Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

استجواب مواز لـ α-Arrestin2 تجنيد لـ Ligand الفحص على نطاق GPCR على نطاق واسع باستخدام PRESTO-Tango assay

Published: March 10, 2020 doi: 10.3791/60823

Summary

وبالنظر إلى أن الـ GPCRs أهداف جذابة قابلة للتخدير، فإن فحص GPCR ligand أمر لا غنى عنه لتحديد مركبات الرصاص ودراسات إزالة التيتم. نحو هذه الجهود، ونحن نصف PRESTO-Tango، منصة موارد مفتوحة المصدر تستخدم للتنميط المتزامن للتجنيد العابر في حوالي 300 GPCRs باستخدام تقييم مراسل TEV.

Abstract

باعتبارها أكبر وأكثر تنوعا الجينات superfamily والوسطاء من سلسلة من مسارات الإشارات الخلوية، G-البروتين مقرونة مستقبلات (GPCRs) تمثل واحدة من الأهداف الواعدة لصناعة الأدوية. Ergo ، وتصميم وتنفيذ وتحسين GPCR ligand فحص المقالات أمر بالغ الأهمية ، لأنها تمثل أدوات التحكم عن بعد لاكتشاف المخدرات والتلاعب الدوائية GPCR والنتائج. في الماضي ، كانت المقالات المعتمدة على البروتين G تجسد هذا المجال من البحث ، واكتشاف الأحداث الناجمة عن ligand وتحديد عدد الرسل الثانويين. ومع ذلك ، منذ ظهور الانتقائية الوظيفية ، فضلا عن زيادة الوعي بعدة مسارات أخرى G المستقلة عن البروتين والقيود المرتبطة بمقالات G-البروتين تعتمد ، هناك دفعة أكبر نحو خلق بديل GPCR ligand فحص المقالات. نحو هذا المسعى ، ونحن نصف تطبيق واحد من هذه الموارد ، ومنصة PRESTO - Tango ، وهو نظام قائم على مراسل luciferase التي تمكن من الاستجواب المتوازي والمتزامن للGPCR -ome الإنسان ، وهو إنجاز كان ينظر فيه سابقا من الناحية الفنية والاقتصادية غير مجدية. واستناداً إلى اختبار تجنيد مستقل من نوع G-protein-ed-arrestin2، فإن عالمية الاتجار ببوساطة α-arrestin2 والإشارة في GPCRs تجعل PRESTO-TANGO أداة ملائمة لدراسة ما يقرب من 300 من وحدات GPCRs البشرية غير الشمية، بما في ذلك ما يقرب من 100 مستقبلات اليتيم. حساسية PRESTO-Tango وقوتها تجعلها مناسبة للشاشات الأولية عالية الإنتاجية باستخدام المكتبات المركبة ، وتستخدم للكشف عن أهداف GPCR جديدة للأدوية المعروفة أو لاكتشاف ليغاند جديدة للمستقبلات اليتيمة.

Introduction

تشكل مستقبلات البروتين G-المقترنة (GPCRs) أكبر عائلة وأكثرها تنوعًا من البروتينات عبر الغشاء ، وتعمل كواجهات اتصال بين الخلية وبيئتها1. ويبرز براعة GPCRs من خلال قدرتها على الكشف عن مجموعة متنوعة من ligands - من الناقلات العصبية إلى النيوكليوتيدات ، والببتيدات إلى الفوتونز ، وغيرها الكثير ، فضلا عن قدرتها على تنظيم العديد من الشلالات إشارات المصب المشاركة في النمو الخلوي ، والهجرة ، والتمايز ، وموت الخلايا المبرمج ، وإطلاق الخلايا ، وما إلى ذلك2،3. وبالنظر إلى انتشارها ومشاركتها في العديد من العمليات الفسيولوجية ، فإن هذه العائلة المستقبلة ذات أهمية علاجية قصوى ، ويتضح ذلك من خلال حقيقة أن أكثر من ثلث الأدوية الموصوفة المتاحة حاليًا تستهدف GPCRs4. ومع ذلك، تستهدف هذه العلاجات الموجودة فقط مجموعة فرعية صغيرة من الأسرة الخارقة (ما يقدر بـ 10٪)، ولا يزال علم الأدوية للعديد من وحدات المعالجة بالأدوية الوراثية غير مُستوضح. وعلاوة على ذلك، أكثر من 100 GPCRs موجودة كمستقبلات اليتيم، كما أنها لم تكن مطابقة مع ligand الذاتية5. وبالتالي ، فإن فحص GPCR ligand أمر بالغ الأهمية في إزالة التيتم وتطوير الدواء ، لأنه يمهد الطريق نحو اكتشاف الرصاص والتحسين ، وربما إلى مرحلة التجربة السريرية.

وقد انخفضت أساليب فحص جي بي سي جي ليغاند تقليديا في واحدة من فئتين، G-البروتين تعتمد أو G-البروتين مستقل مقالات وظيفية6. يتم تنظيم إشارات GPCR من قبل البروتينات G-البروتينات الغيرية (Gααα) ، والتي يتم تنشيطها من خلال تبادل GTP للناتج المحلي الإجمالي المقيد على الوحدة الفرعية Gα7. يتم نقل الإشارات من المستقبلات المنشطة بواسطة G-proteins عبر الرسل الثانوية ، مثل cAMP ، الكالسيوم ، DAG ، و IP3 ، للتوسط في إشارات المصب في المؤثرات المصب8. وقد استغلت طبيعة العواقب الوظيفية للإشارة G-البروتين لإنشاء الخلايا القائمة على المقالات التي تعكس تنشيط مستقبلات. هذه الأساليب، التي تقيس الأحداث القريبة (المباشرة) أو البعيدة (غير المباشرة) في إشارات G-protein، تستخدم في أغلب الأحيان لفحص GPCR ligand وقد استخدمت بشكل رئيسي في دراسات إزالة التيتم6. أمثلة على الاختبارات التي تقيس مباشرة GPCR بوساطة تنشيط G-البروتين تشمل [35S] GTPаS ملزمة للتحليل، الذي يقيس ملزمة من التسمية الإشعاعية وغير hydrolyzable GTP التناظرية إلى الوحدة الفرعية Gα، وFörster / bioluminescence نقل الطاقة بالرنين (FRET / بريت، على التوالي) تحقيقات لرصد GPCR-Gα وGα / Gα التفاعلات، والتي تم كسب المزيد من الجر على مدى السنوات10. المقالات التي ترصد الأحداث البعيدة هي الأدوات الأكثر استخدامًا لتنميط GPCR؛ على سبيل المثال، يقيس cAMP وIP1/3 التراكم داخل الخلايا للرسل الثانويين المعتمدين على G-protein، في حين أن [Ca2+]التدفق ومقالات المراسل ة التي تنطوي على عناصر استجابة محددة متورطة في تنشيط G-protein (CRE، NFAT-RE، SRE، SRF-RE) تفحص الأحداث بشكل أكبر في اتجاه التعاقب الالإشارات11. في حين أن معظم المقالات المذكورة أعلاه يمكن أن يتم إجراؤها على مستوى الإنتاجية العالية، حساسة إلى حد ما ، وتتباهى ببعض المزايا الخاصة بالقياس (على سبيل المثال ، التمييز بين الناهضات الكاملة / الجزئية ، والخصوم المحايدين والمناهضين العكسيين في حالة ربط GTPаS ، أو وظيفة القياس على الخلايا الحية مثل [Ca2 +] و IP1/3)6، للأسف لا توجد طرق تعتمد على البروتين G تناسب استجواب GPCR-ome القابل للتخدير بالكامل. ويرجع ذلك إلى حد كبير إلى اقتران الأصلي من الأسر الفرعية G-البروتين متعددة إلى GPCRs، مما أدى إلى إشارات في العديد من السلاسل التعاقبية واقتران البروتين G غير معروف في GPCRs اليتيم. للتخفيف من هذه المسألة، وقد وضعت المقالات لفرض مشوش G-البروتين اقتران من خلال إشارة واحدة مشتركة القراءة، مثل cAMP، وكاليفورنيا2 +، وإن كان معظمهم من الإنتاجية المنخفضة12.

أحد الجوانب الهامة في دورة حياة GPCR هو إنهاء الإشارات المعتمدة على البروتين G ، والتي تحدث في جزء كبير منها من خلال تجنيد α-arrestins الذي يؤدي إلى تفكك بروتين G ، وفي نهاية المطاف إزالة الحساسية من المستقبل ، والتي تستهدف الاستيعاب الداخلي المغلف بالكلاترين13. الأشكال المتساوية الأكثر تعبيراً في كل مكان من α-arrestin هي α-arrestin1 و α-arrestin2 غير البصرية، المشار إليها أيضاً باسم arrestin-2 وarrestin-3، على التوالي14. أدخل G-البروتين المستقلة الخلايا القائمة على المقالات, التي تضيف بعدا جديدا لفحص LIGAND GPCR; مستقبلات الاتجار، خلية كاملة خالية من التسمية، ومقال التوظيف α-arrestin كلها أمثلة بارزة. اختبارات الاتجار GPCR تستخدم الليغاند المسمى الفلوروفورأو الأجسام المضادة المشتركة التي تستهدفالمستقبلات 15، في حين تستخدم اختبارات الخلايا الكاملة الخالية من التسمية أجهزة الاستشعار الحيوية التي تترجم التغيرات الخلوية الناجمة عن الربط بالليجة إلى مخرجات قابلة للقياس الكمي ، مثل الإشارات الكهربائية أو البصرية16. وتجدر الإشارة إلى أن تفاعلات GPCR-α-arrestin الجوهرية تُعنى بعملية اختبار التوظيف باعتبارها أداة جذابة في ذخيرة المقالات الجوهرية17. نظام التانغو، الذي طوره بارينا وآخرون قبل عقد واحد فقط، ينطوي على إدخال ثلاثة عناصر وراثية خارجية: مزيج البروتين يتكون من α-arrestin2 مع بروتياز فيروس حفر التبغ (TEVp)، وهو محول التتراسيكلين (tTA) الذي يرتبط GPCR عن طريق فيروس حفر التبغ موقع انشقاق البروتياز (TEVcs) ويسبقه تسلسل من C-terminus من مستقبلات V2 فاسوبريسين (V2 الذيل) لتعزيز تجنيد arrestin، وجين لوسيفيراز المراسل الذي يتم تشغيل النسخ من قبل tTA نسخ عامل نقل إلى نواة، والتي يتم تحريرها من رسو الغشاء بعد تجنيد α-arrestin2(الشكل 1)18. ويمكن بعد ذلك تحديد القراءات الكمية لتفعيل GPCR وتجنيد α-arrestin2 من خلال القراءة للتلأل. وثمة تمييز ملحوظ هو أنه في حين أن الاتجار بالمستقبلات وطرق الخلايا الكاملة الخالية من التسمية منخفضة الإنتاجية نسبيًا ، فإن التانغو له العديد من المزايا ، بما في ذلك القراءة الانتقائية الخاصة بالمستقبل المستهدف والحساسية بسبب تكامل الإشارة ، مما يجعله مرشحًا مناسبًا لفحص ligand على نطاق أوسع18.

في ضوء هذه الميزات الاستراتيجية ، طورت Kroeze وآخرون PRESTO-Tango (التعبير المتوازي للمستقبلات -ome والفرز عبر النسخ الإخراج -Tango) ، وهي منصة مفتوحة المصدر عالية الإنتاجية تستخدم نهج Tango لتوصيف GPCR-ome القابل للتخدير بطريقة متوازية ومتزامنة19. استغلال "مشوش" تجنيد α-arrestin2 إلى ما يقرب من جميع GPCRs، PRESTO-Tango هو الأول من نوعه من حيث الاختبارات الوظيفية القائمة على الخلية، مما يتيح الفحص السريع "الجولة الأولى" من مركبات الجزيئات الصغيرة في جميع GPCRs تقريبا غير الشمية، بما في ذلك الأيتام، مستقلة عن اقتران الأسرة الفرعية G-البروتين.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. الفحص الأولي: زراعة الخلايا وبذر الصفيحة

  1. لإعداد لوحات بولي-L-ليسين (PLL)، الاستغناء 20 ميكرولتر/بئر من 25 ميكروغرام/مل من محلول الأسهم PLL في الأبيض أو الأسود 384-well لوحات القاع البصرية باستخدام ماصة متعددة القنوات الإلكترونية أو موزع كاشف. احتضان لوحات في درجة حرارة الغرفة لمدة 0.5-2 ساعة.
    ملاحظة: إذا كنت تستخدم اللوحات السوداء 384-well، فتوقع أن تكون إشارة الخلفية أقل مقارنة باللوحات البيضاء. يوصى باللوحات السوداء للحد من النزيف من خلال التلألؤ بين الآبار المجاورة.
  2. للحفاظ على لوحات المغلفة وغسل قبالة PLL الزائدة، وإزالة PLL عن طريق النقر عليه على الحوض، والاستفادة الجافة على منشفة ورقية، وإضافة 40 ميكرولتر / جيدا من محلول 1x المخفف من المضادات الحيوية المضادة للميكولتيك باستخدام ماصة متعددة القنوات الإلكترونية أو موزع كاشف. تخزين لوحات PLL المغلفة في 4 درجة مئوية حتى جاهزة للبذر لوحة.
  3. الحفاظ على خلايا HTLA (التكرم المقدمة من قبل الدكتور ريتشارد أكسل) - خط خلية الكلى الجنينية البشرية (HEK293T) صريحة بشكل ثابت عبر α-arrestin2-TEV و luciferase tTA-riven-riven-in كامل دولبكو تعديل النسر المتوسطة (DMEM) تستكمل مع 5٪ من مصل الأبقار الجنين، 5% من مصل العجل البقري، 2.5 ميكروغرام/مل من البوروميسين، 50 ميكروغرام/مل من الهيغروماسين، 100 يو/مل البنسلين، و100 ميكروغرام/مل ستربتوموسين عند 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة تحتوي على 5% ثاني أكسيد الكربون2.
  4. خلايا HTLA الثقافة في أطباق 150 ملم وتمرير الخلايا مرتين في الأسبوع في عامل تخفيف من 1:10، مع عدد مرور الخلية الأمثل من 5-25. تأكد من أن عددًا كافيًا من الأطباق مقاس 150 مم مالًا مُلحّة في يوم بذر الصفيحة 384 بئرًا ، اعتمادًا على حجم الشاشة الأساسية.
    ملاحظة: قد يؤدي استخدام خلايا HTLA أكبر من المقطع 25 إلى انخفاض القدرة على البقاء، مما يؤدي إلى نتائج دون المستوى الأمثل.
  5. لبذور خلايا HTLA للشاشة الأساسية، شطف بلطف الطبق (es) 150 مم المحيرة مع 1x الفوسفات العازلة المالحة (PBS)، درجة الحموضة 7.4. فصل الخلايا مع ما يقرب من 6 مل من 0.05٪ التربسين/0.53 mM EDTA، ونقل إلى أنبوب الطرد المركزي التي تحتوي على ما لا يقل عن كمية متساوية من كامل دولبيكو في المتوسط النسر المعدلة (DMEM) لتحييد التربسين.
  6. قم بتدوير خلايا HTLA عند 500 × ز لمدة 3 دقيقة وإعادة تعليق بيليه الخلية بكثافة 0.22 × 106 خلايا / مل في DMEM كاملة ، مع حذف إضافة 2.5 ميكروغرام / مل من البوروميسين و 50 ميكروغرام / مل من الهيغروميسين لأنها يمكن أن تقلل من فعالية الإرسال.
  7. احتضان لوحات 384-well-pLL المغلفة في 37 درجة مئوية لتدفئة لهم قبل البذر الخلايا. قم بإزالة محلول التخزين من 1x مضاد المضادات الحيوية- الأميكتيك من لوحة (ق) PLL المغلفة 384-well-PLL عن طريق النقر على لوحة فوق الحوض وتسجيله على منشفة ورقية لتجف.
  8. خلايا البذور في 384 جيدا PLL المغلفة لوحات في الكثافة النهائية من 10000 خلية / جيدا عن طريق الاستغناء 45 ميكرولتر من تعليق 0.22 × 106 خلايا / مل HTLA باستخدام أنبوب متعدد القنوات الإلكترونية. لوحات احتضان في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. إذا كان يفضل الترانفسيف في نفس اليوم، خلايا البذور بكثافة 16،000 الخلايا / جيدا وأداء transfection 4 ح في وقت لاحق.
    ملاحظة: للحصول على كفاءة نقل عالية، 50-70٪ التقاء الخلية هو الأمثل.

2. الفحص الأولي: إعداد لوحة الحمض النووي وtransfections

  1. لإعداد لوحة مصدر الحمض النووي 384-well للتطفل كما هو موضح في الشكل 2، قم بتوزيع cDNAs البلازميد ترميز بنيات GPCR-Tango ذات الاهتمام في لوحة 96-well ، مع GPCR /well مختلفة. وينبغي تعليق الحمض النووي البلازميد في 0.1x تريس-EDTA (TE) عازلة بتركيز 50 نانوغرام/ميكرولتر.
    ملاحظة: يمكن إغلاق لوحات الحمض النووي 96-well وتخزينها عند -20 درجة مئوية، وإعادة استخدامها في تجارب فحص متعددة. جميع cDNA ترميز GPCR-Tango يبني متوفرة تجاريا (انظر جدول المواد)ويتم استنساخها في pcDNA3.1 neomycin plasmid. تتكون مجموعة PRESTO-Tango GPCR من أربعة لوحات تحتوي على 96 بئرًا ، والتي تشمل 80 GPCRs لكل منها ، واثنين من الآبار ذات المتجه الفارغ كعناصر تحكم سلبية ، وآبار تحكم إيجابية تحمل مستقبلات الدوبامين D2 (DRD2) ، والآبار التي تحمل ترميزًا بلازميدًا بروتين فلوري (YFP) لتتبع كفاءة التغوط.
  2. باستخدام ماصة متعددة القنوات، قم بنقل محلول الحمض النووي يدويًا من 96-well إلى لوحة مصدر الحمض النووي 384-well، مما يضيف 10 ميكرولتر لكل 384 بئرًا. لضمان أن يتم فحص كل حالة من شروط التجربة في رباعية، نصف لوحة الحمض النووي 96-well (الصفوف A-D أو E-H) سوف تغطي لوحة كاملة 384-well عن طريق توزيع كل GPCR في الربعين (الربع الأول = - مركب، الربع الثاني = + مركب)، بحيث سيتم نقل GPCR نفسه في 8 آبار من لوحة 384-well (انظر الشكل 2 كدليل).
  3. تجميع الكواشف الترانفية التالية اللازمة لطريقة هطول الأمطار فوسفات الكالسيوم، كما وصفها الأردن وآخرون20:0.1x TE المخزن المؤقت (1 mM Tris-HCl و 0.1 mM EDTA)؛ 2.5 M CaCl2 الحل؛ 2x العازلة Hepes، درجة الحموضة 7.05 (50 mM HEPES، 280 mM NaCl، 1.5 mM Na2HPO4). قم بتعقيم جميع الحلول عن طريق الترشيح وتخزينها عند درجة حرارة 4 درجات مئوية. يوم الترانزفيشن، والسماح للكواشف للوصول إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام.
  4. تمييع 2.5 M CaCl2 حل الأسهم في 0.1x TE (1:8 تخفيف) إلى تركيز نهائي من 0.313 M CaCl2 والدوامة. نقل 40 ميكرولتر من 0.313 M CaCl2 إلى لوحة مصدر الحمض النووي 384-well ومزيج عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا مع ماصة متعددة القنوات باليد أو على مقاعد البدلاء الآلي 384 قناة pipettor.
  5. إضافة 50 ميكرولتر من 2x العرافة العازلة إلى لوحة مصدر الحمض النووي 384-well, مزيج مرة أخرى عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا والسماح للوقوف لمدة 1 دقيقة; كل 384-جيدا سيكون كمية كافية من الحمض النووي / خليط transfection لنقل تسعة لوحات 384-well, اعتمادا على عدد من المركبات التي تحتاج إلى اختبار. نقل 10 ميكرولتر من خليط الحمض النووي/ الترانسفير من لوحة مصدر الحمض النووي 384 بئر إلى خلايا HTLA المزروعة واحتضان اللوحات بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية.

3. الفحص الأولي: تحفيز الخلايا

  1. بعد 24 ساعة، قم بإزالة الخلايا المنقولة عن طريق النقر بلطف على لوحة 384-well على الحوض وتسجيله فوق منشفة ورقية، أو برأس طاب. إضافة ببطء 40 ميكرولتر من وسائل الإعلام المتضورة جوعا (DMEM تكملها مع 1٪ مصل الأبقار الجنينية (dFBS) و 1x المضادات الحيوية / antimycotic)، مع الحرص على تجنب لمس الخلايا مباشرة.
  2. Pipet 20 μL من مركب الفائدة في تركيز 3x (التركيز النهائي للدواء في لوحة الخلية سيكون 1x) في الصفوف بالتناوب مع (+) التحفيز، و 20 ميكرولتر من الحاجز مركبة للصفوف بالتناوب دون (-) مركب. عودة لوحة الخلية في 37 درجة مئوية في 5٪ CO2 واحتضان لمدة لا تقل عن 16 ساعة.

4. الفحص الأولي: قراءة الإنارة

  1. إعداد كاشف غلو, تعديل من بيكر وبويس21: 108 mM تريس-HCl; 42 mM Tris-Base, 75 m M NaCl, 3 mM MgCl2, 5 mM Dithiothrei-tol (DTT), 0.2 mM إنزيم A, 0.14 ملغم/مل D-لوسيفيرين, 1.1 mM ATP, 0.25% v/v Triton X-100, 2 mM هيدروسولفيت الصوديوم.
    ملاحظة: يمكن إجراء حلول المخزون من الكواشف مقدما، باستثناء D-لوسيفيرين، الذي يتم إضافته دائما طازجة إلى كاشف غلو في شكله مسحوق. إذا تم استخدام لوحات سوداء، يمكن زيادة كمية D-لوسيفيرين تصل إلى 0.25 ملغ/مل.
  2. في 16-24 ساعة بعد التحفيز, decant وسائل الإعلام الخلايا المنقولة عن طريق النقر بلطف لوحة 384 جيدا على الحوض وتسجيله على منشفة ورقية. إضافة 20 ميكرولتر / بئر من الكاشف غلو واحتضان لوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 5-20 دقيقة. قراءة لوحات باستخدام عداد التلألؤ لوحة صغيرة، مع وقت التكامل من 1 ق / حسنا.

5- الفحص الأولي: تحليل البيانات

  1. تصدير الملفات المحفوظة من عداد الإنارة كجدول بيانات؛ سيتم تسجيل النتائج في وحدات التلألؤ النسبي (RLU). استنادا إلى تخطيط لوحة 384 جيدا، حساب تفعيل (تغيير أضعاف) من كل مستقبل باستخدام الصيغة التالية:
    Equation 1
    ملاحظة: هنا عينة RLU يشير إلى قيمة كل من الآبار الأربعة تكرار رباعي ة تحفيز (+ مركب) ، متوسط الخلفية RLU هو متوسط الضوابط السلبية على لوحة، وRLU القاعدية يعني متوسط الربع غير المعالجة من نفس المستقبل (- مركب). بالإضافة إلى ذلك، قم بحساب الانحراف المعياري لنقاط البيانات الأربعة للتحقق من جودة النتائج. فمن المستحسن لإجراء تحويل log2 على متوسط التغييرات أضعاف لتصحيح أي heteroskedasticity; قاعدة log2 هو خيار عملي للمساعدة في تحديد الزيارات الإيجابية. وضع العتبات الإيجابية للإصابة على نحو تجريبي؛ لا بد من ملاحظة أن بعض المستقبلات يمكن أن يكون لها زيادة منخفضة تصل إلى 2 أضعاف وإلى زيادة تصل إلى 40 مرة للآخرين مع الناضون الكامل.
  2. واستناداً إلى النتائج، حدد الاستعراضات العامة للنتائج التي يمكن أن تكون إيجابية للفحص الثانوي.

6. الفحص الثانوي: البذر الخلوي وtransfections

  1. خلايا HTLA الثقافة الفرعية في أطباق 100 ملم بكثافة خلايا إجمالية تبلغ 5 × 10خلايا في 11 مل من الوسائط الكاملة (4.55 × 105/ مل) واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. إذا كان يفضل الترانزفيشن في نفس اليوم، خلايا البذور بكثافة 7.5 × 106 خلايا وأداء transfection 4 ساعة في وقت لاحق.
  2. ما قبل التدفئة الكواشف اللازمة لهطول الأمطار فوسفات الكالسيوم في درجة حرارة الغرفة. الجمع بين 450 ميكرولتر من 0.1x العازلة TE مع 50 ميكرولتر من 2.5 M CaCl2 ودوامة بسرعة؛ هذه المبالغ محددة لطبق واحد 100 ملم، على أساس حجم متوسط النمو الذي يحمله.
  3. في أنبوب، إضافة 500 ميكرولتر من الحل TE/CaCl2 إلى 10 ميكروغرام من CDNA GPCR والدوامة. إضافة 500 ميكرولتر من محلول العازلة 2x Hepes في أنبوب، يهز بقوة (لا دوامة)، واحتضان لمدة 1 دقيقة.
    ملاحظة: 1 ميكروغرام من أي ترميز البلازميد بروتين الفلورسنت (مثل YFP، mCherry، الخ) يمكن أن تكون تشارك في transfect مع 9 ميكروغرام من CDNA GPCR لما مجموعه 10 ميكروغرام. يتم استخدام البروتين الفلوري لتتبع كفاءة الترانفسيشن، وهذا الحد الأدنى من المبلغ لن تتداخل مع مقادير.
  4. مباشرة بعد حضانة قصيرة، والاستغناء عن حل 1 مل dropwise على الخلايا. صخرة بلطف لوحة ذهابا وإيابا لتوزيع بالتساوي راسب، مع الحرص على عدم دوامة لوحة، واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
  5. في اليوم التالي، ومراقبة كفاءة الترانزفية من خلال النظر في التعبير عن البروتين الفلوري تحت صور خلية الفلورسنت؛ transfections أكبر من 50٪ تغطية مثالية.
  6. احتضان لوحة (ق) PLL المغلفة 384-well-well-المصممة في الحاضنة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لتسخينها قبل خلايا البذر. قم بإزالة محلول التخزين من 1x مضاد المضادات الحيوية- الأميكتيك من لوحة (ق) PLL المغلفة 384-well-PLL عن طريق النقر على لوحة فوق الحوض وتسجيله على منشفة ورقية لتجف.
  7. شطف بلطف الخلايا المنقولة مع محلول Versene (1X PBS، درجة الحموضة 7.4؛ 0.53 mM EDTA)، وفصل عن طريق إضافة 3 مل من 0.05٪ التربسين/0.53 mM EDTA إلى الطبق. نقل المحتويات إلى أنبوب الطرد المركزي التي تحتوي على الأقل على كمية متساوية من DMEM كاملة لتحييد التربسين.
  8. قم بتدوير الخلايا عند 500 × ز لمدة 3 دقيقة وإعادة تعليق الخلايا بكثافة 0.4 × 106 خلايا / مل في الوسائط المتضورة جوعاً. خلايا البذور في لوحة (لوحات) PLL المغلفة 384-well-pLL بكثافة نهائية تبلغ 25,000 خلية/جيد ًا عن طريق الاستغناء عن 45 ميكرولتر من تعليق الخلية باستخدام أنبوب إلكتروني متعدد القنوات. إعادة لوحات إلى 37 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 4 ساعة، مما يسمح للخلايا نعلق بشكل صحيح إلى الآبار قبل الشروع في التحفيز.

7. الفحص الثانوي: إعداد صفيحة الدواء لمنحنى الجرعة من 16 نقطة (نصف سجل)

  1. في لوحة 96-well، أضف 270 ميكرولتر من 1X HBSS Drug buffer (1x حل الملح المتوازن لهانك [HBSS]، 20 mM HEPES pH 7.4، 1x مضاد المضادات الحيوية)، باستثناء الصف الأخير (الصف H) من اللوحة، كما هو موضح في الشكل 4.
    ملاحظة: بالنسبة للببتيدات والجزيئات الغروية والمركبات القابلة للذوبان في الماء بشكل سيئ ، يقترح إضافة 0.1-1٪ BSA. لمنع أكسدة المخدرات، يمكن أيضا إضافة ما يصل إلى 0.01٪ حمض الأسكوربيك.
  2. من مخزون المخدرات ، وإعداد محلول المخدرات (يشار إليها باسم التركيز "العالي") عن طريق حساب تركيز 3x النهائي (التركيز النهائي للدواء في لوحة الخلية سيكون 1x). على سبيل المثال، بالنسبة لمنحنى الجرعة والاستجابة مع 10 ميكرومتر كأعلى تركيز له، قم بإعداد التركيز "العالي" عند 30 ميكرومتر. Pipet 300 ميكرولتر من التركيز "العالي" في الآبار في الصف H.
  3. في أنبوب آخر، قم بإعداد التركيز "المنخفض"، الذي يمثل التركيز "العالي" مقسومًا على 3.16 (نصف سجل). واستناداً إلى المثال السابق، سيكون التركيز "المنخفض" 9.49 ميكرومتر. Pipet 300 ميكرولتر من التركيز "المنخفض" في الآبار في الصف H، بجوار الآبار "العالية".
    ملاحظة: يعتمد العدد الإجمالي لـ 96 بئرًا مطلوبة في الصف H على عدد الخلايا وظروف التحفيز. أربعة آبار (اثنين من "عالية" واثنين من "منخفضة") سيكون لها حل المخدرات وافرة لتحفيز لوحة بئر 384 كامل.
  4. تنفيذ تخفيف المسلسل عن طريق pipetting 30 ميكرولتر من محلول المخدرات من "عالية" و "منخفضة" آبار الصف H إلى الصف السابق (الصف G) ومزيج عن طريق الأنابيب يدويا صعودا وهبوطا، أو على النحو الموصى به، وذلك باستخدام ماصة متعددة القنوات الإلكترونية مع وظيفة "ماصة وميكس". كرر هذه الخطوة حتى الصف الأول والأكثر تخفيفا (الصف A)، مع تجاهل النصائح بين المخففات.
    ملاحظة: إذا رغبت في ذلك، يمكن إيقاف التخفيفات التسلسلية قبل الصف A، الذي يمثل عنصر تحكم داخلي بدون دواء، وبعبارة أخرى، "صفر حقيقي".
  5. باستخدام الشكل 4 كمرجع، تحفيز الخلايا المنقولة عن طريق الأنابيب 20 ميكرولتر من "منخفض" تخفيف العمود من لوحة 96-well إلى الصفوف A-O من لوحة 384-well المصنفة سابقاً، وكذلك 20 ميكرولتر من تخفيف العمود "العالي" إلى الآبار B-P. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 16 ساعة.

8- الفحص الثانوي: قراءة الإنارة وتحليل البيانات

  1. في 16-24 ساعة بعد التحفيز, decant وسائل الإعلام الخلايا المنقولة عن طريق النقر بلطف لوحة 384 جيدا على الحوض وتسجيله على منشفة ورقية. إضافة 20 ميكرولتر / بئر من الكاشف غلو واحتضان لوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 5-20 دقيقة. قراءة لوحات باستخدام عداد التلألؤ لوحة صغيرة، مع وقت التكامل من 1 ق / حسنا.
  2. تصدير الملفات المحفوظة من عداد الإنارة كجدول بيانات؛ سيتم تسجيل النتائج في وحدات التلألؤ النسبي (RLU). نقل بيانات لوحة 384-well إلى برنامج الإحصائيات لتحليل النتائج باستخدام التحليل المدمج XY لمنحنى الانحدار غير الخطي المناسب. حدد المدمج في 3-المعلمة وظيفة تحفيز الجرعة والاستجابة "سجل (agonist) مقابل الاستجابة (ثلاثة معلمات)"،
    Equation 2
    ملاحظة: هنا أعلى وأسفل هي الهضاب في وحدات المحور ص، على التوالي الاستجابة القصوى والمستوى القاعدي، EC50 هو تركيز الناضر الذي يولد استجابة 50٪ بين أعلى وأسفل، وX يشير إلى تركيز سجل من الناضر. يفترض هذا النموذج أن منحنى الاستجابة للجرعة له ميل تل قياسي من 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

باستخدام بروتوكول PRESTO-Tango المعروض هنا ، تم فحص مستخلص حبيبات الكرومافين (CG) مقابل 168 هدفًا من أهداف GPCR غير الشمية ، وغالبيتها هي مستقبلات يتيمة. تم تنفيذ التنميط من استخراج وقال من خلال فحص تعبئة α-arrestin2 في المستقبلات المختارة، استنادا إلى المبدأ الذي صممه بارنيا وآخرون18 (الشكل 1). تم أخذ Plasmid cDNA من GPCRs ذات الأهمية من مجموعة PRESTO-Tango GPCR وتجميعها في لوحتين من 96 في التخطيط المطلوب. في المجموع ، تم نقل أربعة لوحات 384 بئرًا المصنفة بخلايا HTLA ، حيث تم تحويل كل نصف من لوحات الحمض النووي 96 بئرًا إلى لوحة كاملة 384 بئرًا ، مما أدى إلى نقل كل مستقبل في ربعين (ثمانية آبار 384). تم تحفيز أحد الربعين مع استخراج CG. وضع بشكل مختلف، بالتناوب الصفوف C-D، G-H، K-L، وO-P تمثل التحفيز (+)(الشكل 2). من بين 168 GPCRs التي تم استجوابها في الفحص الأولي، كان اثنان فقط من المستقبلين المتنافسين كأهداف نشطة محتملة، وتحديداً مستقبلات الدوبامين D3 (DRD3) وopsin 5 (OPN5). أنتجت DRD3 تغييرًا كبيرًا في السجل2أضعاف قدره 4.70 ، في حين أن OPN5 أنتج استجابة أقل قليلاً من 2.39 ، وكلاهما يلبي الحد الأدنى لتغيير أضعاف log2 > 2. بالمقارنة، كان التحكم الإيجابي للشاشة الأولية DRD2 حفزت مع quinpirole، وهو ناضر انتقائي من هذا المستقبل، وأنتجت تغيير أضعاف log2 من 4.58(الشكل 3). لإعادة إنتاج هذه النوافذ إشارة والقضاء على إمكانية الزيارات الإيجابية كاذبة، وأجريت شاشة ثانوية مع المستقبلات المذكورة أعلاه. إلى جانب اختبار استخراج CG، بالنظر إلى أن DRD3 هو مستقبلات غير يتيمة، تم إعداد شرط آخر كتحكم إيجابي، والتحفيز على وجه التحديد مع quinpirole، واحدة من ناهضات انتقائية. من ناحية أخرى، OPN5 هو مستقبلات اليتيم وعلى هذا النحو، لا يمكن اختبار أي جهاز المناعة المرجعية جنبا إلى جنب مع استخراج CG كتحكم إيجابي. تم اختبار المخزن المؤقت فقط كعنصر تحكم سلبي. وجرى إجراء توصيف دوائي إضافي لهذين الـ GPCRs من خلال إعداد منحنيات جرعة من 16 نقطة تتراوح بين10-5 م إلى10-12.5 م. وعلى وجه التحديد، تم تخفيف محاليل استخراج CG ومخزون الكينبيرول عند 10 مM إلى 30 ميكرومتر و 9.49 ميكرومتر، وتركيزات "عالية" و"منخفضة" في الصف السفلي (الصف H) من صفيحة الدواء 96-well؛ وسوف تصبح هذه التركيبات10-5 M و10-5.5 M مرة واحدة يتم الاستغناء 20 ميكرولتر على الخلايا المنقولة في 40 ميكرولتر من المتوسطة المتضورة جوعا، لما مجموعه 60 ميكرولتر داخل كل 384-جيدا. كما سبق وصفه ، تم تنفيذ تخفيفات متسلسلة بحيث تكون تشكيلات الأدوية الأكثر تمييعًا لمدة 10-12 M و10-12.5 M في الصف العلوي (الصف A)(الشكل 4). تم إنشاء منحنيات الاستجابة للجرعة من الفحص الثانوي باستخدام GraphPad Prism لتقييم فعالية وفعالية ligand. وبالمقارنة مع الكينبيرول، أنتج مستخلص CG نوافذ إشارة مماثلة وقيم EC50، مما يؤكد صلاحيته كضربة نشطة في DRD3. ومع ذلك ، تم إنتاج منحنى جرعة مسطحة مماثلة للتحكم السلبي لـ OPN5 ، مما يستبعده كهدف محتمل لاستخراج CG(الشكل 5).

Figure 1
الشكل 1: تصميم وحدات من الهياكل التانغو (A) ومخطط عام لα-arrestin (تانجو) إجراء التوظيف (B). (أ)وGPCR التانغو يبني تتكون من عناصر وحدة مختلفة في الترتيب التالي: إشارة HA / علامة العلم، وCDS GPCR، مستقبلات فاسوبريسين 2 C-الطرفية الذيل، TEV موقع الانقسام البروتياز، وعامل النسخ tTA. (ب)مبدأ اختبار تانجو ينطوي على نقل عابر لالبلازميدات التانغو GPCR في خلايا HTLA، HEK293T الخلايا بشكل ثابت التعبير عن بروتين الانصهار البروتياز α-arrestin2-TEV والجينات مراسل luciferase الذي يتم تنشيط التعبير عن طريق tTA. سيؤدي تنشيط GPCR في نهاية المطاف إلى تعبئة α-arrestin2-TEV إلى المستقبلات ، مما يجعل البروتياز على مقربة من موقع الانقسام الخاص به. ونتيجة لذلك ، يتم مرجل tTA من ذيل GPCR ، وتحرير عامل النسخ لنقل إلى النواة وتنشيط التعبير luciferase. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: تخطيطات لوحة cDNA 96-well و 384-well لوحة خلية للنقل والتحفيز في الفحص الأولي PRESTO-TANGO. تصور إعداد لوحة مصدر cDNA 384-well للترانفسيشن ، يتم نقل بنيات GPCR Tango أولاً من نصف لوحة 96-well إلى لوحة كاملة 384-well ، مع نقل كل مستقبل في octuplicate. في هذا الإطار، تحفيز الخلايا مع (+) وبدون (-) الدواء (ق) من الفائدة سوف تحدث في أربعة مرات لكل مستقبل الفردية. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: تمثيلات رسومية لتحديد هوية الأصابة من الفحص الأولي PRESTO-Tango. كدليل على المفهوم ، تم تحليل النشاط البيولوجي لمستخلص حبيبات الكرومافين (CG) على GPCRome. تم نقل خلايا HTLA في 384 لوحات بئر مع 168 GPCR تانجو يبني، وحفزت إما مع استخراج CG (+ مركب) أو مع العازلة السيارة (- مركب). تم استخدام pcDNA3.1 كتحكم سلبي ، واستخدمت مستقبلات DRD2 المحفزة مع quinpirole كتحكم إيجابي. تم حساب نوافذ الإشارة(A)وتغيير أضعاف log2(B)في تنشيط المستقبلات بين الآبار في غياب أو وجود استخراج CG. تمثل كافة أشرطة الخطأ SD (n = أربعة قياسات). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: تخطيط إعداد صفيحة الدواء 96 بئر للتحفيز في الفحص الثانوي. تصور إعداد لوحة المخدرات 96 جيدا لتحفيز الخلية، والمخففات المسلسل لمدى منحنى جرعة 16 نقطة تبدأ في10-5 M (التركيز النهائي) في الصف H، مع فترات نصف سجل بين كل نقطة حتى10-12.5 M في الصف A. وتستخدم "عالية" و "منخفضة" أعمدة المخدرات لتحفيز الصفوف بالتناوب من لوحة 384-جيدا المصنفة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: استجابات منحنى الجرعة للتنميط المركب وإظهار التجنيد في وحدات تحليل الأداء في الفحص الثانوي. تم نقل خلايا HTLA بشكل عابر مع مستقبلات DRD3(A)وOPN5(B). تم تحفيز كل من الحالات المنقولة مع استخراج CG في زيادات نصف السجل، فضلا عن الكنايفي ة الكناضة DRD3 محددة كتحكم إيجابي، وعازلة مركبة لOPN5 كتحكم سلبي. تمثل كافة أشرطة الخطأ SD (n = ثلاثة قياسات). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وGPCRs ديناميكية تشكيلية هي القوى من نقل الإشارات. الخصائص الفيزيوكيميائية للجيوب الملزمة لهذه المستقبلات heptahelical، فضلا عن أهميتها الفسيولوجية تؤكد الحاجة إلى أدوات فحص جي بي سي آر ليغاند. وكما هو موضح أعلاه، فإن اختبار PRESTO-Tango سريع وحساس وسهل الاستخدام، ويضفي نفسه على تطوير المخدرات. ليس فقط هذا القياس الفحص الحثي التنشيط، ولكن يمكن أيضا أن تستخدم لتحديد حجم نشاط الخصوم والموسرات allosteric19. في ضوء الانتقائية الوظيفية، وهو مفهوم يشير إلى أن هياكل المخدرات المختلفة يمكن أن تثير مستقبلات مختلفة إشارة الشلالات في مستقبلات واحدة، مقارنة تفعيل مسار G-البروتين باستخدام G-البروتين تعتمد على المقالات مع توظيف α-arrestin باستخدام PRESTO-Tango يمكن أن توفر العظة لتصميم مركبات الرصاص مع انخفاض الآثار الجانبية السلبية. وتجدر الإشارة إلى أن استقلاليتها عن اكتشاف اقتران بروتين G يساعد على تحديد شركاء الاقتران لـ GPCRs اليتيم ة التي لم تكن لتكتشف من قبل من قبل المقالات المعتمدة على بروتين G.

لضمان اتساق ومتانة شاشات PRESTO-Tango ، يجب توخي الحذر في جميع خطوات البروتوكول ، حيث سيتم تضخيم الاضطرابات المقدمة بسبب طبيعة هذه المنصة. وبطبيعة الحال، هناك تدابير عامة مشتركة بين جميع شاشات HTS التي ينبغي أن تؤخذ في الاعتبار، مثل استخدام الكواشف من نفس الكثير / صياغة لضمان استقرار متطابقة والنشاط البيولوجي في جميع أنحاء، فضلا عن الحفاظ على الظروف على نظام HTS متسقة مثل كثافة البذر الخلية ووقت حضانة المخدرات. يتطلب الشكل المصغر لPRESTO-Tango الانتباه إلى نقطتين حاسمتين: الاختلاف في كثافة بذر الخلايا وتوزيعها المتجانس (التكتل مقابل تعليق الخلية الواحدة) بين الآبار ، وانخفاض كفاءة الترانفسيشن ، وضعف التحفيز المركب والتسليم سيمنع تكرار الخلايا من يوم إلى يوم ولوحة إلى لوحة. لهذا الغرض، ثلاثي ة تعليق الخلية HTLA لتجانس الحل قبل البذر وضمان التقاء الخلية 50-70٪ قبل الترانزج. وينبغي التحقق من مركبة تسليم المركبات، على أن يكون السلوفيك أكسيد ثنائي الميثيل هو الناقل الأكثر شيوعا. عادة, أعلى تركيز من منحنيات الجرعة لدينا هو 10 ميكرومتر, ولكن هذا قد يتغير اعتمادا على طبيعة وقوة المركب; من المهم اختبار تركيزات مختلفة لأختبر التسامح الخلوي والسمية.

وبالنظر إلى أن بعض الاستعراضات العامة للأنشطة الوراثية لها نشاط تأسيسي مرتفع، فإن إحدى المسائل التي قد تنشأ أثناء الفحص هي انخفاض النطاق الدينامي وإشارة الخلفية التي تكون أعلى مما كان متوقعاً. ويمكن التخفيف من هذا إلى حد ما عن طريق ضمان أن يتم تنفيذ تجويع المصل مع DMEM المتوسطة تستكمل مع 1٪ dFBS. وينبغي أن يؤخذ في الاعتبار أنه إذا كان إنتاج الإضاءة مرتفعاً بما فيه الكفاية، فلا يزال من الممكن أن يكون هناك نزيف في الآبار المجاورة، مما قد يؤدي إلى تغييرات أضعاف محسوبة خطأ. يمكن تفسير الإشارات المنخفضة أو غير القابلة للكشف (على افتراض توقع استجابة) بعدة طرق، وهي ضعف التعبير عن GPCR (الخلايا) في خلايا HTLA، أو فقدان النشاط البيولوجي للمركب مما يجعله غير فعال، أو أن المستقبلات (المستقبلات) المعنية لا تجند في جوهرها α-arrestin2. على التوالي، وتقييم كمية ونوعية الحمض النووي مستقبلات البلازميد المنقولة، واختبار الاستعدادات الأخرى / الكثير من مركب غير فعال في السؤال، وأداء تقنيات التفاعل البروتين البروتيني المتوشور مثل بريت / FRET أو الترسيب المناعي المشترك هي بعض الحلول المقترحة لهذه المشكلة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضا تحسين التعبير مستقبلات عن طريق subcloning مستقبلات تانجو (ق) من الفائدة في ناقلات لينتينيووووووووووووووووووووووووووووووووووووووووووووووووووووووووووووووووووووووووووووووووووووووووووووووووووووووووووووووو يمكن أن يعني التحول في الفعالية المتوقعة للناقد أثناء الفحص الثانوي أن وقت تحفيز الدواء و / أو تركيز المركب اللازم لتحفيز الاستجابة غير كافٍ ، أو أن المخففات التسلسلية للوحة الدواء تم إعدادها بشكل غير صحيح. استخدام ماصة إلكترونية متعددة القنوات أو نظام الأنابيب الآلي دون تغيير النصائح بين عند إنشاء تخفيف اتّهابات المخدرات يمكن أن يكون مشكلة عند العمل مع المركبات اللاصقة.

الاختلافات الملحوظة بين التانغو الأصلي ة التي وضعتها Barnea وآخرون18 ومنصة PRESTO-Tango تشمل تصميم المستقبلات في شكل وحدات ، تتكون من تسلسل codon الأمثل ، مما يحسن التعبير عن مستقبلات في خلايا الثدييات ، والعلامات epitope للتحقق من صحة التعبير المذكور ، والمواقع التي تفرض قيودا على GPCRs ، V2 الذيل وTEVcs - tTA ، مما يتيح لختان الأجزاء وsubcloning. والأهم من ذلك، PRESTO-Tango يتجاوز فحص تانجو من حيث قوة الفحص والتصميم التجريبي. يتم إجراء اختبار عينة رباعية من حوالي 300 GPCRs في لوحات 8 384 بئر فقط ، مع المحاسبة على الضوابط الخلفية السلبية والضوابط الإيجابية لمراقبة كفاءة الترانزفيشن. في حين أن PRESTO-Tango مناسب لفحص GPCR-ome مع مركب واحد فقط من الفائدة ، يمكن أيضًا إجراء الاستجواب مع الليغاند المتعددة ، وإن كان بزيادة التكلفة واستخدام الموارد ، مثل المكتبات المجمعة أو المجمعة ذات الجزيئات الصغيرة المركبة أو العينات البيولوجية التي تتكون من خليط من كيانات كيميائية مختلفة. ومن المسلم به أن هذه المسألة يمكن التخفيف من حدتها عن طريق تخفيض عدد المركبات التي يمكن استجوابها عن طريق إجراء تحليلات للتشابه الكيميائي والتنوع في المكتبات المركبة المعنية. في حين أن منصة PRESTO-Tango أكثر انطباقًا لأغراض الفحص الأولي ، يمكن إجراء التنميط الثانوي على نطاق أصغر ، في تنسيقات متوسطة أو منخفضة الإنتاجية ، لتأكيد العواقب الوظيفية لتحفيز ligand. ومع ذلك ، كما هو الحال مع جميع المقالات الأخرى GPCR ، يجب الاعتراف بأنه لا توجد ضوابط إيجابية مناسبة للمستقبلات اليتيمة أثناء الفحص الثانوي مع فحص Tango. ومع ذلك، يمكن تحديد الضربات الإيجابية المحتملة إذا أمكن تركيب بيانات النواتج على منحنى استجابة الجرعة السينية، مع نافذة إشارة محسوبة وقيمة EC50. ومن المهم أيضا أن نلاحظ أن آلية نشاط ligand، إذا كان ذلك لمستقبلات اليتيم أو غير اليتيم، لا يمكن توضيح دون تشغيل المقالات المتوازية.

مع جميع مكونات PRESTO-Tango الأمثل بالفعل، بما في ذلك خط الخلية HTLA وبنيات التانغو GPCR، مطلوب مساحة صغيرة للتعديل وبصرف النظر عن اختيار تركيبة مركب (ق) لاستخدامها لتحفيز المخدرات. إذا رغبت في ذلك ، يمكن إنشاء خط خلية HTLA بشكل ثابت يعبر عن مستقبلات بسهولة عن طريق الاستنساخ وقال مستقبلات GPCR - Tango داخل ناقلات pIRESbleo3 الموصى بها (Clonetech) ، واختيار المستنسخين باستخدام الزوسين. فيما يتعلق بالمبادلة من pcDNA3.1 إلى pIRESbleo3 ، ببساطة هضم بناء GPCR Tango مع NotI و XbaI وإدراجها في متجه الوجهة في مواقع التقييد NotI و NheI. وعلى الرغم من ذلك، هناك سبل لتكييف هذه التكنولوجيا وتحسينها. واحدة من ركائز هذه التكنولوجيا هي خلايا HTLA ، وهو خط خلية HEK293T بشكل ثابت يعبر عن جين الانصهار α-arrestin2-TEV ومراسل لوسيفراز المعتمد على tTA ، الذي تم توفيره بسخاء من مختبر ريتشارد أكسل. في حين أن عنصرا حاسما من PRESTO-Tango، لا توجد حاليا بدائل أخرى من حيث أصل خط الخلية، أو الجينات التي تعبر عنها. وعلاوة على ذلك، يمكن إنشاء خطوط الخلايا المهندسة في المستقبل للتعبير عن جينات الاندماج TEV الأخرى لتتبع البروتينات الأخرى إلى جانب α-arrestin2، وتحديدا تلك التي سبق أن أظهرت أن تتفاعل أو وجدت في الإقامة لGPCRs، مثل 14-3-322، SAP9723، وα-arrestin1، وهو أكثر انتشارا isoform من الاعتقالات غير البصرية في الفقاريات24. ويمكن تحقيق ذلك باستخدام الخلايا HTL الأبوية التي تحتوي فقط على مراسل luciferase التي تسيطر عليها المروج tetO7. أحد القيود على PRESTO-Tango هو التنشيط غير المحدد لمروج المراسل. استناداً إلى نظام تنظيمي يعتمد على التتراسيكلين (نظام tet)، يتحكم العنصر المستجيب للتتراسيكلين (TRE) في التعبير عن مراسل لوسيفراز المصب. ومع ذلك ، أظهرت الدراسات السابقة "راشح" التعبير عن luciferase بسبب عوامل النسخ الذاتية25،26. ونتيجة لذلك، يمكن لبعض المركبات تنشيط المراسل بشكل مستقل عن التجنيد أو تنشيط GPCR، مما يزيد من عدد الإيجابيات الكاذبة. وثمة مسألة أخرى تظهر، شائعة أيضا ً في أساليب هيئة تحرير الشام الأخرى، هي "الضاربين المتكررين"، وهي مركبات منحرفة تحفز استجابات كبيرة في عدة أهداف27. ومع ذلك، فإن إعداد الفحص الموازي لPRESTO-Tango يسهل التعرف على هذه القطع الأثرية، والتي يمكن اختبارها بشكل أكبر لتأكيد تأثيرها على نشاط لوسيفيراز. وإجمالاً، وفرت PRESTO-Tango أسساً متينة لدراسة التجنيد في عمليات الاعتقال في وحدات الشرطة العالمية، وفي المخطط الأكبر لاكتشاف المخدرات، كأداة للفحص وإزالة التيتم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

تعلن ساعات العمل عن عدم وجود مصالح متنافسة.

Acknowledgments

وقد دعم هذا العمل المعاهد الكندية للبحوث الصحية (CIHR منحة #MOP142219).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
384 Well Optical Bottom Plates, Polystyrene Polymer Base, Cell Culture Treated, BLACK, with lid, Sterile NUNC 12-566
384 Well Optical Bottom Plates, Polystyrene Polymer Base, Cell Culture Treated, White, with lid, Sterile NUNC 12-566-1
384 Well Round Bottom, Polypropylene, Non-Treated, Blue, non-sterile, without lid ThermoFisher 12-565-390
Antibiotic-Antimycotic Wisent 450-115-EL
D-Luciferin, sodium salt GoldBio LUCNA
DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate Corning 10-013-CV
Eppendorf Xplorer, 12-channel, variable, 15–300 µL Eppendorf 4861000155
Eppendorf Xplorer, 12-channel, variable, 5–100 µL Eppendorf 4861000139
Matrix Platemate 2x3 ThermoFisher 801-10001
MicroBeta 1450 Wallac Perkin Elmer
Penicilin-Streptomycin Wisent 450-201-EL
Poly-L-Lysine hydrobromide Millipore-Sigma P2636-500MG
Roth Lab PRESTO-Tango GPCR Kit Addgene Kit #1000000068

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Liapakis, G., et al. The G-protein coupled receptor family: actors with many faces. Current pharmaceutical design. 18 (2), 175-185 (2012).
  2. Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. Seven-transmembrane receptors. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 3 (9), 639-650 (2002).
  3. Kroeze, W. K., Sheffler, D. J., Roth, B. L. G-protein-coupled receptors at a glance. Journal of cell science. 116, Pt 24 4867-4869 (2003).
  4. Rask-Andersen, M., Almén, M. S., Schiöth, H. B. Trends in the exploitation of novel drug targets. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (8), 579-590 (2011).
  5. Ngo, T., et al. Identifying ligands at orphan GPCRs: current status using structure-based approaches. British journal of pharmacology. 173 (20), 2934-2951 (2016).
  6. Zhang, R., Xie, X. Tools for GPCR drug discovery. Acta pharmacologica Sinica. 33 (3), 372-384 (2012).
  7. Kimple, A. J., Bosch, D. E., Giguere, P. M., Siderovski, D. P. Regulators of G-Protein Signaling and Their G Substrates: Promises and Challenges in Their Use as Drug Discovery Targets. Pharmacological Reviews. 63 (3), 728-749 (2011).
  8. Wettschureck, N., Offermanns, S. Mammalian G Proteins and Their Cell Type Specific Functions. Physiological Reviews. 85 (4), 1159-1204 (2005).
  9. Denis, C., Saulière, A., Galandrin, S., Sénard, J. -M., Galés, C. Probing heterotrimeric G protein activation: applications to biased ligands. Current Pharmaceutical Design. 18 (2), 128-144 (2012).
  10. Yin, H., et al. Lipid G protein-coupled receptor ligand identification using beta-arrestin PathHunter assay. The Journal of Biological Chemistry. 284 (18), 12328-12338 (2009).
  11. Cheng, Z., et al. Luciferase Reporter Assay System for Deciphering GPCR Pathways. Current Chemical Genomics. 4, 84-91 (2010).
  12. Roth, B. L., Kroeze, W. K. Integrated Approaches for Genome-wide Interrogation of the Druggable Non-olfactory G Protein-coupled Receptor Superfamily. The Journal of Biological Chemistry. 290 (32), 19471-19477 (2015).
  13. Jean-Charles, P. -Y., Kaur, S., Shenoy, S. K. G Protein-Coupled Receptor Signaling Through β-Arrestin-Dependent Mechanisms. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 70 (3), 142-158 (2017).
  14. Smith, J. S., Rajagopal, S. The β-Arrestins: Multifunctional Regulators of G Protein-coupled Receptors. The Journal of Biological Chemistry. 291 (17), 8969-8977 (2016).
  15. Böhme, I., Beck-Sickinger, A. G. Illuminating the life of GPCRs. Cell Communication and Signaling. 7 (1), 16 (2009).
  16. Fang, Y. Label-Free Receptor Assays. Drug discovery today. Technologies. 7 (1), 5-11 (2011).
  17. Wang, T., et al. Measurement of β-Arrestin Recruitment for GPCR Targets. Assay Guidance Manual. Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. , (2004).
  18. Barnea, G., et al. The genetic design of signaling cascades to record receptor activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (1), 64-69 (2008).
  19. Kroeze, W. K., et al. PRESTO-Tango as an open-source resource for interrogation of the druggable human GPCRome. Nature Structural & Molecular Biology. 22 (5), 362-369 (2015).
  20. Jordan, M., Schallhorn, A., Wurm, F. M. Transfecting Mammalian Cells: Optimization of Critical Parameters Affecting Calcium-Phosphate Precipitate Formation. Nucleic Acids Research. 24 (4), 596-601 (1996).
  21. Baker, J. M., Boyce, F. M. High-throughput functional screening using a homemade dual-glow luciferase assay. Journal of Visualized Experiments. (88), 50282 (2014).
  22. Li, H., Eishingdrelo, A., Kongsamut, S., Eishingdrelo, H. G-protein-coupled receptors mediate 14-3-3 signal transduction. Signal Transduction and Targeted Therapy. 1 (1), 16018 (2016).
  23. Walther, C., Ferguson, S. S. G. Minireview: Role of intracellular scaffolding proteins in the regulation of endocrine G protein-coupled receptor signaling. Molecular Endocrinology. 29 (6), Baltimore, Md. 814-830 (2015).
  24. Gurevich, E. V., Benovic, J. L., Gurevich, V. V. Arrestin2 expression selectively increases during neural differentiation. Journal of Neurochemistry. 91 (6), 1404-1416 (2004).
  25. Shaikh, S., Nicholson, L. F. B. Optimization of the Tet-On system for inducible expression of RAGE. Journal of Biomolecular Techniques JBT. 17 (4), 283-292 (2006).
  26. Blau, H. M., Rossi, F. M. Tet B or not tet B: advances in tetracycline-inducible gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (3), 797-799 (1999).
  27. Roche, O., et al. Development of a Virtual Screening Method for Identification of "Frequent Hitters" in Compound Libraries. Journal of Medicinal Chemistry. 45 (1), 137-142 (2002).

Tags

الكيمياء الحيوية، العدد 157، G-البروتين مستقبلات مقرانة، فحص ligand، اكتشاف المخدرات، إزالة التيتم، الإنتاجية العالية، فحص تانجو، α-arrestin2، G-البروتين- فحص مستقل، GPCR-ome
استجواب مواز لـ α-Arrestin2 تجنيد لـ Ligand الفحص على نطاق GPCR على نطاق واسع باستخدام PRESTO-Tango assay
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zeghal, M., Laroche, G.,More

Zeghal, M., Laroche, G., Giguère, P. M. Parallel Interrogation of β-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening on a GPCR-Wide Scale using PRESTO-Tango Assay. J. Vis. Exp. (157), e60823, doi:10.3791/60823 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter