Summary
Nous fournissons un protocole pour abattre de façon stable les gènes codant les protéines de matrice extracellulaire (ECM) dans les myoblastes C2C12 à l’aide d’ARN à épingle sh. Ciblant ADAMTSL2 à titre d’exemple, nous décrivons les méthodes de validation de l’efficacité de knockdown sur l’ARNm, la protéine et le niveau cellulaire pendant le myoblaste C2C12 à la différenciation myotube.
Abstract
Les protéines de matrice extracellulaire (ECM) sont cruciales pour le développement des muscles squelettiques et l’homéostasie. Le renversement stable des gènes codant pour les protéines ECM dans les myoblastes C2C12 peut être appliqué pour étudier le rôle de ces protéines dans le développement des muscles squelettiques. Ici, nous décrivons un protocole pour épuiser la protéine d’ECM ADAMTSL2 comme exemple, utilisant l’ARN de petite épingle (sh) dans les cellules c2C12. Après transfection des plasmides de shRNA, les cellules stables ont été batch-sélectionnées utilisant la puromycine. Nous décrivons en outre le maintien de ces lignées cellulaires et l’analyse phénotypique par l’expression de l’ARNm, l’expression protéique et la différenciation C2C12. Les avantages de la méthode sont la génération relativement rapide de cellules stables de knockdown c2C12 et la différenciation fiable des cellules c2C12 en myotubes multinucléés lors de l’épuisement du sérum dans le milieu de culture cellulaire. La différenciation des cellules C2C12 peut être surveillée par microscopie lumineuse de champ et en mesurant les niveaux d’expression des gènes canoniques de marqueur, tels que MyoD, myogénine, ou chaîne lourde de myosine (MyHC) indiquant la progression de la différenciation de myoblast c2C12 dans les myotubes. Contrairement à l’élimination transitoire des gènes avec de l’ARN à petite interférence (si), les gènes qui sont exprimés plus tard au cours de la différenciation C2C12 ou pendant la maturation du myotube peuvent être ciblés plus efficacement en générant des cellules C2C12 qui expriment de façon stable shRNA. Les limites de la méthode sont une variabilité dans l’efficacité knockdown, en fonction de l’ARSs spécifique qui peut être surmontée en utilisant des stratégies de knockout gène basé sur CRISPR/Cas9, ainsi que les effets potentiels hors cible de l’ARSs qui devraient être considérés.
Introduction
Les protéines de matrice extracellulaire (ECM) fournissent le soutien structurel pour tous les tissus, la communication de cellules-cellules de médiation, et déterminent le destin de cellules. La formation et le remodelage dynamique de l’ECM sont donc essentiels pour maintenir l’homéostasie des tissus et des organes1,2. Les variantes pathologiques dans plusieurs gènes codant pour des protéines d’ECM donnent lieu à des désordres musculo-squelettiques avec des phénotypes s’étendant des dystrophies musculaires à la construction pseudomouscular3,4. Par exemple, les variantes pathogènes dans ADAMTSL2 causent la dysplasie géléophile extrêmement rare de désordre musculo-squelettique, qui présente avec la construction pseudomusculaire, c.-à-d., une augmentation apparente de la masse de muscle squelettique5. Avec les données d’expression génique chez la souris et l’homme, cela suggère un rôle pour ADAMTSL2 dans le développement des muscles squelettiques ou l’homéostasie6,7.
Le protocole que nous décrivons ici a été développé pour étudier le mécanisme par lequel ADAMTSL2 module le développement de muscle squelettique et/ou l’homéostasie dans un arrangement de culture cellulaire. Nous avons poignardé ADAMTSL2 dans la lignée de myoblastes murine C2C12. Les myoblastes C2C12 et leur différenciation en myotubes est un modèle de culture cellulaire bien décrit et largement utilisé pour la différenciation des muscles squelettiques et la bioingénierie des muscles squelettiques8,9. Les cellules C2C12 passent par des étapes distinctes de différenciation après le retrait de sérum, ayant pour résultat la formation des myotubes multinucleated après 3-10 jours dans la culture. Ces étapes de différenciation peuvent être surveillées de façon fiable en mesurant les niveaux d’ARNm de gènes marqueurs distincts, tels que la myod, la myogénine ou la chaîne lourde de myosine (MyHC). Un avantage de générer des renversements de gènes stables dans les cellules C2C12 est que les gènes qui sont exprimés à des stades ultérieurs de la différenciation C2C12 peuvent être ciblés plus efficacement, par rapport à l’élimination transitoire réalisée par l’ARN à petite interférence (si), qui dure généralement de 5 à 7 jours après la transfection, et est influencé par l’efficacité de la transfection. Un deuxième avantage du protocole tel que décrit ici est la génération relativement rapide de lots de cellules knockdown C2C12 en utilisant la sélection de puromycine. Les solutions de rechange, telles que l’élimination du gène CRISPR/Cas9 ou l’isolement des précurseurs des cellules musculaires squelettiques primaires provenant de souris humaines ou déficientes en gènes cibles, sont techniquement plus difficiles ou nécessitent la disponibilité de biopsies musculaires du patient ou de souris déficientes en gènes cibles, respectivement. Cependant, comme d’autres approches basées sur la culture cellulaire, il ya des limites dans l’utilisation des cellules C2C12 comme modèle pour la différenciation des cellules musculaires squelettiques, tels que la nature bidimensionnelle (2D) de la culture cellulaire mise en place et l’absence de microenvironnement in vivo qui est essentiel pour maintenir indifférenciées cellules précurseurs musculaires squelettiques10.
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Protocol
1. Préparation de l’ADN plasmide shRNA d’Escherichia coli
- Génération de colonies bactériennes clonales porteuses des plasmides shRNA
- Obtenir des stocks de glycérol d’E. coli transportant des plasmides shRNA spécifiques à la cible et un plasmide de contrôle provenant de sources commerciales (Tableau des matériaux).
REMARQUE : Trois plasmides différents de shRNA ont été employés, ciblant différentes régions de l’ARNm Adamtsl2 murine. Un shRNA a été sélectionné pour cibler la région 3'-non traduite (3'UTR) d’Adamtsl2 pour faciliter les expériences de sauvetage avec des plasmides d’expression codant recombinant s’adamTSL2 ou différents domaines de protéines ADAMTSL2. En outre, un plasmide brouillé de shRNA a été inclus comme contrôle négatif. Les détails des séquences de shRNA sont fournis à la figure 1A. - Décongeler le stock bactérien de glycérol shRNA à température ambiante (RT). Transférer 10 l de stock bactérien de glycérol sur une plaque d’agar Luria-Bertani (LB) complétée d’ampicilline de 100 g/mL (LB-Amp).
REMARQUE: Les plaques LB-Amp sont préparées en autoclant1 L de milieu LB (pour 1 L: 10 g de tryptone, 5 g d’extrait de levure, 10 g de NaCl, ajuster le pH à 7,0) avec 12 g d’agar. Laisser refroidir le milieu jusqu’à 50 oC et ajouter l’ampicilline (solution de stock : 50 mg/mL dans de l’eau stérile) à une concentration finale d’agar LB/mL. Verser immédiatement 20 ml d’agar LB-Amp dans un plat Petri de 10 cm et laisser l’agar se solidifier avant de l’utiliser. 1 L de lb-amause est généralement suffisant pour verser environ 40 10 cm de vaisselle Petri. Les plats Petri contenant de l’agar LB-Amp sont stables pendant au moins un mois s’ils sont conservés scellés à 4 oC dans l’obscurité. - Étendre les bactéries avec la spatule stérile Drygalski ou toute autre méthode appropriée pour atteindre des colonies bactériennes uniques. Incuber les plaques bactériennes à l’envers pendant la nuit à 37 oC.
- Obtenir des stocks de glycérol d’E. coli transportant des plasmides shRNA spécifiques à la cible et un plasmide de contrôle provenant de sources commerciales (Tableau des matériaux).
- Préparation Plasmid
- Le lendemain matin, retirez le plat Petri avec les différentes colonies bactériennes et entreposez-les à 4 oC pour éviter la surcroissance des colonies bactériennes et la formation de colonies satellites. Scellez le plat Petri s’il est conservé pendant la nuit ou plus longtemps.
- Dans l’après-midi, ajouter 5 ml de lb-ampli moyen dans un tube de culture bactérienne en polypropylène. Sélectionnez une seule colonie bactérienne du plat Petri cultivé pendant la nuit avec une pointe de pipette et inoculez le milieu LB-Amp en éjectant la pointe de pipette dans le tube de culture bactérienne contenant le milieu LB-Amp.
- Incuber la culture bactérienne toute la nuit dans un shaker à 250 tr/min à 37 oC avec le couvercle lâchement fixé pour permettre l’aération.
- Sortez le tube de culture bactérienne le lendemain matin et conservez-le à 4 oC pour éviter la prolifération bactérienne. Dans l’après-midi, resuspendre les bactéries par vortex et transférer 1 ml de la culture bactérienne de nuit dans 50 ml de lb-ampli moyen dans un flacon conique de 250 ml. Incuber toute la nuit dans un shaker à 250 tr/min à 37 oC.
- Le lendemain matin, transférer les bactéries dans un tube de centrifugeuse jetable de 50 ml et des bactéries centrifugeuses à 6 000 x g à RT pendant 15 min. Retirez le milieu et continuez à l’étape 1,2,6.
REMARQUE : Si l’ADN plasmide ne peut pas être isolé immédiatement, retirez le milieu LB-Amp après l’étape de centrifugation et stockez la granule bactérienne à -20 oC. - Suivez les instructions pour le kit de préparation du plasmide (échelle midi) pour extraire l’ADN plasmide de la bactérie. Évaluez la qualité de l’ADN plasmique en mesurant le rapport A260/A280 à l’aide d’un spectrophotomètre.
REMARQUE : Un rapport A260/A280 de 1,8 est souhaitable, ce qui indique une grande pureté de la préparation de l’ADN plasmide. Un rapport A260/A280 inférieur suggère une contamination par des protéines ou un retrait insuffisant des réactifs d’extraction. D’autres étapes de purification du plasmide peuvent être nécessaires.
2. Culture et transfection des cellules C2C12 et de la sélection de puromycine
- Culture cellulaire C2C12
- Décongeler rapidement les cellules C2C12(tableau des matériaux)dans un bain d’eau de 37 oC et verser les cellules dans un tube de centrifugeuse stérile de 15 mL contenant 8 mL de milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco, complété par 100 unités d’antibiotiques de pénicilline et de streptomycine (DMEM sans sérum) dans un capuchon de culture cellulaire. Cellules centrifugeuses pendant 3 min à 160 x g à RT.
- Aspirate supernatant et resuspendre la pastille cellulaire dans 10 ml de DMEM sans sérum complété avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS) (DMEM complet). Transférer les cellules dans des plats en plastique traités par la culture tissulaire de 10 cm. Incuber les cellules dans un incubateur humidifié à 37 oC dans une atmosphère de CO2 de 5 %.
- Le lendemain, remplacez le milieu par un DMEM frais et complet.
- Élargir les cellules C2C12 à faible passage sur des plats de 3 à 4 10 cm. Lorsque les cellules C2C12 atteignent la confluence de 50 à 60 %, aspirez les cellules c2C12 moyennes et rinçant es avec 10 ml de salin tamponné par le phosphate (PBS).
- Ajouter 1 ml de trypsine-EDTA de 0,25 % et couver pendant 2 min au cr.T. Surveiller le détachement cellulaire sous un microscope et prolonger le temps d’incubation si nécessaire, jusqu’à ce que la plupart des cellules soient détachées.
REMARQUE : Le fait de taper soigneusement le plat peut aider à déloger les cellules. - Lorsque la plupart des cellules sont détachées, ajouter 10 ml de DMEM complet au plat, pipette le volume de haut en bas plusieurs fois, et transférer la suspension cellulaire à un tube stérile de centrifugeuse jetable de 15 ml. Cellules centrifugeuses pendant 3 min à 160 x g à RT. Aspirate supernatant et resuspend la pastille cellulaire en 2 ml de milieu de congélation (10 % de sulfoxide de diméthyle [DMSO]/90% FBS).
- Transférer deux aliquots de 1 ml par plat de 10 cm dans des cryovials. Incuber dans un récipient de congélation cellulaire rempli d’isopropanol DE RT pendant au moins 24 h dans un congélateur de -80 oC, ce qui donne un taux de congélation d’environ -1 oC par min pour éviter la formation de cristaux de glace. Entreposez les cellules pour une utilisation à long terme dans la phase de vapeur de l’azote liquide.
REMARQUE : Le fournisseur recommande d’utiliser des cellules C2C12 jusqu’au numéro de passage 15. Les expériences des auteurs ont également montré que les cellules de nombre de passage inférieurs ont montré une différenciation plus cohérente et plus rapide en myotubes. Il est essentiel de maintenir les cellules C2C12 à faible densité cellulaire (confluence de 50 % pour éviter l’début prématuré de la différenciation. Les cellules C2C12 différenciées ou différenciées ne peuvent pas être retournées dans l’état de myoblast d’origine et doivent être jetées.
- Préparation des cellules C2C12 pour la transfection
- Culture indifférenciée cellules C2C12 dans un plat de 10 cm jusqu’à ce qu’ils atteignent 50-60% confluence. Aspirer le milieu, rincer les cellules C2C12 avec 10 ml de PBS, et ajouter 1 ml de 0,25% trypsine-EDTA. Incuber pendant 2 min à RT, surveiller le détachement cellulaire au microscope et prolonger le temps d’incubation si nécessaire, jusqu’à ce que la plupart des cellules soient détachées.
REMARQUE : Le fait de taper soigneusement le plat peut aider à déloger les cellules. - Lorsque la plupart des cellules sont détachées, ajouter 10 ml de DMEM complet au plat et transférer la suspension cellulaire à un tube de centrifugeuse stérile jetable de 15 ml. Cellules centrifugeuses pendant 3 min à 160 x g à RT. Aspirate supernatant et resuspend le granule cellulaire en 4 ml de DMEM complet.
- Combiner 10 l de suspension cellulaire avec 10 l de bleu trypan dans un tube de réaction de 1,5 ml, mélanger en pipetting de haut en bas et en faisant glisser soigneusement le tube de réaction, et transférer les cellules à une glissière de comptage. Déterminez le numéro de cellule/mL à l’aide d’un compteur cellulaire automatisé.
- Diluer les cellules C2C12 à 50 000 cellules/mL et à graines 100 000 cellules (2 ml) par puits dans une plaque de 6 puits pour atteindre une confluence d’environ 40 à 50 % après l’incubation pendant la nuit. Incuber les cellules dans un incubateur humidifié à 37 oC dans une atmosphère de CO2 de 5 %.
- Culture indifférenciée cellules C2C12 dans un plat de 10 cm jusqu’à ce qu’ils atteignent 50-60% confluence. Aspirer le milieu, rincer les cellules C2C12 avec 10 ml de PBS, et ajouter 1 ml de 0,25% trypsine-EDTA. Incuber pendant 2 min à RT, surveiller le détachement cellulaire au microscope et prolonger le temps d’incubation si nécessaire, jusqu’à ce que la plupart des cellules soient détachées.
- Transfection des cellules C2C12 avec le plasmide de l’ARNc à l’aide de la polyéthylènenimine (PEI) et de la sélection de la puromycine
- Préparation de la solution d’actions de l’Ile-du-Prince-
- Dissoudre 16 mg de l’Ile-du-Prince-Édouard dans 50 ml d’eau distillée stérile (concentration de la solution de stock : 0,32 mg/ml) dans une bouteille de 50 ml en verre avec un bouchon à vis. Incuber la solution à 65 oC pendant 1 h et le vortex la solution vigoureusement plusieurs fois au cours de la période d’incubation pour dissoudre complètement l’Ile-du-Prince-Édouard.
- Ajuster au pH 8 en ajoutant 15 oL de 1N HCl par 50 ml.
CAUTION: HCl est corrosif. Le HCl concentré doit être manipulé sous le capot de fumée. Les enquêteurs devraient porter l’équipement de protection individuelle approprié. - Congeler la solution de l’Ile-du-Prince-Édouard à -80 oC pendant 1 h avec un couvercle lâchement fixé et décongeler rapidement à 37 oC dans un bain d’eau pour améliorer davantage la solubilité. Répétez le cycle de gel-dégel 3x.
- Stock-solution de l’Ile-du-Prince-Édouard dans des aliquots de 0,5 ml pour une utilisation ponctuelle à -20 oC.
- Transfection des cellules C2C12
- Combiner 25,5 L (8,5 'L/'g d’ADN plasmid) de la solution de stock de l’Ile-du-Prince-Édouard avec 100 'L de 25 mM NaCl dans un tube de réaction de 1,5 mL et incuber pendant 5 min à 37 'C. Combiner 3 g d’ADN plasmide avec 100 oL de 25 mM NaCl et couver pendant 5 min à 37 oC.
- Mélanger l’ensemble du volume de réactif dilué de l’Ile-du-Prince-Édouard avec le plasmide dilué et mélanger en faisant doucement monter et descendre. Incuber pendant 25 min à 37 oC.
- Pendant la période d’incubation, modifiez le milieu des cellules C2C12 destinées à la transfection vers le DMEM sans SGF ni antibiotiques.
- Ajoutez le mélange de transfection de l’Ile-du-Prince-Édouard/ADN aux cellules C2C12 goutte à goutte et mélangez constamment en déplaçant soigneusement le plat de culture cellulaire. Incuber dans un incubateur humidifié à 37 oC dans une atmosphère de CO2 à 5 %. Après 6 h, changer le support pour compléter DMEM.
- Sélection Puromycine
- 24 h après transfection, passer du milieu au milieu de sélection (DMEM complet plus 5 'g/mL puromycine). Continuer la sélection de puromycine jusqu’à ce que les cellules C2C12 résistantes à la puromycine soient obtenues, ce qui prend généralement de 10 à 14 jours.
- Élargir les cellules C2C12 résistantes à la puromycine à faible densité cellulaire (confluence de 50 à 60 %), c’est-à-dire pour maintenir l’état indifférencié et la cryoconservation de 6 à 10 flacons pour de futures expériences, comme décrit dans les étapes 2.1.4-2.1.7.
REMARQUE : Maintenir les cellules C2C12 résistantes à la puromycine en présence d’une puromycine de 5 g/mL pour la culture et l’expansion cellulaires de routine. Cependant, la puromycine a été omise dans les expériences de différenciation.
- Préparation de la solution d’actions de l’Ile-du-Prince-
3. Analyse phénotypique de la différenciation C2C12
REMARQUE : Les méthodes décrites ci-dessous peuvent facilement être adaptées pour l’analyse phénotypique générale de la différenciation du myoblaste C2C12 en myotubes en variant les anticorps spécifiques utilisés dans le ballonnement occidental ou les amorces spécifiques aux gènes utilisées dans la polymérase quantitative l’analyse de réaction en chaîne (qPCR).
- Protocole de différenciation C2C12 et microscopie brightfield
- Graines 150 000 cellules/puits dans une plaque de 12 puits. Cellules stables C2C12 résistantes à la puromycine dans une plaque de 12 puits dans un milieu de sélection dans un incubateur humidifié à 37 oC dans une atmosphère de CO2 de 5 %. Culture C2C12 cellules en DMEM complet jusqu’à ce qu’ils atteignent la confluence de 95%.
- Pour induire la différenciation des cellules C2C12, remplacez le DMEM complet par du DMEM sans sérum (jour 0 de différenciation). Changez de milieu tous les deux jours et suivez la formation du myotube C2C12 à l’aide d’un microscope de champ lumineux inversé avec une caméra.
REMARQUE : De nombreux protocoles utilisent 2 % de sérum de cheval pour différencier les cellules C2C12 en myotubes. Dans les mains des auteurs, enlever le sérum a eu un effet similaire. L’insuline est décrite comme un additif au milieu de culture cellulaire pour accélérer la différenciation C2C12. Cependant, dans le protocole actuel, les cellules c2C12 se différencient de façon fiable en myotubes dans les 3 à 5 jours suivant la privation de sérum et l’ajout d’insuline a été jugé inutile.
- Myosin heavy chain (MyHC) immunostaining to visualize myotubes Myosin heavy chain (MyHC) immunostaining to visualize myotubes Myosin heavy chain (MyHC) immunostaining to visualize myotubes Myos
- Graines 50 000 cellules C2C12 résistantes à la puromycine par chambre dans une glissière de chambre de puits de 8 dans 500 'L de DMEM complet. Cellules de culture jusqu’à ce qu’elles atteignent 95% de confluence dans le DMEM complet (environ 24 h).
- Pour induire la différenciation, passez d’un DMEM complet à 500 L de DMEM sans sérum (jour 0 de différenciation). Au moment souhaité(s), aspirer le milieu et rincer les cellules 3x avec 0,5 ml de PBS.
REMARQUE : Effectuez toutes les étapes suivantes à RT. - Fixer les cellules avec 0,2 ml de paraformaldéhyde (PFA) dilué dans le PBS pendant 15 min. Rincer les cellules avec 0,5 mL de PBS 3x pour 5 min chacun.
CAUTION: PFA est dangereux. Prenez les précautions appropriées et jetez la solution de paraformaldéhyde comme déchets dangereux. - Quench PFA avec 0,2 ml de 0,5 M de glycine en PBS pendant 5 min. Rincer les cellules avec 0,5 mL de PBS 3x pour 5 min chacun.
- Incubate les cellules avec 0,2 ml de 0,1% de surfactant/détergent non ionique (Tableau des matériaux) en PBS pendant 10 min pour perméabilize la membrane cellulaire. Bloquer avec 0,2 ml d’albumine de sérum bovin de 5 % en PBS pendant 1 h. Rincer les cellules avec 0,5 ml de PBS 3x pendant 5 min chacun.
- Incuber les cellules avec 0,2 ml d’anticorps MyHC (1:200 en PBS) pendant 2 h. Rincer les cellules avec 0,5 ml de PBS 3x pendant 5 min chacun.
- Cellules d’incubation avec 0.2 ml de la chèvre-anti souris rhodamine rouge-conjugué anticorps secondaires (1:200 dans PBS). Rincer les cellules avec 0,5 ml de PBS 3x pendant 5 min chacune.
- Après avoir supprimé PBS quantitativement, ajouter une goutte de support de montage contenant 4,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) par chambre. Coverslip et guérir le milieu de montage selon les instructions du fabricant. Sceller avec du vernis à ongles.
- Observez les cellules C2C12 à l’aide d’un microscope à fluorescence à l’aide de l’ensemble de filtre approprié.
- Évaluation de l’efficacité du knockdown par réaction quantitative en chaîne de polymérase en temps réel (qRT-PCR)
- Cellules de culture C2C12 dans des conditions de différenciation dans 12 plaques de puits comme décrit dans la section 3.1.
- Au moment souhaité( s), retirez le milieu de différenciation, rincez les cellules une fois avec 1 ml de PBS, et ajoutez 0,5 ml de réactif d’extraction d’ARN (Tableau des matériaux) par puits. Lyse les cellules en pipetting soigneusement de haut en bas et le lysate cellulaire de transfert à un tube de réaction stérile de 1,5 ml. Isolez l’ARN en suivant attentivement le protocole du fabricant.
CAUTION: Le réactif d’extraction d’ARN contient du phénol. Il doit être utilisé sous une hotte de fumée. Recueillir les déchets de réagent d’extraction d’ARN et éliminer comme déchets dangereux. Les enquêteurs devraient porter l’équipement de protection individuelle approprié. - Dissoudre la pastille d’ARN finale dans 20 l’eau traitée par le pyrocarbonate de diéthyle (DEPC). Déterminer la quantité et la qualité de la préparation de l’ARN à l’aide d’un spectrophotomètre et déterminer le rapport A260/A280 comme mesure de qualité.
REMARQUE : Un rendement typique de 1 puits d’une plaque de puits de 12 est de 5 à 7 g d’ARN total avec un ratio A260/A280 de 1,8 à 2. - Pour digérer l’ADN génomique co-purifié résiduel, diluer 1 'g d’ARN dans un volume total de 8 'L d’eau DEPC-traitée dans un tube de PCR. Ajouter 1 l de mémoire tampon de réaction 10x et 1 l de DNase I (1 unité/L)(tableau des matériaux)et couver pendant 15 min à RT. Ajouter 1 l de solution d’arrêt (25 mM EDTA) et couver à 70 oC pendant 10 min.
- Pour générer de l’ADNc, combiner 10 L d’ARN traité Par DNase avec 10 l de mix principal de transcriptase inversé, contenant la transcriptase inversée, les amorces aléatoires, le mix dNTP de 4 mM (1 mM chacun de dATP, dTTP, dGTP et dCTP), et le tampon de réaction de transcriptase inversé. Incuber la réaction dans un thermocycleur en utilisant le programme tel que recommandé par le fabricant. Diluer l’ADNc avec de l’eau dans un rapport de 1:5.
- Pour préparer la réaction qRT-PCR, combiner 5 'L de sYBR vert qPCR master mix avec 0,5 'L d’amorces avant et inverses spécifiques aux gènes (stock: 10 'M), respectivement, et 2 'L d’eau traitée par DEPC-traité par réaction. Réaction de Pipette qPCR dans un puits d’une plaque qRT-PCR de puits et ajoutez 2 L de cDNA dilué. Configurez trois répliques techniques pour chaque réplique biologique et incluez un gène d’entretien ménager tel que Gapdh ou Hprt1.
- Amplifiez le produit PCR avec un thermocycler qRT-PCR à l’aide du programme suivant : 50 oC pour 2 min (activation de glycosylase d’uracil-ADN [UDG]), 95 oC pour 2 min (activation de la polymérase d’ADN à double verrouillage), 40 cycles de 95 oC pour 15 s, 60 oC pour 30 s et 72 oC pour 1 min.
- Quantifier les résultats qRT-PCR en utilisant la méthode DDCt de normalisation à un gène d’entretien ménager, tels que Gapdh ou Hprt1.
- Évaluation de l’efficacité de knockdown par le ballonnement occidental
- Seed 300,000 puromycin-résistant c2C12 cellules par puits dans une plaque de 6 puits pour l’analyse de tache occidentale. Après 24 h, changer de DMEM moyen à sans sérum pour initier la différenciation (jour 0 de différenciation).
- Au moment souhaité( s), recueillir deux 1 ml de milieu conditionné sans sérum dans un tube de réaction de 1,5 ml et une centrifugeuse pendant 5 min à 500 x g à RT pour enlever les cellules détachées et les débris cellulaires.
REMARQUE : Cette étape n’est nécessaire que si l’on étudie les protéines ECM ou d’autres protéines sécrétées dans le milieu conditionné. Si la protéine d’intérêt est localisée dans le cytoplasme ou est liée à la membrane, aspirez le milieu de culture cellulaire et procédez aux étapes de lyse cellulaire (3,4,7 à 3,4,12). La lyse cellulaire doit être effectuée en parallèle aux précipitations protéiques du milieu conditionné sans sérum afin de minimiser la dégradation protéolytique et d’autres conséquences involontaires d’un stockage prolongé de la couche cellulaire. - Après centrifugation, transférer 1 ml de milieu conditionné dans un nouveau tube de réaction de 1,5 ml et précipiter les protéines en ajoutant 0,391 ml d’un mélange d’acide trichloroacétique (TCA) et de surfactant/détergent non ionique. Vortex brièvement le mélange et couver pendant 10 min sur la glace.
REMARQUE : Préparer le mélange de précipitations protéiques directement avant utilisation en combinant 0,252 ml de 55 % de TCA et 0,139 ml de 1 % de surfactant/détergent non ionique par mL de milieu conditionné et de vortex brièvement. La solution devient turbide.
CAUTION: TCA est corrosif et doit être manipulé de manière appropriée. - Pelleter les protéines précipitées à 16 000 x g pour 10 min à 4 oC. Jetez le supernatant.
CAUTION: Le supernatant contient tCA et doit être recueilli séparément et éliminé comme matière dangereuse. - Laver la protéine granule 3x avec de l’acétone glacée et centrifugeuse à chaque fois à 16 000 x g x 10 min à 4 oC.
- Sécher à l’air la pastille protéique pendant 3 à 4 min à RT et dissoudre en 50 oL de 1x dodecyl sulfate de sulfate de polyacrylamide de gel électrophorésis (SDS-PAGE) tampon d’échantillon (50 mM Tris pH 6,8, 2% SDS, 6% glycérol, et 0,004% bromophenol bleu, complété par 5% de mercaptoéthanol). Faire bouillir l’échantillon pendant 5 min à 95 oC et utiliser pour le ballonnement occidental pour détecter la protéine cible désirée à l’aide de procédures standard.
ATTENTION : Le mercaptoéthanol est odorant et toxique et doit être manipulé dans une hotte de fumée. - Pour les protéines intracellulaires et liées à la membrane, rincer la couche cellulaire une fois avec 2 ml de PBS.
- Ajouter 1 ml de PBS et déloger les cellules en les grattant du puits à l’aide d’un grattoir cellulaire. Recueillir les cellules dans un tube de réaction de 1,5 ml et une centrifugeuse à 3 420 x g pendant 3 min à 4 oC. Laver la pastille cellulaire 3x avec 1 ml de PBS et la centrifugeuse à 3 420 x g pendant 3 min à 4 oC à chaque fois.
- Pour lyser les cellules, resuspendre la pastille cellulaire dans 0,2 ml de tampon de lyse (20 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM Na2EDTA, 1 mM EGTA, 1 % NP40, 1 % de désoxycholate de sodium, 2,5 mM de pyrophosphate de sodium, 1 mM d’orthovanadate de sodium et 1 mM d’orthovanadate de sodium) complétés par 1 x réagent de cocktail et incubé sain de 30 min sur glace.
- Ultrasonate pour 15 s sur glace avec un réglage de puissance de 10 à une fréquence de fonctionnement de 23 kHz.
- Enlever les débris cellulaires par centrifugation à 13 680 x g pendant 20 min à 4 oC. Recueillir le supernatant dans un nouveau tube de réaction de 1,5 ml et déterminer la concentration de protéines à l’aide d’un essai commercial Bradford ou de toute autre méthode appropriée.
- Pour chaque échantillon, combiner 100 g de protéines avec un tampon d’échantillon SDS-PAGE de 5 x 5 x dans un volume total de 60 L et faire bouillir pendant 5 min à 95 oC. Analyser les échantillons par les procédures occidentales standard de ballonnement pour la présence de la protéine cible désirée.
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Representative Results
La sélection du C2C12 résistant à la puromycine peut être réalisée en 10 à 14 jours après la transfection en raison de l’élimination efficace des cellules non résistantes, c’est-à-dire non transfectées (figure 1B). Typiquement, plus de 80% des cellules se détachent du plat de culture cellulaire et ces cellules sont enlevées pendant l’entretien courant des cellules. Les cellules C2C12 résistantes à la puromycine exprimant l’ARNc de contrôle (brouillé) conservent la morphologie cellulaire allongée en forme de fuseau à faible densité cellulaire et la capacité de se différencier en myotubes. La différenciation C2C12 sur le retrait du sérum peut être surveillée par microscopie de champ lumineuse et par immunostaining pour la chaîne lourde de myotube de myotube de myosin (MyHC) (figure 2). Les myotubes myHC-positifs sont observés entre 3 et 5 jours après l’initiation de différenciation. Les myotubes sont multinucléés comme le montre la présence de plus d’un noyau Positif DAPI dans les limites cellulaires MyHC-positives. La figure 3A montre des images de champ lumineuses de cellules Stables C2C12 cultivées en DMEM complet. L’efficacité de knockdown présentée ici varie de 40 à 60% (figure 3B). Depuis l’ARNm a été récolté dans l’état de prolifération où le peu Adamtsl2 est exprimé, l’efficacité knockdown semble faible, mais l’efficacité knockdown devrait être plus grande à des moments ultérieurs au cours de la différenciation C2C12, où Adamtsl2 endogène est induit et donc exprimé à des niveaux beaucoup plus élevés. L’analyse occidentale de tache a confirmé le knockdown réussi d’ADAMTSL2 dans le lysate de cellule obtenu des cellules de C2C12 exprimant stably shRNA 3086 comparé au shRNA de commande (figure 3C).
Figure 1 : Sélection de cellules Stables c2C12 après transfection avec l’ADN plasmide shRNA-encodage. (A) Tableau montrant la région cible (CDS, séquence de codage; 3'-UTR, 3'-région non traduite), ID de clone (ci-après désigné sous le nom de 1977, 3086, et 972), et séquence des shRNAs utilisés pour cibler Adamtsl2. (B) Les panneaux montrent la sélection des cellules C2C12 transfectées avec le shRNA de contrôle et les trois shARN d’Adamtsl2-ciblage. Les cellules C2C12 ont été transfectées avec les plasmides de shRNA et la puromycine a été ajoutée au milieu après 24 h. Les cellules sensibles à la puromycine apparaissent rondes et finissent par se détacher pendant le maintien de la culture cellulaire de routine (flèches rouges). En revanche, les cellules résistantes à la puromycine abritant les plasmides shRNA intégrés apparaissent en forme de fuseau, légèrement allongées, attachées et viables (flèches bleues). Barres d’échelle de 100 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Myoblaste C2C12 à la différenciation myotube. Des images lumineuses de champ de cellules C2C12 différenciantes montrent l’aspect dense de pavé des cellules au début de la différenciation (jour 0-1) et les myotubes multinucleated ont été observés après le jour 5 (rangée supérieure). L’immunostaining des cellules c2C12 différenciantes avec la chaîne lourde de myosine (MyHC, rouge), qui est un marqueur pour des myotubes, est induite au jour 3 de la différenciation (panneau moyen). Les noyaux ont été tachés de DAPI et l’image fusionnée est affichée dans les panneaux inférieurs. Barres d’échelle de 50 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Validation d’un renversement stable dans les cellules C2C12 proliférantes. (A) Images de champ lumineuses des cellules stables de C2C12 cultivées dans le DMEM complet. Barres d’échelle de 300 m. (B) analyse qRT-PCR de l’expression de l’ARNm Adamtsl2 dans des cellules C2C12 stables. Les valeurs de Ct ont été normalisées au gène d’entretien ménager Hprt1. l’ARNm a été récolté avant le début de la différenciation. Les barres d’erreur représentent l’écart type. (C) Analyse de tache occidentale montrant la protéine ADAMTSL2 réduite dans la fraction de lysate/ECM de cellules de C2C12 exprimant de façon stable shRNA 3086. AdamTSL2 endogène a été détecté à l’aide d’un anticorps peptidique polyclonal sur mesure (disponible sur demande). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Nous décrivons ici un protocole pour le knockdown stable des protéines d’ECM dans les myoblastes de C2C12 et pour l’analyse phénotypique de la différenciation des myoblastes de C2C12 dans les myotubes. Plusieurs facteurs déterminent l’issue de l’expérience et doivent être examinés attentivement. Le maintien des cellules C2C12 dans la phase proliférante est une étape critique pour maintenir les cellules C2C12 dans l’état précurseur du myoblaste. Le maintien de la capacité des cellules C2C12 à se différencier uniformément en myotubes dépend de i) le nombre de passage des cellules, ii) la densité des cellules cultivées pendant l’entretien courant, et iii) la disponibilité des éléments nutritifs, nécessitant un réapprovisionnement fréquent et régulier du milieu de culture cellulaire11,12,13. En raison de certains mécanismes inconnus, le nombre de passage plus élevé C2C12 cellules perdent également le potentiel pour la fusion de myoblast11. Les instructions du fournisseur des cellules C2C12 suggèrent de maintenir ces cellules jusqu’au passage numéro 15. Par la suite, le potentiel de différenciation peut être réduit et les expériences avec de telles cellules peuvent avoir comme conséquence la formation moins cohérente de myotube. D’autre part, la densité cellulaire pendant l’entretien peut entraîner des effets similaires9. Atteindre les densités cellulaires confluentes C2C12 pendant la culture cellulaire de routine favoriselle l’initiation de la différenciation du myoblaste C2C12 et peut donc avoir une influence négative sur le potentiel de différenciation de la population cellulaire. Par conséquent, il est d’une importance critique pour empêcher les cellules C2C12 d’atteindre des densités cellulaires élevées pendant l’entretien courant des cellules C2C12. Ceci peut être réalisé en sous-cculturant déjà des cellules C2C12 à de faibles densités cellulaires (confluence de 50 à 60 %). La famine de sérum est employée pour induire la différenciation de cellules de C2C12 en myotubes. Par conséquent, le maintien des cellules pendant de plus longues périodes sans reconstituer le milieu épuisent sévèrement les niveaux nutritifs et sériques. Le réapprovisionnement avec le sérum frais contenant le milieu au moins tous les deux jours peut empêcher le début de la différenciation prématurée non désirée due à la privation d’éléments nutritifs et de sérum.
La différenciation C2C12 est généralement induite par la famine de sérum. Le pourcentage de sérum utilisé pour induire la différenciation C2C12 peut grandement influencer les résultats, en particulier le temps qu’il faut pour former des myotubes positifs MyHC14,15. Plusieurs protocoles montrent l’induction réussie de la différenciation sous diverses concentrations de sérum. L’utilisation de 2-10% FBS ou sérum de cheval et la privation complète de sérum a été rapportée et toutes les conditions ont comme conséquence la formation de myotube de C2C12. Le pourcentage de sérum ou le changement dans le lot de sérum peut modifier de manière significative des marqueurs pour la différenciation. En outre, la source du sérum peut affecter les résultats expérimentaux, parce que le pays d’origine peut ou ne peut pas permettre certains additifs pendant la production de sérum bovin8. Le niveau de sérum pourrait être ajusté pour atteindre le taux de différenciation selon des exigences expérimentales spécifiques. L’insuline peut être ajoutée au milieu de culture des cellules C2C12 pour accélérer la différenciation et la formation de myotube16.
La capacité de fournir des plasmides codant shRNA ou protéines recombinantes dans les cellules C2C12 par transfection est une caractéristique attrayante des cellules C2C12. Plusieurs réactifs commerciaux à base de liposome transfection ont été utilisés précédemment pour fournir de l’ADN plasmide dans les cellules C2C12 avec des efficacités de transfection déclarées variables17,18,19,20,21. L’Ile-du-Prince-Édouard fait également preuve d’une efficacité raisonnable en transfection et constitue une solution de rechange rentable aux réactifs à transfection à base de liposome. Une comparaison entre la transfection avec un réactif de transfection à base de liposome et l’Ile-du-Prince-Édouard n’a montré aucun changement considérable dans l’efficacité de la transfection et une efficacité légèrement plus élevée a été constatée avec l’Ile-du-Prince-Édouard22. Dans nos mains, l’efficacité de la transfection avec l’Ile-du-Prince-Édouard était suffisante pour générer des cellules C2C12 résistantes à la puromycine. Cependant, une étape critique dans ce protocole est de garder le temps d’incubation du réactif de transfection court. Comme mentionné ci-dessus, les cellules C2C12 sont sensibles au retrait du sérum et l’exposition prolongée à de faibles conditions sériques pendant la transfection peut favoriser la différenciation des cellules C2C12. Puisque la transfection est effectuée en l’absence de sérum, le temps d’incubation après la transfection a été gardé court pour réapprovisionner rapidement le milieu sérique-contenant pour empêcher la différenciation prématurée. La puromycine a été ajoutée au milieu de culture 24 h après transfection pour initier la sélection des cellules C2C12 résistantes à la puromycine. Les méthodes pour introduire l’ADN plasmide dans les myotubes différenciés incluent la transfection (jusqu’à 85% d’efficacité rapportée), l’électroporation, ou une approche biolistique23,24,25. Alternativement, des cellules stables de C2C12 abritant un plasmide inductible de shRNA pourraient être produites pour abattre des gènes aux stades postérieurs de la différenciation de myotube ou pendant la maturation de myotube26.
La méthode décrite ici a eu comme conséquence le knockdown stable d’ADAMTSL2 dans les cellules c2C12 où sa fonction pendant la différenciation en myotubes peut maintenant être déterminée. La génération de cellules stables knockdown peut être particulièrement important pour étudier la fonction des protéines qui sont induites pendant la formation ou la maturation du myotube. Le transfection transitoire avec le siRNA par exemple ne serait pas suffisant pour abattre efficacement ces gènes, puisque l’effet de knockdown transitoire du siRNA peut sevrer après 5 à 7 jours. Alternativement, le knock-out d’une protéine ECM à l’aide de CRISPR/Cas9 est techniquement plus difficile et les clones individuels doivent être sélectionnés et séquencés pour assurer le knock-out du gène désiré. Cependant, l’évolution de la ligne de réactifs peut faire de CRISPR/Cas9 la méthode de choix pour les expériences de perte de fonction à l’avenir.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à révéler.
Acknowledgments
D.H. est soutenu par les National Institutes of Health (National Institute for Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases, NIAMS, grant number AR070748) et le fonds de démarrage du Département d’orthopédie Leni et Peter W. May, Icahn School of Medicine à Mont Sinaï.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Fisher Chemical | 191784 | |
| Agar | Fisher Bioreagents | BP1423 | |
| Ampicillin | Fisher Bioreagents | BP1760-5 | |
| Automated cell counter Countesse II | Invitrogen | A27977 | |
| Bradford Reagent | Thermo Scientific | P4205987 | |
| C2C12 cells | ATCC | CRL-1772 | |
| Chamber slides | Invitrogen | C10283 | |
| Chloroform | Fisher Chemical | 183172 | |
| DMEM | GIBCO | 11965-092 | |
| DMSO | Fisher Bioreagents | BP231-100 | |
| DNase I (Amplification Grade) | Invitrogen | 18068015 | |
| Fetal bovine serum | VWR | 97068-085 | |
| GAPDH | EMD Millipore | MAB374 | |
| Glycine | VWR Life Sciences | 19C2656013 | |
| Goat-anti-mouse secondary antibody (IRDYE 800CW) | Li-Cor | C90130-02 | |
| Goat-anti mouse secondary antibody (Rhodamine-red) | Jackson Immune Research | 133389 | |
| HCl | Fisher Chemical | A144S | |
| Incubator (Shaker) | Denville Scientific Corporation | 1704N205BC105 | |
| Mercaptoethanol | Amresco, VWR Life Sciences | 2707C122 | |
| Midiprep plasmid extraction kit | Qiagen | 12643 | |
| Myosin 4 (myosin heavy chain) | Invitrogen | 14-6503-82 | |
| Mounting medium | Invitrogen | 2086310 | |
| NaCl | VWR Life Sciences | 241 | |
| non-ionic surfactant/detergent | VWR Life Sciences | 18D1856500 | |
| Paraformaldehyde | MP | 199983 | |
| PBS | Fisher Bioreagents | BP399-4 | |
| PEI | Polysciences | 23966-1 | |
| Penicillin/streptomycin antibiotics | GIBCO | 15140-122 | |
| Petridishes | Corning | 353003 | |
| Polypropylene tubes | Fisherbrand | 149569C | |
| Protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 33576300 | |
| Puromycin | Fisher Scientific | BP2956100 | |
| PCR (Real Time) | Applied Biosystems | 4359284 | |
| Reaction tubes | Eppendorf | 22364111 | |
| Reverse Transcription Master Mix | Applied Biosystems | 4368814 | |
| RIPA buffer | Thermo Scientific | TK274910 | |
| sh control plasmid | Sigma-Aldrich | 07201820MN | |
| sh 3086 plasmid | Sigma-Aldrich | TRCN0000092578 | |
| sh 972 plasmid | Sigma-Aldrich | TRCN0000092579 | |
| sh 1977 plasmid | Sigma-Aldrich | TRCN0000092582 | |
| Spectrophotometer (Nanodrop) | Thermo Scientific | NanoDrop One C | |
| SYBR Green Reagent Master Mix | Applied Biosystems | 743566 | |
| Trichloroacetic acid | Acros Organics | 30145369 | |
| Trizol reagent | Ambion | 254707 | |
| Trypan blue | GIBCO | 15250-061 | |
| Tryptone | Fisher Bioreagents | BP1421 | |
| Trypsin EDTA 0.25% | Gibco-Life Technology Corporation | 2085459 | |
| Water (DEPC treated and nuclease free) | Fisher Bioreagents | 186163 | |
| Western blotting apparatus | Biorad | Mini Protean Tetra Cell | |
| Yeast extract | Fisher Bioreagents | BP1422 |
References
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