Summary
Fornecemos um protocolo para derrubar genes que codificam proteínas de matriz extracelular (ECM) em mioblastos C2C12 usando rNA de pino pequeno (sh). Visando o ADAMTSL2 como exemplo, descrevemos os métodos para a validação da eficiência de knockdown no nível mRNA, proteína e celular durante o mioblasto C2C12 à diferenciação do miotubo.
Abstract
As proteínas de matriz extracelular (ECM) são cruciais para o desenvolvimento muscular esquelético e homeostase. A derrubada estável da codificação de genes para proteínas ECM em mioblastos C2C12 pode ser aplicada para estudar o papel dessas proteínas no desenvolvimento muscular esquelético. Aqui, descrevemos um protocolo para esgotar a proteína ECM ADAMTSL2 como exemplo, usando rna de pino pequeno (sh) em células C2C12. Após a transfecção de plasmídeos shRNA, as células estáveis foram selecionadas em lote usando puromicina. Descrevemos ainda a manutenção dessas linhas celulares e a análise penópeica via expressão mRNA, expressão proteica e diferenciação C2C12. As vantagens do método são a geração relativamente rápida de células de knockdown C2C12 estáveis e a diferenciação confiável das células C2C12 em miotubos multinucleados após o esgotamento do soro no meio da cultura celular. A diferenciação das células C2C12 pode ser monitorada por microscopia de campo brilhante e medindo os níveis de expressão de genes marcadores canônicos, como MioD, miogenina ou cadeia pesada de miosina (MyHC) indicando a progressão da diferenciação do mioblasto C2C12 em miotubos. Em contraste com a derrubada transitória de genes com RNA de pequeno interferção (si), genes que são expressos mais tarde durante a diferenciação do C2C12 ou durante o amadurecimento do miotubo podem ser alvo de forma mais eficiente, gerando células C2C12 que expressam shRNA. Limitações do método são uma variabilidade nas eficiências de knockdown, dependendo da shRNA específica que pode ser superada usando estratégias de nocaute genético baseadas no CRISPR/Cas9, bem como potenciais efeitos fora do alvo do shRNA que devem ser considerados.
Introduction
As proteínas de matriz extracelular (ECM) fornecem suporte estrutural para todos os tecidos, mediam a comunicação celular-célula e determinam o destino celular. A formação e remodelação dinâmica do ECM são, portanto, fundamentais para manter a homeostase tecidual e órgão1,2. Variantes patológicas em vários genes codificando proteínas ECM dão origem a distúrbios musculoesqueléticos com fenótipos que vão desde distrofias musculares até construção pseudomouscular3,4. Por exemplo, variantes patogênicas em ADAMTSL2 causam a desordem musculoesquelética extremamente rara que a geleofísica, que apresenta com construção pseudomuscular, ou seja, um aumento aparente na massa muscular esquelética5. Juntamente com dados de expressão genética em camundongos e humanos, isso sugere um papel para ADAMTSL2 no desenvolvimento muscular esquelético ou homeostase6,7.
O protocolo que descrevemos aqui foi desenvolvido para estudar o mecanismo pelo qual o ADAMTSL2 modula o desenvolvimento muscular esquelético e/ou homeostase em um ambiente de cultura celular. Derrubamos o ADAMTSL2 na linha de células mioblastos C2C12 murina. Os mioblastos C2C12 e sua diferenciação em miotubos é um modelo de cultura celular bem descrito e amplamente utilizado para diferenciação muscular esquelética e bioengenharia muscular esquelética8,9. As células C2C12 passam por etapas distintas de diferenciação após a retirada do soro, resultando na formação de miotubos multinucleados após 3-10 dias na cultura. Essas etapas de diferenciação podem ser monitoradas de forma confiável medindo níveis de mRNA de genes marcadores distintos, como MyoD, miogenina ou cadeia pesada de miosina (MyHC). Uma vantagem de gerar knockdowns genéticos estáveis em células C2C12 é que genes que são expressos em estágios posteriores da diferenciação C2C12 podem ser direcionados de forma mais eficiente, em comparação com o knockdown transitório alcançado pelo RNA de pequeno interferência (si), que normalmente dura 5-7 dias após a transfecção, e é influenciado pela eficiência da transfecção. Uma segunda vantagem do protocolo como descrito aqui é a geração relativamente rápida de lotes de células de knockdown C2C12 usando seleção de puromicina. Alternativas, como o nocaute genético mediado crispr/cas9 ou o isolamento de precursores primários das células musculares esqueléticas de camundongos deficientes humanos ou genes-alvo são tecnicamente mais desafiadores ou requerem a disponibilidade de biópsias musculares do paciente ou camundongos deficientes de genes alvo, respectivamente. No entanto, semelhante a outras abordagens baseadas na cultura celular, há limitações no uso de células C2C12 como modelo para diferenciação de células musculares esqueléticas, como a natureza bidimensional (2D) da cultura celular configurada e a falta do microambiente in vivo que é fundamental para manter células musculares esqueléticas indiferenciadas10.
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Protocol
1. Preparando o DNA shRNA Plasmid de Escherichia coli
- Geração de colônias bacterianas clonais carregando os plasmídeos shRNA
- Obtenha estoques de glicerol de E. coli carregando plasmídeos shRNA específicos para alvos e um plasmídeo de controle de fontes comerciais (Tabela de Materiais).
NOTA: Foram utilizados três plasmídeos diferentes de shRNA, visando diferentes regiões da murina Adamtsl2 mRNA. Um shRNA foi selecionado para atingir a região 3'-untranslated (3'UTR) de Adamtsl2 para facilitar experimentos de resgate com plasmídeos de expressão codificando recombinante full-length ADAMTSL2 ou domínios de proteína ADAMTSL2 individuais. Além disso, um plasmídeo shRNA mexido foi incluído como um controle negativo. Detalhes das sequências shRNA são fornecidos na Figura 1A. - Descongele o estoque de glicerol bacteriano shRNA à temperatura ambiente (RT). Transfira 10 μL de estoque de glicerol bacteriano em uma placa de agar Luria-Bertani (LB) suplementada com 100 μg/mL ampicillin (LB-Amp).
NOTA: As placas LB-Amp são preparadas por autoclaving 1 L de lb médio (para 1 L: 10 g de triptone, 5 g de extrato de levedura, 10 g de NaCl, ajustar pH a 7.0) juntamente com 12 g de ágar. Deixe o meio esfriar até ~50 °C e adicione ampicillin (solução de estoque: 50 mg/mL em água estéril) a uma concentração final de μg/mL (LB-Amp agar). Despeje imediatamente ~20 mL de ágar LB-Amp em uma placa de Petri de 10 cm e deixe o ágar solidificar antes do uso. 1 L de agar LB-Amp é tipicamente suficiente para derramar cerca de 40 pratos petri de 10 cm. As placas de petri contendo agar LB-Amp estão estáveis por pelo menos um mês se armazenadas seladas a 4 °C no escuro. - Espalhe bactérias com espátula drygalski estéril ou qualquer outro método apropriado para alcançar colônias bacterianas únicas. Incubar placas bacterianas de cabeça para baixo durante a noite a 37 °C.
- Obtenha estoques de glicerol de E. coli carregando plasmídeos shRNA específicos para alvos e um plasmídeo de controle de fontes comerciais (Tabela de Materiais).
- Preparação plasmática
- Na manhã seguinte, remova a placa de Petri com as colônias bacterianas individuais e armazene a 4 °C para evitar o crescimento excessivo das colônias bacterianas e a formação de colônias de satélites. Selar a placa de Petri se for armazenada durante a noite ou mais.
- À tarde, adicione 5 mL de meio LB-Amp em um tubo de cultura bacteriana de polipropileno. Selecione uma única colônia bacteriana da placa de Petri cultivada durante a noite com uma ponta de pipette e inocular lb-amp meio, ejetando a ponta pipette no tubo de cultura bacteriana contendo o meio LB-Amp.
- Incubar a cultura bacteriana durante a noite em um shaker a 250 rpm a 37 °C com a tampa vagamente presa para permitir a aeração.
- Tire o tubo de cultura bacteriana na manhã seguinte e mantenha-se a 4 °C para evitar o crescimento excessivo bacteriano. À tarde, resuspenda bactérias por vórtice e transfira 1 mL da cultura bacteriana durante a noite em 50 mL de meio LB-Amp em um frasco conical de 250 mL. Incubar durante a noite em um shaker a 250 rpm a 37 °C.
- Na manhã seguinte, transfira bactérias para um tubo de centrífuga descartável de 50 mL e bactérias centrífugas a 6.000 x g na RT por 15 min. Remova o meio e continue com a etapa 1.2.6.
NOTA: Se o DNA plasmídeo não puder ser isolado imediatamente, remova o meio LB-Amp após a etapa de centrífuga e armazene a pelota de bactérias a -20 °C. - Siga as instruções para o kit de preparação plasmática (escala midi) para extrair o DNA plasmídeo da bactéria. Avalie a qualidade do DNA plasmático medindo a razão A260/A280 usando um espectrofotômetro.
NOTA: Uma proporção A260/A280 de >1.8 é desejável, indicando alta pureza da preparação do DNA plasmídeo. Uma proporção A260/A280 mais baixa sugere contaminação com proteína ou remoção insuficiente de reagentes de extração. Podem ser necessárias medidas adicionais de purificação plasmídea.
2. Culturing e Transfecção de C2C12 Células e Seleção de Puromicin
- Cultura celular C2C12
- Descongele as células C2C12 (Tabela de Materiais) rapidamente em um banho de água de 37 °C e despeje células em tubo de centrífuga descartável estéril contendo 8 mL do meio de Águia modificado de Dulbecco (DMEM) complementado com 100 unidades de penicilina e antibióticos de estreptomicina (DMEM livre de soro) em uma capa de cultura celular. Células centrífugas por 3 min a 160 x g na RT.
- Supernatant aspirado e resuspender a pelota celular em 10 mL de DMEM sem soro complementado com soro bovino 10% fetal (FBS) (DMEM completo). Transferir células para 10 cm de cultura de tecido tratados pratos plásticos tratados. Incubam células em uma incubadora umidificada a 37 °C em uma atmosfera de CO2 de 5%.
- No dia seguinte, substitua o meio por DMEM completo fresco.
- Expanda as células C2C12 de passagem baixa em pratos de 3-4 10 cm. Quando as células C2C12 atingem de 50 a 60% de confluência, aspiram as células Média e Enxágüe C2C12 com 10 mL de salino tampão de fosfato (PBS).
- Adicione 1 mL de 0,25% de trypsin-EDTA e incuba raste por 2 min no RT. Monitore o desprendimento celular um microscópio e amplie o tempo de incubação, se necessário, até que a maioria das células sejam separadas.
NOTA: Tocar cuidadosamente o prato pode ajudar a desalojar as células. - Quando a maioria das células são separadas, adicione 10 mL de DMEM completo ao prato, pipeta o volume para cima e para baixo várias vezes, e transferir suspensão celular para um tubo de centrífuga descartável estéril de 15 mL. Células centrífugas por 3 min a 160 x g no RT. Aspirar supernatant e resuspender a pelota celular em 2 mL de meio congelante (10% sulfoxide de dimetila [DMSO]/90% FBS).
- Transfira duas alíquotas de 1 mL por prato de 10 cm em crioviais. Incubar em um recipiente de congelamento de células cheio de isopropanol RT por pelo menos 24 h em um freezer de -80 °C resultando em uma taxa de congelamento de cerca de -1 °C por min para evitar a formação de cristais de gelo. Armazene células para uso a longo prazo na fase vapor de nitrogênio líquido.
NOTA: O fornecedor recomenda o uso de células C2C12 até a passagem número 15. As experiências dos autores também mostraram que as células de menor número de passagem apresentaram diferenciação mais consistente e rápida em miotubos. É essencial manter células C2C12 em baixa densidade celular (<50% confluência) para evitar o início prematuro da diferenciação. Diferenciar ou diferenciar células C2C12 não pode ser revertida para o estado original do mioblasto e deve ser descartada.
- Preparando células C2C12 para transfecção
- Células C2C12 indiferenciadas de cultura em um prato de 10 cm até atingirem 50-60% de confluência. Aspirado ao meio, enxágue células C2C12 com 10 mL de PBS, e adicione 1 mL de 0,25% de trypsin-EDTA. Incubar por 2 min na RT, monitorar o desprendimento celular um microscópio e estender o tempo de incubação, se necessário, até que a maioria das células sejam separadas.
NOTA: Tocar cuidadosamente o prato pode ajudar a desalojar as células. - Quando a maioria das células forem separadas, adicione 10 mL de DMEM completo ao prato e transfira a suspensão celular para um tubo de centrífuga descartável estéril de 15 mL. Células centrífugas por 3 min a 160 x g no RT. Aspirar supernatant e resuspender a pelota celular em 4 mL de DMEM completo.
- Combine 10 μL de suspensão celular com 10 μL de azul trypan em um tubo de reação de 1,5 mL, misture canalizando para cima e para baixo e cuidadosamente mexendo o tubo de reação e transfira as células para um slide de contagem. Determine o número/mL da célula usando um contador de celular automatizado.
- Diluir células C2C12 para 50.000 células/mL e sementes 100.000 células (2 mL) por poço em uma placa de 6 poços para alcançar cerca de 40-50% de confluência após a incubação durante a noite. Incubam células em uma incubadora umidificada a 37 °C em uma atmosfera de CO2 de 5%.
- Células C2C12 indiferenciadas de cultura em um prato de 10 cm até atingirem 50-60% de confluência. Aspirado ao meio, enxágue células C2C12 com 10 mL de PBS, e adicione 1 mL de 0,25% de trypsin-EDTA. Incubar por 2 min na RT, monitorar o desprendimento celular um microscópio e estender o tempo de incubação, se necessário, até que a maioria das células sejam separadas.
- Transfecção de células C2C12 com o plasmídeo shRNA utilizando polietilenina (PEI) e seleção de puromicina
- Preparação da solução de ações pei
- Dissolva 16 mg de PEI em 50 mL de água destilada estéril (concentração de solução de estoque: 0,32 mg/mL) em uma garrafa de 50 mL com uma tampa de parafuso. Incubar a solução a 65 °C para 1 h e vórtice a solução vigorosamente várias vezes durante o período de incubação para dissolver completamente o PEI.
- Ajuste para pH 8 adicionando 15 μL de 1N HCl por 50 mL.
ATENÇÃO: O HCl é corrosivo. O HCl concentrado deve ser manuseado o capô da fumaça. Os investigadores devem usar equipamentos de proteção pessoal apropriados. - Congele a solução PEI em -80 °C por 1 h com uma tampa frouxamente presa e descongele rapidamente a 37 °C em um banho de água para aumentar ainda mais a solubilidade. Repita o ciclo de degelo congelante 3x.
- Armazene a solução de estoque PEI em alíquotas de 0,5 mL para uso único a -20 °C.
- Transfecção de células C2C12
- Combine 25,5 μL (DNA plasmídeo de 8,5 μL/μg) da solução de estoque PEI com 100 μL de 25 mM NaCl em um tubo de reação de 1,5 mL e incubar por 5 min a 37 °C. Combine 3 μg do DNA plasmídeo com 100 μL de 25 mM NaCl e incubar por 5 min a 37 °C.
- Combine todo o volume de reagente PEI diluído com o plasmídeo diluído e misture, encando suavemente para cima e para baixo. Incubar por 25 min a 37 °C.
- Durante o tempo de incubação, altere o meio das células C2C12 destinadas à transfecção para DMEM sem FBS ou antibióticos.
- Adicione a mistura de transfecção PEI/DNA às células C2C12, queda por gota e misture constantemente movendo cuidadosamente o prato de cultura celular. Incubar em uma incubadora umidificada a 37 °C em uma atmosfera de CO2 de 5%. Depois das 6h, mude o meio para o DMEM completo.
- Seleção de puromitina
- 24 h após a transfecção, altere médio para meio de seleção (DMEM completo mais 5 μg/mL puromycin). Continue a seleção de puromicina até que sejam obtidas células C2C12 resistentes à puromicina, que normalmente leva de 10 a 14 dias.
- Expanda as células C2C12 resistentes à puromicina em baixa densidade celular (<50-60% confluência), ou seja, para manter o estado indiferenciado e criopreservação de 6-10 frascos para experimentos futuros descritos nas etapas 2.1.4-2.1.7.
NOTA: Mantenha células C2C12 resistentes à puromicina na presença de 5 μg/mL puromicina para cultura celular de rotina e expansão. No entanto, a puromicina foi omitida nos experimentos de diferenciação.
- Preparação da solução de ações pei
3. Análise phenotipica da diferenciação c2C12
NOTA: Os métodos descritos abaixo podem ser facilmente adaptados para análise penotilípica geral da diferenciação do mioblasto C2C12 em miotubos, variando os anticorpos específicos usados na mancha ocidental ou os primers específicos do gene usados na polímerase quantitativa análise de reação em cadeia (qPCR).
- Protocolo de diferenciação C2C12 e microscopia de campo brilhante
- Sementes 150.000 células/bem em uma placa de 12 poços. Células estáveis C2C12 resistentes à puromicina em uma placa de 12 poços em meio de seleção em uma incubadora umidificada a 37 °C em uma atmosfera de CO2 de 5%. Células C2C12 culturais em DMEM completo até atingirem ~95% de confluência.
- Para induzir a diferenciação das células C2C12, substitua o DMEM completo por DMEM sem soro (dia 0 de diferenciação). Mude o meio a cada dois dias e siga a formação do miotubo C2C12 usando um microscópio de campo brilhante invertido com câmera.
NOTA: Muitos protocolos usam 2% de soro de cavalo para diferenciar células C2C12 em miotubos. Nas mãos dos autores, remover o soro teve um efeito semelhante. A insulina é descrita como um aditivo ao meio de cultura celular para acelerar a diferenciação de C2C12. No entanto, no protocolo atual, as células C2C12 se diferenciavam de forma confiável em miotubos dentro de 3 a 5 dias após a privação de soro e a adição de insulina ser considerada desnecessária.
- Imunostainamento da cadeia pesada de miosina (MyHC) para visualizar miotubos
- Sementes 50.000 células C2C12 resistentes à puromicina por câmara em um deslizamento de 8 poços em 500 μL de DMEM completo. Células culturais até atingirem 95% de confluência em DMEM completo (cerca de 24 h).
- Para induzir a diferenciação, mude de DMEM completo para 500 μL de DMEM soro livre de soro (dia 0 de diferenciação). No ponto de tempo desejado, aspirar as células médias e enxágüe 3x com 0,5 mL de PBS.
NOTA: Realize todas as etapas seguintes na RT. - Fixar células com 0,2 mL de 4% paraformaldeído (PFA) diluído na PBS por 15 min. Células enxágüe com 0,5 mL de PBS 3x para 5 min cada.
ATENÇÃO: PfA é perigoso. Tome as precauções apropriadas e descarte a solução paraformaldeído como resíduos perigosos. - Apagar PFA com 0,2 mL de 0,5 M de glicina na PBS para 5 min. Células enxágüe com 0,5 mL de PBS 3x por 5 min cada.
- Células incubadas com 0,2 mL de 0,1% surfactante/detergente não iônico(Tabela de Materiais) na PBS por 10 min para permeabilizar a membrana celular. Bloqueie com 0,2 mL de 5% de albumina de soro bovino na PBS para 1h. Células enxágüe com 0,5 mL de PBS 3x por 5 min cada.
- Incubar células com 0,2 mL de anticorpo MyHC (1:200 em PBS) para 2 h. Células de enxágüe com 0,5 mL de PBS 3x para 5 min cada.
- Células incubadas com 0,2 mL de células secundárias conjugadas de cabra-anti-rato (1:200 na PBS). Enxágüe células com 0,5 mL de PBS 3x por 5 min cada.
- Após a remoção quantitativa do PBS, adicione uma gota de meio de montagem contendo 4′,6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) por câmara. Deslizamento de cobertura e cura meio de montagem de acordo com as instruções do fabricante. Selar com esmalte.
- Observe as células C2C12 usando um microscópio de fluorescência usando o conjunto de filtro apropriado.
- Avaliando a eficiência do knockdown por reação quantitativa da cadeia de polimerase em tempo real (qRT-PCR)
- Células C2C12 de cultura em condições de diferenciação em 12 placas de poço, conforme descrito na seção 3.1.
- No ponto de tempo desejado,remova o meio de diferenciação, enxague as células uma vez com 1 mL de PBS e adicione 0,5 mL de reagente de extração de RNA(Tabela de Materiais) por poço. Lise as células, canalizando cuidadosamente para cima e para baixo e transfira o lysato celular para um tubo de reação estéril de 1,5 mL. Isole o RNA seguindo cuidadosamente o protocolo do fabricante.
ATENÇÃO: O reagente de extração de RNA contém fenol. Deve ser usado um capô de fumaça. Recolher os resíduos de reagente de extração de RNA e descartar como resíduos perigosos. Os investigadores devem usar equipamentos de proteção pessoal apropriados. - Dissolva a pelota rna final em 20 μL de pirocarbonato diethyl (DEPC)-tratada. Determine a quantidade e a qualidade da preparação do RNA usando um espectrômetro e determine a razãoA 260/A280 como medida de qualidade.
NOTA: Um rendimento típico de 1 poço de uma placa de 12 poços é de 5-7 μg de RNA total com uma razão A260/A280 de 1,8-2. - Para digerir DNA genômico copurificado residual, diluir 1 μg de RNA em um volume total de 8 μL de água tratada com DEPC em um tubo PCR. Adicione 1 μL de tampão de reação de 10x e 1 μL de DNase I (1 unidade/μL)(Tabela de Materiais)e incubar por 15 min na RT. Adicionar 1 μL de solução de parada (25 mM EDTA) e incubar a 70 °C por 10 min.
- Para gerar cDNA, misture 10 μL de RNA tratado de DNase com 10 μL de mistura master de transcrição reversa de 2x, contendo a transcrição reversa, primers aleatórios, mistura de dNTP de 4 mM (1 mM cada de dATP, dTTP, dGTP e dCTP), e buffer de reação transcritose reversa. Incubar a reação em um termociclo usando o programa conforme recomendado pelo fabricante. Diluir cDNA com água em uma proporção de 1:5.
- Para preparar a reação qRT-PCR, misture 5 μL do mix mestre qPCR verde SYBR com 0,5 μL de primers dianteiros e reversos específicos de genes (estoque: 10 μM), respectivamente, e 2 μL de água tratada com DEPC por reação. Pipette qPCR reação em um poço de uma placa qRT-PCR de 96 poços e adicionar 2 μL de cDNA diluído. Configure três réplicas técnicas para cada replicação biológica e inclua um gene de limpeza como Gapdh ou Hprt1.
- Amplificar o produto PCR com um termociclo qRT-PCR utilizando o seguinte programa: 50 °C para 2 min (uracil-DNA glicosilase [UDG]), 95 °C para 2 min (ativação de polimererase de DNA dual-lock), 40 ciclos de 95 °C para 15 s, 60 °C para 30 s e 72 °C para 1 min.
- Quantifique os resultados qRT-PCR usando o método DDCt normalizando para um gene de limpeza, como Gapdh ou Hprt1.
- Avaliando a eficiência do knockdown por manchas ocidentais
- Sementes 300.000 células C2C12 resistentes à puromicina por poço em uma placa de 6 poços para análise de manchas ocidentais. Após 24 h, mude o DMEM médio para soro livre de soro para iniciar a diferenciação (dia 0 de diferenciação).
- No ponto de tempo desejado, colete dois 1 mL de meio condicionado sem soro em um tubo de reação de 1,5 mL e centrífuga por 5 min a 500 x g no RT para remover células separadas e detritos celulares.
NOTA: Este passo só é necessário se forem investigadas proteínas ECM ou outras proteínas secretadas em meio sedide. Se a proteína de interesse for localizada no citoplasma ou estiver vinculada à membrana, aspirar o meio de cultura celular e prosseguir com as etapas de lise celular (3.4.7-3,4,12). A lise celular deve ser realizada paralelamente à precipitação proteica do meio condicionado sem soro para minimizar a degradação proteolítica e outras consequências não intencionais do armazenamento prolongado da camada celular. - Após a centrífuga, transfira 1 mL de meio condicionado em um novo tubo de reação de 1,5 mL e precipitar proteínas adicionando 0,391 mL de uma mistura de ácido tricotoáceo (TCA) e surfactante/detergente não iônico. Brevemente vórtice a mistura e incubar por 10 min no gelo.
NOTA: Prepare a mistura de precipitação proteica diretamente antes do uso combinando 0,252 mL de 55% TCA e 0,139 mL de 1% surfactante/detergente não iônico por mL de médio e vórtice condicionado brevemente. A solução se torna turva.
ATENÇÃO: O TCA é corrosivo e deve ser tratado adequadamente. - Pelotas as proteínas precipitadas em >16.000 x g por 10 min a 4 °C. Descarte o supernatante.
ATENÇÃO: O supernatante contém TCA e deve ser coletado separadamente e descartado como material perigoso. - Lave a pelota de proteína 3x com acetona gelada e centrífuga cada vez em >16.000 x g por 10 min a 4 °C.
- Seque o ar da pelota de proteína por 3-4 min na RT e dissolva-se em 50 μL de 1x sódio do sulfato de poliacrilamida eletroforreise gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) tampão amostral (50 mM Tris pH 6.8, 2% SDS, glicerol de 6% e 0,004% bromophenol azul, complementado com 5 β% mercaptoetanol). Ferva a amostra de 5 min a 95 °C e use para manchas ocidentais para detectar a proteína-alvo desejada usando procedimentos padrão.
ATENÇÃO: o β-Mercaptoetanol é odoroso e tóxico e deve ser manuseado em um capô de fumaça. - Para proteínas intracelulares e ligadas à membrana, enxágue a camada celular uma vez com 2 mL de PBS.
- Adicione 1 mL de PBS e desalojando células raspando-as do poço usando um raspador de celular. Colete células em um tubo de reação de 1,5 mL e centrífuga em 3.420 x g por 3 min a 4 °C. Lave a pelota de célula 3x com 1 mL de PBS e centrífuga a 3.420 x g por 3 min a 4 °C cada vez.
- Para seder as células, resuspender a pelota celular em 0,2 mL de tampão de lise (20 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM Na2EDTA, 1 mM EGTA, 1% NP40, 1% dedesoxilárica de sódio, 2,5 mM pirofosfato de sódio, 1 mM β-glicêfosphate e 1 mM ortovanadate de sódio) complementado com 1x edta inibidor inibidor de protease reagente e incubato por 30 min no gelo.
- Ultrassônico para 15 s no gelo com uma configuração de saída de potência de 10 em uma frequência operacional de 23 kHz.
- Remova os detritos das células por centrífuga em 13.680 x g por 20 min a 4 °C. Colete supernatant em um novo tubo de reação de 1,5 mL e determine a concentração de proteínausando um ensaio comercial de Bradford ou qualquer outro método adequado.
- Para cada amostra, misture 100 μg de proteína com 5x sds-PAGE tampão de amostra em um volume total de 60 μL e ferva por 5 min a 95 °C. Analisar amostras por procedimentos padrão de coagulação ocidental para a presença da proteína-alvo desejada.
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Representative Results
A seleção de C2C12 resistente à puromicina pode ser alcançada em 10-14 dias após a transfecção devido à eliminação eficiente de células não resistentes, ou seja, não transfecdas(Figura 1B). Normalmente, mais de 80% das células se desprendem da cultura celular e essas células são removidas durante a manutenção de células rotineiras. As células C2C12 resistentes à puromicina expressando o controle (mexido) shRNA mantêm a morfologia celular alongada em forma de eixo e alongada em baixa densidade celular e a capacidade de diferenciar em miotubos. A diferenciação c2C12 sobre a retirada do soro pode ser monitorada por microscopia de campo brilhante e por imunocoloração para a cadeia pesada do marcador de miotubo (MyHC) (Figura 2). Miotubos myHC positivos são observados entre 3 a 5 dias após a iniciação da diferenciação. Os miotubos são multinucleados, como mostrado pela presença de mais de um núcleo POSITIVO da DAPI dentro dos limites celulares positivos do MyHC. Figura 3A mostra imagens de campo brilhante de células C2C12 estáveis cultivadas em DMEM completo. A eficiência de knockdown aqui apresentada varia de 40 a 60%(Figura 3B). Como o mRNA foi colhido no estado proliferativo onde o pequeno Adamtsl2 é expresso, a eficiência do knockdown parece baixa, mas espera-se que a eficiência do knockdown seja maior em pontos de tempo posteriores durante a diferenciação do C2C12, onde o endogeno Adamtsl2 é induzido e, portanto, expresso em níveis muito mais altos. A análise da mancha ocidental confirmou o sucesso do knockdown de ADAMTSL2 no lysato celular obtido a partir de células C2C12 expressando shRNA 3086 em comparação com o controle shRNA (Figura 3C).
Figura 1: Seleção de células C2C12 estáveis após transfecção com DNA plasmídeo de codificação shRNA. (A) Tabela mostrando a região alvo (CDS, sequência de codificação; 3'-UTR, 3'-região não traduzida), ID clone (a partir de agora referido como 1977, 3086 e 972), e sequência dos shRNAs usados para atingir Adamtsl2. (B) Os painéis mostram a seleção de células C2C12 transfecdas com o controle shRNA e as três shRNAs alvo de Adamtsl2. As células C2C12 foram transfecdas com os plasmídeos shRNA e a puromicina foi adicionada ao meio após 24 h. Células sensíveis à puromicina aparecem redondas e eventualmente se desprendem durante a manutenção da cultura celular de rotina (setas vermelhas). Em contraste, as células resistentes à puromicina que abrigam os plasmídeos integrados de shRNA parecem em forma de fuso, ligeiramente alongadas, anexadas e viáveis (setas azuis). Barras de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 2: Mioblasto C2C12 para diferenciação do miotubo. Imagens de campo brilhantes de células C2C12 diferenciadas mostram a aparência desnsa das células no início da diferenciação (dia 0-1) e miotubos multinucleados foram observadas após o dia 5 (linha superior). A imunocoloração de células C2C12 diferenciadas com corrente pesada de miosina (MyHC, vermelho), que é um marcador para miotubos, é induzida no 3º dia de diferenciação (painel médio). Os núcleos foram manchados com dapi e a imagem mesclada é mostrada nos painéis inferiores. Barras de escala = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 3: Validação de knockdown estável em células C2C12 proliferadas. (A)Imagens de campo brilhante de células C2C12 estáveis cultivadas em DMEM completo. Barras de escala = 300 μm.(B) análise qRT-PCR da expressão Adamtsl2 mRNA em células C2C12 estáveis. Os valores da tomografia foram normalizados para o gene de limpeza Hprt1. mRNA foi colhido antes do início da diferenciação. Barras de erro representam desvio padrão. (C) Análise de manchas ocidentais mostrando a proteína ADAMTSL2 reduzida na fração de lysato celular/ECM de células C2C12 expressando shRNA 3086. AdamTSL2 endógeno foi detectado usando um anticorpo de peptídeo policlonal feito medida (disponível mediante solicitação). Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
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Discussion
Descrevemos aqui um protocolo para o knockdown estável das proteínas ECM em mioblastos C2C12 e para análise fenotipico da diferenciação dos mioblastos C2C12 em miotubos. Vários fatores determinam o resultado do experimento e precisam ser considerados com cuidado. Manter células C2C12 na fase proliferante é um passo fundamental para manter as células C2C12 no estado precursor do mioblasto. Manter a capacidade das células C2C12 de diferenciar consistentemente em miotubos depende i) do número de passagem das células, ii) a densidade das células cultivadas durante a manutenção de rotina, e iii) disponibilidade de nutrientes, exigindo reposição frequente e regular da cultura celular média11,12,13. Devido a alguns mecanismos desconhecidos, as células C2C12 de passagem mais alta também perdem o potencial para mais fusão de mioblast obsoblasto11. As instruções do provedor das células C2C12 sugerem manter essas células até a passagem número 15. Depois disso, o potencial de diferenciação pode ser reduzido e experimentos com tais células podem resultar em formação de miotubo menos consistente. Por outro lado, a densidade celular durante a manutenção pode resultar em efeitos semelhantes9. Alcançar densidades celulares C2C12 durante a cultura celular de rotina promove o início da diferenciação do mioblasto C2C12 e, portanto, pode influenciar negativamente o potencial de diferenciação da população celular. Portanto, é de fundamental importância evitar que as células C2C12 atinjam altas densidades celulares durante a manutenção de células C2C12 de rotina. Isso pode ser alcançado já sub-culturing células C2C12 em baixas densidades celulares (<50-60% confluência). A fome soro é usada para induzir a diferenciação celular C2C12 em miotubos. Portanto, manter as células por tempos mais longos sem reabastecer os níveis médios de nutrientes e soro. Reabastecer com soro fresco contendo meio a cada dois dias pode evitar o início da diferenciação prematura indesejada devido à privação de nutrientes e soro.
A diferenciação c2C12 é tipicamente induzida pela fome de soro. O percentual de soro usado para induzir a diferenciação c2C12 pode influenciar muito os resultados, especificamente o tempo necessário para formar miotubos positivos MyHC14,15. Vários protocolos mostram indução bem sucedida de diferenciação várias concentrações de soro. O uso de 2-10% fbs ou soro de cavalo e privação completa de soro foi relatado e todas as condições resultam na formação do miotubo C2C12. A porcentagem de soro ou mudança no lote do soro pode alterar significativamente marcadores para diferenciação. Além disso, a origem do soro pode afetar o desfecho experimental, pois o país de origem pode ou não permitir certos aditivos durante a produção de soro bovino8. O nível do soro poderia ser ajustado para alcançar a taxa de diferenciação de acordo com requisitos experimentais específicos. A insulina pode ser adicionada ao meio cultural das células C2C12 para acelerar a diferenciação e a formação do miotubo16.
A capacidade de fornecer plasmídeos codificando shRNA ou proteínas recombinantes em células C2C12 via transfecção é uma característica atraente das células C2C12. Vários reagentes comerciais baseados em transfecção à base de liposome foram usados anteriormente para fornecer DNA plasmídeo em células C2C12 com eficiências de transfecção relatadas variáveis17,18,19,20,21. O PEI também mostra eficiência de transfecção razoável e é uma alternativa econômica aos reagentes de transfecção baseados em liposome. Uma comparação entre transfecção com um reagente comercial à base de transfecção à base de liposomos e PEI não mostrou nenhuma mudança considerável na eficiência da transfecção e eficiência ligeiramente maior foi encontrada com PEI22. Em nossas mãos, a eficiência transfecção com PEI foi suficiente para gerar células C2C12 resistentes à puromicina estável. No entanto, um passo crítico neste protocolo é manter o tempo de incubação do reagente transfection curto. Como mencionado acima, as células C2C12 são sensíveis à retirada de soro e a exposição prolongada a baixas condições sorodurante a transfecção pode favorecer a diferenciação celular C2C12. Como a transfecção é realizada na ausência de soro, o tempo de incubação após a transfecção foi mantido curto para reabastecer rapidamente o meio contendo soro para evitar diferenciação prematura. A puromicina foi adicionada à cultura média 24 h após a transfecção para iniciar a seleção de células C2C12 resistentes à puromicina. Os métodos para introduzir o DNA plasmídeo em miotubos diferenciados incluem transfecção (até 85% de eficiência relatada), eletroporação ou uma abordagem biolística23,24,25. Alternativamente, células C2C12 estáveis que abrigam um plasmídeo shRNA indutovel poderiam ser geradas para derrubar genes em estágios posteriores de diferenciação do miotubo ou durante o amadurecimento do miotubo26.
O método descrito aqui resultou em knockdown estável de ADAMTSL2 em células C2C12 onde sua função durante a diferenciação em miotubos agora pode ser determinada. A geração de células de knockdown estáveis pode ser especialmente importante para estudar a função das proteínas que são induzidas durante a formação ou maturação do miotubo. Transfecção transitória com siRNA, por exemplo, não seria suficiente para derrubar eficientemente esses genes, uma vez que o efeito de knockdown transitório do siRNA pode desmemcar depois de 5-7 dias. Alternativamente, o nocaute de uma proteína ECM usando CRISPR/Cas9 é tecnicamente mais desafiador e clones individuais precisam ser selecionados e sequenciados para garantir o nocaute do gene desejado. No entanto, a linha em evolução dos reagentes pode tornar o CRISPR/Cas9 o método de escolha para experimentos de perda de função no futuro.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
D.H. é apoiado pelo Instituto Nacional de Saúde (Instituto Nacional de Artrite e Doenças Musculoesqueléticas e da Pele, NIAMS, número de subvenção AR070748) e financiamento de sementes do Departamento de Ortopedia de Leni & Peter W. May, Icahn School of Medicine em Mt. Sinai.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Fisher Chemical | 191784 | |
| Agar | Fisher Bioreagents | BP1423 | |
| Ampicillin | Fisher Bioreagents | BP1760-5 | |
| Automated cell counter Countesse II | Invitrogen | A27977 | |
| Bradford Reagent | Thermo Scientific | P4205987 | |
| C2C12 cells | ATCC | CRL-1772 | |
| Chamber slides | Invitrogen | C10283 | |
| Chloroform | Fisher Chemical | 183172 | |
| DMEM | GIBCO | 11965-092 | |
| DMSO | Fisher Bioreagents | BP231-100 | |
| DNase I (Amplification Grade) | Invitrogen | 18068015 | |
| Fetal bovine serum | VWR | 97068-085 | |
| GAPDH | EMD Millipore | MAB374 | |
| Glycine | VWR Life Sciences | 19C2656013 | |
| Goat-anti-mouse secondary antibody (IRDYE 800CW) | Li-Cor | C90130-02 | |
| Goat-anti mouse secondary antibody (Rhodamine-red) | Jackson Immune Research | 133389 | |
| HCl | Fisher Chemical | A144S | |
| Incubator (Shaker) | Denville Scientific Corporation | 1704N205BC105 | |
| Mercaptoethanol | Amresco, VWR Life Sciences | 2707C122 | |
| Midiprep plasmid extraction kit | Qiagen | 12643 | |
| Myosin 4 (myosin heavy chain) | Invitrogen | 14-6503-82 | |
| Mounting medium | Invitrogen | 2086310 | |
| NaCl | VWR Life Sciences | 241 | |
| non-ionic surfactant/detergent | VWR Life Sciences | 18D1856500 | |
| Paraformaldehyde | MP | 199983 | |
| PBS | Fisher Bioreagents | BP399-4 | |
| PEI | Polysciences | 23966-1 | |
| Penicillin/streptomycin antibiotics | GIBCO | 15140-122 | |
| Petridishes | Corning | 353003 | |
| Polypropylene tubes | Fisherbrand | 149569C | |
| Protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 33576300 | |
| Puromycin | Fisher Scientific | BP2956100 | |
| PCR (Real Time) | Applied Biosystems | 4359284 | |
| Reaction tubes | Eppendorf | 22364111 | |
| Reverse Transcription Master Mix | Applied Biosystems | 4368814 | |
| RIPA buffer | Thermo Scientific | TK274910 | |
| sh control plasmid | Sigma-Aldrich | 07201820MN | |
| sh 3086 plasmid | Sigma-Aldrich | TRCN0000092578 | |
| sh 972 plasmid | Sigma-Aldrich | TRCN0000092579 | |
| sh 1977 plasmid | Sigma-Aldrich | TRCN0000092582 | |
| Spectrophotometer (Nanodrop) | Thermo Scientific | NanoDrop One C | |
| SYBR Green Reagent Master Mix | Applied Biosystems | 743566 | |
| Trichloroacetic acid | Acros Organics | 30145369 | |
| Trizol reagent | Ambion | 254707 | |
| Trypan blue | GIBCO | 15250-061 | |
| Tryptone | Fisher Bioreagents | BP1421 | |
| Trypsin EDTA 0.25% | Gibco-Life Technology Corporation | 2085459 | |
| Water (DEPC treated and nuclease free) | Fisher Bioreagents | 186163 | |
| Western blotting apparatus | Biorad | Mini Protean Tetra Cell | |
| Yeast extract | Fisher Bioreagents | BP1422 |
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