Summary
Forniamo un protocollo per abbattere stabilmente i geni che codificano le proteine eCM (Extracellular Matrix) nei mioblasti C2C12 usando l'RNA per piccoli capellini (sh). Mirando ad ESEMPIO ad ADAMTSL2, descriviamo i metodi per la convalida dell'efficienza di abbattimento a livello mRNA, proteina e cellulare durante il mioblasto C2C12 alla differenziazione del miotubo.
Abstract
Le proteine a matrice extracellulare (ECM) sono fondamentali per lo sviluppo muscolare scheletrico e l'omeostasi. L'abbattimento stabile dei geni che codificano per le proteine ECM nei mioblasti C2C12 può essere applicato per studiare il ruolo di queste proteine nello sviluppo muscolare scheletrico. Qui, descriviamo un protocollo per esaurire la proteina ECM ADAMTSL2 come esempio, usando l'RNA small-hairpin (sh) nelle cellule C2C12. Dopo la trafezione di plasmidi shRNA, le cellule stabili sono state selezionate in batch utilizzando la panina puromicina. Descriviamo inoltre il mantenimento di queste linee cellulari e l'analisi fenotipica tramite l'espressione mRNA, l'espressione proteica e la differenziazione C2C12. I vantaggi del metodo sono la generazione relativamente veloce di cellule knockdown C2C12 stabili e la differenziazione affidabile delle cellule C2C12 in miotubi multinuletti al momento dell'esaurimento del siero nel mezzo di coltura cellulare. La differenziazione delle cellule C2C12 può essere monitorata mediante microscopia da campo brillante e misurando i livelli di espressione dei geni dei marcatori canonici, come MyoD, miogenina o miosina a catena pesante (MyHC) che indica la progressione della mioblastizzazione C2C12 nei miotubi. A differenza dell'abbattimento transitorio di geni con RNA a piccole interferenze (si), i geni che vengono espressi in seguito durante la differenziazione del C2C12 o durante la maturazione del miotubo possono essere mirati in modo più efficiente generando cellule C2C12 che esprimono stabilmente lo shRNA. Le limitazioni del metodo sono una variabilità nell'efficienza del knockdown, a seconda dello shRNA specifico che può essere superato utilizzando strategie di knockout genico basate su CRISPR/Cas9, così come potenziali effetti fuori bersaglio dello shRNA che dovrebbero essere considerati.
Introduction
Le proteine della matrice extracellulare (ECM) forniscono supporto strutturale per tutti i tessuti, mediano la comunicazione cellulare-cellula e determinano il destino cellulare. La formazione e il rimodellamento dinamico di ECM è quindi fondamentale per mantenere l'omeostasi dei tessuti e degli organi1,2. Varianti patologiche in diversi geni codificando per le proteine ECM danno origine a disturbi muscolo-scheletrici con fenotipi che vanno dalle distrofie muscolari alla costruzione pseudomouscolare3,4. Ad esempio, le varianti patogene in ADAMTSL2 causano la rarissima displasia geleofisica del disturbo muscolo-scheletrico, che presenta una costruzione pseudomuscolare, cioè un apparente aumento della massa muscolare scheletrica5. Insieme ai dati di espressione genica nel topo e negli esseri umani, questo suggerisce un ruolo per ADAMTSL2 nello sviluppo muscolare scheletrico o omeostasi6,7.
Il protocollo che descriviamo qui è stato sviluppato per studiare il meccanismo con cui ADAMTSL2 modula lo sviluppo muscolare scheletrico e/omeostasi in un ambiente di coltura cellulare. Abbiamo stabilmente abbattuto ADAMTSL2 nella linea cellulare del mioblasto murine C2C12. I mioblasti C2C12 e la loro differenziazione nei miotubi è un modello di coltura cellulare ben descritto e ampiamente utilizzato per la differenziazione muscolare scheletrica e la bioingegneria muscolare scheletrica8,9. Le cellule C2C12 attraversano passaggi di differenziazione distinti dopo il ritiro del siero, con conseguente formazione di miotubi multinucleati dopo 3-10 giorni di tempo. Questi passaggi di differenziazione possono essere monitorati in modo affidabile misurando i livelli di mRNA di geni marcatori distinti, come MyoD, miogenina o miosina pesante (MyHC). Uno dei vantaggi derivanti dalla generazione di abbattimenti genici stabili nelle cellule C2C12 è che i geni che vengono espressi nelle fasi successive della differenziazione C2C12 possono essere mirati in modo più efficiente, rispetto al knockdown transitorio ottenuto dall'RNA a piccole interferenze (si), che in genere dura 5-7 giorni dopo la trasfezione, ed è influenzato dall'efficienza della trasparenza. Un secondo vantaggio del protocollo come descritto qui è la generazione relativamente veloce di lotti di celle knockdown C2C12 utilizzando la selezione della puromicina. Alternative, come l'abbattimento del gene mediato da CRISPR/Cas9 o l'isolamento dei precursori primari delle cellule muscolari scheletriche da topi umani o carenti di geni bersaglio, sono tecnicamente più impegnative o richiedono la disponibilità rispettivamente di biopsie muscolari dei pazienti o di topi carenti di cellule bersaglio-geniche. Tuttavia, analogamente ad altri approcci basati sulla coltura cellulare, ci sono limitazioni nell'uso delle cellule C2C12 come modello per la differenziazione delle cellule muscolari scheletriche, come la natura bidimensionale (2D) dell'impostazione della coltura cellulare e la mancanza del microambiente in vivo che è fondamentale per mantenere le cellule precursori del muscolo scheletrico indifferenziate10.
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Protocol
1. Preparazione del DNA shRNA Plasmid da Escherichia coli
- Generazione di colonie batteriche clonali che trasportano i plasmidi shRNA
- Ottenere scorte di glicerolo di E. coli che trasportano plasmidi shRNA specifici del bersaglio e un plasmide di controllo da fonti commerciali (Tabella dei materiali).
NOTA: Sono stati utilizzati tre diversi plasmidi shRNA, mirati a diverse regioni dell'mRNA murino Adamtsl2. Uno shRNA è stato selezionato per colpire la regione 3'-untranslated (3'UTR) di Adamtsl2 per facilitare gli esperimenti di salvataggio con plasmidi di espressione che codificano ADAMTSL2 ricombinante o singoli domini proteici ADAMTSL2. Inoltre, un plasmide shRNA strapazzato è stato incluso come controllo negativo. I dettagli delle sequenze di shRNA sono forniti nella Figura 1A. - Scongelare lo stock di glicerolo batterico shRNA a temperatura ambiente (RT). Trasferire 10 lun di brodo di glicerolo batterico su una piastra di agar Luria-Bertani (LB) integrata con 100 ampicillina (LB-Amp).
NOTA: Le piastre LB-Amp sono preparate autoclavando 1 L di LB medio (per 1 L: 10 g di tryptone, 5 g di estratto di lievito, 10 g di NaCl, regolare pH a 7.0) insieme a 12 g di agar. Lasciare raffreddare il mezzo fino a 50 gradi centigradi e aggiungere l'ampicillina (soluzione di riserva: 50 mg/mL in acqua sterile) ad una concentrazione finale di agar LB-Amp. Versare immediatamente 20 mL di agar LB-Amp in un piatto Petri di 10 cm e lasciare che l'agar si solidifichi prima dell'uso. 1 L di LB-Amp agar è in genere sufficiente per versare circa 40 10 cm piatti Petri. I piatti Petri contenenti l'agar LB-Amp sono stabili per almeno un mese se conservati sigillati a 4 gradi centigradi al buio. - Stendere batteri con spatola sterile Drygalski o qualsiasi altro metodo appropriato per raggiungere singole colonie batteriche. Incubare le piastre batteriche capovolta durante la notte a 37 gradi centigradi.
- Ottenere scorte di glicerolo di E. coli che trasportano plasmidi shRNA specifici del bersaglio e un plasmide di controllo da fonti commerciali (Tabella dei materiali).
- Preparazione plasmide
- La mattina seguente, rimuovere il piatto Petri con le singole colonie batteriche e conservare a 4 gradi centigradi per evitare la crescita eccessiva delle colonie batteriche e la formazione di colonie satellitari. Sigillare il piatto Petri se conservato durante la notte o più a lungo.
- Nel pomeriggio, aggiungere 5 mL di lB-Amp medio in un tubo di coltura batterica in polipropilene. Selezionare una singola colonia batterica del piatto Petri coltivata durante la notte con una punta pipetta e un mezzo LB-Amp inoculato espellendo la punta della pipetta nel tubo di coltura batterica contenente il mezzo LB-Amp.
- Incubare la coltura batterica durante la notte in uno shaker a 250 rpm a 37 gradi centigradi con il coperchio vagamente attaccato per consentire l'aerazione.
- Estrarre il tubo di coltura batterica la mattina successiva e mantenere a 4 gradi centigradi per evitare la crescita eccessiva batterica. Nel pomeriggio, risospendere i batteri vortice e trasferire 1 mL della coltura batterica durante la notte in 50 mL di mezzo LB-Amp in un flacone conico da 250 mL. Incubare per una notte in uno shaker a 250 giri/min a 37 gradi centigradi.
- La mattina successiva, trasferire i batteri in un tubo di centrifuga usa e getta da 50 mL e i batteri centrifugati a 6.000 x g a RT per 15 min. Rimuovere il mezzo e continuare con il passo 1.2.6.
NOTA: Se il DNA plasmide non può essere isolato immediatamente, rimuovere il supporto LB-Amp dopo la fase di centrifugazione e conservare i batteri pellet a -20 gradi centigradi. - Seguire le istruzioni per il kit di preparazione del plasmide (scala midi) per estrarre il DNA plasmide dai batteri. Valutare la qualità del DNA plasmide misurando il rapporto A260/A280 utilizzando uno spettrofotometro.
NOTA: È auspicabile un rapporto A260/A280 di >1,8, che indica un'elevata purezza della preparazione del DNA del plasmide. Un rapporto A260/A280 più basso suggerisce la contaminazione con proteine o una rimozione insufficiente dei reagenti di estrazione. Potrebbero essere necessarie ulteriori misure di purificazione plasmida.
2. Culturazione e trasfezione delle cellule C2C12 e Puromycin Selection
- Coltura cellulare C2C12
- Scongelare le cellule C2C12 (Tabella dei materiali) rapidamente in un bagno d'acqua a 37 gradi centigradi e versare le cellule in sterile tubo di centrifugazione usa e getta da 15 mL contenente 8 mL del mezzo Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) integrato con 100 unità di penicillina e antibiotici per streptomici (DMEM senza siero) in una cappa di cellule di coltura. Centrifuga cellule per 3 min a 160 x g a RT.
- Aspirato supernatante e risospensione del pellet cellulare in 10 mL di DMEM senza sfumato integrato con 10% siero bovino fetale (FBS) (DMEM completo). Trasferire le cellule a 10 cm di coltura tissutale trattati piatti di plastica. Incubare le cellule in un'incubatrice umidificata a 37 gradi centigradi in un'atmosfera di CO2 del 5%.
- Il giorno successivo, sostituire il supporto con un DMEM completo.
- Espandi le celle a basso passaggio C2C12 su piatti da 3-4 10 cm. Quando le cellule C2C12 raggiungono il 50-60% di confluenza, aspirate il mezzo e risciacquate le cellule C2C12 con 10 mL di salina con buffer fosfato (PBS).
- Aggiungere 1 mL di 0,25% di trypsin-EDTA e incubare per 2 min a RT. Monitorare il distacco cellulare al microscopio ed estendere il tempo di incubazione, se necessario, fino a quando la maggior parte delle cellule sono staccate.
NOTA: toccare con attenzione il piatto può aiutare a spostare le cellule. - Quando la maggior parte delle cellule sono staccate, aggiungere 10 mL di DMEM completo al piatto, pipettare il volume su e giù più volte, e trasferire le sospensioni cellulari a un tubo sterile monouso 15 mL centrifuga. Centrifuga cellule per 3 min a 160 x g a RT. Aspirate supernatant e resospendere il pellet cellulare in 2 mL di mezzo di congelamento (10% di zolfo dimetile [DMSO]/90% FBS).
- Trasferire due aliquote da 1 mL per piatto di 10 cm in criovialle. Incubare in un contenitore di congelamento cellulare riempito con isopropanolo RT per almeno 24 h in un congelatore -80 gradi centigradi con conseguente un tasso di congelamento di circa -1 gradi centigradi per min per evitare la formazione di cristalli di ghiaccio. Conservare le cellule per l'uso a lungo termine nella fase di vapore dell'azoto liquido.
NOTA: Il fornitore consiglia di utilizzare le celle C2C12 fino al passaggio numero 15. Le esperienze degli autori hanno anche mostrato che le cellule con un numero di passaggio inferiore mostravano una differenziazione più coerente e rapida nei miotubi. È essenziale mantenere le cellule C2C12 a bassa densità di cellule (<50% di confluenza) per evitare l'insorgenza prematura della differenziazione. Le celle C2C12 differenziate o differenziate non possono essere ripristinate allo stato myoblast originale e devono essere eliminate.
- Preparazione delle cellule C2C12 per la trasfezione
- Coltura cellule C2C12 indifferenziate in un piatto di 10 cm fino a raggiungere 50-60% confluenza. Aspirate il mezzo, risciacquare le cellule C2C12 con 10 mL di PBS e aggiungere 1 mL di 0.25% trypsin-EDTA. Incubare per 2 min a RT, monitorare il distacco delle cellule al microscopio ed estendere il tempo di incubazione, se necessario, fino a quando la maggior parte delle cellule sono staccate.
NOTA: toccare con attenzione il piatto può aiutare a spostare le cellule. - Quando la maggior parte delle cellule sono staccate, aggiungere 10 mL di DMEM completo al piatto e trasferire la sospensione cellulare in un tubo sterile di centrifuga monouso da 15 mL. Centrifuga cellule per 3 min a 160 x g a RT. Aspirate supernatant e rimettere in sospensione il pellet cellulare in 4 mL di DMEM completo.
- Combinare 10 l di sospensione cellulare con 10 litri di trypan blu in un tubo di reazione da 1,5 ml, mescolare pipetting su e giù e far scorrere con attenzione il tubo di reazione e trasferire le celle in una diapositiva di conteggio. Determinare il numero di cella/mL utilizzando un contatore cellulare automatizzato.
- Diluire le cellule C2C12 a 50.000 cellule / mL e semi 100.000 cellule (2 mL) per pozzo in una piastra 6 po ' per ottenere circa 40-50% di confluenza dopo l'incubazione notturna. Incubare le cellule in un'incubatrice umidificata a 37 gradi centigradi in un'atmosfera di CO2 del 5%.
- Coltura cellule C2C12 indifferenziate in un piatto di 10 cm fino a raggiungere 50-60% confluenza. Aspirate il mezzo, risciacquare le cellule C2C12 con 10 mL di PBS e aggiungere 1 mL di 0.25% trypsin-EDTA. Incubare per 2 min a RT, monitorare il distacco delle cellule al microscopio ed estendere il tempo di incubazione, se necessario, fino a quando la maggior parte delle cellule sono staccate.
- Trasfezione di cellule C2C12 con plasmide shRNA utilizzando polietilenimine (PEI) e selezione della pancina
- Preparazione della soluzione stock PEI
- Sciogliere 16 mg di PEI in 50 mL di acqua distillata sterile (concentrazione di soluzione di riserva: 0,32 mg/mL) in una bottiglia di vetro da 50 mL con un tappo a vite. Incubare la soluzione a 65 gradi centigradi per 1 h e vortice la soluzione più volte durante il periodo di incubazione per sciogliere completamente il PEI.
- Regolare su pH 8 aggiungendo 15 L di 1N HCl per 50 mL.
AVVISO: HCl è corrosivo. L'HCl concentrato deve essere maneggiato sotto il cofano del fume. Gli investigatori devono indossare adeguati dispositivi di protezione personale. - Congelare la soluzione PEI a -80 gradi centigradi per 1 h con un coperchio vagamente attaccato e scongelare rapidamente a 37 gradi centigradi in un bagno d'acqua per migliorare ulteriormente la solubilità. Ripetere il ciclo di congelamento-scongelamento 3x.
- Conservare la soluzione di stock PEI in 0,5 mL per un utilizzo una tantentra.
- Trasfezione delle cellule C2C12
- Unire 25,5 l (8,5 sg di DNA plasmid) della soluzione di stock PEI con 100 luna di 25 mM NaCl in un tubo di reazione di 1,5 ml e incubare per 5 min a 37 . Unire 3 g di DNA plasmide con 100 gradi luna di 25 mM NaCl e incubare per 5 min a 37 gradi centigradi.
- Combinare l'intero volume del reagente PEI diluito con il plasmide diluito e mescolare con la pipista delicatamente su e giù. Incubare per 25 min a 37 gradi centigradi.
- Durante il tempo di incubazione, modificare il mezzo delle cellule C2C12 destinate alla trasfezione in DMEM senza FBS o antibiotici.
- Aggiungere la miscela di trasfezione PEI/DNA alle cellule C2C12 goccia a goccia e mescolare costantemente muovendo con attenzione il piatto di coltura cellulare. Incubare in un'incubatrice umidificata a 37 gradi centigradi in un'atmosfera di CO2 del 5%. Dopo 6 h, modificare il supporto per completare DMEM.
- Selezione puromycin
- 24 h dopo la trasfezione, passare medio a mezzo di selezione (completo DMEM più 5 g/mL puromycin). Continua la selezione della puromicmicina fino a ottenere cellule C2C12 resistenti alla puromycina, che in genere richiede 10-14 giorni.
- Espandi le cellule C2C12 resistenti alla ventina a bassa densità cellulare (confluenza di <50-60%), cioè per mantenere lo stato indifferenziato e la criopreserve di 6-10 fiale per esperimenti futuri, come descritto nei passi 2.1.4.1.7.
NOTA: Mantenere le cellule C2C12 resistenti alla colmicina in presenza di 5 g/mL puromycin per la coltura e l'espansione delle cellule di routine. Tuttavia, la puromycina è stata omessa negli esperimenti di differenziazione.
- Preparazione della soluzione stock PEI
3. Analisi fenotipica della differenziazione C2C12
NOTA: I metodi descritti di seguito possono essere facilmente adattati per l'analisi fenotipica generale della differenziazione del mioblasto C2C12 nei miotubi variando gli anticorpi specifici utilizzati nella bionda occidentale o i primer specifici del gene utilizzati nella polimerasi quantitativa analisi della reazione a catena (qPCR).
- Protocollo di differenziazione C2C12 e microscopia a campo luminoso
- Semi 150.000 cellule / pozzo in una piastra di 12 pozze. Cellule stabili C2C12 resistenti alla coltura in un mezzo di selezione di 12 pozze in un'incubatrice umidificata a 37 gradi centigradi in un'atmosfera di CO2 del 5%. Coltura C2C12 cellule in DMEM completo fino a raggiungere il 95% di confluenza.
- Per indurre la differenziazione delle cellule C2C12, sostituire DMEM completo con DMEM senza siero (giorno 0 di differenziazione). Cambia il mezzo ogni due giorni e segui la formazione del miotubi C2C12 usando un microscopio a campo luminoso invertito con fotocamera.
NOTA: molti protocolli utilizzano il 2% del siero di cavallo per differenziare le celle C2C12 in miotubi. Nelle mani degli autori, la rimozione del siero ha avuto un effetto simile. L'insulina è descritta come un additivo al mezzo di coltura cellulare per accelerare la differenziazione C2C12. Tuttavia, nell'attuale protocollo, le cellule C2C12 si differenziavano in modo affidabile nei miotubi entro 3-5 giorni dalla privazione del siero e l'aggiunta di insulina è stata ritenuta inutile.
- Miosina heavy chain (MyHC) immunostaining per visualizzare miotubi
- Seme 50.000 cellule C2C12 resistenti alla puromycina per camera in uno scivolo a 8 pozzetti in 500 - L di DMEM completo. Cellule di coltura fino a raggiungere 95% confluenza in DMEM completo (circa 24 h).
- Per indurre la differenziazione, passare da Un DMEM completo a 500 L di DMEM senza siero (giorno 0 di differenziazione). Nei punti temporali desiderati, aspirare le celle medie e di risciacquo 3x con 0,5 mL di PBS.
NOTA: eseguire tutti i passaggi seguenti in RT. - Fissare le cellule con 0,2 mL del 4% di paraformaldeide (PFA) diluite in PBS per 15 min.
AVVISO: il PFA è pericoloso. Prendere le precauzioni appropriate e scartare la soluzione di paraformaldeide come rifiuti pericolosi. - Quench PFA con 0,2 mL di 0,5 M glicina in PBS per 5 min.
- Incubare cellule con 0,2 mL dello 0,1% di sovrafattore/detergente non ionico (Tabella dei materiali) in PBS per 10 min per permeabilizzare la membrana cellulare. Blocco con 0,2 mL del 5% di albumina del siero bovino in PBS per 1 h. Celle di rinse con 0,5 mL di PBS 3x per 5 min ciascuno.
- Incubare cellule con 0,2 mL di anticorpo MyHC (1:200 in PBS) per 2 h. Risciacquare le cellule con 0,5 mL di PBS 3x per 5 min ciascuna.
- Incubare cellule con 0,2 mL di anti-capra anti topo damino rosso coniugato (1:200 in PBS). Risciacquare le cellule con 0,5 mL di PBS 3x per 5 min ciascuna.
- Dopo aver rimosso quantitativamente PBS, aggiungere una goccia di supporto di montaggio contenente 4,6-diamidino-2-fenilondole (DAPI) per camera. Coverslip e supporto di montaggio cura secondo le istruzioni del produttore. Sigillare con smalto.
- Osservare le cellule C2C12 utilizzando un microscopio a fluorescenza utilizzando il set di filtri appropriato.
- Valutazione dell'efficienza del knockdown mediante reazione quantitativa della catena della polimerasi in tempo reale (qRT-PCR)
- Colture C2C12 cellule in condizioni di differenziazione in 12 piastre ben come descritto nella sezione 3.1.
- Nei punti temporali desiderati, rimuovere il mezzo di differenziazione, sciacquare le cellule una volta con 1 mL di PBS e aggiungere 0,5 mL di reagente di estrazione RNA (Tabella dei materiali) per pozzo. Lisciviazione delle cellule pipettando su e giù e trasferire cella lisato a un tubo di reazione sterile 1,5 mL. Isolare l'RNA seguendo attentamente il protocollo del produttore.
AVVISO: Il reagente di estrazione dell'RNA contiene fenolo. Deve essere usato sotto un cappuccio fumato. Raccogliere i rifiuti reagenti per l'estrazione dell'RNA e smaltire i rifiuti pericolosi. Gli investigatori devono indossare adeguati dispositivi di protezione personale. - Sciogliere il pellet di RNA finale in 20 o più l di acqua trattata DEPC (Diethyl pirocarbonato). Determinare la quantità e la qualità della preparazione dell'RNA utilizzando uno spettrofotometro e determinare il rapporto A260/A280 come misura di qualità.
NOTA: Un rendimento tipico da 1 pozzetto di un pozzo 12 è di 5,7 g di RNA totale con un rapporto A260/A280 di 1,8. - Per digerire il DNA genomico residuo compurificato, diluire 1 g di RNA in un volume totale di 8 :L di acqua trattata con DEPC in un tubo PCR. Aggiungete 1 L di 10x di buffer di reazione e 1 L l di DNase I (1 unità/L) (Tabella dei materiali) e incubate per 15 min a RT. Aggiungere 1 L di soluzione di arresto (25 mM EDTA) e incubare a 70 gradi centigradi per 10 min.
- Per generare cDNA, combinare 10 L di RNA trattato da DNase con 10 - L di 2x mix master di trascrizione inversa, contenente la trascrizione inversa, primer casuali, 4 mM dNTP mix (1 mM ciascuno di dATP, dTTP, dGTP, e dCTP), e buffer di reazione trascrizione inversa. Incubare la reazione in un termociclore utilizzando il programma come raccomandato dal produttore. Diluire cDNA con acqua in un rapporto 1:5.
- Per preparare la reazione qRT-PCR, unire rispettivamente 5 L di sYBR green qPCR master mix con 0,5 - L di primer in avanti e indietro specifici del gene (stock: 10 M), e 2 -L di acqua trattata con DEPC per reazione. Reazione di pipetta qPCR in un pozzo di una piastra da 96 pozzetto qRT-PCR e aggiungere 2 - L di cDNA diluito. Impostare tre repliche tecniche per ogni replica biologica e includere un gene delle pulidi, ad esempio Gapdh o Hprt1.
- Amplificare il prodotto PCR con un termociclista qRT-PCR utilizzando il seguente programma: 50 S per 2 min (attivazione del glicoscosylasi del DNA uracil [UDG]), 95 c per 2 min (attivazione di polimerasi del DNA a doppio blocco), 40 cicli di 95 s per 15 s, 60 c per 30 s e 72 C per 1 min.
- Quantificare i risultati qRT-PCR utilizzando il metodo DDCt normalizzando si rimostra in un gene di pulizia, come Gapdh o Hprt1.
- Valutazione dell'efficienza da un knockdown mediante gonfiore occidentale
- Seme 300.000 cellule C2C12 resistenti alla puromicina per pozzo in una piastra 6 per l'analisi delle macchie occidentali. Dopo 24 h, cambiare dMEM medio a senza siero per avviare la differenziazione (giorno 0 di differenziazione).
- Nei punti temporali desiderati, raccogliere due 1 mL di mezzo condizionato senza silo in un tubo di reazione di 1,5 mL e centrifugare per 5 min a 500 x g a RT per rimuovere le cellule staccate e detriti cellulari.
NOTA: Questo passaggio è necessario solo se vengono studiate proteine ECM o altre proteine secrete in un mezzo condizionato. Se la proteina di interesse è localizzata nel citoplasma o è legata alla membrana, aspirare il mezzo di coltura cellulare e procedere con i gradini di lisi cellulare (3.4.7.3.4.12). La lisi cellulare deve essere eseguita in parallelo alla precipitazione proteica dal mezzo condizionato senza siero per ridurre al minimo la degradazione proteolitica e altre conseguenze indesiderate di conservazione prolungata dello strato cellulare. - Dopo la centrifugazione, trasferire 1 mL di mezzo condizionato in un nuovo tubo di reazione di 1,5 mL e proteine precipitate aggiungendo 0,391 mL di una miscela di acido tricloroacetico (TCA) e surfactant/detergent non ionico. Vorticare brevemente la miscela e incubare per 10 min sul ghiaccio.
NOTA: Preparare direttamente la miscela di precipitazioni proteiche prima dell'uso combinando brevemente 0,252 mL del 55% TCA e 0,139 mL dell'1% di surfactant/detergente non ionico per mL di mezzo condizionato e vortice. La soluzione diventa torbida.
AVVISO: TCA è corrosivo e deve essere gestito in modo appropriato. - Pellet le proteine precipitate a >16,000 x g per 10 min a 4 gradi centigradi. Scartare il super-attardato.
AVVISO: Il supernatante contiene TCA e deve essere raccolto separatamente e smaltito come materiale pericoloso. - Lavare la proteina pellet 3x con acetone ghiacciato e centrifugare ogni volta a >16.000 x g per 10 min a 4 gradi centigradi.
- Asciugare ad aria il pellet proteico per 3/4 min a RT e sciogliere in 50 -L di 1x di sodio dodecyl bioacrita gel elettroforosi (SDS-PAGE) buffer campione (50 mM MM Tris pH 6.8, 2% SDS, 6% glicerolo, e 0.004% blu bromofenolo, integrato con 5% -mercaptoetanolo). Far bollire il campione per 5 min a 95 gradi centigradi e utilizzarlo per il gonfiore occidentale per rilevare la proteina bersaglio desiderata utilizzando procedure standard.
AVVISO: il flocchiolo è odoroso e tossico e deve essere maneggiato in un cappuccio fumatorio. - Per le proteine intracellulari e legate alla membrana, sciacquare lo strato cellulare una volta con 2 mL di PBS.
- Aggiungere 1 mL di PBS e spostare le celle raschiando loro del pozzo utilizzando un raschietto cellulare. Raccogliere le cellule in un tubo di reazione di 1,5 mL e centrifugare a 3.420 x g per 3 min a 4 gradi centigradi. Lavare la cella pellet 3x con 1 mL di PBS e centrifugare a 3.420 x g per 3 min a 4 gradi centigradi ogni volta.
- Per eseguire la lingotto delle cellule, risospendere il pellet cellulare in 0,2 mL di buffer di lisi (20 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM Na2EDTA, 1 mM EGTA, 1% NP40, 1% deoxicolato di sodio, 2,5 mM di pirofofafato di sodio, 1 mM e 1 mM di sodio ottravanottero) integrati con 1x ed-a-free protease inhibitor cocktail e incubatore di ghiaccio per 30 min.
- Ultrasuoni per 15 s sul ghiaccio con un'impostazione di uscita di potenza di 10 ad una frequenza operativa di 23 kHz.
- Rimuovere i detriti cellulari con centrifugazione a 13.680 x g per 20 min a 4 gradi centigradi. Raccogliere supernatali in un nuovo tubo di reazione 1,5 mL e determinare la concentrazione di proteine utilizzando un saggio commerciale Bradford o qualsiasi altro metodo adatto.
- Per ogni campione, unire 100 g di proteine con 5x buffer campione SDS-PAGE in un volume totale di 60 ,l e far bollire per 5 min a 95 gradi centigradi. Analizzare i campioni mediante procedure standard di gonfiore occidentale per la presenza della proteina bersaglio desiderata.
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Representative Results
La selezione di C2C12 resistenti alla puromycina può essere ottenuta in 10-14 giorni dopo la trasfezione a causa dell'eliminazione efficiente delle cellule non resistenti, cioè non transfette (Figura 1B). Tipicamente, più dell'80% delle cellule si staccano dal piatto di coltura cellulare e queste cellule vengono rimosse durante la manutenzione ordinaria delle cellule. Le cellule C2C12 resistenti alla formicina che esprimono lo shRNA di controllo (scrambled) mantengono la forma del mandrino, la morfologia cellulare allungata a bassa densità cellulare e la capacità di differenziarsi in miotubi. La differenziazione C2C12 al ritiro del siero può essere monitorata mediante microscopia da campo luminoso e mediante immunostaining per la catena pesante del marcatore myotube myosin (MyHC) (Figura 2). I miotubi mio-positivi sono osservati tra i 3 e 5 giorni dopo l'inizio della differenziazione. I miotubi sono multinucleati come dimostrato dalla presenza di più di un nucleo DAPI-positivo all'interno dei confini cellulari MyHC-positivi. Figura 3A Mostra immagini di campo luminoso di celle C2C12 stabili coltivate in DMEM completo. L'efficienza di knockdown qui presentata varia dal 40-60%(Figura 3B). Dal momento che l'mRNA è stato raccolto nello stato proliferante in cui si esprime il piccolo Adamtsl2, l'efficienza di knockdown appare bassa, ma l'efficienza di knockdown dovrebbe essere maggiore in momenti successivi durante la differenziazione C2C12, dove Adamtsl2 endogeno viene indotto e quindi espresso a livelli molto più elevati. L'analisi delle macchie occidentali ha confermato il successo dell'abbattimento di ADAMTSL2 nel lisato cellulare ottenuto dalle cellule C2C12 che esprimono stabilmente shRNA 3086 rispetto allo shRNA di controllo (Figura 3C).
Figura 1: Selezione delle cellule C2C12 stabili dopo la trasfezione con DNA plasmide codificante shRNA. (A) Tabella che mostra la regione di destinazione (CDS, sequenza di codifica; 3'-UTR, regione 3'-non tradotta), ID clone (in seguito indicato come 1977, 3086 e 972) e sequenza degli shRNA utilizzati per indirizzare Adamtsl2. (B) I pannelli mostrano la selezione delle cellule C2C12 trascate con lo shRNA di controllo e i tre shRNA di puntamento di Adamtsl2. Le cellule C2C12 sono state trascate con i plasmidi shRNA e la purocina è stata aggiunta al mezzo dopo 24 h. Le cellule sensibili alla panca appaiono rotonde e infine staccate durante la manutenzione ordinaria della coltura cellulare (frecce rosse). Al contrario, le cellule alla lontana della puromicina che ospitano i plasmidi shRNA integrati appaiono a forma di mandrino, leggermente allungate, attaccate e vitali (frecce blu). Barre di scala : 100 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: c2C12 mioblasto alla differenziazione del miotubo. Immagini luminose di campo di differenziazione delle cellule C2C12 mostrano l'aspetto denso ciottoli delle cellule all'inizio della differenziazione (giorno 0 -1) e miotubi multinucleati sono stati osservati dopo il giorno 5 (riga superiore). L'immunostaining delle cellule C2C12 differenzianti con la catena pesante della miosina (MyHC, rosso), che è un marcatore per i miotubi, è indotta al terzo giorno di differenziazione (pannello centrale). I nuclei sono stati macchiati con DAPI e l'immagine fusa è mostrata nei pannelli inferiori. Barre di scala - 50 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Convalida del knockdown stabile nelle cellule C2C12 proliferando. (A) Immagini di campo luminoso di cellule C2C12 stabili coltivate in DMEM completo. Barre di scala : 300 - m. (B) analisi qRT-PCR dell'espressione mRNA Adamtsl2 nelle cellule C2C12 stabili. I valori ct sono stati normalizzati al gene delle pulizie Hprt1. l'mRNA è stato raccolto prima dell'inizio della differenziazione. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard. (C) Analisi occidentale delle macchie che mostrano una proteina ADAMTSL2 ridotta nella frazione cell lysate/ECM delle cellule C2C12 che esprimono stabilmente lo shRNA 3086. Endogeno ADAMTSL2 è stato rilevato utilizzando un anticorpo peptide policlonale su misura (disponibile su richiesta). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Descriviamo qui un protocollo per il knockdown stabile delle proteine ECM nei mioblasti C2C12 e per l'analisi fenotipica della differenziazione dei mioblasti C2C12 nei miotubi. Diversi fattori determinano l'esito dell'esperimento e devono essere considerati con attenzione. Mantenere le cellule C2C12 nella fase di proliferazione è un passo fondamentale per mantenere le cellule C2C12 nello stato precursore del mioblasto. Mantenere la capacità delle cellule C2C12 di differenziarsi costantemente in miotubi dipende da i) il numero di passaggio delle cellule, ii) la densità delle cellule coltivate durante la manutenzione di routine, e iii) disponibilità di nutrienti, che richiede il rifornimento frequente e regolare del mezzo di coltura cellulare11,12,13. A causa di alcuni meccanismi sconosciuti, anche le cellule c2C12 di passaggio più elevato perdono il potenziale di ulteriore fusione del mioblasto11. Le istruzioni del fornitore delle cellule C2C12 suggeriscono di mantenere queste cellule fino al passaggio numero 15. Successivamente, il potenziale di differenziazione può essere ridotto e gli esperimenti con tali cellule possono portare a una formazione di miotubi meno coerente. D'altra parte, la densità cellulare durante la manutenzione può provocare effetti simili9. Raggiungere la densità delle cellule confluenti C2C12 durante la coltura cellulare di routine promuove l'avvio della differenziazione del mioblasto C2C12 e quindi può influenzare negativamente il potenziale di differenziazione della popolazione cellulare. Pertanto, è di importanza critica impedire alle cellule C2C12 di raggiungere alte densità di cellule durante la manutenzione delle cellule C2C12 di routine. Ciò può essere ottenuto già sotto-coltura delle cellule C2C12 a basse densità di cellule (<50-60% di confluenza). La fame di siero è usato per indurre la differenziazione delle cellule C2C12 nei miotubi. Pertanto, mantenere le cellule per tempi più lunghi senza reintegrare il mezzo esaurisce gravemente i livelli di nutrienti e siero. Ricostituire con siero fresco contenente mezzo almeno ogni due giorni può prevenire l'insorgenza di differenziazione prematura indesiderata a causa di privazione di nutrienti e siero.
La differenziazione C2C12 è tipicamente indotta dalla fame di siero. La percentuale di siero utilizzato per indurre la differenziazione C2C12 può influenzare notevolmente i risultati, in particolare il tempo necessario per formare miotubi positivi MyHC14,15. Diversi protocolli mostrano l'induzione di differenziazione con varie concentrazioni di siero. È stato riportato l'uso del 2-10% di FBS o siero di cavallo e la completa privazione del siero e tutte le condizioni portano alla formazione del miotubi C2C12. La percentuale di siero o la variazione del lotto del siero può alterare significativamente i marcatori per la differenziazione. Inoltre, la fonte del siero può influenzare l'esito sperimentale, perché il paese di origine può o non può consentire alcuni additivi durante la produzione di siero bovino8. Il livello del siero potrebbe essere regolato per raggiungere il tasso di differenziazione in base a specifiche esigenze sperimentali. L'insulina può essere aggiunta al mezzo di coltura delle cellule C2C12 per accelerare la differenziazione e la formazione di miotubi16.
La capacità di fornire plasmidi codifica shRNA o proteine ricombinanti nelle cellule C2C12 tramite trasfezione è una caratteristica interessante delle cellule C2C12. Diversi reagenti di trasfezione a base di liposomi commerciali sono stati utilizzati in precedenza per fornire DNA plasmide in cellule C2C12 con efficienze di trasfezione segnalate variabili17,18,19,20,21. PEI mostra anche una ragionevole efficienza di trasfezione ed è un'alternativa conveniente ai reagenti di trasfezione liposomati. Un confronto tra la trasfezione con un reagente commerciale di trasfezione a base di liposoma e pEI non ha mostrato alcun cambiamento considerevole nell'efficienza della trasfezione e un'efficienza leggermente superiore con PEI22. Nelle nostre mani, l'efficienza della trasfezione con PEI era sufficiente a generare celle C2C12 resistenti alla puromiccina stabili. Tuttavia, un passo critico in questo protocollo è quello di mantenere il tempo di incubazione del reagente di trasfezione breve. Come accennato in precedenza, le cellule C2C12 sono sensibili al ritiro del siero e l'esposizione prolungata a basse condizioni di siero durante la trasfezione può favorire la differenziazione cellulare C2C12. Poiché la trasfezione viene eseguita in assenza di siero, il tempo di incubazione dopo la trasfezione è stato mantenuto breve per rifornire rapidamente il mezzo contenente siero per evitare una differenziazione prematura. La formicina è stata aggiunta al mezzo di coltura 24 h dopo la trasfezione per avviare la selezione delle cellule C2C12 resistenti alla puromicina. I metodi per introdurre il DNA plasmide nei miotubi differenziati includono la trasfezione (fino all'85% di efficienza riportata), l'elettroporazione o un approccio biolistico23,24,25. In alternativa, cellule C2C12 stabili che ospitano un plasmide di shRNA inducibile potrebbero essere generate per abbattere i geni nelle fasi successive della differenziazione del miotubo o durante la maturazione del miotubo26.
Il metodo qui descritto ha provocato un knockdown stabile di ADAMTSL2 nelle cellule C2C12 in cui è ora possibile determinare la sua funzione durante la differenziazione in miotubi. La generazione di cellule knockdown stabili può essere particolarmente importante per studiare la funzione delle proteine che vengono indotte durante la formazione o la maturazione del miotubio. La trasfezione transitoria con il siRNA, per esempio, non sarebbe sufficiente per abbattere in modo efficiente questi geni, poiché l'effetto di knockdown transitorio del siRNA potrebbe svezzarsi dopo 5-7 giorni. In alternativa, l'eliminazione di una proteina ECM che utilizza CRISPR/Cas9 è tecnicamente più impegnativa e i singoli cloni devono essere selezionati e sequenziati per garantire l'eliminazione del gene desiderato. Tuttavia, la linea in evoluzione dei reagenti può rendere CRISPR/Cas9 il metodo di scelta per esperimenti di perdita di funzione in futuro.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
D.H. è sostenuto dal National Institutes of Health (Istituto nazionale per l'artrite e malattie muscolosche e malattie della pelle, NIAMS, numero di sovvenzione AR070748) e il finanziamento dei semi del Dipartimento di Ortopedia Leni & Peter W. Maggio, Icahn School of Medicine presso Monte Sinai.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Fisher Chemical | 191784 | |
| Agar | Fisher Bioreagents | BP1423 | |
| Ampicillin | Fisher Bioreagents | BP1760-5 | |
| Automated cell counter Countesse II | Invitrogen | A27977 | |
| Bradford Reagent | Thermo Scientific | P4205987 | |
| C2C12 cells | ATCC | CRL-1772 | |
| Chamber slides | Invitrogen | C10283 | |
| Chloroform | Fisher Chemical | 183172 | |
| DMEM | GIBCO | 11965-092 | |
| DMSO | Fisher Bioreagents | BP231-100 | |
| DNase I (Amplification Grade) | Invitrogen | 18068015 | |
| Fetal bovine serum | VWR | 97068-085 | |
| GAPDH | EMD Millipore | MAB374 | |
| Glycine | VWR Life Sciences | 19C2656013 | |
| Goat-anti-mouse secondary antibody (IRDYE 800CW) | Li-Cor | C90130-02 | |
| Goat-anti mouse secondary antibody (Rhodamine-red) | Jackson Immune Research | 133389 | |
| HCl | Fisher Chemical | A144S | |
| Incubator (Shaker) | Denville Scientific Corporation | 1704N205BC105 | |
| Mercaptoethanol | Amresco, VWR Life Sciences | 2707C122 | |
| Midiprep plasmid extraction kit | Qiagen | 12643 | |
| Myosin 4 (myosin heavy chain) | Invitrogen | 14-6503-82 | |
| Mounting medium | Invitrogen | 2086310 | |
| NaCl | VWR Life Sciences | 241 | |
| non-ionic surfactant/detergent | VWR Life Sciences | 18D1856500 | |
| Paraformaldehyde | MP | 199983 | |
| PBS | Fisher Bioreagents | BP399-4 | |
| PEI | Polysciences | 23966-1 | |
| Penicillin/streptomycin antibiotics | GIBCO | 15140-122 | |
| Petridishes | Corning | 353003 | |
| Polypropylene tubes | Fisherbrand | 149569C | |
| Protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 33576300 | |
| Puromycin | Fisher Scientific | BP2956100 | |
| PCR (Real Time) | Applied Biosystems | 4359284 | |
| Reaction tubes | Eppendorf | 22364111 | |
| Reverse Transcription Master Mix | Applied Biosystems | 4368814 | |
| RIPA buffer | Thermo Scientific | TK274910 | |
| sh control plasmid | Sigma-Aldrich | 07201820MN | |
| sh 3086 plasmid | Sigma-Aldrich | TRCN0000092578 | |
| sh 972 plasmid | Sigma-Aldrich | TRCN0000092579 | |
| sh 1977 plasmid | Sigma-Aldrich | TRCN0000092582 | |
| Spectrophotometer (Nanodrop) | Thermo Scientific | NanoDrop One C | |
| SYBR Green Reagent Master Mix | Applied Biosystems | 743566 | |
| Trichloroacetic acid | Acros Organics | 30145369 | |
| Trizol reagent | Ambion | 254707 | |
| Trypan blue | GIBCO | 15250-061 | |
| Tryptone | Fisher Bioreagents | BP1421 | |
| Trypsin EDTA 0.25% | Gibco-Life Technology Corporation | 2085459 | |
| Water (DEPC treated and nuclease free) | Fisher Bioreagents | 186163 | |
| Western blotting apparatus | Biorad | Mini Protean Tetra Cell | |
| Yeast extract | Fisher Bioreagents | BP1422 |
References
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