Med tanke på att GPCRs är attraktiva druggable mål, GPCR ligand screening är därför oumbärlig för identifiering av blyföreningar och för deorphanization studier. Mot dessa insatser beskriver vi PRESTO-Tango, en resursplattform med öppen källkod som används för samtidig profilering av övergående β-arrestin2-rekrytering på cirka 300 GPCRs med hjälp av en TEV-baserad reporteranalys.
Som den största och mest mångsidiga gensuperfamiljen och medlare av ett spektrat av cellulära signalvägar, g-protein-kopplade receptorer (GPCRs) representerar en av de mest lovande målen för läkemedelsindustrin. Ergo, design, genomförande och optimering av GPCR ligand screening analyser är avgörande, eftersom de representerar fjärrstyrning verktyg för läkemedelsupptäckt och för att manipulera GPCR farmakologi och resultat. Tidigare, G-protein beroende analyser kännetecknas detta område av forskning, upptäcka ligand-inducerad händelser och kvantifiera generering av sekundära budbärare. Men sedan tillkomsten av funktionell selektivitet, samt en ökad medvetenhet om flera andra G protein-oberoende vägar och begränsningar i samband med G-protein beroende analyser, det finns en större push mot skapandet av alternativa GPCR ligand screening analyser. Mot denna strävan beskriver vi tillämpningen av en sådan resurs, PRESTO-Tango-plattformen, ett luciferase reporterbaserat system som möjliggör parallella och samtidiga förhör av den mänskliga GPCR-ome, en bedrift som tidigare ansågs tekniskt och ekonomiskt omöjligt. Baserat på en G-protein oberoende β-arrestin2 rekrytering analys, universalitet β-arrestin2-medierad människohandel och signalering på GPCRs gör PRESTO-TANGO ett passande verktyg för att studera cirka 300 icke-lukt mänskliga GPCRs, inklusive cirka 100 särläkemedel. PRESTO-Tangos känslighet och robusthet gör den lämplig för primära höggenomströmningsskärmar med hjälp av sammansatta bibliotek, används för att avslöja nya GPCR-mål för kända läkemedel eller för att upptäcka nya ligander för föräldralösa receptorer.
G-protein-kopplade receptorer (GPCRs) utgör den största och mest varierande familjen av transmembrane proteiner, fungerar som kommunikationsgränssnitt mellan en cell och dess miljö1. Mångsidigheten hos GPCRs framhävs av deras förmåga att upptäcka ett varierat utbud av ligander-från signalsubstanser till nukleotider, peptider till fotoner, och många fler, samt deras förmåga att reglera många nedströms signalering kaskader inblandade i cellulära tillväxt, migration, differentiering, apoptos, cell bränning, etc.2,3. Med tanke på deras allestädes närvarande och engagemang i en mängd fysiologiska processer, denna receptorfamilj är av yttersta terapeutisk betydelse, framgår av det faktum att mer än en tredjedel av för närvarande tillgängliga föreskrivna läkemedel mål GPCRs4. Dessa befintliga terapier riktar dock endast in sig på en liten delmängd av superfamiljen (uppskattningsvis 10 %), och farmakologiför många GPCRs förblir oklarat. Dessutom finns mer än 100 GPCRs som föräldralösa receptorer, eftersom de inte har matchats med en endogen ligand5. Därför är GPCR ligand screening avgörande i avbarnbildning och läkemedelsutveckling, eftersom det banar väg mot bly upptäckt och optimering, och eventuellt till den kliniska prövningen fasen.
Metoder för GPCR ligand screening har traditionellt fallit i en av två kategorier, G-protein beroende eller G-protein oberoende funktionella analyser6. GPCR-signalering regleras av heterotrimeric G-proteiner (Gαβγ), som aktiveras genom utbyte av GTP för BNP på bundet på Gα-underenheten7. Signaler från den aktiverade receptorn transduceds av G-proteiner via sekundära budbärare, såsom cAMP, kalcium, DAG och IP3, att medla nedströms signalering vid nedströms effektorer8. Arten av de funktionella konsekvenserna av G-protein signalering har utnyttjats för att skapa cellbaserade analyser som återspeglar receptoraktivering. Dessa metoder, som mäter proximala (direkta) eller distala (indirekta) händelser i G-protein signalering, används oftast för GPCR ligand screening och har huvudsakligen använts i deorphanization studier6. Exempel på analyser som direkt mäter GPCR-medierad G-proteinaktivering är [35S]GTPγS bindningsanalys, som mäter bindning av en radiomärkt och icke-hydrolyzable GTP-analog till Gα-underenheten, och Förster/bioluminescensresonansenergiöverföring (FRET/BRET) sonder för att övervaka GPCR-Gα- och Gα/Gγ-interaktioner, som har fått mer dragkraft under åren9,10. Analyser som övervakar distala händelser är de vanligaste verktygen för GPCR-profilering; Till exempel cAMP och IP1/3 analyser mäta intracellulär ackumulering av G-protein beroende sekundära budbärare, medan [Ca2 +] flux och reporter analyser med specifika svarelement inblandade i G-protein aktivering (CRE, NFAT-RE, SRE, SRF-RE) undersöka händelser längre nedströms signalering kaskad11. Medan de flesta av de ovannämnda analyser kan utföras på en hög genomströmningsnivå, är ganska känsliga, och skryta med vissa analysspecifika fördelar (t.ex. diskriminering mellan fullständiga / partiella agonister, neutrala antagonister och omvända agonister när det gäller GTPγS bindning, eller analys funktionalitet på levande celler som [Ca2 +] och IP1 /3)6, det finns tyvärr inga befintliga G-protein beroende metoder som anstår förhör et hela druggable GPCR-ome. Detta beror till stor del på den inhemska kopplingen av flera G-protein underfamiljer till GPCRs, vilket resulterar i signalering vid flera kaskader och den okända G-protein koppling på föräldralösa GPCRs. För att mildra denna fråga, analyser har utvecklats för att tvinga promiskuösa G-protein koppling genom en enda gemensam signalering avläsning, såsom cAMP, och Ca2 +, om än de flesta av dem är låg genomströmning12.
En viktig aspekt av GPCR livscykel är uppsägning av G-protein-beroende signalering, som uppstår till stor del genom rekrytering av β-arrestiner som inducerar dissociation av G-proteinet, och slutligen desensibilisera receptorn, som är avsedd för clathrin-belagda internalisering13. De mest allmänt uttryckta isoformerav β-arrestin är icke-visuella β-arrestin1 och β-arrestin2, också betecknas som arresti-2 och arrestin-3, respektive14. Ange G-protein oberoende cellbaserade analyser, som lägger till en ny dimension till GPCR ligand screening; receptorhandel, etikettfri helcell och β-arresteringi rekrytering analyser är alla anmärkningsvärda exempel. GPCR människohandel analyser anställa fluorfores-märkta ligands eller co-internalized antikroppar riktade mot receptorn15, medan etikett-fri hela cellanalyser använder biosensorer som översätter cellulära förändringar som orsakas av ligand bindning till kvantifierbara utgångar, såsom elektriska eller optiska signaler16. Noterbart är att kvintessensen GPCR- β-arrestin interaktioner mode β-arrestin rekrytering analys som ett attraktivt verktyg i repertoaren av funktionella analyser17. Tango-systemet, som först utvecklades av Barnea et al. för bara ett decennium sedan, innebär införande av tre exogena genetiska element: en proteinfusion bestående av β-arrestin2 med ett växtskydd för tobaksetetetsvirus (TEVp), en tetracyklintransactivator (tTA) som är bunden till en GPCR via ett tobaksetsningsvirus proteas klyvning webbplats (TEVcs) och föregås av en sekvens från C-ändstationen av V2 vasopressin receptorn (V2 svans) för att främja arrestering i rekrytering, och en reporter luciferase gen vars transkription utlöses av tTA transkriptionsfaktor flyttning till kärnan, som befrias från membranet förankring efter β-arrestin2 rekrytering (figur 1)18. Kvantitativa avläsningar av GPCR-aktivering och β-arrestin2-rekrytering kan senare bestämmas genom läsning för luminiscens. En anmärkningsvärd skillnad är att medan receptorhandel och etikettfria hela cellmetoder är relativt låggenomströmning, har Tango flera fördelar, inklusive selektiv avläsning som är specifik för målreceptorn och känslighet på grund av signalintegration, vilket gör det till en lämplig kandidat för ligand screening i större skala18.
Med tanke på dessa strategiska funktioner utvecklade Kroeze et al. PRESTO-Tango (Parallellreceptor-ome Expression and Screening via Transkriptionsproduktion-Tango), en öppen källkodsplattform med hög genomströmning som använder Tango-metoden för att profilera den drogbara GPCR-ome på ett parallellt och samtidigt sätt19. Utnyttja “promiskuösa” rekrytering av β-arrestin2 till nästan alla GPCRs, presto-Tango är den första i sitt slag när det gäller cellbaserade funktionella analyser, vilket möjliggör snabb “första omgången” screening av små molekyler föreningar på nästan alla icke-lukt GPCRs, inklusive föräldralösa barn, oberoende av G-protein underfamilj koppling.
Konformationally dynamiska GPCRs är kraftpaket av signaltransduktion. De fysiokemiska egenskaperna hos de bindande fickorna på dessa heptaheliska receptorer, liksom deras fysiologiska relevans understryker behovet av GPCR ligand screeningverktyg. Som presenteras ovan, presto-Tango analysen är snabb, känslig och användarvänlig, utlåning sig till läkemedelsutveckling. Inte bara denna analys åtgärd agonist-inducerad aktivering, men det kan också användas för att kvantifiera aktiviteten hos antagonister och allo…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av Canadian Institutes of Health Research (CIHR grant #MOP142219).
384 Well Optical Bottom Plates, Polystyrene Polymer Base, Cell Culture Treated, BLACK, with lid, Sterile | NUNC | 12-566 | |
384 Well Optical Bottom Plates, Polystyrene Polymer Base, Cell Culture Treated, White, with lid, Sterile | NUNC | 12-566-1 | |
384 Well Round Bottom, Polypropylene, Non-Treated, Blue, non-sterile, without lid | ThermoFisher | 12-565-390 | |
Antibiotic-Antimycotic | Wisent | 450-115-EL | |
D-Luciferin, sodium salt | GoldBio | LUCNA | |
DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate | Corning | 10-013-CV | |
Eppendorf Xplorer, 12-channel, variable, 15–300 µL | Eppendorf | 4861000155 | |
Eppendorf Xplorer, 12-channel, variable, 5–100 µL | Eppendorf | 4861000139 | |
Matrix Platemate 2×3 | ThermoFisher | 801-10001 | |
MicroBeta 1450 Wallac | Perkin Elmer | ||
Penicilin-Streptomycin | Wisent | 450-201-EL | |
Poly-L-Lysine hydrobromide | Millipore-Sigma | P2636-500MG | |
Roth Lab PRESTO-Tango GPCR Kit | Addgene | Kit #1000000068 |