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Genetics

सी2C12 Myoblast सेल लाइन में एक्स्ट्रासेलुलर मैट्रिक्स प्रोटीन एन्कोडिंग जीन का स्थिर नॉकडाउन छोटे हेयरपिन (एसएच) आरएनए का उपयोग कर

Published: February 12, 2020 doi: 10.3791/60824
Automatic Translation
1, 1, 1
1Orthopaedic Research Laboratories, Leni & Peter W. May Department of Orthopaedics, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

Summary

हम छोटे हेयरपिन (श) आरएनए का उपयोग करके C2C12 मायोब्लास्ट में एक्स्ट्रासेलुलर मैट्रिक्स (ईसीएम) प्रोटीन को एन्कोडिंग करने वाले जीन को स्थिर रूप से नीचे गिराने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। एक उदाहरण के रूप में ADAMTSL2 को लक्षित करते हुए, हम C2C12 myoblast के दौरान mRNA, प्रोटीन और सेलुलर स्तर पर नॉकडाउन दक्षता के सत्यापन के तरीकों का वर्णन मायोट्यूब भेदभाव के लिए ।

Abstract

कंकाल मांसपेशियों के विकास और होमोस्टोसिस के लिए एक्स्ट्रासेलुलर मैट्रिक्स (ईसीएम) प्रोटीन महत्वपूर्ण हैं। C2C12 मायोब्लास्ट में ईसीएम प्रोटीन के लिए जीन कोडिंग के स्थिर नॉकडाउन कंकाल मांसपेशियों के विकास में इन प्रोटीन की भूमिका का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है । यहां, हम C2C12 कोशिकाओं में छोटे हेयरपिन (एसएच) आरएनए का उपयोग करके, एक उदाहरण के रूप में ईसीएम प्रोटीन ADAMTSL2 को कम करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। श्रना प्लाज्मिड्स के ट्रांसफेक्शन के बाद, स्थिर कोशिकाओं को प्यूरोमाइसिन का उपयोग करके बैच-चुना गया था। हम आगे इन सेल लाइनों के रखरखाव और mRNA अभिव्यक्ति, प्रोटीन अभिव्यक्ति, और C2C12 भेदभाव के माध्यम से फेनोटाइपिक विश्लेषण का वर्णन । विधि के फायदे स्थिर C2C12 नॉकडाउन कोशिकाओं की अपेक्षाकृत तेज पीढ़ी और सेल संस्कृति माध्यम में सीरम की कमी पर बहुआयामी मायोट्यूब में C2C12 कोशिकाओं के विश्वसनीय विभेदन हैं। C2C12 कोशिकाओं के भेदभाव की निगरानी उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी द्वारा और मयोड, मायोजेनिन, या मायोसिन भारी श्रृंखला (MyHC) जैसे विहित मार्कर जीन की अभिव्यक्ति के स्तर को मापने के द्वारा की जा सकती है जो मायोट्यूब में C2C12 myoblast भेदभाव की प्रगति का संकेत है। छोटे हस्तक्षेप (एसआई) आरएनए के साथ जीन के क्षणिक नॉकडाउन के विपरीत, जीन जो बाद में C2C12 भेदभाव के दौरान या मायोट्यूब परिपक्वता के दौरान व्यक्त किए जाते हैं, उन्हें C2C12 कोशिकाओं को उत्पन्न करके अधिक कुशलता से लक्षित किया जा सकता है जो स्आरएनए को स्थिर रूप से व्यक्त करते हैं। विधि की सीमाएं नॉकडाउन क्षमता में परिवर्तनशीलता हैं, जो विशिष्ट श्रना पर निर्भर करती है जिसे CRISPR/Cas9 के आधार पर जीन नॉकआउट रणनीतियों का उपयोग करके दूर किया जा सकता है, साथ ही साथ श्ना के संभावित ऑफ-टारगेट प्रभावों पर विचार किया जाना चाहिए ।

Introduction

एक्स्ट्रासेलुलर मैट्रिक्स (ईसीएम) प्रोटीन सभी ऊतकों, मध्यस्थता सेल-सेल संचार के लिए संरचनात्मक समर्थन प्रदान करते हैं, और सेल भाग्य का निर्धारण करते हैं। इस प्रकार ऊतक और अंग होमोस्तासिस1,2को बनाए रखने के लिए ईसीएम का गठन और गतिशील रीमॉडलिंग महत्वपूर्ण है । ईसीएम प्रोटीन के लिए कई जीन कोडिंग में पैथोलॉजिकल वेरिएंट मस्कुलोस्केलेटल विकारों को जन्म देते हैं, जिनमें मस्कुलोस्केलेटल विकार ों को जन्म मिलता है, जिनमें मस्कुलोस्केलेटल विकार ों को जन्म मिलता है, जिनमें मस्कुलोस्केलेटल विकार ों को जन्म मिलता है, जिनमें मस्कुलोस्फेट्रॉफी से लेकर स्यूडोमसकुलर बिल्ड3,4तक होता है । उदाहरण के लिए, ADAMTSL2 में रोगजनक वेरिएंट अत्यंत दुर्लभ मस्कुलोस्केलेटल डिसऑर्डर गेलियोफिजियोसिसिक डिस्प्लेसिया का कारण बनता है, जो छद्म मस्कुलर बिल्ड के साथ प्रस्तुत करता है, यानी कंकाल मांसपेशियों में स्पष्ट वृद्धि5। माउस और मनुष्यों में जीन अभिव्यक्ति डेटा के साथ, यह कंकाल मांसपेशी विकास या होमोस्टोसिस6,7में ADAMTSL2 के लिए एक भूमिका का सुझाव देता है।

प्रोटोकॉल है कि हम यहां वर्णन तंत्र है जिसके द्वारा ADAMTSL2 कंकाल मांसपेशी विकास और/या एक सेल संस्कृति सेटिंग में होमोस्टोसिस modulates अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया था । हमने मूत्र C2C12 myoblast सेल लाइन में ADAMTSL2 को नीचे गिरा दिया। C2C12 मायोब्लास्ट और मायोट्यूब में उनका भेदभाव कंकाल मांसपेशी भेदभाव और कंकाल मांसपेशी बायोइंजीनियरिंग8,9के लिए एक अच्छी तरह से वर्णित और व्यापक रूप से उपयोग किया जाने वाला सेल संस्कृति मॉडल है। सी2सी 12 कोशिकाएं सीरम वापसी के बाद अलग-अलग विभेदन चरणों से गुजरती हैं, जिसके परिणामस्वरूप संस्कृति में 3−10 दिनों के बाद बहुआयामी मायोट्यूब का गठन होता है। इन भेदभाव चरणों को मायोड, मायोजेनिन, या मायोसिन भारी श्रृंखला (MyHC) जैसे अलग मार्कर जीन के एमआरएनए स्तर को मापने के द्वारा मज़बूती से निगरानी की जा सकती है। C2C12 कोशिकाओं में स्थिर जीन नॉकडाउन पैदा करने का एक लाभ यह है कि जीन है कि C2C12 भेदभाव के बाद के चरणों में व्यक्त कर रहे है और अधिक कुशलता से लक्षित किया जा सकता है, छोटे हस्तक्षेप (एसआई) आरएनए, जो आम तौर पर ट्रांसफेक्शन के बाद 5−7 दिनों के लिए रहता है द्वारा प्राप्त क्षणिक नॉकडाउन की तुलना में, और परिवर्तन क्षमता से प्रभावित है । प्रोटोकॉल का दूसरा लाभ के रूप में यहां वर्णित C2C12 नॉकडाउन कोशिकाओं के बैचों की अपेक्षाकृत तेजी से पीढ़ी puromycin चयन का उपयोग कर रहा है । ऐसे CRISPR/Cas9 मध्यस्थता जीन नॉकआउट या मानव या लक्ष्य जीन की कमी चूहों से प्राथमिक कंकाल मांसपेशी सेल अग्रदूत के अलगाव के रूप में विकल्प, तकनीकी रूप से अधिक चुनौतीपूर्ण है या रोगी मांसपेशी बायोप्सी या लक्ष्य जीन कमी चूहों की उपलब्धता की आवश्यकता है, क्रमशः । हालांकि, अन्य सेल संस्कृति आधारित दृष्टिकोणों के समान, कंकाल मांसपेशी कोशिका भेदभाव के लिए मॉडल के रूप में C2C12 कोशिकाओं के उपयोग में सीमाएं हैं, जैसे सेल संस्कृति की दो आयामी (2डी) प्रकृति और विवो माइक्रोएनवायरमेंटल में कमी जो अविभेदित कंकाल मांसपेशी अग्रदूत कोशिकाओं को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है10।

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Protocol

1. एस्चेरिचिया कोलाई से श्आरएनए प्लाज्मिड डीएनए तैयार करना

  1. क्लोनल बैक्टीरियल कॉलोनियों का उत्पादन श्रना प्लाज्मिड्स ले जाने
    1. लक्ष्य-विशिष्ट श्रना प्लाज्मिड और वाणिज्यिक स्रोतों(सामग्री की तालिका)से एक नियंत्रण प्लाज्मिड ले जाने वाले ई कोलाई के ग्लीसेरोल स्टॉक प्राप्त करें।
      नोट: तीन अलग-अलग श्रना प्लाज्मिड का उपयोग किया गया था, जो मूत्र Adamtsl2 mRNA के विभिन्न क्षेत्रों को लक्षित करते थे। एक श्रना को Adamtsl2 के 3'-अअनुवादित क्षेत्र (3'UTR) को लक्षित करने के लिए चुना गया था ताकि अभिव्यक्ति प्लाज्मिड्स एन्कोडिंग पूर्ण लंबाई ADAMTSL2 या व्यक्तिगत ADAMTSL2 प्रोटीन डोमेन के साथ बचाव प्रयोगों को सुविधाजनक बनाया जा सके। इसके अलावा, एक तले हुए श्रना प्लाज्मिड को नकारात्मक नियंत्रण के रूप में शामिल किया गया था। श्रना दृश्यों का विवरण चित्र 1एमें प्रदान किया गया है।
    2. कमरे के तापमान (आरटी) पर shRNA जीवाणु ग्लाइसेरोल स्टॉक गल । एक लुरिया-Bertani (पौंड) आगर प्लेट पर बैक्टीरियल ग्लाइसेरोल स्टॉक के 10 μL हस्तांतरण १०० μg/mL ampicillin (LB-Amp) के साथ पूरक ।
      नोट: एलबी-एम्प प्लेट्स एलबी मीडियम के 1 एल को ऑटोक्लेव करके तैयार की जाती हैं (1 एल के लिए: ट्राइप्टोन के 10 ग्राम, 5 ग्राम खमीर निकालने, नैसल के 10 ग्राम, पीएच को 7.0 में समायोजित करें) 12 ग्राम एगर के साथ। मध्यम को ~ 50 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा होने दें और एम्पिसिलिन (स्टॉक सॉल्यूशन: बाँझ पानी में 50 मिलीग्राम/एमएल) को μg/mL (एलबी-एएमपी एगर) की अंतिम एकाग्रता में जोड़ें। तुरंत एक 10 सेमी पेट्री डिश में एलबी-Amp आगर के ~ 20 mL डालना और उपयोग से पहले आगर जमना । एल-एम्प एगर का 1 एल आमतौर पर लगभग 40 10 सेमी पेट्री व्यंजन डालने के लिए पर्याप्त होता है। एलबी-एम्प एगर युक्त पेट्री व्यंजन कम से कम एक महीने के लिए स्थिर हैं यदि अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर सील रखा जाता है।
    3. एकल जीवाणु उपनिवेशों को प्राप्त करने के लिए बाँझ ड्राइगलस्की स्पैटुला या किसी अन्य उपयुक्त विधि के साथ बैक्टीरिया फैलाएं। इनक्यूबेट बैक्टीरियल प्लेटें 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर उल्टा।
  2. प्लाज्मिड तैयारी
    1. अगली सुबह, अलग-अलग बैक्टीरियल कॉलोनियों के साथ पेट्री डिश को हटा दें और बैक्टीरियल कॉलोनियों के ओवरग्रोथ और सैटेलाइट कॉलोनियों के गठन से बचने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। पेट्री डिश सील अगर रात भर या उससे अधिक समय तक संग्रहीत किया जाता है।
    2. दोपहर में, एलबी-एएमपी मीडियम के 5 मिलील को पॉलीप्रोपाइलीन बैक्टीरियल कल्चर ट्यूब में जोड़ें। पेट्री डिश से एक एकल जीवाणु कॉलोनी का चयन करें एक पिपेट टिप के साथ रात भर सुसंस्कृत और पौंड-Amp माध्यम युक्त जीवाणु संस्कृति ट्यूब में पिपेट टिप बाहर निकालकर पौंड-Amp माध्यम टीका ।
    3. 37 डिग्री सेल्सियस पर 250 आरपीएम पर एक शेकर में रात भर बैक्टीरियल कल्चर इनक्यूबेट बैक्टीरियल कल्चर को वाष्पीकरण की अनुमति देने के लिए ढक्कन ढीला संलग्न किया गया।
    4. अगली सुबह बैक्टीरियल कल्चर ट्यूब को बाहर निकालें और बैक्टीरियल ओवरग्रोथ से बचने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें। दोपहर में, भंवर द्वारा बैक्टीरिया को फिर से निलंबित करें और 250 मिलील शंकुीय फ्लास्क में एलबी-एएमपी माध्यम के 50 मिलील में रातोंरात बैक्टीरियल संस्कृति के 1 मिलील को स्थानांतरित करें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 250 आरपीएम पर एक शेकर में रात भर इनक्यूबेट।
    5. अगली सुबह, बैक्टीरिया को 15 मीटर के लिए आरटी पर 6,000 x ग्राम पर 50 मिलीग्राम डिस्पोजेबल सेंट्रलाइज ट्यूब और सेंट्रलाइज बैक्टीरिया में स्थानांतरित करें। माध्यम को हटा दें और चरण 1.2.6 जारी रखें।
      नोटः अगर प्लाज्मिड डीएनए को तुरंत अलग नहीं किया जा सकता है तो सेंट्रलाइज्ड स्टेप के बाद एलबी-एएमपी मीडियम को हटा दें और बैक्टीरिया पैलेट को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें ।
    6. बैक्टीरिया से प्लाज्मिड डीएनए निकालने के लिए प्लाज्मिड तैयारी किट (मिडी स्केल) के निर्देशों का पालन करें। स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके ए260/ए280 अनुपात को मापकर प्लाज्मिड डीएनए गुणवत्ता का आकलन करें।
      नोट: >1.8 का260/ए280 अनुपात वांछनीय है, जो प्लाज्मिड डीएनए तैयार करने की उच्च शुद्धता का संकेत देता है। एक कम एक२६०/एक२८० अनुपात प्रोटीन या निष्कर्षण अभिकर्मकों के अपर्याप्त हटाने के साथ संदूषण पता चलता है । अतिरिक्त प्लाज्मिड शुद्धिकरण कदम की आवश्यकता हो सकती है।

2. C2C12 कोशिकाओं और Puromycin चयन की पुलिया और ट्रांसफेक्शन

  1. C2C12 सेल संस्कृति
    1. Thaw C2C12 कोशिकाओं(सामग्री की तालिका)जल्दी से एक ३७ डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में और बाँझ डिस्पोजेबल में कोशिकाओं डालना 15 mL अपकेंद्री ट्यूब Dulbecco संशोधित ईगल माध्यम (DMEM) मध्यम के 8 mL युक्त पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन एंटीबायोटिक दवाओं (सीरम मुक्त DMEM) की १०० इकाइयों के साथ पूरक एक सेल संस्कृति हुड में । आरटी में 160 x ग्राम पर 3 मिन के लिए सेंट्रलाइज कोशिकाएं।
    2. एस्पिरेट सुपरनेटेंट और सीरम मुक्त DMEM के 10 मिलील में सेल गोली को फिर से निलंबित करें 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) (पूर्ण डीएमईएम) के साथ पूरक हैं। 10 सेमी ऊतक संस्कृति के लिए कोशिकाओं स्थानांतरण प्लास्टिक व्यंजन ों का इलाज किया। 5% सीओ2 वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर आर्द्र इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट कोशिकाएं।
    3. अगले दिन, नए सिरे से पूरा DMEM के साथ माध्यम की जगह ।
    4. 3−4 10 सेमी व्यंजन पर कम मार्ग C2C12 कोशिकाओं का विस्तार करें। जब C2C12 कोशिकाएं 50−60% संगम तक पहुंचती हैं, तो मध्यम को एस्पिरेट करें और फॉस्फेट-बफर्ड लवण (पीबीएस) के 10 मिलील के साथ C2C12 कोशिकाओं को कुल्ला करें।
    5. 0.25% ट्राइप्सिन-EDTA के 1 mL जोड़ें और आरटी में 2 मिन के लिए इनक्यूबेट करें। एक माइक्रोस्कोप के तहत सेल टुकड़ी की निगरानी करें और यदि आवश्यक हो तो ऊष्मायन समय का विस्तार करें, जब तक कि अधिकांश कोशिकाएं अलग न हो जाएं।
      नोट: ध्यान से पकवान दोहन कोशिकाओं को उखाड़ फेंकने में मदद कर सकते हैं ।
    6. जब अधिकांश कोशिकाएं अलग हो जाती हैं, तो डिश में पूर्ण डीएमईएम के 10 एमएल जोड़ें, वॉल्यूम को कई बार ऊपर और नीचे पिपेट करें, और सेल निलंबन को बाँझ डिस्पोजेबल 15 mL अपकेंद्री ट्यूब पर स्थानांतरित करें। आरटी. एस्पिरेट सुपरनेटेंट पर 3 मिन के लिए सेंट्रलाइज कोशिकाएं और फ्रीजिंग मीडियम के 2 एमएल (10% डिमेथिल सल्फासऑक्साइड [डीएमएसओ]/90% एफबीएस) में सेल पैलेट को फिर से सस्पेंड करें।
    7. क्रायोवियल्स में प्रति 10 सेमी डिश में दो 1 mL aliquots स्थानांतरित करें। एक सेल-फ्रीजिंग कंटेनर में इनक्यूबेट-80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में कम से कम 24 घंटे के लिए आरटी आइसोप्रोपेनॉल से भरा हुआ है जिसके परिणामस्वरूप बर्फ क्रिस्टल के गठन से बचने के लिए लगभग -1 डिग्री सेल्सियस प्रति मिनट की ठंड दर होती है। तरल नाइट्रोजन के वाष्प चरण में दीर्घकालिक उपयोग के लिए कोशिकाओं को स्टोर करें।
      नोट: विक्रेता 15 नंबर तक C2C12 कोशिकाओं का उपयोग करने की सिफारिश करता है। लेखकों के अनुभवों से यह भी पता चला है कि कम मार्ग संख्या कोशिकाओं को मायोट्यूब में अधिक सुसंगत और तेजी से भेदभाव दिखाया । भेदभाव की समय से पहले शुरुआत से बचने के लिए कम सेल घनत्व (<50% संगम) पर C2C12 कोशिकाओं को बनाए रखना आवश्यक है। अंतर या विभेदित C2C12 कोशिकाओं को मूल myoblast राज्य में वापस नहीं किया जा सकता है और त्याग दिया जाना चाहिए ।
  2. ट्रांसफेक्शन के लिए C2C12 कोशिकाओं की तैयारी
    1. संस्कृति एक 10 सेमी पकवान में C2C12 कोशिकाओं को अविभेदित जब तक वे 50−60% संगम तक पहुंचने । मध्यम एस्पिरेट, पीबीएस के 10 मिलील के साथ C2C12 कोशिकाओं को कुल्ला, और 0.25% ट्राइप्सिन-EDTA के 1 mL जोड़ें। आरटी में 2 मिन के लिए इनक्यूबेट, एक माइक्रोस्कोप के तहत सेल टुकड़ी की निगरानी, और यदि आवश्यक हो तो ऊष्मायन समय का विस्तार, जब तक कोशिकाओं के अधिकांश अलग कर रहे हैं ।
      नोट: ध्यान से पकवान दोहन कोशिकाओं को उखाड़ फेंकने में मदद कर सकते हैं ।
    2. जब अधिकांश कोशिकाएं अलग हो जाती हैं, तो डिश में पूर्ण डीएमईएम का 10 एमएल जोड़ें और सेल निलंबन को बाँझ डिस्पोजेबल 15 एमएल अपकेंद्री ट्यूब में स्थानांतरित करें। आरटी. एस्पिरेट सुपरनेट ेंट पर 3 मिन के लिए सेंट्रलाइज कोशिकाएं और सेल पैलेट को पूर्ण डीएमईएम के 4 मीटर में फिर से निलंबित करें।
    3. 1.5 मिलीग्राम प्रतिक्रिया ट्यूब में ट्राइपैन नीले रंग के 10 माइक्रोन के साथ सेल निलंबन के 10 माइक्रोन को मिलाएं, ऊपर और नीचे पाइपिंग करके मिश्रण करें और प्रतिक्रिया ट्यूब को ध्यान से फ़्लिकिंग करें, और कोशिकाओं को गिनती स्लाइड में स्थानांतरित करें। स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करके सेल नंबर/एमएएल निर्धारित करें।
    4. 50,000 कोशिकाओं/mL और बीज 100,000 कोशिकाओं (2 mL) प्रति अच्छी तरह से एक 6 अच्छी तरह से प्लेट में तनु C2C12 कोशिकाओं को रातोंरात ऊष्मायन के बाद लगभग 40−50% संगम प्राप्त करने के लिए। 5% सीओ2 वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर आर्द्र इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट कोशिकाएं।
  3. पॉलीथीनिनीमाइन (पीई) और प्यूरोमाइसिन चयन का उपयोग करके श्रना प्लाज्मिड के साथ C2C12 कोशिकाओं का ट्रांसफेक्शन
    1. पीई स्टॉक समाधान की तैयारी
      1. एक पेंच टोपी के साथ एक 50 मिलीग्राम ग्लास मीडिया की बोतल में बाँझ आसुत पानी (स्टॉक समाधान की एकाग्रता: 0.32 मिलीग्राम/mL) के 50 मिलीग्राम में पी के 16 मिलीग्राम भंग करें। 1 एच के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर समाधान को इनक्यूबेट करें और ईवन अवधि के दौरान कई बार समाधान को पूरी तरह से भंग करने के लिए समाधान को तेजी से करें।
      2. प्रति 50 एमएल 1एन एचसीएल के 15 माइक्रोन जोड़कर पीएच 8 में समायोजित करें।
        सावधानी: एचसीएल संक्षारक है। केंद्रित एचसीएल को धूम हुड के तहत संभाला जाना चाहिए। जांचकर्ताओं को उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनना चाहिए ।
      3. एक शिथिल संलग्न ढक्कन के साथ 1 घंटे के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर -80 डिग्री सेल्सियस पर पी समाधान फ्रीज और तेजी से एक पानी के स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस पर गल को और अधिक घुलनशीलता को बढ़ाने के लिए। फ्रीज-गल चक्र 3x दोहराएं।
      4. -20 डिग्री सेल्सियस पर एक बार उपयोग के लिए 0.5 मिलीएल aliquots में स्टोर पी स्टॉक समाधान।
    2. C2C12 कोशिकाओं का ट्रांसफेक्शन
      1. पी स्टॉक समाधान के 25.5 माइक्रोन (8.5 माइक्रोन/माइक्रोन प्लाज्मिड डीएनए) को 1.5 मिलीग्राम प्रतिक्रिया ट्यूब में 25 मीटर नैल के 100 माइक्रोन के साथ मिलाएं और 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए इनक्यूबेट करें। प्लाज्मिड डीएनए के 3 μg 25 mM NaCl के 100 μL के साथ और 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए इनक्यूबेट मिलाएं।
      2. पतला पीई रिएजेंट की पूरी मात्रा को पतला प्लाज्मिड के साथ मिलाएं और धीरे-धीरे ऊपर और नीचे पाइपिंग करके मिलाएं। 37 डिग्री सेल्सियस पर 25 मिन के लिए इनक्यूबेट।
      3. ऊष्मायन समय के दौरान, एफबीएस या एंटीबायोटिक दवाओं के बिना डीएमईएम में ट्रांसफेक्शन के लिए इरादा C2C12 कोशिकाओं के माध्यम को बदलें।
      4. C2C12 कोशिकाओं को पी/डीएनए ट्रांसफेक्शन मिश्रण जोड़ें ड्रॉप द्वारा ड्रॉप करें और सेल कल्चर डिश को सावधानीसे आगे बढ़ाकर लगातार मिलाएं । 5% सीओ2 वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर आर्द्र इनक्यूबेटर में इनक्यूबेटर। 6 घंटे के बाद, डीएमईएम को पूरा करने के लिए माध्यम बदलें।
    3. प्यूरोमाइसिन चयन
      1. 24 घंटे ट्रांसफेक्शन के बाद, चयन माध्यम के लिए मध्यम स्विच (पूरा DMEM प्लस 5 μg/mL puromycin) । प्यूरोमाइसिन चयन तब तक जारी रखें जब तक कि प्यूरोमाइसिन प्रतिरोधी C2C12 कोशिकाएं प्राप्त नहीं हो जाती हैं, जिसमें आमतौर पर 10−14 दिन लगते हैं।
      2. कम सेल घनत्व (<50−60% संगम) पर प्यूरोमाइसिन प्रतिरोधी C2C12 कोशिकाओं का विस्तार करें, यानी, भविष्य के प्रयोगों के लिए 6−10 शीशियों के अविभेदित राज्य और क्रायोसंरक्षित को बनाए रखने के लिए, जैसा कि चरण 2.1.4−2.1.7 में वर्णित है।
        नोट: नियमित कोशिका संस्कृति और विस्तार के लिए 5 μg/mL puromycin की उपस्थिति में puromycin प्रतिरोधी C2C12 कोशिकाओं को बनाए रखें । हालांकि, विभेदन प्रयोगों में प्यूरोमाइसिन को छोड़ दिया गया था।

3. C2C12 भेदभाव का फेनोटाइपिक विश्लेषण

नोट: नीचे वर्णित तरीकों को आसानी से पश्चिमी दाग में इस्तेमाल विशिष्ट एंटीबॉडी या मात्रात्मक बहुलक में इस्तेमाल जीन विशिष्ट प्राइमर अलग करके मायोट्यूब में C2C12 myoblast भेदभाव के सामान्य फेनोटाइपिक विश्लेषण के लिए अनुकूलित किया जा सकता है चेन रिएक्शन (क्यूपीसीआर) विश्लेषण।

  1. C2C12 भेदभाव प्रोटोकॉल और ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोपी
    1. बीज 12 अच्छी प्लेट में 150,000 कोशिकाएं/अच्छी तरह से। संस्कृति puromycin प्रतिरोधी C2C12 एक 5% सह2 वातावरण में ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक humidified इनक्यूबेटर में चयन माध्यम में एक 12 अच्छी तरह से थाली में स्थिर कोशिकाओं । संस्कृति C2C12 कोशिकाओं को पूरा DMEM में जब तक वे ~ 95% संगम तक पहुंचने।
    2. C2C12 कोशिकाओं के भेदभाव को प्रेरित करने के लिए, सीरम-मुक्त डीएमईएम (भेदभाव के दिन 0) के साथ पूर्ण डीएमईएम को बदलें। हर दो दिन में माध्यम बदलें और कैमरे के साथ एक उल्टे उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोप का उपयोग कर C2C12 मायोट्यूब गठन का पालन करें ।
      नोट: कई प्रोटोकॉल C2C12 कोशिकाओं को मायोट्यूब में अंतर करने के लिए 2% घोड़े सीरम का उपयोग करते हैं। लेखकों के हाथों में, सीरम को हटाने का पूरी तरह से एक समान प्रभाव पड़ा। इंसुलिन C2C12 भेदभाव में तेजी लाने के लिए सेल संस्कृति माध्यम के लिए एक योजक के रूप में वर्णित है । हालांकि, वर्तमान प्रोटोकॉल में, सी2C12 कोशिकाओं को मज़बूती से सीरम अभाव और इंसुलिन के अलावा अनावश्यक समझा गया था के बाद 3−5 दिनों के भीतर मायोट्यूब में अंतर ।
  2. मायोसिन भारी श्रृंखला (MyHC) मायोट्यूब की कल्पना करने के लिए इम्यूनोस्टेनिंग
    1. बीज 50,000 puromycin प्रतिरोधी C2C12 कोशिकाओं को पूरा DMEM के 500 μL में एक 8 अच्छी तरह से कक्ष स्लाइड में प्रति कक्ष। संस्कृति कोशिकाओं जब तक वे पूरा DMEM (लगभग 24 घंटे) में ९५% संगम तक पहुंचने ।
    2. भेदभाव को प्रेरित करने के लिए, पूर्ण डीएमईएम से सीरम-मुक्त डीएमईएम (भेदभाव के दिन 0) के 500 माइक्रोन में स्विच करें। वांछित समय बिंदु (एस) पर, माध्यम को एस्पिरेट करें और पीबीएस के 0.5 एमएल के साथ कोशिकाओं को 3x कुल्ला एंट्रिक करें।
      नोट: आरटी पर निम्नलिखित सभी चरणों का प्रदर्शन करें।
    3. पीबीएस में 15 मिन के लिए 0.2 मीटर पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) पतला होने के साथ कोशिकाओं को ठीक करें। 5 मिन के लिए पीबीएस 3x के 0.5 एमएल के साथ कुल्ला कोशिकाओं।
      सावधानी: पीएफए खतरनाक है। उचित सावधानी बरतें और पैराफॉर्मलडिहाइड समाधान को खतरनाक कचरे के रूप में त्यागें।
    4. 5 मिन के लिए पीबीएस में 0.5 मीटर ग्लाइसिन के 0.2 एमएल के साथ पीएफए बुझाएं। 5 मिन के लिए पीबीएस 3x के 0.5 mL के साथ कोशिकाओं को कुल्ला करें।
    5. 0.1% गैर आयनिक surfactant/डिटर्जेंट(सामग्री की तालिका)के 0.2 mL के साथ इनक्यूबेट कोशिकाओं को 10 मेंस के लिए पीबीएस में कोशिका झिल्ली परछाई। पीबीएस में 5% गोजातीय सीरम एल्बुमिन के 0.2 मीटर के साथ ब्लॉक करें 1 घंटे के लिए कुल्ला कोशिकाओं पीबीएस 3x के 0.5 mL के साथ 5 मिन के लिए प्रत्येक।
    6. 2 घंटे के लिए MyHC एंटीबॉडी (पीबीएस में 1:200) के 0.2 mL के साथ इनक्यूबेट कोशिकाओं को 5 मिन के लिए पीबीएस 3x के 0.5 mL के साथ कुल्ला कोशिकाओं।
    7. बकरी-विरोधी माउस रोडामिन लाल-conjugated माध्यमिक एंटीबॉडी (पीबीएस में 1:200) के 0.2 मिलील के साथ इनक्यूबेट कोशिकाओं। प्रत्येक 5 मिन के लिए पीबीएस 3x के 0.5 mL के साथ कोशिकाओं को कुल्ला।
    8. पीबीएस मात्रात्मक रूप से हटाने के बाद, प्रति कक्ष 4′,6-डिमिडिनो-2-फेनिलिंडॉल (डीएपीआई) युक्त बढ़ते माध्यम की एक बूंद जोड़ें। कवरस्लिप और निर्माता के निर्देशों के अनुसार बढ़ते माध्यम का इलाज करें। नेल पॉलिश के साथ सील।
    9. उपयुक्त फ़िल्टर सेट का उपयोग करके फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करके C2C12 कोशिकाओं का निरीक्षण करें।
  3. मात्रात्मक वास्तविक समय बहुलक श्रृंखला प्रतिक्रिया (qRT-पीसीआर) द्वारा नॉकआउट दक्षता का आकलन
    1. धारा 3.1 में वर्णित 12 अच्छी तरह से प्लेटों में भेदभाव की स्थिति के तहत संस्कृति C2C12 कोशिकाओं ।
    2. वांछित समय बिंदु (एस) पर, भेदभाव माध्यम को हटा दें, पीबीएस के 1 एमएल के साथ एक बार कोशिकाओं को कुल्ला करें, और प्रति अच्छी तरह से आरएनए निष्कर्षण अभिकर्ता(सामग्री की तालिका)के 0.5 एमएएल जोड़ें। कोशिकाओं को ध्यान से ऊपर और नीचे पाइपिंग करके और सेल लाइसेट को बाँझ 1.5 मिलीग्राम प्रतिक्रिया ट्यूब में स्थानांतरित करें। निर्माता के प्रोटोकॉल का सावधानीपूर्वक पालन करके आरएनए को अलग करें।
      सावधानी: आरएनए निष्कर्षण अभिकर्ता में फिनॉल होता है। इसका उपयोग धूम हुड के नीचे किया जाना चाहिए। आरएनए निष्कर्षण पुनएजेंट अपशिष्ट एकत्र करें और खतरनाक कचरे के रूप में निपटाएं। जांचकर्ताओं को उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनना चाहिए ।
    3. अंतिम आरएनए गोली को 20 माइक्रोन में भंग करें जो कि डायथिल पायरोकार्बोनेट (डीपीसी) के इलाज वाले पानी के 20 माइक्रोन में करें। एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करआरएनए तैयारी की मात्रा और गुणवत्ता निर्धारित करें और गुणवत्ता उपाय के रूप में ए260/ए280 अनुपात निर्धारित करें।
      नोट: 12 अच्छी प्लेट के 1 कुएं से एक विशिष्ट उपज कुल आरएनए की 5−7 माइक्रोन है जिसमें260/ए280 अनुपात 1.8−2 है।
    4. अवशिष्ट सह-शुद्ध जीनोमिक डीएनए को पचाने के लिए, पीसीआर ट्यूब में डीपीसी-उपचारित पानी के 8 माइक्रोन की कुल मात्रा में आरएनए के 1 μg को पतला करें। 10x रिएक्शन बफर के 1 माइक्रोन और DNase I (1 यूनिट/μL)(सामग्री की तालिका)के 1 μL जोड़ें और आरटी में 15 मिन के लिए इनक्यूबेट करें । 10 m EDTA के स्टॉप सॉल्यूशन (25 m EDTA) के 1 μL जोड़ें और 10 min के लिए ७० डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट ।
    5. सीडीएनए उत्पन्न करने के लिए, 2x रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज़ मास्टर मिक्स के 10 माइक्रोन के साथ डीएनएज इलाज आरएनए के 10 माइक्रोन को मिलाएं, जिसमें रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज़, रैंडम प्राइमर, 4 एमएम डीएनटीपी मिक्स (डीएटीपी, डीटीपी, डीजीटीपी और डीसीटीपी का 1 एमएम), और रिवर्स ट्रांसक्रिप्टाज़ रिएक्शन बफर शामिल है। निर्माता द्वारा अनुशंसित कार्यक्रम का उपयोग करके थर्मोसाइकिलर में प्रतिक्रिया को इनक्यूबेट करें। 1:5 अनुपात में पानी के साथ पतला cDNA।
    6. क्यूआरटी-पीसीआर प्रतिक्रिया तैयार करने के लिए, क्रमशः जीन-विशिष्ट फॉरवर्ड और रिवर्स प्राइमर (स्टॉक: 10 माइक्रोन) के 0.5 माइक्रोन के साथ एसवाईबीआर ग्रीन क्यूपीसीआर मास्टर मिक्स के 5 माइक्रोन को मिलाएं, और डीपीसी के 2 माइक्रोन-इलाज पानी प्रति प्रतिक्रिया। 96 अच्छी तरह से क्यूआरटी-पीसीआर प्लेट के एक कुएं में पिपेट क्यूपीसीआर प्रतिक्रिया और पतला सीडीएनए के 2 माइक्रोन जोड़ें। प्रत्येक जैविक प्रतिकृति के लिए तीन तकनीकी प्रतिकृतियां स्थापित करें और इसमें एक हाउसकीपिंग जीन जैसे गगध या एचपीआरटी1शामिल हैं।
    7. निम्नलिखित कार्यक्रम का उपयोग करके पीसीआर उत्पाद को क्यूआरटी-पीसीआर थर्मोसाइकिलर के साथ बढ़ाना: 2 मिन (यूसिल-डीएनए ग्लाइकोसिलेस [यूडीयूजी] सक्रियण के लिए 50 डिग्री सेल्सियस), 2 मिन के लिए 95 डिग्री सेल्सियस (डुअल-लॉक डीएनए पॉलीमरेज एक्टिवेशन), 15 एस के लिए 95 डिग्री सेल्सियस के 40 चक्र, 30 एस के लिए 60 डिग्री सेल्सियस और 72 डिग्री सेल्सियस।
    8. क्यूआरटी-पीसीआर परिणाम डीडीसीटी विधि का उपयोग करके एक हाउसकीपिंग जीन, जैसे गगध या एचपीआरटी1को सामान्य बनाना।
  4. पश्चिमी दाग द्वारा नॉकआउट दक्षता का आकलन
    1. बीज 300,000 puromycin प्रतिरोधी C2C12 कोशिकाओं को पश्चिमी दाग विश्लेषण के लिए एक 6 अच्छी तरह से थाली में अच्छी तरह से प्रति अच्छी तरह से। 24 घंटे के बाद, मध्यम को सीरम-मुक्त डीएमईएम में बदलकर भेदभाव (भेदभाव का दिन 0) शुरू करें।
    2. वांछित समय बिंदु (ओं) पर, अलग कोशिकाओं और कोशिका मलबे को हटाने के लिए आरटी पर 500 x ग्राम पर 5 00 x ग्राम पर 5 00 x पर 5 00 x के लिए सीरम-मुक्त वातानुकूलित माध्यम के दो 1 मिलील एकत्र करें।
      नोट: यह कदम तभी आवश्यक है जब वातानुकूलित माध्यम में ईसीएम प्रोटीन या अन्य स्रावित प्रोटीन की जांच की जाए। यदि साइटोप्लाज्म में ब्याज का प्रोटीन स्थानीयकृत है या झिल्ली बाध्य है, तो सेल संस्कृति माध्यम को एस्पिरेट करें और सेल लाइसिस चरणों (3.4.7−3.4.12) के साथ आगे बढ़ें। सेल लाइसिस को सीरम-मुक्त वातानुकूलित माध्यम से प्रोटीन वर्षा के समानांतर किया जाना चाहिए ताकि कोशिका परत के लंबे समय तक भंडारण के प्रोटेलिटिक क्षरण और अन्य अनपेक्षित परिणामों को कम किया जा सके।
    3. केंद्रीकरण के बाद, एक नए 1.5 एमएल प्रतिक्रिया ट्यूब में वातानुकूलित माध्यम के 1 एमएल स्थानांतरित करें और ट्राइक्लोरोसेटिक एसिड (टीसीए) और गैर-आयनिक सरफेसेंट/डिटर्जेंट के मिश्रण का 0.391 एमएल जोड़कर प्रोटीन को उपजी करें। संक्षेप में मिश्रण भंवर और बर्फ पर 10 मेंस के लिए इनक्यूबेट ।
      नोट: 55% टीसीए के 0.252 मीटर और वातानुकूलित माध्यम और भंवर के प्रति एमल के 0.139 मिलील के संयोजन से उपयोग से पहले सीधे प्रोटीन वर्षा मिश्रण तैयार करें। समाधान टर्बिड हो जाता है।
      सावधानी: टीसीए संक्षारक है और इसे उचित रूप से संभाला जाना चाहिए।
    4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिन के लिए 16,000 x ग्राम पर वर्षा प्रोटीन गोली। अधिस्थान त्यागें।
      सावधानी: अधिनेता में टीसीए होता है और इसे अलग से एकत्र किया जाना चाहिए और खतरनाक सामग्री के रूप में निपटाया जाना चाहिए।
    5. प्रोटीन पैलेट 3x को बर्फ-ठंडा एसीटोन और अपकेंद्री के साथ हर बार 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिन के लिए 16,000 x ग्राम पर धोलें।
    6. आरटी में 3−4 मिन के लिए प्रोटीन पैलेट को हवा-सुखाएं और 1x सोडियम डोडेसिल सल्फेट पॉलीएक्रिलैमाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस (एसडीएस-पेज) नमूना बफर (50 मीटर ट्रिस पीएच 6.8, 2% एसडीएस, 6% ग्लाइसेरोल, और 0.004% ब्रोमोफेनॉल ब्लू के 50 माइक्रोन में भंग करें। 95 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए नमूना उबालें और मानक प्रक्रियाओं का उपयोग करके वांछित लक्ष्य प्रोटीन का पता लगाने के लिए पश्चिमी दाग के लिए उपयोग करें।
      सावधानी: -मर्काप्तोइथेननॉल गंध और विषाक्त है और इसे धुएं के हुड में संभाला जाना चाहिए।
    7. इंट्रासेलर और झिल्ली बाउंड प्रोटीन के लिए, पीबीएस के 2 एमएल के साथ एक बार सेल लेयर को कुल्ला करें।
    8. पीबीएस के 1 mL जोड़ें और कोशिकाओं को एक सेल स्क्रैपर का उपयोग करके अच्छी तरह से स्क्रैप करके कोशिकाओं को उखाड़ फेंकना। 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिन के लिए 3,420 x ग्राम पर 1.5 मिलीग्राम प्रतिक्रिया ट्यूब और अपकेंद्रित्र में कोशिकाओं को इकट्ठा करें। सेल पैलेट 3x को पीबीएस के 1 mL और अपकेंद्रित्र को 3,420 x ग्राम पर 3,420 x के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर हर बार धोएं।
    9. कोशिकाओं को ले ज़ब्त करने के लिए, लेसिस बफर (20 एमएम ट्रिस-एचसीएल पीएच 7.5) के 0.2 एम एल में सेल पैलेट को फिर से निलंबित करें, 150 एमएम एनएएल, 1 एमएम एनए2ईटीए, 1 एमएम ईसीटीए, 1% एनपी40, 1% सोडियम डिऑक्सीकोलेट, 2.5 एमएम सोडियम पायरोफॉस्फेट, 1 एमएम-ग्लाइसेरोफॉस्फेट, और 1 एमएम सोडियम ऑर्थोवानाडेट) 1x ईटीए-फ्री प्रोटीज अवरोधक कॉकटेल रिएजेंट और इनक्यूबेट के साथ पूरक हैं।
    10. 23 किलोवाट की ऑपरेटिंग फ्रीक्वेंसी पर 10 की पावर आउटपुट सेटिंग के साथ बर्फ पर 15 एस के लिए अल्ट्रासोनीकेट ।
    11. 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिन के लिए 13,680 x ग्राम पर सेंट्रलाइज्ड द्वारा सेल मलबे को हटा दें। एक नया 1.5 मिलीग्राम प्रतिक्रिया ट्यूब में अधिनेत लीजिए और एक वाणिज्यिक ब्रैडफोर्ड परख या किसी अन्य उपयुक्त विधि का उपयोग करप्रोटीन एकाग्रता निर्धारित करें।
    12. प्रत्येक नमूने के लिए, 60 माइक्रोन की कुल मात्रा में 5x एसडीएस-पेज नमूना बफर के साथ 100 माइक्रोन प्रोटीन को मिलाएं और 95 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए उबालें। वांछित लक्ष्य प्रोटीन की उपस्थिति के लिए मानक पश्चिमी दाग प्रक्रियाओं द्वारा नमूनों का विश्लेषण करें।

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Representative Results

प्यूरोमाइसिन प्रतिरोधी C2C12 का चयन गैर प्रतिरोधी के कुशल उन्मूलन के कारण ट्रांसफेक्शन के बाद 10−14 दिनों में प्राप्त किया जा सकता है, यानी, ट्रांसट्रांससंक्रमित कोशिकाएं(चित्रा 1बी)। आमतौर पर, कोशिका संस्कृति पकवान से अलग कोशिकाओं के ८०% से अधिक और इन कोशिकाओं को नियमित सेल रखरखाव के दौरान हटा रहे हैं । पूर्णामिसिन प्रतिरोधी C2C12 कोशिकाओं नियंत्रण व्यक्त (तले हुए) shRNA धुरी आकार, कम सेल घनत्व पर विस्तारित सेल आकृति विज्ञान और मायोट्यूब में अंतर करने की क्षमता बनाए रखने । सीरम वापसी पर C2C12 भेदभाव उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी द्वारा और मायोट्यूब मार्कर मायोसिन भारी श्रृंखला (MyHC)(चित्रा 2)के लिए इम्यूनोस्टेनिंग द्वारा निगरानी की जा सकती है। MyHC-सकारात्मक मायोट्यूब भेदभाव दीक्षा के बाद 3−5 दिनों के बीच मनाया जाता है। मायोट्यूब को मल्टीन्यूक्लिट किया जाता है जैसा कि MyHC-सकारात्मक सेल सीमाओं के भीतर एक से अधिक DAPI-सकारात्मक नाभिक की उपस्थिति से दिखाया गया है। चित्रा 3एक स्थिर C2C12 पूर्ण DMEM में सुसंस्कृत कोशिकाओं के उज्ज्वल क्षेत्र छवियों से पता चलता है । यहां प्रस्तुत नॉकआउट दक्षता 40−60%(चित्रा 3बी)से लेकर है। चूंकि एमआरएनए को जन्मात्मक स्थिति में काटा गया था जहां थोड़ा Adamtsl2 व्यक्त किया जाता है, नॉकडाउन दक्षता कम दिखाई देती है, लेकिन नॉकडाउन दक्षता C2C12 भेदभाव के दौरान बाद के समय बिंदुओं पर बड़ी होने की उम्मीद है, जहां एंडोजेनस Adamtsl2 प्रेरित है और इस प्रकार बहुत उच्च स्तर पर व्यक्त किया जाता है। पश्चिमी दाग विश्लेषण C2C12 कोशिकाओं से प्राप्त सेल lysate में ADAMTSL2 के सफल नॉकडाउन की पुष्टि की स्तर पर नियंत्रण shRNA(चित्रा 3सी)की तुलना में shRNA ३०८६ व्यक्त ।

Figure 1
चित्रा 1: shRNA-एन्कोडिंग प्लाज्मिड डीएनए के साथ ट्रांसफेक्शन के बाद स्थिर C2C12 कोशिकाओं का चयन। (क)लक्ष्य क्षेत्र (सीडीएस, कोडिंग अनुक्रम; 3'-यूटीआर, 3'-अअनुवादित क्षेत्र), क्लोन आईडी (इसके बाद 1977, 3086 और 972 के रूप में संदर्भित), और shRNAs के अनुक्रम को दिखाने वाली तालिका जो Adamtsl2को लक्षित करने के लिए उपयोग की जाती थी। (ख)पैनलC2C12 कोशिकाओं के चयन को नियंत्रण shRNA और तीन Adamtsl2-लक्ष्यीकरणshRNAs से ट्रांसट्रांसिकन दिखाते हैं । C2C12 कोशिकाओं को श्आरएनए प्लाज्मिड्स से ट्रांसकिया गया था और प्यूरोमाइसिन को 24 घंटे के बाद माध्यम में जोड़ा गया था। प्यूरोमाइसिन-संवेदनशील कोशिकाएं गोल दिखाई देती हैं और अंततः नियमित सेल संस्कृति रखरखाव (लाल तीर) के दौरान अलग होती हैं। इसके विपरीत, एकीकृत श्रना प्लाज्मिड को शरण देने वाली प्यूरोमाइसिन प्रतिरोधी कोशिकाएं धुरी के आकार, थोड़ी विस्तारित, संलग्न और व्यवहार्य (नीले तीर) दिखाई देती हैं। स्केल बार = 100 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: C2C12 myoblast myotube भेदभाव करने के लिए । C2C12 कोशिकाओं में अंतर की उज्ज्वल क्षेत्र छवियां भेदभाव (दिन 0−1) की शुरुआत में कोशिकाओं की घने कोबलस्टोन उपस्थिति दिखाती हैं और 5 दिन (ऊपरी पंक्ति) के बाद बहुआयामी मायोट्यूब मनाए गए थे। मायोसिन भारी श्रृंखला (MyHC, लाल), जो मायोट्यूब के लिए एक मार्कर है के साथ C2C12 कोशिकाओं में अंतर की इम्यूनोस्टेनिंग, भेदभाव (मध्य पैनल) के दिन 3 पर प्रेरित है । नाभिक को डीपीआई से दाग दिया गया और विलय की गई छवि को निचले पैनलों में दिखाया गया है। स्केल बार = 50 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: C2C12 कोशिकाओं के प्रसार में स्थिर नॉकडाउन का सत्यापन । (A)स्थिर C2C12 कोशिकाओं की उज्ज्वल क्षेत्र छवियां पूर्ण DMEM में सुसंस्कृत । स्केल बार = 300 माइक्रोन.(बी)क्यूआरटी-स्थिर C2C12 कोशिकाओं में Adamtsl2 mRNA अभिव्यक्ति के पीसीआर विश्लेषण। सीटी मूल्यों को हाउसकीपिंग जीन Hprt1को सामान्यीकृत किया गया था । एमआरएनए को भेदभाव की शुरुआत से पहले काटा गया था। त्रुटि सलाखों के मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं। (C)पश्चिमी दाग विश्लेषण C2C12 कोशिकाओं से सेल lysate/ECM अंश में कम ADAMTSL2 प्रोटीन दिखा sRNA ३०८६ स्थिर व्यक्त करते हैं । एक कस्टम-निर्मित पॉलीक्लोनल पेप्टाइड एंटीबॉडी (अनुरोध पर उपलब्ध) का उपयोग करके एंडोजेनस ADAMTSL2 का पता चला था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

हम यहां C2C12 मायोब्लास्ट में ईसीएम प्रोटीन के स्थिर नॉकडाउन के लिए और मायोट्यूब में C2C12 मायोब्लास्ट के भेदभाव के फेनोटाइपिक विश्लेषण के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। कई कारक प्रयोग के परिणाम को निर्धारित करते हैं और ध्यान से विचार करने की आवश्यकता है। प्रसार चरण में C2C12 कोशिकाओं को बनाए रखना एक महत्वपूर्ण कदम के लिए myoblast अग्रदूत राज्य में C2C12 कोशिकाओं को रखने के लिए है । लगातार मायोट्यूब में अंतर करने के लिए C2C12 कोशिकाओं की क्षमता को बनाए रखना आई पर निर्भर करता है) कोशिकाओं की मार्ग संख्या, ii) नियमित रखरखाव के दौरान सुसंस्कृत कोशिकाओं का घनत्व, और iii) पोषक तत्वों की उपलब्धता, कोशिका संस्कृति माध्यम11,12,13की लगातार और नियमित भरपाई की आवश्यकता होती है। कुछ अज्ञात तंत्रों के कारण, उच्च मार्ग संख्या C2C12 कोशिकाएं भी आगे myoblast संलयन11के लिए क्षमता खो देते हैं । C2C12 कोशिकाओं के प्रदाता से निर्देश 15 पारित संख्या तक इन कोशिकाओं को बनाए रखने का सुझाव देते हैं । इसके बाद, भेदभाव क्षमता कम हो सकती है और ऐसी कोशिकाओं के साथ प्रयोगों के परिणामस्वरूप कम सुसंगत मायोट्यूब गठन हो सकता है। दूसरी ओर, रखरखाव के दौरान सेल घनत्व इसी तरह के प्रभाव9में परिणाम कर सकते हैं । नियमित सेल संस्कृति के दौरान confluent C2C12 सेल घनत्व तक पहुंचने C2C12 myoblast भेदभाव की दीक्षा को बढ़ावा देने और इस तरह नकारात्मक सेल आबादी की भेदभाव क्षमता को प्रभावित कर सकते हैं । इसलिए, नियमित C2C12 सेल रखरखाव के दौरान उच्च सेल घनत्व तक पहुंचने से C2C12 कोशिकाओं को रोकने के लिए यह महत्वपूर्ण महत्व का है । यह कम सेल घनत्व (<50−60% संगम) पर पहले से ही उप-culturing C2C12 कोशिकाओं द्वारा प्राप्त किया जा सकता है। सीरम भुखमरी का उपयोग C2C12 सेल भेदभाव को मायोट्यूब में प्रेरित करने के लिए किया जाता है। इसलिए, मध्यम की भरपाई के बिना लंबे समय तक कोशिकाओं को बनाए रखना पोषक तत्व और सीरम के स्तर को गंभीर रूप से समाप्त करता है। कम से कम हर दो दिन में मध्यम युक्त ताजा सीरम के साथ भरपाई पोषक तत्वों और सीरम अभाव के कारण अवांछित समय से पहले भेदभाव की शुरुआत को रोक सकता है।

C2C12 भेदभाव आम तौर पर सीरम भुखमरी से प्रेरित है। C2C12 भेदभाव को प्रेरित करने के लिए उपयोग किया जाने वाला सीरम का प्रतिशत परिणामों को बहुत प्रभावित कर सकता है, विशेष रूप से MyHC सकारात्मक मायोट्यूब14,15बनाने में लगने वाला समय। कई प्रोटोकॉल विभिन्न सीरम सांद्रता के तहत भेदभाव के सफल शामिल होते हैं। 2−10% एफबीएस या हॉर्स सीरम और पूर्ण सीरम अभाव का उपयोग सूचित किया गया है और सभी शर्तों C2C12 मायोट्यूब गठन में परिणाम है। सीरम प्रतिशत या सीरम लॉट में परिवर्तन काफी भेदभाव के लिए मार्कर बदल सकते हैं। इसके अलावा, सीरम का स्रोत प्रायोगिक परिणाम को प्रभावित कर सकता है, क्योंकि मूल का देश गोजातीय सीरम उत्पादन8के दौरान कुछ एडिटिव्स की अनुमति दे सकता है या नहीं कर सकता है। सीरम स्तर विशिष्ट प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के अनुसार भेदभाव दर को प्राप्त करने के लिए समायोजित किया जा सकता है । इंसुलिन को भेदभाव और मायोट्यूब गठन16में तेजी लाने के लिए C2C12 कोशिकाओं के संस्कृति माध्यम में जोड़ा जा सकता है।

ट्रांसफेक्शन के माध्यम से C2C12 कोशिकाओं में shRNA या recombinant प्रोटीन एन्कोडिंग प्लाज्मिड्स देने की क्षमता C2C12 कोशिकाओं की एक आकर्षक विशेषता है । कई वाणिज्यिक लिपोसोम आधारित ट्रांसफेक्शन पुनरुत्थान अभिकर्ताओं का उपयोग पहले सी2सी 12 कोशिकाओं में प्लाज्मिड डीएनए देने के लिए किया गया है जिसमें चर रिपोर्ट ट्रांसफेक्शन क्षमता17,18 ,19,20,21थी । पी भी उचित ट्रांसफेक्शन दक्षता से पता चलता है और liposome आधारित ट्रांसफेक्शन रेएजेंट्स के लिए एक लागत प्रभावी विकल्प है । एक वाणिज्यिक लिपोसोम आधारित ट्रांसफेक्शन पुनरुत्थान अभिकर्ता और पी के साथ ट्रांसफेक्शन के बीच तुलना में ट्रांसफेक्शन दक्षता में कोई खास बदलाव नहीं दिखा और पी22के साथ थोड़ी अधिक दक्षता पाई गई। हमारे हाथों में, पी के साथ ट्रांसफेक्शन दक्षता स्थिर प्यूरोमाइसिन प्रतिरोधी C2C12 कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए पर्याप्त थी। हालांकि, इस प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम ट्रांसफेक्शन रिएजेंट के ऊष्मायन समय को छोटा रखना है। जैसा कि ऊपर बताया गया है, C2C12 कोशिकाएं सीरम वापसी के प्रति संवेदनशील हैं और ट्रांसफेक्शन के दौरान कम सीरम स्थितियों के लिए लंबे समय तक जोखिम C2C12 सेल भेदभाव के पक्ष में हो सकती हैं। चूंकि सीरम के अभाव में ट्रांसफेक्शन किया जाता है, इसलिए समय से पहले भेदभाव को रोकने के लिए ट्रांसफेक्शन के बाद ऊष्मायन समय को जल्दी सीरम युक्त माध्यम को पुन: आपूर्ति करने के लिए कम रखा गया था। प्यूरोमाइसिन को पूर्णिमाइसिन प्रतिरोधी C2C12 कोशिकाओं के चयन की शुरुआत करने के लिए ट्रांसफेक्शन के बाद संस्कृति माध्यम 24 एच में जोड़ा गया था। विभेदित मायोट्यूब में प्लाज्मिड डीएनए शुरू करने के तरीकों में ट्रांसफेक्शन (85% दक्षता की रिपोर्ट), इलेक्ट्रोपोशन, या बायोलिस्टिक दृष्टिकोण23,24,25शामिल हैं। वैकल्पिक रूप से, एक प्रेरक शआरएना प्लाज्मिड को शरण देने वाली स्थिर C2C12 कोशिकाओं को मायोट्यूब भेदभाव के बाद के चरणों में या मायोट्यूब परिपक्वता26के दौरान जीन को नीचे गिराने के लिए उत्पन्न किया जा सकता है।

यहां वर्णित विधि C2C12 कोशिकाओं में ADAMTSL2 के स्थिर नॉकआउट के परिणामस्वरूप जहां मायोट्यूब में भेदभाव के दौरान अपने समारोह अब निर्धारित किया जा सकता है । स्थिर नॉकआउट कोशिकाओं की पीढ़ी विशेष रूप से प्रोटीन के कार्य का अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण हो सकती है जो मायोट्यूब गठन या परिपक्वता के दौरान प्रेरित होते हैं। उदाहरण के लिए siRNA के साथ क्षणिक क्षणिक क्षणिक इन जीनों को कुशलतापूर्वक नॉकआउट करने के लिए पर्याप्त नहीं होगा, क्योंकि सिआरएनए का क्षणिक नॉकडाउन प्रभाव 5−7 दिनों के बाद बंद हो सकता है। वैकल्पिक रूप से, CRISPR/Cas9 का उपयोग कर एक ECM प्रोटीन के नॉकआउट तकनीकी रूप से अधिक चुनौतीपूर्ण है और व्यक्तिगत क्लोन का चयन और वांछित जीन के नॉकआउट सुनिश्चित करने के लिए अनुक्रम की जरूरत है । हालांकि, अभिकर्मकों की उभरती लाइन भविष्य में नुकसान के कार्य प्रयोगों के लिए पसंद की विधि CRISPR/Cas9 प्रदान कर सकती है ।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

D.H. राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (राष्ट्रीय गठिया और मस्कुलोस्केलेटल और त्वचा रोग संस्थान, NIAMS, अनुदान संख्या AR070748) और Leni & पीटर डब्ल्यू मई आर्थोपेडिक विभाग, Icahn स्कूल ऑफ मेडिसिन से बीज वित्तपोषण द्वारा समर्थित है माउंट सिनाई।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone Fisher Chemical 191784
Agar Fisher Bioreagents BP1423
Ampicillin Fisher Bioreagents BP1760-5
Automated cell counter Countesse II Invitrogen A27977
Bradford Reagent Thermo Scientific P4205987
C2C12 cells ATCC CRL-1772
Chamber slides Invitrogen C10283
Chloroform Fisher Chemical 183172
DMEM GIBCO 11965-092
DMSO Fisher Bioreagents BP231-100
DNase I (Amplification Grade) Invitrogen 18068015
Fetal bovine serum VWR 97068-085
GAPDH EMD Millipore MAB374
Glycine VWR Life Sciences 19C2656013
Goat-anti-mouse secondary antibody (IRDYE 800CW) Li-Cor C90130-02
Goat-anti mouse secondary antibody (Rhodamine-red) Jackson Immune Research 133389
HCl Fisher Chemical A144S
Incubator (Shaker) Denville Scientific Corporation 1704N205BC105
Mercaptoethanol Amresco, VWR Life Sciences 2707C122
Midiprep plasmid extraction kit Qiagen 12643
Myosin 4 (myosin heavy chain) Invitrogen 14-6503-82
Mounting medium Invitrogen 2086310
NaCl VWR Life Sciences 241
non-ionic surfactant/detergent VWR Life Sciences 18D1856500
Paraformaldehyde MP 199983
PBS Fisher Bioreagents BP399-4
PEI Polysciences 23966-1
Penicillin/streptomycin antibiotics GIBCO 15140-122
Petridishes Corning 353003
Polypropylene tubes Fisherbrand 149569C
Protease inhibitor cocktail tablets Roche 33576300
Puromycin Fisher Scientific BP2956100
PCR (Real Time) Applied Biosystems 4359284
Reaction tubes Eppendorf 22364111
Reverse Transcription Master Mix Applied Biosystems 4368814
RIPA buffer Thermo Scientific TK274910
sh control plasmid Sigma-Aldrich 07201820MN
sh 3086 plasmid Sigma-Aldrich TRCN0000092578
sh 972 plasmid Sigma-Aldrich TRCN0000092579
sh 1977 plasmid Sigma-Aldrich TRCN0000092582
Spectrophotometer (Nanodrop) Thermo Scientific NanoDrop One C
SYBR Green Reagent Master Mix Applied Biosystems 743566
Trichloroacetic acid Acros Organics 30145369
Trizol reagent Ambion 254707
Trypan blue GIBCO 15250-061
Tryptone Fisher Bioreagents BP1421
Trypsin EDTA 0.25% Gibco-Life Technology Corporation 2085459
Water (DEPC treated and nuclease free) Fisher Bioreagents 186163
Western blotting apparatus Biorad Mini Protean Tetra Cell
Yeast extract Fisher Bioreagents BP1422

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References

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जेनेटिक्स इश्यू 156 एडमटीएस प्रोटीज एडमटीएस जैसे प्रोटीन सी2सी12 मायोब्लास्ट्स एक्स्सेल्युलर मैट्रिक्स कंकाल मांसपेशियों में अंतर मायोजेनेसिस शना
सी2C12 Myoblast सेल लाइन में एक्स्ट्रासेलुलर मैट्रिक्स प्रोटीन एन्कोडिंग जीन का स्थिर नॉकडाउन छोटे हेयरपिन (एसएच) आरएनए का उपयोग कर
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Taye, N., Stanley, S., Hubmacher, D. … More

Taye, N., Stanley, S., Hubmacher, D. Stable Knockdown of Genes Encoding Extracellular Matrix Proteins in the C2C12 Myoblast Cell Line Using Small-Hairpin (sh)RNA. J. Vis. Exp. (156), e60824, doi:10.3791/60824 (2020).

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