर्धारण से पहले 30 मिन के लिए 3 μg/mL प्रोपिडियम आयोडाइड (पीआई) के लिए चढ़ाया न्यूरोस्फीयर बेनकाब करें ।
- सेल प्रसार परख
- 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में निर्धारण से पहले 4 घंटे के लिए प्लेटेड न्यूरोस्फीयर को 10 माइक्रोन 5-ब्रोमो-2'-डिऑक्सीयूरीडीन (बीआरडीयू) का पर्दाफाश करें।
नोट: बीआरडीयू एक सिंथेटिक थाइमिडीन एनालॉग है जिसे 9 जन्मकोशिकाओंमें डीएनए संश्लेषण के दौरान शामिल किया जा सकता है ।
- 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में निर्धारण से पहले 4 घंटे के लिए प्लेटेड न्यूरोस्फीयर को 10 माइक्रोन 5-ब्रोमो-2'-डिऑक्सीयूरीडीन (बीआरडीयू) का पर्दाफाश करें।
- सेल विभेदन परख
- पहले 24 घंटे में 10 माइक्रोन बीआरडीयू को 7 दिन पुराने प्लेटेड न्यूरोस्फीयर का पर्दाफाश करें, इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर।
- विकास कारकों (विभेदक स्थितियों) से रहित एसएफएम को नवीनीकृत करें और कोशिकाओं को निर्धारण तक अगले 6 दिनों के लिए बीआरडीयू की अनुपस्थिति में विकसित करने की अनुमति दें।
नोट: परिपक्व तंत्रिका कोशिकाओं के मार्कर के साथ सह-लेबलिंग द्वारा ये पल्स-चेस प्रयोग, प्रोजेनिटर कोशिकाओं के मूल्यांकन की अनुमति देते हैं जो प्रोटोकॉल के दौरान परिपक्व कोशिकाओं में अंतर करते हैं।
14. न्यूरोस्फीयर संस्कृतियों का इम्यूनोस्टेनिंग
- सेल निर्धारण
- 1x पीबीएस में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) तैयार करें और 4 डिग्री सेल्सियस या -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
- कुओं से विकास कारकों से रहित एसएफएम को हटादें और जोड़ें, प्रत्येक कुएं में, आरटी में 20 मिन के लिए 4% पीएफए के 500 माइक्रोन 4 डिग्री सेल्सियस पर।
- 1x पीबीएस के साथ 3x धोएं, हर बार 5 मिन के लिए, विभेदित न्यूरोस्फीयर युक्त कवरस्लिप।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 1x पीबीएस के 500 माइक्रोन में उपयोग होने तक स्टोर कवरस्लिप स्टोर करें।
नोट: यदि प्रयोग में बीआरडीयू नहीं है, तो 14.3 कदम रखना छोड़ दें।
- Denaturation विधि (केवल BrdU प्रयोगों के लिए)
- 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 एम एचसीएल तैयार करें।
- कुल्ला 1x PBS में कवरस्लिप 3x।
- पीबीएस में 30 मिन के लिए कोशिकाओं को 1% nonionic सरफेसटैंट (जैसे, ट्राइटन एक्स-100) युक्त
- 37 डिग्री सेल्सियस (~ 300 माइक्रोन/वेल) पर 30−40 मिन के लिए 1 एम एचसीएल प्री-गर्म 37 डिग्री सेल्सियस के साथ डिनेचर डीएसएसडीएनए।
- 1x पीबीएस के साथ कुओं 4x धोएं।
- परमीबिलाइजेशन और ब्लॉकिंग
- 5 मिन के लिए 1x पीबीएस में कवरस्लिप कुल्ला।
- 1x पीबीएस (~ 300 μL/well) में 0.5% nonionic सर्फेक्टेंट और 3% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) के साथ 1.5 घंटे के लिए इनक्यूबेट।
नोट: NeuN के लिए, 1x PBS में 6% बीएसए का उपयोग करें।
- इनक्यूबेशन और बढ़ते
- 1 दिन, धोने के बिना, प्राथमिक एंटीबॉडी(सामग्री की तालिका)के साथ इनक्यूबेट कोशिकाओं को इनक्यूबेशन कक्ष में 1x पीबीएस में 0.1% nonionic सर्फेक्टेंट और 0.3% बीएसए में (24-अच्छी तरह से प्लेटों का उपयोग 20 μL/well) में। यदि एंटीबॉडी फ्लोरोफोर के लिए संयुग्मित हैं तो 4 डिग्री सेल्सियस प्रकाश संरक्षित पर रात भर कवरस्लिप को छोड़ दें।
- दूसरे दिन, अपने संबंधित कुओं को वापस कवरस्लिप और 5 मिन के लिए 1x पीबीएस में 3x कुल्ला ।
- उचित फ्लोरेसेंस के साथ काउंटरदाग माध्यमिक एंटीबॉडी (कमजोर पड़ने 1:200) और 1x पीबीएस में 12 μg/mL Hoechst ३३३४२ के साथ आरटी में 2 घंटे के लिए और प्रकाश इनक्यूबेशन चैंबर में संरक्षित (20 μL/coverslip) ।
- 5 मिन के लिए 1x पीबीएस में वॉश कवरस्लिप 3x।
- फ्लोरेसेंस बढ़ते माध्यम के 5 μL/कवरस्लिप का उपयोग करके माइक्रोस्कोप स्लाइड पर माउंट कवरस्लिप।
- 1 दिन के लिए, प्रकाश से संरक्षित, आरटी पर कवरस्लिप एयर ड्राई दें।
- माइक्रोस्कोपी
- फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करके छवियों को देखें और प्राप्त करें।
- प्रत्येक स्थिति के लिए, तीन प्रतिकृति यों का उपयोग करें। 40x उद्देश्य (~ 100 कोशिकाओं प्रति क्षेत्र) के साथ प्रत्येक कवरस्लिप में पांच स्वतंत्र सूक्ष्म क्षेत्रों में सेल मायने रखता है।
15. ईजीएफ और बीएफएफएफ स्टॉक समाधान तैयार करना
- ईजीएफ स्टॉक समाधान
- लाइओफिलेइज्ड ईजीएफ का पुनर्गठन करने के लिए, उत्पाद को उच्च शुद्धता वाले पानी में पतला करें ताकि 20 μg/mL की अंतिम एकाग्रता तक पहुंच सके ।
- अलीकोट और माइक्रोट्यूब में -5 से -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
- बीएफजीएफ स्टॉक समाधान
नोट: bFGF 10 mM Tris, पीएच 7.6 के समाधान के साथ पुनर्गठन किया जाना चाहिए।- सामग्री को नीचे लाने के लिए खोलने से पहले शीशी को संक्षेप में अपकेंद्रित करें।
- 10 एमएम ट्रिस, पीएच 7.6 के 50 मीटर तैयार करें। इसके लिए 60.57 मिलीग्राम ट्रिस ((होच2)3सीएनएच2)का वजन करें और इसे उच्च शुद्धता वाले पानी के 40 मिलीग्राम में पतला करें। पीएच को 7.6 तक समायोजित करें और उच्च शुद्धता वाले पानी के साथ 50 मीटर तक बनाएं।
- 10 एमएम ट्रिस, पीएच 7.6 में 0.1% बीएसए के 10 मीटर तैयार करें। उसके लिए 10 मिलीग्राम बीएसए का वजन कर 10 एमएम ट्राई के 10 मिलीग्राम में पतला कर लें।
- लैमिनार फ्लो हुड के नीचे 0.22 माइक्रोन फिल्टर के साथ चरण 15.2.2 और 15.2.3 में तैयार फ़िल्टर समाधान।
- पीएच 7.6 के साथ 10 एमएम ट्राई में 0.1% बीएसए के 1,000 माइक्रोन में बीएफजीएफ के 10 माइक्रोग्राम का पुनर्गठन 10 μg/mL की अंतिम एकाग्रता तक पहुंचने के लिए। अलीट्यूब में अधिकतम 6 महीने के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर।
Representative Results
एनएसए का उपयोग करके प्राप्त एसवीजेड और डीजी न्यूरोस्फीयर, अविभेदित कोशिकाओं से बने होते हैं, Sox2 के लिए सकारात्मक, आत्म-नवीकरण क्षमता में शामिल एक प्रतिलेखन कारक और नेस्टिन के लिए सकारात्मक, एनएसपीसी(चित्रा 1ए)में व्यक्त एक मध्यवर्ती फिलामेंट प्रोटीन। इसके अलावा, एसवीजेड-व्युत्पन्न न्यूरोस्फीयर के अपने डीजी समकक्षों(चित्रा 1ए)की तुलना में बड़े आयाम हैं। महत्वपूर्ण बात यह है कि विभेदक परिस्थितियों में, एसवीजेड और डीजी-व्युत्पन्न एनएसपीसी कोशिकाओं के छद्म मोनोलेयर बनाने वाले न्यूरोस्फीयर से बाहर निकलते हैं(चित्र ा 1बी)।
आत्म-नवीकरण क्षमता तक पहुंचने के लिए, सेल जोड़ी परख Sox2 और नेटिन की अभिव्यक्ति के आधार पर किया जाता है जो कोशिकाओं को विभाजित करने में गायब हो जाता है जो न्यूरोनल वंश के मार्कर के संयोजन के साथ भेदभाव प्रक्रिया शुरू करते हैं, डीसीएक्स। न्यूरोजेनिक दोनों क्षेत्रों में, Sox2+/+/nestin+/+/DCX-/-सममित डिवीजनों (आत्म नवीकरण)(चित्रा 2A1,B1),Sox2-/+ /nestin-/+// DCX-/++/-विषम डिवीजनों(चित्रा 2A1, B2)और-/+Sox2-/-/nestin//-/DCX+/+ सममित विभाजन (भेदभाव)(चित्रा 2-/-A2, B1)।+/+-/- -/-
न्यूरोस्फीयर को पास करने से एनएसपीसी की उपज बढ़ जाती है; हालांकि, DIV2 में सेल मौत passaging के साथ बदलता है । वास्तव में, पीआई-पॉजिटिव कोशिकाओं का प्रतिशत एसवीजेड (पी0: 15.6% ± 1.2% बनाम पी 1: 19.2% ± 2.7% बनाम पी 2: 32.35% ± 0.14% बनाम पी 3: 39.6% ± 4.0%) और डीजी में (P0: 16.31% ± 0.95% बनाम पी 1: 32.1% ± 1.7% बनाम पी 2: 27.42% बनाम पी 3: 32.2% ± 3.1%) (चित्रा 3)।
भेदभाव की शुरुआत में एसवीजेड और डीजी एनएसपीसी के भेदभाव से प्राप्त न्यूरॉन्स में नियूरिटोजेनेसिस का मूल्यांकन किया जा सकता है: DIV1(चित्रा 4ए, डी),DIV2(चित्र4बी, ई)और DIV3(चित्रा 4सी, एफ)। वास्तव में, जैसा कि चित्र4में देखा गया है, न्यूराइट्स की लंबाई और असर भेदभाव के साथ बढ़ता है।
सेल प्रसार का मूल्यांकन एसवीजेड और डीजी-व्युत्पन्न न्यूरोस्फीयर में किया जा सकता है । SVZ से DIV1 में प्राथमिक विभेदित न्यूरोस्फीयर की तुलना(चित्रा 5A1)और डीजी(चित्रा 5A2),बीआरडीसी-पॉजिटिव कोशिकाओं का प्रतिशत डीजी (एसवीजेड: 6.15% ± 0.64% बनाम डीजी: 3.27% ± 0.13%; पी एंड लेफ्टिनेंट; 0.05; एन = 4; चित्रा 5A3)। इसके अलावा, सेल भेदभाव को एक परिपक्व निर्माता जैसे न्यूरोनल न्यूक्लिक (न्यून) के साथ बीआरडीयू धुंधला करके भी एक्सेस किया जा सकता है जो परिपक्व न्यूरॉन्स(चित्र5बी 1, बी 2)की पहचान करता है। चित्रा 5B3 से पता चलता है कि परिपक्व न्यूरॉन्स में अंतर करने वाले जनकों का प्रतिशत एसवीजेड और डीजी (एसवीजेड: 12.04% ± 1.58% बनाम डीजी: 13.56% ± 0.48%; पी एंड जीटी; 0.05; एन = 4) में समान है।
एसवीजेड और डीजी-व्युत्पन्न एनएसपीसी की तनेस और बहुशक्ति को विभिन्न भेदभाव दिनों (DIV2 और DIV7) पर विभिन्न मार्कर की अभिव्यक्ति का मूल्यांकन करके एनएसए का उपयोग करके एक्सेस किया जा सकता है । दरअसल, एनएससी (नेस्टिन-और ग्लियल फिब्रिलरी एसिडिक प्रोटीन [जीएफएपी]-डबल-पॉजिटिव कोशिकाएं) दोनों न्यूरोजेनिक क्षेत्रों(चित्रा 6ए, जी)में मौजूद हैं। ये कोशिकाएं अपरिपक्व न्यूरॉन्स (DCX-सकारात्मक कोशिकाओं)(चित्रा 6बी, एच),परिपक्व न्यूरॉन्स (NeuN-सकारात्मक कोशिकाओं)(चित्रा 6एफ, एल),ओलिगोडेन्ट्रोसाइट अग्रदूत कोशिकाओं (न्यूरॉन-ग्लियल एंटीजन 2 [NG2] और प्लेटलेट-में अंतर करने में सक्षम हैं व्युत्पन्न विकास कारक रिसेप्टर α [PDGFRα]- सकारात्मक कोशिकाएं)(चित्रा 6सी, मैं),परिपक्व ओलिगोडेन्ट्रोसाइट्स (मायलिन बेसिक प्रोटीन [एमबीपी]-सकारात्मक कोशिकाएं)(चित्रा 6ई,के)और एस्ट्रोसाइट्स (जीएफएपी-पॉजिटिव कोशिकाएं)(चित्रा 6डी, जे)।
विभिन्न सब्सट्रेट्स का उपयोग अलग-अलग परिस्थितियों में कोशिकाओं के छद्म मोनोलेयर बनाने के लिए कवरस्लिप को कोट करने के लिए किया जा सकता है। जैसा कि अनुपूरक चित्र 1में दिखाया गया है, डीजी कोशिकाएं तब अधिक प्रवास करती हैं जब कवरस्लिप में अकेले पीपीएल(अनुपूरक चित्र 1बी−एच)की तुलना में पीलो या पीडीएल के साथ मिलकर लेमिनिन के साथ अतिरिक्त कोटिंग होती है । वास्तव में, जब पीडीएल और लेमिनिन का उपयोग सब्सट्रेट्स(सप्लीमेंट्री फिगर 1सी, जी)के रूप में एक साथ किया जाता है, तो डीजी सेल एसवीजेड कोशिकाओं की तुलना में अधिक अनुकूल छद्म मोनोलेयर बनाते हैं जिसके लिए पीडीएल का उपयोग अकेले किया जाता है(अनुपूरक चित्रा 1A, ई)।
महत्वपूर्ण बात यह है कि ये परिणाम एनएसए की क्षमता को दो मुख्य न्यूरोजेनिक निकस से प्राप्त एनएससी के स्टेमनेस और बहुशक्ति गुणों का मूल्यांकन करने के लिए प्रदर्शित करते हैं ।
चित्रा 1: उपवेंट्रिकुलर जोन और डेनटेट जाइरस ने एनएसपीसी को न्यूरोस्फीयर के रूप में या छद्म मोनोलेयर के रूप में सुसंस्कृत किया। (A)प्रतिनिधि ब्राइटफील्ड(A1,A3)और फ्लोरेसेंस(A2,A4)एसवीजेड की छवियां- और डीजी-व्युत्पन्न न्यूरोस्फीयर, जहां न्यूक्लिसी को होक्सस्ट 33342 (ब्लू) और एनएससी के साथ Sox2 (ग्रीन) और नेस्टिन (लाल) के लिए दाग दिया गया था। (ख)अलग-अलग परिस्थितियों में एसवीजेड और डीजी-व्युत्पन्न न्यूरोस्फीयर से उत्पन्न छद्म मोनोलेयर की प्रतिनिधि ब्राइटफील्ड छवियां। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2: सेल जोड़ी परख । एक जनक सेल डिवीजन से प्राप्त सेल जोड़े के प्रतिनिधि फ्लोरेसेंस छवियां। एसवीजेड और डीजी न्यूक्लिय को Hoechst 33342 (नीला), Sox2 (लाल) और नेस्टिन (सफेद) के साथ-साथ डीसीएक्स (हरे) के साथ अपरिपक्व न्यूरॉन्स के लिए स्टेम जैसी कोशिकाओं के साथ दाग दिया गया था। पैनलों में एरोहेड्स A1 और B1 से संकेत मिलता है Sox2+/+/nestin+/-सममितआत्म-नवीनीकरण प्रभाग, पैनलों में तीर A1 और B2 Sox2+/-/-nestin+/-DCX-/+विषम डिवीजनों का संकेत मिलता है, पैनलों में धराशायी लाइन तीर A2 और B1 शो Sox2-/-/nestin-/-dcX +-/-+/सममित डिवीजनों-/- -/+ -/- कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 3: सेल पासिंग के साथ सेल सर्वाइवल एनालिसिस। एसवीजेड में DIV2 में पीआई-पॉजिटिव कोशिकाओं का मात्रात्मक विश्लेषण- और डीजी-व्युत्पन्न विभेदित न्यूरोस्फीयर संस्कृति, 0, 1, 2 और 3 मार्ग (पी0−पी 3) के बाद। डेटा मतलब ± एसईएम, एन = 1−8 के रूप में व्यक्त किया जाता है। पीआई = प्रोपिडियम आयोडाइड। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 4: DIV 1, 2 और 3 में Neuritogenesis विश्लेषण । एसवीजेड में न्यूराइट्स और डीजी न्यूरॉन्स(ए,डी)DIV1,(बी,ई)DIV2, और(सी, एफ)DIV3 में पहचाना गया न्यूराइट्स की प्रतिनिधि कॉन्फोकल फ्लोरेसेंस छवियां। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 5: सेल प्रसार परख । डीआईवी 1 में बीआरडीयू-पॉजिटिव कोशिकाओं की प्रतिनिधि कॉन्फोकल छवियां(A1)एसवीजेड और(A2)डीजी। (A3) डीजी में DIV1 में बीआरडीयू-पॉजिटिव कोशिकाओं का मात्रात्मक विश्लेषण- और एसवीजेड-व्युत्पन्न विभेदित न्यूरोस्फीयर संस्कृति। डेटा मतलब ± एसईएम, एन = 4 के रूप में व्यक्त किया जाता है। * टी-टेस्ट द्वारा पी एंड एलटी; 0.05। बीआरडीयू और न्यूएन-पॉजिटिव कोशिकाओं की प्रतिनिधि फ्लोरेसेंस छवियां DIV7 में(B1)एसवीजेड और(B2)डीजी । एरोहेड्स से पता चलता है BrdU-/NeuN-सकारात्मक कोशिकाओं । (B3) दोनों निकस में DIV7 में BrdU/NeuN-सकारात्मक कोशिकाओं का मात्रात्मक विश्लेषण । डेटा मतलब ± एसईएम, एन = 4 के रूप में व्यक्त किया जाता है। बीआरडीयू: 5-ब्रोमो-2'-डिऑक्सीयूडीन, सिंथेटिक थाइमिडीन एनालॉग। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 6: SVZ में मौजूद तंत्रिका कोशिका प्रकार- और डीजी-व्युत्पन्न विभेदित न्यूरोस्फीयर संस्कृति। न्यूरोस्फीयर भेदभाव (DIV2 और DIV7) के 2 और 7 दिनों के बाद एसवीजेड-और डीजी-व्युत्पन्न सेल प्रकारों की प्रतिनिधि फ्लोरेसेंस छवियां, जहां सेल न्यूक्लिय को Hoechst 33342 (नीला) के साथ दाग दिया गया था और:(ए, जी)GFAP (ग्रीन) और नेटिन (लाल),(बी, एच)अपरिपक्व न्यूरॉन के लिए एनएससी DCX (ग्रीन),(सी,I)F,LPDGFRα (हरे) और NG2 (लाल),(D,J)GFAP (हरे),(ई, कश्मीर)एमबीपी (हरे रंग) के लिए परिपक्व ओलिगोडेन्ट्रोसाइट्स के लिए ओलिगोडेन्ट्रोसाइट्स के लिए ओलिगोडेन्ट्रोसाइट्स के लिए ओलिगोडेन्रोसाइट्स के लिए ओलिगोडेन्रोसाइट्स के लिए कोशिकाओं के लिए कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
अनुपूरक चित्र 1: न्यूरोस्फीयर पालन और छद्म मोनोलेयर बनाने के लिए माइग्रेशन के लिए विभिन्न सब्सट्रेट्स का परीक्षण करना। एक सब्सट्रेट के रूप में पॉली-डी-लाइसेन का उपयोग करके(ए,ई)एसवीजेड-व्युत्पन्न छद्म मोनोलेयर की प्रतिनिधि फ्लोरेसेंस छवियां,(बी,एफ)डीजी-व्युत्पन्न छद्म मोनोलेयर पॉली-डी-लाइसिन का उपयोग करके एक सब्सट्रेट के रूप में,(सी, जी)डीजी-व्युत्पन्न छद्म मोनोलेयर पॉली-डी-लाइसिन का उपयोग करके लेमिनिन के साथ एक सब्सट्रेट के रूप में, और(डी, एच-व्युत्पन्न छद्म मोनोलेयर पॉली-डी-लाइसिन का उपयोग करके पॉली-एल-ऑर्निथिन के रूप में। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
Discussion
एनएसपीसी की इन विट्रो प्रणालियां सेलुलर और आणविक तंत्र ों की बेहतर समझ की अनुमति देती हैं, जिसे वीवो में और मान्य किया जा सकता है। एनएसए अपने त्रिआयामी ढांचे के कारण शारीरिक परिस्थितियों की नकल करने का एक बहुत शक्तिशाली तरीका है । इसके अलावा, इस संस्कृति प्रणाली को तकनीकी रूप से10संस्कृति के लिए भी आसान है, मोनोलेयर संस्कृति प्रणाली जैसे अन्य इन विट्रो प्रणालियों की तुलना में। दरअसल, एनएसए के साथ, सेल विकास के दौरान उजागर बाह्य संकेतों को नियंत्रित करना आसान है, या तो विस्तार या भेदभाव चरण के दौरान, मीडिया के लिए ब्याज के कारकों की सटीक और चर मात्रा को जोड़कर और साथ ही अन्य सेल प्रकार6के साथ न्यूरोस्फीयर को संजोकर। इसके अलावा, एनएसए में मोनोलेयर संस्कृतियों की तुलना में, थोड़ी मात्रा में ऊतक या छोटी संख्या में कोशिकाओं के साथ उच्च कोशिका घनत्व प्राप्त करना संभव है, जिससे समानांतर अध्ययन किए जा सकते हैं, इस प्रकार जानवरों की संख्या कम हो जाती है1।
एनएसए एनएससी11,,12,,13को अलग-थलग और विस्तारित करने का सबसे आम तरीका है, जिसका उपयोग किसी दिए गए ऊतक नमूने5 में मौजूद अग्रदूत कोशिकाओं की संख्या और विभिन्न स्थितियों के बीच अग्रदूत कोशिका आवृत्ति का अनुमान लगाने के लिए किया जा सकता है । हालांकि, न्यूरोस्फीयर और मोनोलेयर दोनों संस्कृतियां14से मतभेद नहीं करती हैं। इसके अलावा, एनएसए की कुछ सीमाएं11,12,,13 हैं और परिणामस्वरूप न्यूरोस्फीयर फ्रीक्वेंसी मध्यम घटकों, विच्छेदन प्रक्रिया, विच्छेदन प्रक्रिया11,5,12,,13और न्यूरोस्फीयर एग्रीग्रेशन 5 सहित कई कारकों पर निर्भर करती है । दरअसल, एक उच्च घनत्व संस्कृति में, न्यूरोस्फीयर कुल करते हैं। नतीजतन, एक नमूने में अग्रदूत कोशिकाओं की संख्या का आकलन करते समय सावधानी बरती जानी चाहिए। उपरोक्त सीमाओं को दूर करने के लिए, अलग-थलग पड़े एनएसपीसी का विस्तार किया जा सकता है और मोनोलेयर5,15में पारित किया जा सकता है। महत्वपूर्ण बात, एनएसए का उपयोग करने के लिए विभिन्न स्थितियों के बीच अग्रदूत सेल आवृत्ति की तुलना बहुत उपयोगी और सटीक है क्योंकि इन सभी सीमाओं अंतर्निहित और सभी एक ही प्रयोग में प्रदर्शन शर्तों के बीच समान हैं.
न्यूरोस्फीयर संस्कृति में महत्वपूर्ण कदम हैं जिन पर ध्यान देने की आवश्यकता है। मस्तिष्क संचयन चरण में, एनएसपीसी की शुद्धता और उपज को अधिकतम करने के लिए मेनिंग्स को पूरी तरह से हटाना और न्यूरोजेनिक निकस का अच्छा अलगाव आवश्यक है। ऊतक विच्छेदन के दौरान, ट्राइप्सिन की प्रोटेलिटिक गतिविधि के कारण, ट्राइप्सिन या इनक्यूबेशन समय का अत्यधिक उपयोग कोशिका लिसिस का कारण बन सकता है। इसके अलावा, पारित होने का दिन न्यूरोस्फीयर की स्वस्थ आबादी प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है। 200 माइक्रोन से अधिक व्यास वाले न्यूरोस्फीयर को एनपीपीसी की व्यवहार्यता, प्रसारशील और विभेदक क्षमता को बहुत प्रभावित करता है। महत्वपूर्ण बात यह है कि मार्ग के लंबे चक्र, 10 से अधिक आनुवंशिक अस्थिरता6को बढ़ा सकते हैं। इसके अलावा, भेदभाव प्रक्रिया से समझौता किए बिना न्यूरोस्फीयर से बाहर अच्छे सेल माइग्रेशन को सुनिश्चित करने के लिए क्रमशः एसवीजेड और डीजी कोशिकाओं के लिए पीडीएल और पीएलडी/लेमिनिन के साथ कोटिंग आवश्यक है । इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री एनालिसिस के लिहाज से पीएफए के साथ अब इनक्यूबेशन बार एंटीजन को मास्किंग करके और बैकग्राउंड बढ़ाकर धुंधला करने से समझौता कर सकते हैं ।
एनएसए तंत्रिका विकास और भेदभाव के साथ - साथ चिकित्सीय प्रयोजनों के लिए16,17के इन विट्रो अध्ययनों के लिए एनएसपीसी का एक सुसंगत और असीमित स्रोत प्रदान करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है । दरअसल, एनएसपीसी प्रसार और भेदभाव18,,19में शामिल आणविक और सेलुलर तंत्र को समझने के लिए इस परख को आनुवंशिक और व्यवहार मॉडलों पर लागू किया जा सकता है। यह परख एनएससी गुणों को मिलाने के लिए विभिन्न दवाओं और यौगिकों20,,21,,22 के साथ-साथ आनुवंशिक जोड़तोड़19,,23 को करने के लिए भी उपयोगी है। इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री के अलावा, रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन पॉलीमरेज चेन रिएक्शन और वेस्टर्न ब्लॉट एना और प्रोटीन एक्सप्रेशन तक पहुंचने के लिए वेस्टर्न ब्लॉट एना किया जा सकता है, जबकि इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल स्टडीज और कैल्शियम इमेजिंग का इस्तेमाल नवजात न्यूरॉन्स21के फंक्शन का मूल्यांकन करने के लिए किया जा सकता है ।
Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
इस काम को आईएफ/01227/2015 और यूआईडी/बीआईएम/50005/2019 ने समर्थन दिया था, प्रोजेटो फिनांसिडो पेला फंडाकाओ पैरा ए सिएनसिया ई ए टेक्नोलोगिया (एफसीटी)/मिनीस्टेरियो दा सिएनसिया, टेक्नोलोजिया ई एनसिनो सुपीरियर (एमसीटीईएस) एट्रावेस डी फंडोस डो ओरकामेंटो डी एस्टाडो । आरएस (एसएफआरएच/बीडी/128280/2017, एफएफआर (आईएमएम/सीटी/35-2018), डी.एम.एल. (पीडी/बीडी/141784/2018), और आर.एस.आर. (एसएफआर/बीडी/129710/2017) को एफसीटी से फेलोशिप मिली। लेखक माइक्रोस्कोपी सहायता के लिए इंस्टीटो डी मेडिसिना मॉलिक्यूलर जोआओ लोबो एंट्यून्स में बायोइमेजिंग सुविधा के सदस्यों को धन्यवाद देना चाहते हैं।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1X) | Gibco | 25300-054 | |
| 0.4% Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich | T8154-20ML | |
| 12mm Glass coverslips | VWR | 631-1577 | |
| 15mL Centrifuge Tube | Corning | 430791 | |
| 5-bromo-2'-deoxyuridine | Sigma-Aldrich | B9285-1G | |
| 50 mL Centrifuge Tube | Corning | 430829 | |
| 70% Ethanol | Manuel Vieira & Cª (Irmão) Sucrs, Lda | UN1170 | |
| Adhesion slides, Menzel Gläser, SuperFrost Plus | VWR | 631-9483 | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-chicken IgG (H+L) | Life Technologies | A11039 | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Life Technologies | A21206 | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-rat IgG (H+L) | Life Technologies | A21208 | |
| Alexa Fluor 568 donkey anti-mouse IgG (H+L) | Life Technologies | A10037 | |
| Alexa Fluor 568 donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Life Technologies | A10042 | |
| Alexa Fluor 647 goat anti-mouse IgG (H+L) | Life Technologies | A21235 | |
| Anti-5-Bromo-2-Deoxyuridine | Dako | M0744 | |
| Anti-CD140a (PDGFRα) (rat) | BD Biosciences | 558774 | Dilute at a ratio 1:500. |
| Anti-Chondroitin Sulphate Proteoglycan NG2 (rabbit) | Merck Milipore | AB5320 | Dilute at a ratio 1:200. |
| Anti-Doublecortin (rabbit) | Abcam | ab18723 | Dilute at a ratio 1:200. |
| Anti-Doublecortin (chicken) | Synaptic Systems | 326006 | Dilute at a ratio 1:500. |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (rabbit) | Sigma-Aldrich | G9269-.2ML | Dilute at a ratio 1:1000. |
| Anti-Myelin Basic Protein (rabbit) | Cell Signalling Technology | 78896S | Dilute at a ratio 1:200. |
| Anti-Nestin (mouse) | Merck Milipore | MAB353 | Dilute at a ratio 1:200. |
| Anti-Neuronal Nuclei (mouse) | Merck Milipore | MAB377 | Use 6% BSA in PBS 1X. Dilute at a ratio 1:400. |
| Anti-SOX2 (rabbit) | Abcam | ab97959 | Dilute at a ratio 1:500. |
| Anti-Tubulin β3 (rabbit) | BioLegend | 802001 | Dilute at a ratio 1:200. |
| Axiovert 200 wide field microscope | ZEISS | ||
| B-27 Supplement (50X), serum free | ThermoFisher | 17504044 | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B6768-500g | |
| Bovine Serum Albumin | NZYTech | MB04602 | |
| Cell counting chamber, Neubauer | Hirschmann | 8100104 | |
| Cell culture CO2 incubator | ESCO | CCL-170B-8 | |
| Corning Costar TC-Treated 24 Multiple Well Plate | Corning | CLS3524-100EA | |
| di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate | Merck Milipore | 1.06580.1000 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX Supplement | ThermoFisher | 31331028 | |
| Dumont #5 - Fine Forceps | FST | 11254-20 | |
| Dumont #5S Forceps | FST | 11252-00 | |
| Dumont #7 Forceps | FST | 11272-30 | |
| Epidermal growth factor | ThermoFisher | 53003018 | |
| Fibroblast growth factor | ThermoFisher | 13256029 | |
| Filter papers | Whatman | 1001-055 | |
| Fine Scissors - Sharp | FST | 14060-09 | |
| Gillete Platinum 5 blades | Gillette | ||
| HBSS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher | 14175053 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | 1399 | |
| Hydrochloric acid | Merck Milipore | 1.09057.1000 (1L) | |
| Labculture Class II Biological Safety Cabinet | ESCO | 2012-65727 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| McILWAIN Tissue Chopper | The Mickle Laboratory Engineering CO. LTD. | MTC/2 | Set to 450 μm |
| Micro Spatula - 12 cm | FST | 10091-12 | |
| Micro tube 0.5 mL | SARSTEDT | 72.699 | |
| Micro tube 1.5 mL | SARSTEDT | 72.690.001 | |
| Micro tube 2.0 mL | SARSTEDT | 72.691 | |
| NeuroCult Chemical Dissociation Kit (Mouse) | Stem Cell | 5707 | |
| Olympus microscope SZ51 | Olympus | SZ51 | |
| Paraformaldehyde, powder | VWR | 28794.295 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Petri dishes 60 mm | Corning | 430166 | |
| Phosphate standard solutions, PO43 - in water | BDH ARISTAR | 452232C | |
| Poly-D-Lysine 100mg | Sigma-Aldrich | P7886 | |
| Poly-L-ornithine solution | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405-250g | |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4170-25MG | |
| Sodium chloride | VWR | 27800.360.5K | |
| Sodium Hydroxide | Merck Milipore | 535C549998 | |
| Triton X-100 | BDH | 14630 | |
| VWR INCU-Line IL10 | VWR | 390-0384 |
References
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