Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

ضربة قاضية مستقرة من الجينات ترميز البروتينات مصفوفة خارج الخلية في خط الخلية Myoblast C2C12 باستخدام الصغيرة Hairpin (ش) RNA

Published: February 12, 2020 doi: 10.3791/60824
Automatic Translation
1, 1, 1
1Orthopaedic Research Laboratories, Leni & Peter W. May Department of Orthopaedics, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

Summary

نحن نقدم بروتوكول لضرب بشكل ثابت أسفل الجينات ترميز مصفوفة خارج الخلية (ECM) البروتينات في C2C12 myoblasts باستخدام دبوس الشعر الصغيرة (ش) RNA. استهداف ADAMTSL2 كمثال، ونحن نصف أساليب للتحقق من كفاءة الضربة القاضية على مرنا، والبروتين، والمستوى الخلوي خلال C2C12 myoblast إلى التمايز myotube.

Abstract

مصفوفة خارج الخلية (ECM) البروتينات حاسمة لتنمية العضلات والهيكل العظمي والتوازن. يمكن تطبيق الضربة القاضية المستقرة لترميز الجينات لبروتينات ECM في C2C12 myoblasts لدراسة دور هذه البروتينات في تنمية العضلات الهيكلية. هنا، ونحن نصف بروتوكول لاستنفاد البروتين ECM ADAMTSL2 كمثال، وذلك باستخدام دبوس الشعر الصغيرة (ش) RNA في خلايا C2C12. بعد تحويل البلازميدات shRNA، تم اختيار الخلايا المستقرة دفعة باستخدام puromycin. كما وصفنا الحفاظ على هذه الخطوط الخلوية وتحليل الفينوتيبيك عبر تعبير مرنا، والتعبير البروتيني، والتمايز C2C12. مزايا هذه الطريقة هي توليد سريع نسبيا من خلايا C2C12 المنخفضة مستقرة والتمايز موثوق بها من خلايا C2C12 في myotubes متعددة النوية عند استنفاد المصل في وسط ثقافة الخلية. يمكن رصد التمايز من خلايا C2C12 عن طريق المجهر الميداني مشرق وقياس مستويات التعبير من الجينات علامة الكنسي، مثل MyoD، myogenin، أو سلسلة الميوسين الثقيلة (MyHC) مما يشير إلى تطور تمايز Myoblast C2C12 في الأنابيب الأوروبة. على النقيض من الضربة القاضية العابرة للجينات مع الحمض النووي الريبي الصغير التداخل (si) ، يمكن استهداف الجينات التي يتم التعبير عنها لاحقًا أثناء تمايز C2C12 أو أثناء نضوج اليوتيوب بشكل أكثر كفاءة عن طريق توليد خلايا C2C12 التي تعبر بشكل ثابت عن shRNA. القيود المفروضة على هذه الطريقة هي تباين في الكفاءة الضربة القاضية، اعتمادا على shRNA محددة التي يمكن التغلب عليها باستخدام استراتيجيات خروج المغلوب الجينات على أساس CRISPR/Cas9، فضلا عن الآثار المحتملة خارج الهدف من شرنا التي ينبغي النظر فيها.

Introduction

توفر بروتينات المصفوفة خارج الخلية (ECM) الدعم الهيكلي لجميع الأنسجة ، وتتوسط الاتصال بين الخلايا ، وتحدد مصير الخلية. تشكيل وإعادة عرض ديناميكية من ECM وبالتالي أمر بالغ الأهمية للحفاظ على الأنسجة والجهاز التوازن1،2. المتغيرات المرضية في العديد من الجينات الترميز لبروتينات ECM تؤدي إلى اضطرابات العضلات والعظام مع الأنماط الظاهرية التي تتراوح بين ضمور العضلات لبناء pseudomouscular3،4. على سبيل المثال ، المتغيرات المسببة للأمراض في ADAMTSL2 تسبب اضطراب العضلات والعظام نادرة للغاية geleophysic خلل التنسج ، الذي يقدم مع بناء العضلات الزائفة ، أي زيادة واضحة في كتلة العضلات الهيكل العظمي5. جنبا إلى جنب مع بيانات التعبير الجيني في الماوس والبشر، وهذا يشير إلى دور لADAMTSL2 في تنمية العضلات الهيكل العظمي أو التوازن6،7.

تم تطوير البروتوكول الذي نصفه هنا لدراسة الآلية التي يقوم بها ADAMTSL2 بتعدل تنمية العضلات الهيكلية و / أو التوازن في إعداد زراعة الخلايا. نحن ضرب نابلة إلى أسفل ADAMTSL2 في خط الخلية myoblast Murine C2C12. C2C12 myoblasts وتمايزها في الأنابيب العضلية هو نموذج ثقافة الخلية الموصوفة بشكل جيد والمستخدمة على نطاق واسع للتمايز العضلات والهيكل العظمي الهندسة الحيوية العضلات8،9. تمر خلايا C2C12 بخطوات تمايز متميزة بعد انسحاب المصل، مما يؤدي إلى تكوين أنابيب الأوولب متعددة النواة بعد 3-10 أيام في الثقافة. يمكن مراقبة خطوات التمايز هذه بشكل موثوق من خلال قياس مستويات مرنا من جينات العلامات المتميزة ، مثل MyoD أو myogenin أو سلسلة myosin الثقيلة (MyHC). إحدى مزايا توليد ضربات قاضية جينية مستقرة في خلايا C2C12 هي أن الجينات التي يتم التعبير عنها في مراحل لاحقة من تمايز C2C12 يمكن استهدافها بشكل أكثر كفاءة، مقارنة بالضربة القاضية العابرة التي حققها الحمض النووي الريبي الصغير التداخل (si) ، والذي يستمر عادة لمدة 5-7 أيام بعد الترانزفيشن ، ويتأثر بكفاءة الترانزفي. والميزة الثانية للبروتوكول كما هو موضح هنا هو الجيل السريع نسبيا من دفعات من الخلايا الضربة القاضية C2C12 باستخدام اختيار puromycin. البدائل، مثل CRISPR/Cas9 بوساطة الجينات بالضربة القاضية أو عزل سلائف الخلايا العضلية الهيكلية الأولية من الفئران البشرية أو الجينات المستهدفة ناقصة هي من الناحية الفنية أكثر صعوبة أو تتطلب توافر خزعات العضلات المريض أو الفئران المنقوصة الجينات المستهدفة، على التوالي. ومع ذلك ، على غرار النهج الأخرى القائمة على ثقافة الخلايا ، هناك قيود في استخدام خلايا C2C12 كنموذج للتمايز خلايا العضلات الهيكلية ، مثل الطبيعة ثنائية الأبعاد (2D) للإعداد ثقافة الخلية وعدم وجود بيئة مجهرية في الجسم الحي التي تعتبر حاسمة للحفاظ على خلايا السلائف العضلية الهيكلية غير المتمايزة10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد الحمض النووي بلازميد شرنا من الإشريكية القولونية

  1. جيل من المستعمرات البكتيرية clonal تحمل البلازميدات shRNA
    1. الحصول على مخزونات الجلسرين من الإشريكية القولونية التي تحمل البلازميدات shRNA محددة الهدف وبلازميد التحكم من مصادر تجارية(جدول المواد).
      ملاحظة: تم استخدام ثلاثة البلازميدات shRNA مختلفة، واستهداف مناطق مختلفة من murine Adamtsl2 مرنا. تم اختيار واحد shRNA لاستهداف المنطقة 3'غير مترجمة (3'UTR) من Adamtsl2 لتسهيل تجارب الإنقاذ مع بلازميدات التعبير ترميز المؤتلف كامل الطول ADAMTSL2 أو الفردية مجالات البروتين ADAMTSL2. وبالإضافة إلى ذلك، تم تضمين بلازميد shRNA مخفوق كتحكم سلبي. وترد تفاصيل تسلسل shRNA في الشكل 1ألف.
    2. إذابة مخزون الجلسرين البكتيري SHRNA في درجة حرارة الغرفة (RT). نقل 10 ميكرولتر من مخزون الجلسرين البكتيري على لوحة لوريا-بيرتني (LB) أغار مكمّلة بـ 100 ميكروغرام/مل أمبسيلين (LB-أمبير).
      ملاحظة: يتم إعداد لوحات LB-أمبير عن طريق التعقيم 1 لتر من متوسط LB (ل1 L: 10 غرام من التربتون، 5 غرام من مستخلص الخميرة، 10 غرام من NaCl، ضبط درجة الحموضة إلى 7.0) جنبا إلى جنب مع 12 غرام من أجار. دع المتوسط يبرد إلى ~ 50 درجة مئوية وإضافة الأمبيسيلين (محلول الأسهم: 50 ملغم / مللي لتر في الماء المعقم) إلى تركيز نهائي من ميكروغرام / مل (LB-أمبير أجار). صب على الفور ~ 20 مل من LB-أمبير أجار في طبق بيتري 10 سم والسماح لترسخ أجار قبل الاستخدام. 1 لتر من LB-أمبير أجار عادة ما تكون كافية لتصب حوالي 40 10 سم بيتري الأطباق. أطباق بيتري التي تحتوي على LB-أمبير أجار مستقرة لمدة شهر واحد على الأقل إذا تم تخزينها مختومة عند 4 درجات مئوية في الظلام.
    3. انتشار البكتيريا مع ملعقة دريغالسكي العقيمة أو أي طريقة مناسبة أخرى لتحقيق مستعمرات بكتيرية واحدة. احتضان لوحات البكتيرية رأسا على عقب بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
  2. إعداد البلازميد
    1. في صباح اليوم التالي، وإزالة طبق بيتري مع المستعمرات البكتيرية الفردية وتخزينها في 4 درجة مئوية لتجنب فرط نمو المستعمرات البكتيرية وتشكيل مستعمرات الأقمار الصناعية. ختم طبق بيتري إذا تم تخزينها بين عشية وضحاها أو لفترة أطول.
    2. في فترة ما بعد الظهر، إضافة 5 مل من LB-أمبير المتوسطة في أنبوب ثقافة البولي بروبلين البكتيرية. حدد مستعمرة بكتيرية واحدة من طبق بيتري مثقف بين عشية وضحاها مع طرف ماصة وتلقيح LB-أمبير المتوسطة عن طريق إخراج تلميح ماصة في أنبوب الثقافة البكتيرية التي تحتوي على وسط LB-أمبير.
    3. احتضان الثقافة البكتيرية بين عشية وضحاها في شاكر في 250 دورة في الدقيقة في 37 درجة مئوية مع غطاء تعلق فضفاضة للسماح للتهوّن.
    4. أخرج أنبوب الثقافة البكتيرية في صباح اليوم التالي والحفاظ على 4 درجة مئوية لتجنب فرط البكتيريا. في فترة ما بعد الظهر، إعادة تعليق البكتيريا عن طريق دوامة ونقل 1 مل من الثقافة البكتيرية بين عشية وضحاها في 50 مل من LB-أمبير المتوسطة في قارورة مخروطية 250 مل. احتضان بين عشية وضحاها في شاكر في 250 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية.
    5. في صباح اليوم التالي، نقل البكتيريا إلى 50 مل أنبوب الطرد المركزي المتاح والبكتيريا الطرد المركزي في 6000 × ز في RT لمدة 15 دقيقة. إزالة المتوسطة والاستمرار في الخطوة 1.2.6.
      ملاحظة: إذا كان لا يمكن عزل الحمض النووي البلازميد على الفور، قم بإزالة وسط LB-Amp بعد خطوة الطرد المركزي وتخزين بيليه البكتيريا عند -20 درجة مئوية.
    6. اتبع التعليمات لمجموعة إعداد البلازميد (مقياس MIDI) لاستخراج الحمض النووي البلازميد من البكتيريا. تقييم جودة الحمض النووي البلازميد من خلال قياس نسبة A260/A280 باستخدام مطياف ضوئي.
      ملاحظة: نسبةA 260/A280 من > 1.8 أمر مرغوب فيه، مما يشير إلى نقاء عالية من إعداد الحمض النووي البلازميد. تشير نسبةA 260/A280 المنخفضة إلى التلوث بالبروتين أو إزالة الكواشف الاستخراجية بشكل غير كافٍ. قد تكون هناك حاجة إلى خطوات تنقية البلازميد إضافية.

2. التبول وTransfection من خلايا C2C12 واختيار Puromycin

  1. ثقافة الخلية C2C12
    1. ذوبان خلايا C2C12(جدول المواد)بسرعة في حمام مائي 37 درجة مئوية وصب الخلايا في أنبوب مركزي قابل للتصرف معقم 15 مل تحتوي على 8 مل من متوسط النسر المعدل (DMEM) في Dulbecco المعدلة مع 100 وحدة من البينسيلين والمضادات الحيوية العقديتوميسين (DMEM خالية من المصل) في غطاء ثقافة الخلية. خلايا الطرد المركزي لمدة 3 دقيقة في 160 × ز في RT.
    2. اسشق supernatant وresuspend بيليه الخلية في 10 مل من DMEM خالية من المصل تستكمل مع 10٪ مصل الأبقار الجنين (FBS) (DMEM كاملة). نقل الخلايا إلى 10 سم زراعة الأنسجة الأطباق البلاستيكية المعالجة. الخلايا المحتضنة في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية في الغلاف الجويCO2 بنسبة 5٪.
    3. في اليوم التالي، استبدال المتوسطة مع DMEM كاملة جديدة.
    4. قم بتوسيع خلايا C2C12 ذات الممر المنخفض على أطباق 3-4 10 سم. عندما تصل خلايا C2C12 إلى التقاء 50-60٪، يستنشق الخلايا المتوسطة وشطف خلايا C2C12 مع 10 مل من المالحة المخزنة بالفوسفات (PBS).
    5. إضافة 1 مل من 0.25٪ التربسين-EDTA واحتضان لمدة 2 دقيقة في RT. رصد مفرزة الخلية تحت المجهر وتمديد وقت الحضانة إذا لزم الأمر، حتى يتم فصل معظم الخلايا.
      ملاحظة: يمكن أن يساعد النقر بعناية على الطبق في إزاحة الخلايا.
    6. عندما يتم فصل معظم الخلايا، إضافة 10 مل من DMEM كاملة إلى الطبق، ماصة حجم صعودا وهبوطا عدة مرات، ونقل تعليق الخلية إلى أنبوب طارد مركزي قابل للتصرف 15 مل معقمة. خلايا الطرد المركزي لمدة 3 دقيقة في 160 × ز في RT. استنشق وإعادة تعليق بيليه الخلية في 2 مل من تجميد المتوسطة (10٪ ثنائي ميثيل sulfoxide [DMSO]/90% FBS).
    7. نقل اثنين من 1 مل aliquots لكل طبق 10 سم في cryovials. تحضن في حاوية تجميد الخلايا مليئة إيزوبروبانول RT لمدة 24 ساعة على الأقل في ثلاجة -80 درجة مئوية مما أدى إلى معدل تجميد حوالي -1 درجة مئوية لكل دقيقة لتجنب تشكيل بلورات الثلج. تخزين الخلايا للاستخدام على المدى الطويل في مرحلة بخار النيتروجين السائل.
      ملاحظة: يوصي المورد باستخدام خلايا C2C12 حتى المرور رقم 15. وأظهرت تجارب المؤلفين أيضا أن انخفاض عدد خلايا المرور أظهرت تمايز أكثر اتساقا وسرعة في الأنابيب الأوائية. من الضروري الحفاظ على خلايا C2C12 في كثافة الخلايا المنخفضة (<50% التقاء) لتجنب بداية مبكرة للتمايز. لا يمكن إرجاع خلايا C2C12 المتمايزة أو المتمايزة إلى حالة myoblast الأصلية ويجب التخلص منها.
  2. إعداد خلايا C2C12 للترانز
    1. خلايا C2C12 اللامتمايزة في طبق 10 سم حتى تصل إلى 50-60٪ التقاء. يستنشق المتوسطة، وشطف خلايا C2C12 مع 10 مل من برنامج تلفزيوني، وإضافة 1 مل من 0.25٪ التربسين-EDTA. احتضان لمدة 2 دقيقة في RT، ورصد مفرزة الخلية تحت المجهر، وتمديد وقت الحضانة إذا لزم الأمر، حتى يتم فصل معظم الخلايا.
      ملاحظة: يمكن أن يساعد النقر بعناية على الطبق في إزاحة الخلايا.
    2. عندما يتم فصل معظم الخلايا، إضافة 10 مل من DMEM كاملة إلى الطبق ونقل تعليق الخلية إلى أنبوب طارد مركزي قابل للتصرف معقمة 15 مل. خلايا الطرد المركزي لمدة 3 دقيقة في 160 × ز في RT. استنشق وإعادة تعليق بيليه الخلية في 4 مل من DMEM كاملة.
    3. الجمع بين 10 ميكرولتر من تعليق الخلية مع 10 ميكرولتر من الأزرق trypan في أنبوب رد فعل 1.5 مل، مزيج عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا ونفض الغبار بعناية أنبوب رد الفعل، ونقل الخلايا إلى شريحة العد. تحديد رقم الخلية/مل باستخدام عداد خلية تلقائية.
    4. تمييع خلايا C2C12 إلى 50,000 خلية/مل وبذور 100,000 خلية (2 مل) لكل بئر في صفيحة بئر 6 لتحقيق التقاء حوالي 40-50% بعد الحضانة بين عشية وضحاها. الخلايا المحتضنة في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية في الغلاف الجويCO2 بنسبة 5٪.
  3. Transfection من خلايا C2C12 مع plasmid shRNA باستخدام polyethylenimine (PEI) واختيار puromycin
    1. إعداد حل أسهم جزيرة الأمير إدوارد
      1. حل 16 ملغ من جزيرة الأمير إدوارد في 50 مل من الماء المقطر المعقم (تركيز محلول المخزون: 0.32 ملغ / مل) في زجاجة وسائط زجاجية 50 مل مع غطاء المسمار. احتضان الحل عند درجة حرارة 65 درجة مئوية لساعة واحدة ودوامة الحل بقوة عدة مرات خلال فترة الحضانة لإذابة جزيرة الأمير إدوارد بالكامل.
      2. ضبط إلى درجة الحموضة 8 عن طريق إضافة 15 ميكرولتر من 1N HCl لكل 50 مل.
        تنبيه: HCl هو التآكل. وينبغي التعامل مع HCl المركزة تحت غطاء الدخان. وينبغي للمحققين ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة.
      3. قم بتجميد محلول PEI عند درجة حرارة -80 درجة مئوية لساعة واحدة مع غطاء فضفاض وذوبان هُنا بسرعة عند 37 درجة مئوية في حمام مائي لزيادة تعزيز الذوبان. كرر دورة التجميد والذوبان 3x.
      4. تخزين حل الأسهم جزيرة الأمير إدوارد في 0.5 مل aliquots للاستخدام لمرة واحدة في -20 درجة مئوية.
    2. تحويل خلايا C2C12
      1. الجمع بين 25.5 ميكرولتر (8.5 ميكرولتر / ميكروغرام البلازميد الحمض النووي) من محلول مخزون جزيرة الأمير إدوارد مع 100 ميكرولتر من 25 مل NaCl في أنبوب تفاعل 1.5 مل واحتضان لمدة 5 دقيقة عند 37 درجة مئوية. الجمع بين 3 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد مع 100 ميكرولتر من 25 mM NaCl واحتضان لمدة 5 دقيقة في 37 درجة مئوية.
      2. الجمع بين حجم كامل من كاشف PEI المخفف مع البلازميد المخفف ومزيج عن طريق الأنابيب بلطف صعودا وهبوطا. احتضان لمدة 25 دقيقة في 37 درجة مئوية.
      3. خلال فترة الحضانة، قم بتغيير وسط خلايا C2C12 المخصصة للنقل إلى DMEM دون FBS أو المضادات الحيوية.
      4. أضف مزيج تحويل جزيرة الأمير إدوارد/الحمض النووي إلى خلايا C2C12 التي تسقط عن طريق القطرة وتخلط باستمرار عن طريق تحريك طبق ثقافة الخلية بعناية. احتضان في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية في الغلاف الجويCO2 بنسبة 5٪. بعد 6 ساعة، تغيير المتوسطة لإكمال DMEM.
    3. اختيار بوروماسين
      1. 24 ساعة بعد الترانفسي، قم بالتبديل المتوسط إلى متوسط الاختيار (DMEM كاملة بالإضافة إلى 5 ميكروغرام/مل puromycin). استمر في اختيار البورومايسين حتى يتم الحصول على خلايا C2C12 المقاومة للبورومايسين، والتي عادة ما تستغرق 10-14 يومًا.
      2. توسيع خلايا C2C12 المقاومة للبوروموسين عند كثافة خلايا منخفضة (<50-60%)، أي للحفاظ على الحالة غير المتمايزة والحفاظ على التبريد لـ 6-10 قنينات للتجارب المستقبلية كما هو موضح في الخطوات 2.1.4−2.1.7.
        ملاحظة: الحفاظ على خلايا C2C12 المقاومة للبورومايسين في وجود 5 ميكروغرام/مل بوريوماسين لثقافة الخلايا الروتينية والتوسع. ومع ذلك، تم حذف puromycin في تجارب التمايز.

3. تحليل Phenotypic من التمايز C2C12

ملاحظة: يمكن بسهولة تكييف الأساليب الموضحة أدناه للتحليل العام للفتور C2C12 myoblast التمايز في الأنابيب الأوتريوبية عن طريق تغيير الأجسام المضادة المحددة المستخدمة في النشاف الغربي أو المؤشرات الأولية المحددة للجين المستخدمة في البوليميراز الكمي تحليل تفاعل المتسلسل (qPCR).

  1. C2C12 بروتوكول التمايز والمجهر برايتفيلد
    1. البذور 150،000 الخلايا / جيدا في لوحة 12 جيدا. الخلايا المستقرة C2C12 المقاومة للبوو~اووالستينيين في 12 بئر في وسط الانتقاء في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية فيغلاف جوي من 2% من ثاني أكسيد الكربون. الخلايا C2C12 الثقافة في DMEM كاملة حتى تصل إلى ~ 95٪ التقاء.
    2. للحث على التمايز من خلايا C2C12، استبدال DMEM كاملة مع DMEM خالية من المصل (يوم 0 من التمايز). تغيير المتوسطة كل يومين واتبع تشكيل myotube C2C12 باستخدام مجهر الحقل الساطع المقلوب مع الكاميرا.
      ملاحظة: تستخدم العديد من البروتوكولات مصل الحصان بنسبة 2% للتمييز بين خلايا C2C12 في الأنابيب الأوائية. في أيدي المؤلفين ، وإزالة المصل تماما كان لها تأثير مماثل. يوصف الأنسولين كمادة مضافة إلى وسط ثقافة الخلية لتسريع تمايز C2C12. ومع ذلك، في البروتوكول الحالي، تم تمييز خلايا C2C12 بشكل موثوق في الأنابيب الأوائية في غضون 3-5 أيام بعد حرمان المصل وإضافة الأنسولين.
  2. Myosin سلسلة الثقيلة (MyHC) المناعة لتصور الأنابيب الأوعية
    1. البذور 50،000 الخلايا C2C12 مقاومة البوروميسين لكل غرفة في شريحة غرفة بئر 8 في 500 ميكرولتر من DMEM كاملة. الخلايا الثقافة حتى تصل إلى 95٪ التقاء في DMEM كاملة (حوالي 24 ساعة).
    2. للحث على التمايز، انتقل من DMEM كاملة إلى 500 ميكرولتر من DMEM خالية من المصل (يوم 0 من التمايز). في النقطة الزمنية المطلوبة (ق)، يستنشق المتوسطة وشطف الخلايا 3x مع 0.5 مل من برنامج تلفزيوني.
      ملاحظة: تنفيذ كافة الخطوات التالية في RT.
    3. إصلاح الخلايا مع 0.2 مل من 4٪ paraformaldehyde (PFA) المخفف في برنامج تلفزيوني لمدة 15 دقيقة. شطف الخلايا مع 0.5 مل من PBS 3x لمدة 5 دقيقة لكل منهما.
      تنبيه: PFA خطرة. اتخاذ الاحتياطات المناسبة والتخلص من محلول البارافورمالديهايد كنفايات خطرة.
    4. إخماد PFA مع 0.2 مل من 0.5 M الجليسين في PBS لمدة 5 دقيقة. شطف الخلايا مع 0.5 مل من PBS 3x لمدة 5 دقيقة لكل منهما.
    5. الخلايا المحتضنة مع 0.2 مل من 0.1٪ السطحي غير الأيونية / المنظفات(جدول المواد)في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة لpermeabilize غشاء الخلية. كتلة مع 0.2 مل من 5٪ الزلال مصل البقر في PBS لمدة 1 ح. شطف الخلايا مع 0.5 مل من برنامج تلفزيوني 3x لمدة 5 دقيقة لكل منهما.
    6. الخلايا المحتضنة مع 0.2 مل من الأجسام المضادة MyHC (1:200 في برنامج تلفزيوني) لمدة 2 ساعة. شطف الخلايا مع 0.5 مل من برنامج تلفزيوني 3x لمدة 5 دقيقة لكل منهما.
    7. الخلايا المحتضنة مع 0.2 مل من الماعز المضادة للفأر رودامين الأحمر الاقتران الأجسام المضادة الثانوية (1:200 في برنامج تلفزيوني). شطف الخلايا مع 0.5 مل من برنامج تلفزيوني 3x لمدة 5 دقيقة لكل منهما.
    8. بعد إزالة برنامج تلفزيوني كميا, إضافة قطرة واحدة من وسط تصاعد تحتوي على 4′,6-diamidino-2-فينيليندول (DAPI) لكل غرفة. Coverslip وعلاج تصاعد المتوسطة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. ختم مع طلاء الأظافر.
    9. لاحظ خلايا C2C12 باستخدام مجهر مضان باستخدام مجموعة الفلتر المناسبة.
  3. تقييم كفاءة الضربة القاضية من خلال تفاعل البوليميراز الكمي في الوقت الحقيقي (qRT-PCR)
    1. الخلايا الثقافة C2C12 في ظل ظروف التمايز في 12 لوحات بئر كما هو موضح في القسم 3.1.
    2. في النقطة الزمنية المطلوبة (ق)، وإزالة الوسط التمايز، وشطف الخلايا مرة واحدة مع 1 مل من PBS، وإضافة 0.5 مل من كاشف استخراج الحمض النووي الريبي(جدول المواد)لكل بئر. الخلايا عن طريق الأنابيب بعناية صعودا وهبوطا ونقل خلية lysate إلى أنبوب تفاعل معقم 1.5 مل. عزل الجيش الملكي النيبالي بعناية باتباع بروتوكول الشركة المصنعة.
      تنبيه: يحتوي كاشف استخراج الحمض النووي الريبي RNA على الفينول. وينبغي استخدامه تحت غطاء الدخان. جمع النفايات الكاشف استخراج الحمض النووي الريبي والتخلص من النفايات الخطرة. وينبغي للمحققين ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة.
    3. حل بيليه الحمض النووي الريبي النهائي في 20 ميكرولتر من البيروكربونات الديثيل (DEPC) المياه المعالجة. تحديد كمية ونوعية إعداد الحمض النووي الريبي باستخدام مطياف ضوئي وتحديد نسبةA 260/A280 كمقياس للجودة.
      ملاحظة: العائد النموذجي من بئر واحد من صفيحة بئر 12 هو 5−7 ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي بنسبةA 260/A280 من 1.8−2.
    4. لهضم الحمض النووي الجينومي المشترك المتبقي، تمييع 1 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي في حجم إجمالي قدره 8 ميكرولتر من المياه المعالجة بـ DEPC في أنبوب PCR. إضافة 1 ميكرولتر من 10x العازلة رد الفعل و 1 μL من DNase I (1 وحدة / μL)(جدول المواد)واحتضان لمدة 15 دقيقة في RT. إضافة 1 μL من حل وقف (25 mM EDTA) واحتضان في 70 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
    5. لتوليد cDNA، والجمع بين 10 ميكرولتر من DNase تعامل الجيش الملكي النيبالي مع 10 ميكرولتر من 2x المزيج الرئيسي النسخ العكسي، التي تحتوي على النسخة العكسية، التمهيديات العشوائية، 4 mM مزيج dNTP (1 mM كل من dATP، dTTP، dGTP، وdCTP)، وعكس العازلة رد فعل transcriptase. احتضان رد الفعل في cycler باستخدام البرنامج على النحو الموصى به من قبل الشركة المصنعة. تمييع cDNA بالماء بنسبة 1:5.
    6. لإعداد رد فعل qRT-PCR، الجمع بين 5 ميكرولتر من SYBR الأخضر qPCR مزيج رئيسي مع 0.5 ميكرولتر من الكبريرز إلى الأمام عكس الجينات محددة (الأوراق المالية: 10 μM)، على التوالي، و 2 μL من المياه المعالجة DEPC لكل رد فعل. مازيت qPCR رد فعل في بئر واحد من 96 جيدا qRT-PCR لوحة وإضافة 2 ميكرولتر من cDNA المخفف. إعداد ثلاثة يكرر التقنية لكل تكرار البيولوجية وتشمل الجينات التدبير المنزلي مثل Gapdh أو Hprt1.
    7. تضخيم منتج PCR مع qRT-PCR thermocycler باستخدام البرنامج التالي: 50 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة (uracil-DNA glycosylase [UDG] التنشيط)، 95 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة (تنشيط الحمض النووي المزدوج القفل)، 40 دورات من 95 درجة مئوية لمدة 15 ث، 60 درجة مئوية لمدة 30 ث، و 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة.
    8. قياس نتائج qRT-PCR باستخدام طريقة DDCt التي تتم تسويتها إلى جين التدبير المنزلي، مثل Gapdh أو Hprt1.
  4. تقييم كفاءة الضربة القاضية من قبل النشاف الغربي
    1. البذور 300،000 الخلايا C2C12 مقاومة البوروميسين في بئر في لوحة 6 جيدا لتحليل لطخة الغربية. بعد 24 ساعة، تغيير المتوسطة إلى DMEM خالية من المصل لبدء التمايز (يوم 0 من التمايز).
    2. في النقطة الزمنية المطلوبة (النقاط) ، اجمع اثنين من 1 مل من وسط مكيف خال من المصل في أنبوب تفاعل 1.5 مل والطرد المركزي لمدة 5 دقيقة عند 500 × ز في RT لإزالة الخلايا المنفصلة وحطام الخلايا.
      ملاحظة: هذه الخطوة ضرورية فقط إذا تم التحقيق في بروتينات ECM أو غيرها من البروتينات السرى في وسط مشروط. إذا كان البروتين ذو الفائدة موضعياً في السيتوبلازم أو مرتبطاً بغشاء، يستنشق وسط ثقافة الخلية ويمضي في خطوات تحليل الخلايا (3.4.7−3.4.12). وينبغي أن يؤديتحلل الخلية بالتوازي مع هطول الأمطار البروتين من وسط مشروط خالية من المصل للحد من تدهور البروتين وغيرها من العواقب غير المقصودة للتخزين لفترات طويلة من طبقة الخلية.
    3. بعد الطرد المركزي، نقل 1 مل من المتوسطة مكيفة في أنبوب رد فعل جديد 1.5 مل والبروتينات راسبي بإضافة 0.391 مل من خليط من حمض ثلاثي كلورو الأسيتيك (TCA) وغير الأيونية السطحي / المنظفات. دوامة لفترة وجيزة الخليط واحتضان لمدة 10 دقيقة على الجليد.
      ملاحظة: إعداد خليط هطول الأمطار البروتين مباشرة قبل الاستخدام عن طريق الجمع بين 0.252 مل من 55٪ TCA و 0.139 مل من 1٪ السطحي غير الأيونية / المنظفات لكل مل من المتوسطة المكيفة والدوامة لفترة وجيزة. يصبح الحل عكرًا.
      تنبيه: TCA هو تآكل ويجب التعامل معها بشكل مناسب.
    4. بيليه البروتينات المترسبة في > 16,000 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 °C. تجاهل السوبرناستانت.
      تنبيه: يحتوي الـ supernatant على TCA وينبغي جمعه بشكل منفصل والتخلص منه كمواد خطرة.
    5. اغسل كريات البروتين 3x مع الأسيتون البارد والطرد المركزي في كل مرة في أكثر من 16000 × ز لمدة 10 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
    6. الهواء الجاف بيليه البروتين لمدة 3-4 دقيقة في RT وتذوب في 50 ميكرولتر من 1x الصوديوم dodecyl كبريتات البولي أكريلاميد هلام الكهربائي (SDS-PAGE) عينة عازلة (50 mM تريس درجة الحموضة 6.8، 2٪ SDS، 6٪ الجلسرين، و 0.004٪ بروموفينول الأزرق، تستكمل مع 5٪ α-mercapto اغلي العينة لمدة 5 دقيقة عند درجة حرارة 95 درجة مئوية واستخدمها في النشاف الغربي للكشف عن البروتين المستهدف المطلوب باستخدام الإجراءات القياسية.
      تنبيه: α-Mercaptoethanol هو رائحة وسامة ويجب التعامل معها في غطاء الدخان.
    7. للبروتينات داخل الخلايا والغشاء ملزمة، شطف طبقة الخلية مرة واحدة مع 2 مل من برنامج تلفزيوني.
    8. إضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني وإزاحة الخلايا عن طريق كشط لهم من البئر باستخدام مكشطة الخلية. جمع الخلايا في أنبوب تفاعل 1.5 مل وأجهزة الطرد المركزي في 3420 × ز لمدة 3 دقيقة عند 4 درجة مئوية. غسل بيليه الخلية 3x مع 1 مل من PBS والطرد المركزي في 3420 × ز لمدة 3 دقيقة في 4 درجة مئوية في كل مرة.
    9. لlyse الخلايا، وإعادة تعليق بيليه الخلية في 0.2 مل من المخزن المؤقت ليسيس (20 mM تريس-HCl درجة الحموضة 7.5، 150 mM NaCl, 1 mM Na2EDTA, 1 mM EGTA, 1% NP40, 1% ديوكسيتشوات الصوديوم, 2.5 mM بيروفوسفات الصوديوم, 1 mM α-glycerophosphate, و 1 MM الصوديوم تقويم الأسنان) تستكمل مع 1x EDTA-خالية من مثبطات المثبط الكاشف واحتضان لمدة 30 دقيقة على الجليد.
    10. Ultrasonicate لمدة 15 s على الجليد مع إعداد انتاج الطاقة من 10 في تردد التشغيل من 23 كيلو هرتز.
    11. إزالة حطام الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 13,680 × ز لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية. جمع supernatant في أنبوب تفاعل جديد 1.5 مل وتحديد تركيز البروتين باستخدام تحليل برادفورد التجارية أو أي طريقة مناسبة أخرى.
    12. لكل عينة، الجمع بين 100 ميكروغرام من البروتين مع 5x SDS-PAGE عينة المخزن المؤقت في حجم إجمالي قدره 60 ميكرولتر ويغلي لمدة 5 دقيقة في 95 درجة مئوية. تحليل العينات من خلال إجراءات النشاف الغربية القياسية لوجود البروتين المستهدف المطلوب.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يمكن اختيار C2C12 المقاوم للبوروميسين في غضون 10-14 يومًا بعد الترانقات بسبب التخلص الفعال من الخلايا غير المقاومة ، أي الخلايا غير المصابة(الشكل 1B). عادة، أكثر من 80٪ من الخلايا تنفصل عن طبق ثقافة الخلية ويتم إزالة هذه الخلايا أثناء الصيانة الروتينية للخلايا. تحتفظ خلايا C2C12 المقاومة للبوروموسين التي تعبر عن التحكم (المخفوق) بمورفولوجيا الخلايا المغزلية الممدودة عند كثافة الخلايا المنخفضة والقدرة على التفريق في الأنابيب الأوائية. يمكن رصد تمايز C2C12 عند انسحاب المصل عن طريق المجهر الميداني الساطع وعن طريق التلطيخ المناعي لسلسلة myosin الثقيلة (MyHC)(Figure 2). ويلاحظ myHC-الأنابيب الإيجابية بين 3-5 أيام بعد بدء التمايز. يتم استخدام الأنابيب المتعددة النواة كما هو موضح من خلال وجود أكثر من نواة إيجابية DAPI داخل حدود الخلية الإيجابية MyHC. الشكل 3ألف يظهر الصور الميدانية مشرق من خلايا C2C12 مستقرة المستزرعة في DMEM كاملة. تتراوح كفاءة الضربة القاضية المعروضة هنا بين 40-60%(الشكل 3B). منذ تم حصاد مرنا في الدولة التكاثرية حيث يتم التعبير عن القليل Adamtsl2، وكفاءة ضربة قاضية يبدو منخفضا، ولكن من المتوقع أن تكون كفاءة الضربة القاضية أكبر في وقت لاحق نقاط خلال تمايز C2C12، حيث يتم حث Adamtsl2 الذاتية وبالتالي أعرب في مستويات أعلى من ذلك بكثير. أكد تحليل لطخة الغربية الضربة القاضية الناجحة من ADAMTSL2 في خلية lysate التي تم الحصول عليها من خلايا C2C12 بشكل ثابت التعبير عن shRNA 3086 مقارنة مع السيطرة على شرنا(الشكل 3C).

Figure 1
الشكل 1: اختيار خلايا C2C12 مستقرة بعد التقال مع الحمض النووي plasmid shRNA الترميز. (أ)جدول يبين المنطقة المستهدفة (CDS، تسلسل الترميز؛ 3'-UTR، المنطقة غير المترجمة 3')، معرف المستنسخ (المشار إليه فيما بعد باسم 1977 و 3086 و 972)، وتسلسل shRNAs المستخدمة لاستهداف Adamtsl2. (ب)لوحات تظهر اختيار خلايا C2C12 عبر المصابين SHRNA السيطرة وثلاثة Adamtsl2-استهداف shRNAs. تم نقل خلايا C2C12 مع البلازميدات shRNA وتمت إضافة puromycin إلى الوسط بعد 24 ح. الخلايا الحساسة Puromycin تظهر جولة وفصل في نهاية المطاف خلال صيانة الخلايا الروتينية (السهام الحمراء). في المقابل، الخلايا المقاومة للبوروموسين التي تؤوي البلازميدات المتكاملة للشرنا تظهر على شكل مغزل، ممدود قليلاً، مرفق، وقابل للحياة (سهام زرقاء). أشرطة المقياس = 100 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: C2C12 myoblast إلى تمايز myotube. تُظهر الصور الميدانية الساطعة لخلايا C2C12 المتمايزة المظهر المرصوف بالحصى الكثيف للخلايا في بداية التمايز (اليوم 0−1) ولوحظت الأنابيب المتعددة النوى بعد اليوم الخامس (الصف العلوي). التلطيخ المناعي لخلايا C2C12 المتباينة مع سلسلة الميوسين الثقيلة (MyHC ، الأحمر) ، وهو علامة للأنابيب الأوعية ، يتم حثه في اليوم 3 من التمايز (اللوحة الوسطى). كانت النوى ملطخة DAPI وتظهر الصورة المدمجة في الألواح السفلية. أشرطة المقياس = 50 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: التحقق من صحة الضربة القاضية المستقرة في خلايا C2C12 المنتشرة. (أ)صور ميدانية ساطعة لخلايا C2C12 مستقرة مستزرعة في DMEM كاملة. أشرطة المقياس = 300 ميكرومتر (B) تحليل qRT-PCR للتعبير adamtsl2 mRNA في خلايا C2C12 المستقرة. تم تطبيع القيم Ct إلى جين التدبير المنزلي Hprt1. تم حصاد مرنا قبل بداية التمايز. تمثل أشرطة الخطأ انحرافًا معياريًا. (C)تحليل لطخة الغربية تظهر انخفاض البروتين ADAMTSL2 في الخلايا ليسات / ECM جزء من خلايا C2C12 بشكل ثابت التعبير عن shRNA 3086. تم الكشف عن ADAMTSL2 المنسّقة باستخدام جسم مضاد متعدد النسيلة (متوفر عند الطلب). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

نحن نصف هنا بروتوكول لضربة قاضية مستقرة من بروتينات ECM في C2C12 myoblasts وتحليل فينوتيبيك للتمايز من C2C12 myoblasts في الأنابيب الأومية. وهناك عدة عوامل تحدد نتيجة التجربة وتحتاج إلى النظر فيها بعناية. الحفاظ على خلايا C2C12 في مرحلة التكاثر هو خطوة حاسمة للحفاظ على خلايا C2C12 في حالة السلائف myoblast. الحفاظ على قدرة خلايا C2C12 على التفريق باستمرار في الأنابيب الأوائية يعتمد على i) عدد مرور الخلايا، ii) كثافة الخلايا المستزرعة أثناء الصيانة الروتينية، و3) توافر المواد الغذائية، مما يتطلب متكررة ومنتظمة من تجديد ثقافة الخلية المتوسطة11،12،13. بسبب بعض الآليات غير المعروفة ، أعلى عدد الخلايا C2C12 تفقد أيضا إمكانية مزيد من الانصهار myoblast11. التعليمات من مزود الخلايا C2C12 تشير إلى الحفاظ على هذه الخلايا حتى مرور رقم 15. بعد ذلك ، قد يتم تقليل إمكانية التمايز والتجارب مع مثل هذه الخلايا قد تؤدي إلى تكوين myotube أقل اتساقًا. من ناحية أخرى ، يمكن أن تؤدي كثافة الخلايا أثناء الصيانة إلى تأثيرات مماثلة9. التوصل إلى كثافات الخلايا C2C12 confluent أثناء زراعة الخلايا الروتينية تعزيز بدء تمايز Myoblast C2C12 وبالتالي قد تؤثر سلبا على إمكانية التمايز من السكان الخلية. لذلك ، من الأهمية بمكان منع خلايا C2C12 من الوصول إلى كثافات الخلايا العالية أثناء صيانة الخلايا C2C12 الروتينية. ويمكن تحقيق ذلك من خلال الاستزراع شبه المُستعبد بالفعل لخلايا C2C12 ذات كثافات منخفضة للخلايا (<50−60% التقاء). يستخدم تجويع المصل للحث على تمايز الخلية C2C12 في الأنابيب الأوميوب. ولذلك، والحفاظ على الخلايا لفترات أطول دون تجديد المتوسطة استنفاد بشدة مستويات المواد الغذائية والمصل. يمكن أن يؤدي تجديد المصل الطازج الذي يحتوي على متوسط كل يومين على الأقل إلى منع ظهور التمايز المبكر غير المرغوب فيه بسبب الحرمان من المغذيات والمصل.

عادة ما يحدث التمايز C2C12 عن طريق تجويع المصل. النسبة المئوية للمصل المستخدمة للحث على التمايز C2C12 يمكن أن تؤثر بشكل كبير على النتائج، وتحديدا الوقت الذي يستغرقه لتشكيل MyHC myotubes إيجابية14،15. تظهر عدة بروتوكولات تحريضًا ناجحًا للتمايز تحت تركيزات مصل مختلفة. تم الإبلاغ عن استخدام 2-10٪ FBS أو مصل الحصان والحرمان الكامل من المصل وتسفر جميع الظروف عن تكوين أنبوب اليوتوب C2C12. نسبة المصل أو التغيير في الكثير من المصل يمكن أن يغير بشكل كبير علامات التمايز. بالإضافة إلى ذلك ، قد يؤثر مصدر المصل على النتيجة التجريبية ، لأن بلد المنشأ قد يسمح أو لا يسمح ببعض الإضافات أثناء إنتاج مصل البقر8. ويمكن تعديل مستوى المصل لتحقيق معدل التمايز وفقا لمتطلبات تجريبية محددة. يمكن إضافة الأنسولين إلى الوسط الثقافي لخلايا C2C12 لتسريع التمايز وتشكيل myotube16.

القدرة على تسليم plasmids ترميز shRNA أو البروتينات المؤتلفة في خلايا C2C12 عن طريق الترانزفان هي ميزة جذابة من خلايا C2C12. وقد استخدمت العديد من الكواشف الترانسفيك التجارية المستندة إلى الدهون سابقا لتسليم الحمض النووي البلازميد في خلايا C2C12 مع كفاءة الترانفسيات ذكرت متغير17،18،19،20،21. كما تظهر جزيرة الأمير إدوارد كفاءة نقل معقولة وهي بديل فعال من حيث التكلفة لكواشف الترانزوفايات القائمة على الليبوسوم. وأظهرت مقارنة بين الترانزفيشن مع كاشف الترانفستور التجاري القائم على الليبوسوم وجزيرة الأمير إدوارد أي تغيير كبير في كفاءة الترانفس وكفاءة أعلى قليلا ً مع PEI22. في أيدينا، كانت كفاءة الترانزفيشن مع جزيرة الأمير إدوارد كافية لتوليد خلايا C2C12 المقاومة للبوروماسين مستقرة. ومع ذلك ، فإن الخطوة الحاسمة في هذا البروتوكول هي الحفاظ على وقت حضانة كاشف transfection قصيرًا. كما ذكر أعلاه، خلايا C2C12 حساسة لانسحاب المصل والتعرض لفترات طويلة لظروف المصل منخفضة أثناء التغوط قد تفضل تمايز الخلية C2C12. منذ يتم إجراء transfection في غياب المصل، ووقت الحضانة بعد transfection ظلت قصيرة لإعادة توريد بسرعة المصل التي تحتوي على المتوسطة لمنع التمايز المبكر. تمت إضافة Puromycin إلى الوسط الثقافي 24 ساعة بعد الترانزفيشن لبدء اختيار خلايا C2C12 المقاومة للبوروماسين. طرق لإدخال الحمض النووي البلازميد في myotubes متمايزة تشمل الترانفسيشن (ما يصل إلى 85٪ كفاءة المبلغ عنها)، electroporation، أو نهج biolistic23،24،25. بدلا من ذلك، يمكن إنشاء خلايا مستقرة C2C12 التي تؤوي بلازميد shRNA غير قابل للاختزال لهدم الجينات في مراحل لاحقة من التمايز myotube أو أثناء نضوج myotube26.

الطريقة الموصوفة هنا أسفرت عن ضربة قاضية مستقرة من ADAMTSL2 في خلايا C2C12 حيث يمكن الآن تحديد وظيفتها أثناء التمايز في الأنابيب الأووية. قد يكون توليد خلايا الضربة القاضية المستقرة مهمًا بشكل خاص لدراسة وظيفة البروتينات التي يتم الحصول عليها أثناء تكوين اليوتوب أو نضوجه. نقل عابر مع siRNA على سبيل المثال لن يكون كافيا لضرب هذه الجينات بكفاءة، لأن تأثير الضربة القاضية العابرة من siRNA قد فطام بعد 5-7 أيام. بدلا من ذلك ، فإن خروج المغلوب من بروتين ECM باستخدام CRISPR / Cas9 هو من الناحية الفنية أكثر تحديا واستنساخ الفردية تحتاج إلى اختيار وتسلسل لضمان خروج المغلوب من الجين المطلوب. ومع ذلك، فإن الخط المتطور للكواشف قد يجعل CRISPR/Cas9 الطريقة المفضلة لتجارب فقدان الوظيفة في المستقبل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgments

D.H. بدعم من المعاهد الوطنية للصحة (المعهد الوطني لالتهاب المفاصل والأمراض العضلية الهيكلية والجلدية، NIAMS، رقم المنحة AR070748) والتمويل الأولي من قسم ليني وبيتر دبليو مايو لجراحة العظام، كلية إيكان للطب في جبل سيناء.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone Fisher Chemical 191784
Agar Fisher Bioreagents BP1423
Ampicillin Fisher Bioreagents BP1760-5
Automated cell counter Countesse II Invitrogen A27977
Bradford Reagent Thermo Scientific P4205987
C2C12 cells ATCC CRL-1772
Chamber slides Invitrogen C10283
Chloroform Fisher Chemical 183172
DMEM GIBCO 11965-092
DMSO Fisher Bioreagents BP231-100
DNase I (Amplification Grade) Invitrogen 18068015
Fetal bovine serum VWR 97068-085
GAPDH EMD Millipore MAB374
Glycine VWR Life Sciences 19C2656013
Goat-anti-mouse secondary antibody (IRDYE 800CW) Li-Cor C90130-02
Goat-anti mouse secondary antibody (Rhodamine-red) Jackson Immune Research 133389
HCl Fisher Chemical A144S
Incubator (Shaker) Denville Scientific Corporation 1704N205BC105
Mercaptoethanol Amresco, VWR Life Sciences 2707C122
Midiprep plasmid extraction kit Qiagen 12643
Myosin 4 (myosin heavy chain) Invitrogen 14-6503-82
Mounting medium Invitrogen 2086310
NaCl VWR Life Sciences 241
non-ionic surfactant/detergent VWR Life Sciences 18D1856500
Paraformaldehyde MP 199983
PBS Fisher Bioreagents BP399-4
PEI Polysciences 23966-1
Penicillin/streptomycin antibiotics GIBCO 15140-122
Petridishes Corning 353003
Polypropylene tubes Fisherbrand 149569C
Protease inhibitor cocktail tablets Roche 33576300
Puromycin Fisher Scientific BP2956100
PCR (Real Time) Applied Biosystems 4359284
Reaction tubes Eppendorf 22364111
Reverse Transcription Master Mix Applied Biosystems 4368814
RIPA buffer Thermo Scientific TK274910
sh control plasmid Sigma-Aldrich 07201820MN
sh 3086 plasmid Sigma-Aldrich TRCN0000092578
sh 972 plasmid Sigma-Aldrich TRCN0000092579
sh 1977 plasmid Sigma-Aldrich TRCN0000092582
Spectrophotometer (Nanodrop) Thermo Scientific NanoDrop One C
SYBR Green Reagent Master Mix Applied Biosystems 743566
Trichloroacetic acid Acros Organics 30145369
Trizol reagent Ambion 254707
Trypan blue GIBCO 15250-061
Tryptone Fisher Bioreagents BP1421
Trypsin EDTA 0.25% Gibco-Life Technology Corporation 2085459
Water (DEPC treated and nuclease free) Fisher Bioreagents 186163
Western blotting apparatus Biorad Mini Protean Tetra Cell
Yeast extract Fisher Bioreagents BP1422

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tanzer, M. L. Current concepts of extracellular matrix. Journal of Orthopaedic Science: Official Journal of the Japanese Orthopaedic Association. 11 (3), 326-331 (2006).
  2. Hubmacher, D., Apte, S. S. The biology of the extracellular matrix: novel insights. Current Opinion in Rheumatology. 25 (1), 65-70 (2013).
  3. Sakai, L. Y., Keene, D. R. Fibrillin protein pleiotropy: Acromelic dysplasias. Matrix Biology. 80, 6-13 (2019).
  4. Iozzo, R. V., Gubbiotti, M. A. Extracellular matrix: The driving force of mammalian diseases. Matrix Biology. 71-72, 1-9 (2018).
  5. Le Goff, C., et al. ADAMTSL2 mutations in geleophysic dysplasia demonstrate a role for ADAMTS-like proteins in TGF-beta bioavailability regulation. Nature Genetics. 40 (9), 1119-1123 (2008).
  6. Dubail, J., Apte, S. S. Insights on ADAMTS proteases and ADAMTS-like proteins from mammalian genetics. Matrix Biology. 44-46, 24-37 (2015).
  7. Koo, B. H., et al. ADAMTS-like 2 (ADAMTSL2) is a secreted glycoprotein that is widely expressed during mouse embryogenesis and is regulated during skeletal myogenesis. Matrix Biology. 26 (6), 431-441 (2007).
  8. Khodabukus, A., Baar, K. The effect of serum origin on tissue engineered skeletal muscle function. Journal of Cellular Biochemistry. 115 (12), 2198-2207 (2014).
  9. Bajaj, P., et al. Patterning the differentiation of C2C12 skeletal myoblasts. Integrative Biology. 3 (9), 897-909 (2011).
  10. Mashinchian, O., Pisconti, A., Le Moal, E., Bentzinger, C. F. The Muscle Stem Cell Niche in Health and Disease. Current Topics in Developmental Biology. 126, 23-65 (2018).
  11. Hindi, L., McMillan, J. D., Afroze, D., Hindi, S. M., Kumar, A. Isolation, Culturing, and Differentiation of Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult Mice. Bio-protocol. 7 (9), 2248 (2017).
  12. Krauss, R. S., Joseph, G. A., Goel, A. J. Keep Your Friends Close: Cell-Cell Contact and Skeletal Myogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (2), 029298 (2017).
  13. Lawson, M. A., Purslow, P. P. Differentiation of myoblasts in serum-free media: effects of modified media are cell line-specific. Cells Tissues Organs. 167 (2-3), 130-137 (2000).
  14. Fujita, H., Endo, A., Shimizu, K., Nagamori, E. Evaluation of serum-free differentiation conditions for C2C12 myoblast cells assessed as to active tension generation capability. Biotechnology and Bioengineering. 107 (5), 894-901 (2010).
  15. Cheng, C. S., et al. Conditions that promote primary human skeletal myoblast culture and muscle differentiation in vitro. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 306 (4), 385-395 (2014).
  16. Conejo, R., Valverde, A. M., Benito, M., Lorenzo, M. Insulin produces myogenesis in C2C12 myoblasts by induction of NF-kappaB and downregulation of AP-1 activities. Journal of Cellular Physiology. 186 (1), 82-94 (2001).
  17. Dodds, E., Dunckley, M. G., Naujoks, K., Michaelis, U., Dickson, G. Lipofection of cultured mouse muscle cells: a direct comparison of Lipofectamine and DOSPER. Gene Therapy. 5 (4), 542-551 (1998).
  18. Balcı, B., Dinçer, P. Efficient transfection of mouse-derived C2C12 myoblasts using a matrigel basement membrane matrix. Biotechnology Journal. 4 (7), 1042-1045 (2009).
  19. Xia, D., et al. Overexpression of chemokine-like factor 2 promotes the proliferation and survival of C2C12 skeletal muscle cells. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Cell Research. 1591 (1), 163-173 (2002).
  20. Tapia, O., Gerace, L. Analysis of Nuclear Lamina Proteins in Myoblast Differentiation by Functional Complementation. Methods in Molecular Biology. 1411, 177-194 (2016).
  21. Yamano, S., Dai, J., Moursi, A. M. Comparison of transfection efficiency of nonviral gene transfer reagents. Molecular Biotechnology. 46 (3), 287-300 (2010).
  22. Luo, J., et al. An efficient method for in vitro gene delivery via regulation of cellular endocytosis pathway. International Journal of Nanomedicine. 10, 1667-1678 (2015).
  23. Sandri, M., Bortoloso, E., Nori, A., Volpe, P. Electrotransfer in differentiated myotubes: a novel, efficient procedure for functional gene transfer. Experimental Cell Research. 286 (1), 87-95 (2003).
  24. Yi, C. E., Bekker, J. M., Miller, G., Hill, K. L., Crosbie, R. H. Specific and potent RNA interference in terminally differentiated myotubes. Journal of Biological Chemistry. 278 (2), 934-939 (2003).
  25. Antolik, C., De Deyne, P. G., Bloch, R. J. Biolistic transfection of cultured myotubes. Science's STKE. 2003 (192), 11 (2003).
  26. Shintaku, J., et al. MyoD Regulates Skeletal Muscle Oxidative Metabolism Cooperatively with Alternative NF-kappaB. Cell Reports. 17 (2), 514-526 (2016).

Tags

علم الوراثة، العدد 156، بروتياسيس ADAMTS، البروتينات ADAMTS مثل، C2C12 myoblasts، مصفوفة خارج الخلية، تمايز العضلات الهيكل العظمي، تكوين عضلي، شرنا
ضربة قاضية مستقرة من الجينات ترميز البروتينات مصفوفة خارج الخلية في خط الخلية Myoblast C2C12 باستخدام الصغيرة Hairpin (ش) RNA
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Taye, N., Stanley, S., Hubmacher, D. … More

Taye, N., Stanley, S., Hubmacher, D. Stable Knockdown of Genes Encoding Extracellular Matrix Proteins in the C2C12 Myoblast Cell Line Using Small-Hairpin (sh)RNA. J. Vis. Exp. (156), e60824, doi:10.3791/60824 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter