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Chemistry

उपन्यास प्राकृतिक उत्पादों को उजागर करने के लिए एक उपकरण के रूप में मास स्पेक्ट्रोमेट्री-गाइडेड जीनोम माइनिंग

Published: March 12, 2020 doi: 10.3791/60825
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Organic Chemistry, Institute of Chemistry, University of Campinas (UNICAMP), 2Center for Natural and Human Sciences, Federal University of ABC (UFABC)

Summary

एक बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री निर्देशित जीनोम खनन प्रोटोकॉल की स्थापना की और यहां वर्णित है । यह जीनोम अनुक्रम सूचना और एलसी-एमएस/एमएस विश्लेषण पर आधारित है और इसका उद्देश्य जटिल माइक्रोबियल और पौधों के अर्क से अणुओं की पहचान को सुगम बनाना है ।

Abstract

प्राकृतिक उत्पादों द्वारा कवर रासायनिक अंतरिक्ष अपार और व्यापक रूप से अपरिचित है । इसलिए, प्रकृति और संभावित मानव लाभों (जैसे, दवा खोज अनुप्रयोगों के लिए) में उनके कार्यों का व्यापक मूल्यांकन करने के लिए सुविधाजनक तरीके वांछित हैं। यह प्रोटोकॉल जीनोम खनन (जीएम) और आणविक नेटवर्किंग (एमएन) के संयोजन का वर्णन करता है, दो समकालीन दृष्टिकोण जो कच्चे मेटाबोलिक अर्क से रासायनिक संरचना हस्ताक्षरों के साथ पूरे जीनोम अनुक्रमण में जीन क्लस्टर-एन्कोडेड एनोटेशन से मेल खाते हैं। नई प्राकृतिक संस्थाओं की खोज की दिशा में यह पहला कदम है। इन अवधारणाओं, जब एक साथ लागू किया, एमएस निर्देशित जीनोम खनन के रूप में यहां परिभाषित कर रहे हैं । इस विधि में, मुख्य घटकों को पहले से नामित किया जाता है (एमएन का उपयोग करना), और संरचनात्मक रूप से संबंधित नए उम्मीदवार जीनोम अनुक्रम एनोटेशन (जीएम का उपयोग करके) से जुड़े होते हैं। जीएम और एमएन का संयोजन पहले से ज्ञात यौगिकों से एनालॉग की पहचान करने के लिए नए अणु बैकबोन या फसल मेटाबोलिक प्रोफाइल को लक्षित करने के लिए एक लाभदायक रणनीति है।

Introduction

माध्यमिक चयापचय की जांच में अक्सर विशिष्ट जैविक गतिविधियों के लिए कच्चे तेल के अर्क की स्क्रीनिंग शामिल होती है जिसके बाद सक्रिय अंशों से संबंधित घटकों की शुद्धि, पहचान और लक्षण वर्णन होता है। यह प्रक्रिया कुशल साबित हुई है, जिससे कई रासायनिक संस्थाओं के अलगाव को बढ़ावा मिल रहा है । हालांकि, आजकल इसे मुख्य रूप से पुनर्खोज की उच्च दरों के कारण अव्यवहार्य के रूप में देखा जाता है। चूंकि दवा उद्योग ने विशेष चयापचय की भूमिकाओं और कार्यों के ज्ञान के बिना क्रांति ला दी, इसलिए उनकी पहचान प्रयोगशाला की स्थितियों के तहत की गई थी जो प्रकृति1का सही प्रतिनिधित्व नहीं करती थी। आज, प्राकृतिक सिग्नलिंग प्रभावों, स्राव और अज्ञेय रूप से कम सांद्रता पर अधिकांश लक्ष्यों की उपस्थिति की बेहतर समझ है। इसके अतिरिक्त, इस प्रक्रिया के नियमन से अकादमिक समुदाय और दवा उद्योग को इस ज्ञान का लाभ उठाने में मदद मिलेगी । यह साइलेंट बायोसिंथेटिक जीन क्लस्टर (बीजीएस)2से संबंधित मेटाबोलाइट्स के सीधे अलगाव से जुड़े शोध को भी लाभ ान्वित करेगा ।

इस संदर्भ में, जीनोमिक अनुक्रमण में प्रगति ने सूक्ष्मजीव मेटाबोलाइट्स की स्क्रीनिंग में नए सिरे से रुचि ली है। इसका कारण यह है कि खुला बायोसिंथेटिक समूहों की जीनोमिक जानकारी का विश्लेषण जीन एन्कोडिंग उपन्यास यौगिकों को प्रकट कर सकता है जो प्रयोगशाला की स्थितियों के तहत नहीं मनाया या उत्पादित नहीं किया जाता है। कई माइक्रोबियल पूरे जीनोम परियोजनाएं या ड्राफ्ट आज उपलब्ध हैं, और यह संख्या हर साल बढ़ रही है, जीनोम खनन3,,4के माध्यम से उपन्यास जैव सक्रिय अणुओं को उजागर करने के लिए बड़े पैमाने पर संभावनाएं प्रदान करती हैं।

बायोसिंथेटिक जीन क्लस्टर के एटलस संयुक्त जीनोम संस्थान (JGI IMG-एबीसी)2के एकीकृत माइक्रोबियल जीनोम मंच के एक घटक के रूप में स्वचालित रूप से मिकेन जीन समूहों का वर्तमान सबसे बड़ा संग्रह है । हाल ही में, बायोसिंथेटिक जीन क्लस्टर्स (एमआईबीआईजी) मानकीकरण पहल के लिए न्यूनतम जानकारी ने बीजीएस के मैनुअल पुनर्निर्धारण को बढ़ावा दिया है, जो एक अत्यधिक क्यूरेटेड संदर्भ डेटासेट5प्रदान करता है। आजकल, आनुवंशिक डेटा के कम्प्यूटेशनल खनन और ज्ञात माध्यमिक मेटाबोलाइट्स के लिए उनके कनेक्शन को सक्षम करने के लिए बहुत सारे उपकरण उपलब्ध हैं। नए बायोएक्टिव प्राकृतिक उत्पादों (यानी, विषमलोगस अभिव्यक्ति, लक्ष्य जीन विलोपन, इन विट्रो पुनर्गठन, जीनोमिक अनुक्रम, आइसोटोप-गाइडेड स्क्रीनिंग [जेनोमिसोटोिक दृष्टिकोण], स्थानीय और वैश्विक नियामकों में हेरफेर, प्रतिरोध लक्ष्य आधारित खनन, संस्कृति स्वतंत्र खनन, और हाल ही में, एमएस-गाइडेड/कोड दृष्टिकोण2,,6,,7,,88,9, 9,, 10,11,12,13,14,15.

एक विलक्षण रणनीति के रूप में जीनोम खनन अणुओं के एक या छोटे समूह को एनोटेट करने के प्रयासों की आवश्यकता है; इस प्रकार, इस प्रक्रिया में अंतराल रहते हैं जिसमें अलगाव और संरचना व्याख्या के लिए नए यौगिकों को प्राथमिकता दी जाती है । सिद्धांत रूप में, ये दृष्टिकोण प्रति प्रयोग केवल एक बायोसिंथेटिक मार्ग को लक्षित करते हैं, जिसके परिणामस्वरूप धीमी खोज दर होती है। इस अर्थ में, आणविक नेटवर्किंग दृष्टिकोण के साथ जीएम का उपयोग करना प्राकृतिक उत्पाद अनुसंधान14,,15के लिए एक महत्वपूर्ण अग्रिम का प्रतिनिधित्व करता है।

तरल क्रोमेटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस) की बहुमुखी प्रतिभा, सटीकता और उच्च संवेदनशीलता इसे यौगिक पहचान के लिए एक अच्छी विधि बनाती है। वर्तमान में, कई प्लेटफार्मों ने अलक्षित मेतापोलोमिक्स,16,17,18,,19,,20के लिए एल्गोरिदम और सॉफ्टवेयर सूट का निवेश किया है।, इन कार्यक्रमों के मूल में फीचर डिटेक्शन (पीक पिकिंग)21 और पीक अलाइनमेंट शामिल हैं, जो नमूनों के एक बैच में समान सुविधाओं के मिलान और पैटर्न की खोज की अनुमति देता है। एमएस पैटर्न आधारित एल्गोरिदम22,,23 विशेषता विखंडन पैटर्न की तुलना और मिलान एमएस2 समानताएं आणविक परिवारों संरचनात्मक सुविधाओं को साझा करने पैदा । इन विशेषताओं को तब हाइलाइट और क्लस्टर किया जा सकता है, जो,एमएस2,,24,25के साथ मिलकर एक जटिल जैविक उद्धरण से ज्ञात और अज्ञात अणुओं को तेजी से खोजने की क्षमता प्रदान करता है। इसलिए, एक साथ बड़ी मात्रा में डेटा में निहित कई कीमोटाइप की संरचनात्मक जानकारी हासिल करने के लिए मिलकर एमएस एक बहुमुखी तरीका है।

ग्लोबल नेचुरल प्रोडक्ट्स सोशल मॉलिक्यूलर नेटवर्किंग (जीएनपीएस)26 एल्गोरिदम बहुआयामी वैक्टर के निर्माण के लिए सामान्यीकृत टुकड़ा आयनों तीव्रता का उपयोग करता है, जिसमें समानताएं एक कोसाइन फ़ंक्शन का उपयोग करके तुलना की जाती हैं। विभिन्न माता-पिता आयनों के बीच संबंध को आरेख प्रतिनिधित्व में प्लॉट किया जाता है, जिसमें प्रत्येक विखंडन को नोड (सर्कल) के रूप में कल्पना की जाती है, और प्रत्येक नोड की संबंधितता को किनारे (लाइनों) द्वारा परिभाषित किया जाता है। एक ही स्रोत से अणुओं के वैश्विक दृश्य को आणविक नेटवर्क के रूप में परिभाषित किया गया है। संरचनात्मक रूप से अलग अणु जो विशिष्ट रूप से टुकड़े करते हैं, वे अपने विशिष्ट क्लस्टर या नक्षत्र का निर्माण करेंगे, जबकि संबंधित अणु एक साथ क्लस्टर करते हैं। क्लस्टरिंग कीमोटाइप्स अपने बायोसिंथेटिक मूल के समान संरचनात्मक सुविधाओं के काल्पनिक कनेक्शन की अनुमति देता है।

बीजीएस और उनके छोटे अणु उत्पादों27के बीच बायोइंफॉर्मेटिक्स लिंक बनाते समय कीमोटाइप-टू-जीनोटाइप और जीनोटाइप-टू-कीमोटाइप दृष्टिकोण दोनों का संयोजन शक्तिशाली होता है। इसलिए, एमएस निर्देशित जीनोम खनन एक तेजी से विधि और कम सामग्री लेने वाली रणनीति है, और यह विविध मेटाबोलिक और पर्यावरणीय स्थितियों के तहत एक या अधिक उपभेदों के डब्ल्यूजीएस द्वारा प्रकट माता-पिता आयनों और बायोसिंथेटिक रास्तों को पाटने में मदद करता है।

इस प्रोटोकॉल के कार्यप्रवाहमेंडब्ल्यूजीएस डेटा को बायोसिंथेटिक जीन क्लस्टर एनोटेशन प्लेटफॉर्म जैसे एंटीस्मैश28,29,,30में खिलाना होता है । यह जीनोम द्वारा एन्कोड यौगिकों और यौगिकों के वर्ग की विविधता का अनुमान लगाने में मदद करता है। ब्याज की रासायनिक इकाई को एन्कोडिंग करने वाले बायोसिंथेटिक जीन क्लस्टर को लक्षित करने की रणनीति अपनाई जानी चाहिए, और बीजीसी युक्त जंगली प्रकार के तनाव और/या विषमलोगस तनाव से संस्कृति अर्क का विश्लेषण जीएनपीएस26,,31का उपयोग करसमानताओं के आधार पर संकुल आयनों को उत्पन्न करने के लिए किया जा सकता है । नतीजतन, लक्षित बीजीसी के साथ संबद्ध नए अणुओं की पहचान करना संभव है और डेटाबेस में अनुपलब्ध हैं (मुख्य रूप से अज्ञात एनालॉग, कभी-कभी कम टिटर में उत्पादित)। यह विचार करना प्रासंगिक है कि उपयोगकर्ता इन प्लेटफार्मों में योगदान कर सकते हैं और बायोइन्फॉर्मेटिक्स और एमएस/एमएस डेटा की उपलब्धता तेजी से बढ़ रही है, जो अणुओं के साथ जटिल अर्क के कुशल कनेक्शन का मार्गदर्शन करने के लिए प्रभावी कम्प्यूटेशनल टूल और एल्गोरिदम के निरंतर विकास और उन्नयन के लिए ड्राइविंग कर रही है ।

Figure 1
चित्रा 1: पूरे कार्यप्रवाह का अवलोकन। दिखाया गया है कि नए मेटाबोलाइट्स की पहचान करने के लिए वर्णित एमएस-गाइडेड जीनोम खनन दृष्टिकोण में शामिल बायोइंफॉर्मेटिक, क्लोनिंग और आणविक नेटवर्किंग चरणों का एक उदाहरण है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

यह प्रोटोकॉल प्राकृतिक उत्पाद खोज पाइपलाइन के लिए प्रारंभिक बिंदु के रूप में जीनोम खनन और आणविक नेटवर्किंग को संयोजित करने के लिए एक त्वरित और कुशल कार्यप्रवाह का वर्णन करता है। यद्यपि कई अनुप्रयोग एक नेटवर्क में एमएस-डिटेक्बल अणुओं की संरचना और संबंधितता की कल्पना करने में सक्षम हैं, संरचनात्मक रूप से समान संकुल अणुओं की कल्पना करने के लिए कई को यहां अपनाया जाता है। इस रणनीति का उपयोग करते हुए, स्ट्रेप्टोमाइस एसपी सीबीएमएआई 2042 के मेटाबोलिक अर्क में देखे गए उपन्यास साइक्लोडिपेप्टाइड उत्पादों की सफलतापूर्वक पहचान की जाती है। जीनोम खनन द्वारा निर्देशित, वैलिनोमाइसिन के लिए पूरे बायोसिंथेटिक जीन क्लस्टर एन्कोडिंग को मान्यता दी जाती है और उत्पादक तनाव स्ट्रेप्टोमाइसेस कोएलिकलर M1146 में क्लोन किया जाता है। अंत में, एमएस पैटर्न आधारित आणविक नेटवर्किंग के बाद, एमएस द्वारा पाए गए अणु ओं को उनके बायोजेनेसिस32के लिए जिम्मेदार बीजीसीएस के साथ सहसंबद्ध किया जाता है।

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Protocol

1. बायोसिंथेटिक जीन समूहों के लिए जीनोम खनन

  1. एमएस निर्देशित जीनोम खनन के लिए बायोसिंथेटिक जीन क्लस्टर (बीसीजी) का चुनाव करने के पहले कदम के रूप में पूरे जीनोम अनुक्रमण (डब्ल्यूजीएस) का प्रदर्शन करें। उच्च गुणवत्ता वाले जीनोमिक डीएनए के साथ निम्नलिखित का उपयोग करके इलुमिना मिसेक तकनीक द्वारा ब्याज (बैक्टीरिया) के पूरे जीनोम मसौदे को प्राप्त किया जा सकता है: शॉटगन ट्रूसेक पीसीआर-फ्री लाइब्रेरी प्रेप और नेक्स्टेरा मेट जोड़ी लाइब्रेरी तैयारी किट33।
    नोट: अनुक्रमण के बाद, इलुमिना शॉटगन लाइब्रेरी और इलुमिना मेट जोड़ी लाइब्रेरी को न्यूबलर v3.0 (रोशे, का उपयोग करके इकट्ठा किया जा सकता है, ४५४) असेंबलर कार्यक्रम () पर पाया जाता है और FgeneSB पर आधारित एक पाइपलाइन का उपयोग करए ।"; http://www.softberry.com/berry.phtml?topic=fgenesb_annotator& group=help & सबग्रुप=पाइपलाइन और gt;), जैसा कि पहले३३वर्णित है । माइक्रोबायोलॉजी रिसोर्स घोषणाएं (एमआरए) एक उपलब्ध भंडार में जमा किसी भी माइक्रोबायोलॉजिकल संसाधन की उपलब्धता प्रकाशित लेखों के साथ एक पूरी तरह से खुली पहुंच पत्रिका है () पर पाया जाता है। उम्मीदवार प्रोटीन-कोडिंग जीन की पहचान RAST सर्वर एनोटेशन३४का उपयोग करके की जाती है, और पूरे जीनोम शॉटगन (WGS) परियोजना DDBJ/ENA/GenBank () और गोल्ड (
  2. एक पूर्ण अनुक्रमित जीनोम से माध्यमिक मेटाबोलिज्म जीन समूहों एनोटेशन के बारे में सिलिको जानकारी प्राप्त करने के लिए, अनुक्रम फ़ाइल (GenBank/EMBL या FASTA प्रारूप) एक एंटीस्मैश मंच पर जमा करें () ।
  3. सबसे समान ज्ञात क्लस्टर के आधार पर आउटपुट डेटा(चित्रा 2)से ब्याज के जीन क्लस्टर का चयन करें।
    नोट: सबसे पहले, जीन-दर-जीन का पता लगाना और व्यक्तिगत खोजों (ब्लास्टप) का मूल्यांकन करना नियमित है ताकि यह मूल्यांकन किया जा सके कि कौन से कार्य वांछित बायोसिंथेटिक जीन समूहों से जुड़े हैं। यह प्रक्रिया यह निर्धारित करने में भी मदद कर सकती है कि कौन सा बीजीसी वांछित यौगिक के उत्पादन से जुड़ा हुआ है, भले ही यह कम प्रतिशत हो। एक एंटीस्मैश भविष्यवाणी प्रतिशत कवरेज बनाने के लिए एक क्लस्टर के भीतर सभी जीन पर विचार करती है, जो उद्देश्य बीजीसी के लिए समानता के वैश्विक कम प्रतिशत का प्रतिनिधित्व कर सकती है। हालांकि, जीन-बाय-जीन का विश्लेषण करते समय, सबसे समान ज्ञात क्लस्टर का उपयोग करके अधिक सटीक जानकारी प्राप्त करना संभव है। दूसरा, एंटीस्मैश में खोज को परिष्कृत करने के लिए दो विकल्प हैं: 1) पता लगाने की सख्ती: सख्ती की डिग्री जिसके लिए बायोसिंथेटिक जीन क्लस्टर को हिट माना जाना चाहिए। इस विकल्प के लिए, उपयोगकर्ता को निम्नलिखित मापदंडों का उपयोग करना चाहिए: ए) सख्त: सभी आवश्यक क्षेत्रों वाले विशेष रूप से अच्छी तरह से परिभाषित समूहों का पता लगाता है, आनुवंशिक जानकारी के बारे में त्रुटियों के लिए अतिसंवेदनशील; ख) आराम से: एक या एक से अधिक कार्यात्मक क्षेत्र है, जो भी सख्त सुविधा का पता लगाने के लिए काम करता है लापता आंशिक समूहों का पता लगाता है; या ग) ढीला: खराब परिभाषित समूहों और समूहों का पता लगाता है जो प्राथमिक मेटाबोलाइट्स से मेल खाने की संभावना रखते हैं, जो झूठे सकारात्मक या खराब परिभाषित बीजीसी की उपस्थिति का कारण बन सकते हैं। अन्य विकल्प 2) अतिरिक्त विशेषताएं हैं: प्लेटफ़ॉर्म को किस प्रकार की जानकारी खोजनी चाहिए और आउटपुट में दिखाना चाहिए। सामान्य तौर पर, ये दो विकल्प भविष्यवाणी के बाद समय बचा सकते हैं। हालांकि, एंटीस्मैश जॉब के लिए लंबी टाइम पीरियड की जरूरत होती है ।

Figure 2
चित्रा 2: एंटीस्मैश प्लेटफॉर्म से आउटपुट। पूरे जीनोम अनुक्रम एनोटेशन से सिलिको विश्लेषण में माध्यमिक चयापचय। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

  1. बीजीसी के डीएनए अनुक्रम की जानकारी के आधार पर, ईएसएसी(ई.कोलाई/स्ट्रेप्टोमाइसिस कृत्रिम गुणसूत्र) पुस्तकालय स्क्रीनिंग के लिए जीन क्लस्टर को डिजाइन प्राइमर (20-25 एनटी)फ्लैंकिंग किया गया है ।
    नोट: डीएनए से पूरे बायोसिंथेटिक जीन क्लस्टर को पकड़ने के लिए35,,36 विभिन्न तरीकों का उपयोग किया जा सकता है। यहां, उपयोग की गई विधि एक प्रतिनिधि ईएसएसी लाइब्रेरी37,, स्ट्रेप्टोमाइसेस एसपी सीबीएमएआई 2042 से38 का निर्माण करती है जिसमें ~ 95 केबी के औसत आकार के टुकड़ों वाले क्लोन होते हैं।

2. ईएसएसी लाइब्रेरी से पूरे बायोसिंथेटिक जीन क्लस्टर की हेटेरोलोगस अभिव्यक्ति

  1. ईएसएसी वेक्टर को ई कोलाई DH10B से ई. कोलाई ET12567 को ट्राइपैरेंटल कॉन्जुरेशन32से ले जाएं।
    1. इनोक्यूलेट ई. कोलाई ET12567 (CamR), TOPO10/pR9604 (CarbR), DH10B/ESAC4H (AprR) लुरिया के 5 mL में-Bertani (LB) क्लोरम्फेनिकोल (25 μg/mL), कार्बेनिसिलिन (१०० μg/mL), और apramyininin (5g/ml) ।
    2. संस्कृति को रातोंरात 37 डिग्री सेल्सियस और 250 आरपीएम पर इनक्यूबेट करें।
    3. पौंड माध्यम के 10 mL में रातोंरात संस्कृति के ५०० μL टीका एंटीबायोटिक दवाओं की एक आधा एकाग्रता युक्त ।
    4. 0.4-0.6 के एक600 तक पहुंचने तक 37 डिग्री सेल्सियस और 250 आरपीएम पर संस्कृति को इनक्यूबेट करें।
    5. 5 मिन के लिए 2,200 x ग्राम पर केंद्रीकरण द्वारा कोशिकाओं को काटें।
    6. कोशिकाओं को दो बार एलबी मीडियम के 20 एमएएल से धोएं।
    7. एलबी माध्यम के 500 माइक्रोन में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
    8. माइक्रोसेंटरिफ्यूज ट्यूब में प्रत्येक तनाव के 20 μL मिश्रण और पौंड माध्यम एंटीबायोटिक दवाओं की कमी के साथ एक आगर प्लेट में ड्रिप ।
    9. प्लेटों को रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    10. एक ताजा पौंड आगर एंटीबायोटिक दवाओं युक्त प्लेट पर बढ़ी कोशिकाओं लकीर और ३७ डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात इनक्यूबेट ।

3. स्ट्रेप्टोमाइसेस/ई.कोलाई conjugation

  1. पुनः संयोजन विषमलोगोस जीव प्राप्त करने के लिए, ई. कोलाई ET12567 के बीच conjugation32 प्रदर्शन ईईएसएसी वेक्टर, हेल्पर प्लाज्मिड pR9604, और स्ट्रेप्टोमाइसेस कोएलिकलर M11146 या किसी अन्य चयनित मेजबान तनाव39शामिल हैं।
  2. दिन 1: टीएसबीवाई माध्यम के 25 मिलील में एस कोएलिकलर M1146 की अलग-थलग कॉलोनियों को 30 डिग्री सेल्सियस और 48 घंटे के लिए 200 आरपीएम पर आईनॉक्स-स्प्रिंग के साथ लगे 250 मिलीएल एर्लेनमेयर फ्लास्क में टीका लगाया गया।
  3. दिन 2/3: इनोक्यूलेट ET12567/ESAC/pR9604 एलबी मीडियम के 5 mL में क्लोरम्फेनिकोल (25 μg/mL), कार्बेनिसिलिन (100 g/mL), और एप्रामाइसिन (50 μg/mL) रातोंरात 37 डिग्री सेल्सियस और 250 आरपीएम पर।
  4. दिन 3/4: 2TY के 10 mL में रातोंरात संस्कृति के ५०० μL टीका (एक ५० मिलीआर शंकु ट्यूब में) एंटीबायोटिक दवाओं के आधे काम सांद्रता युक्त । 0.4-0.6 के600 तक पहुंचने तक 37 डिग्री सेल्सियस और 250 आरपीएम पर इनक्यूबेट।
  5. 10 मिन के लिए २२०० x ग्राम पर संस्कृतियों (ET12567/ESAC/pR9604 और M1146) अपकेंद्रित्र ।
  6. 2TY मध्यम के 20 mL में छर्रों 2x धोने और 2TY के 500 μL में फिर से निलंबित।
  7. अलीकोट एस कोएलिकलर M1146 निलंबन के 200 μL और 2TY (निलंबन ए) के 500 μL में पतला।
  8. अलीकोट 200 माइक्रोन ऑफ सस्पेंशन ए और 2TY (निलंबन बी) के 500 माइक्रोन एल में पतला।
  9. अलीकोट 200 माइक्रोन ऑफ सस्पेंशन बी और तनु के 500 माइक्रोन में 2TY (निलंबन सी)।
  10. ALIquot २०० μL ET12567/ESAC/pR9604 निलंबन और निलंबन सी के २०० μL के साथ मिश्रण ।
  11. एक एसएफएम आगर प्लेट पर संयोजन मिश्रण के 150 μL एंटीबायोटिक दवाओं की कमी प्लेट।
  12. 16 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
  13. एंटीबायोटिक समाधान के 1 mL के साथ कवर प्लेटें (प्लाज्मिड प्रतिरोध के अनुसार)। सूखने के बाद 4-7 दिनों तक 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    नोट: यहां, 1.0 मिलीग्राम/mL thiostrepton और 0.5 मिलीग्राम/mL nalidixic एसिड युक्त एक समाधान तैयार किया गया था।
  14. SFM आगर प्लेटों पर लकीर ख्यात उत्तेजक thiostrepton (५० मिलीग्राम/mL) और nalidixic एसिड (25 मिलीग्राम/mL) युक्त । 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
  15. एक SFM आगर पर लकीर exconjugants केवल nalidixic एसिड युक्त ।
  16. इस बात की पुष्टि करने के लिए अलग-थलग कॉलोनियों के साथ पीसीआर विश्लेषण करें कि पूरे जीन क्लस्टर को एस कोएलिकलर M1146 होस्ट में स्थानांतरित कर दिया गया है।

4. तनाव की खेती

  1. मेटाबोलिक प्रोफाइल प्राप्त करने के लिए, उचित किण्वन मीडिया में और उचित संस्कृति की स्थिति के तहत तनाव की पूर्व संस्कृति के 1/100 का टीका लगाते हैं ।
  2. 10 मिन के लिए 2200 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र संस्कृतियों।
  3. ब्याज के चक्रवृद्धि की कक्षा के अनुसार निष्कर्षणकरें 40.

5. बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रा प्राप्त करना और जीएनपीएस विश्लेषण की तैयारी

  1. एमएस/एमएस डेटा प्राप्त करने के लिए, नियंत्रण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर के उपयुक्त एचपीएलसी और बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री विधियों कार्यक्रम । उच्च और निम्न संकल्प डेटा-निर्भर मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण (डीडीए) दोनों का विश्लेषण किया जा सकता है।
    नोट: आम तौर पर, जटिल कच्चे तेल निकालने के नमूनों का 1 मिलीग्राम/mL समाधान आदर्श है । कम जटिल अर्क के लिए कमजोर पड़ने की जरूरत होती है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि एमएस/एमएस नेटवर्किंग दी गई जन स्पेक्ट्रोमेट्रिक स्थितियों के तहत पता लगाने योग्य आणविक नेटवर्क है ।
  2. प्रोटेओविजार्ड (एंड एलटी; http://proteowizard.sourceforge.net/>) से एमएसकन्वर्ट का उपयोग करके बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रा को .mzXML प्रारूप में परिवर्तित करें। रूपांतरण के लिए इनपुट पैरामीटर चित्र3में सचित्र हैं । लगभग सभी कंपनियों के सॉफ्टवेयर से डेटा संगत कर रहे हैं।

Figure 3
चित्रा 3: एमएस फाइलों को एमजेडएक्सएमएल एक्सटेंशन में बदलने के लिए एमएसकन्वर्ट का उपयोग करना। जीएनपीएस विश्लेषण के लिए सही पैरामीटर प्रदर्शित किया जाता है। निर्देश इस प्रकार हैं: बॉक्स 1 में सभी एमएस फ़ाइलों को जोड़ें और बॉक्स 2 में फ़िल्टर पीक पिकिंग जोड़ें; इस फिल्टर के लिए, एल्गोरिदम विक्रेता का उपयोग करें; प्रेस शुरू और रूपांतरण की प्रक्रियाओं का पालन करेंगे। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

  1. परिवर्तित एलसी-एमएस/एमएस फाइलों को जीएनपीएस डाटाबेस में अपलोड करें। दो विकल्प उपलब्ध हैं: फ़ाइल हस्तांतरण प्रोटोकॉल (एफटीपी) का उपयोग करना या सीधे ऑनलाइन प्लेटफ़ॉर्म के माध्यम से ब्राउज़र में।
    नोट: जीएनपीएस को डेटा इंस्टॉल और ट्रांसफर करने के बारे में विस्तृत जानकारी पर उपलब्ध है ।

6. जीएनपीएस विश्लेषण

  1. जीएनपीएस में खाता बनाने के बाद (पर पाया जाता है), बनाए गए खाते में लॉग इन करें मॉलिक्यूलर नेटवर्क बनाएं। एक नौकरी शीर्षक जोड़ें।
  2. बुनियादी विकल्प: आणविक नेटवर्क करने के लिए एमजेडएक्सएमएल फ़ाइलों का चयन करें। वे छह समूहों के लिए आयोजित किया जा सकता है । वास्तविक दिनचर्या(चित्रा 4)के लिए पुस्तकालयों का चयन करें ।
    नोट: ये समूह आणविक नेटवर्क निर्माण में हस्तक्षेप नहीं करते हैं। इस जानकारी का उपयोग केवल ग्राफिकल प्रतिनिधित्व के लिए किया जाएगा।

Figure 4
चित्रा 4: आणविक नेटवर्क विश्लेषण करने के लिए ऑनलाइन जीएनपीएस प्लेटफॉर्म का उपयोग करना। एमजेडएक्सएमएल फाइल्स का चयन बॉक्स 1 में क्लिक करके किया जाता है। ओपन डायलॉग बॉक्स में, फ़ाइलों को व्यक्तिगत फ़ोल्डर (बॉक्स 2) से चुना जा सकता है या ड्रैग-एंड-ड्रॉप फ़ाइल अपलोडर (20 एमबी से कम) का उपयोग करके दूसरे टैब में अपलोड किया जा सकता है। फाइलों को छह समूहों में बांटा जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

  1. क्रमशः 0.02 डीए और 0.05 डीए के अग्रदूत आयन जन सहिष्णुता और खंड आयन जन सहिष्णुता का चयन करें।
    नोट: जीएनपीएस में विभिन्न प्रकार की सख्ती 1 के आधार पर उपलब्ध है) एमएस/एमएस डेटा कितना सही है और 2) एसोसिएशन कितना सही होना चाहिए । बुनियादी विकल्प: इस फ़ोल्डर में, अग्रदूत आयन मास सहिष्णुता और खंड आयन मास सहिष्णुतासेट करना संभव है। इन मापदंडों का उपयोग एक गाइड के रूप में किया जाता है ताकि यह निर्धारित किया जा सके कि अग्रदूत आयन और टुकड़ा आयन कितना सटीक होना चाहिए। चयनित जन सहनशीलता का उपयोग किए जाने वाले द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमीटर के संकल्प और सटीकता पर निर्भर करती है।
  2. उन्नत नेटवर्क विकल्प: चित्रा 5के अनुसार मापदंडों का चयन करें। ये पैरामीटर सीधे नेटवर्क क्लस्टर आकार और रूप को प्रभावित करते हैं। शेष टैब अनुभाग में एक और पैरामीटर उन्नत उपयोगकर्ताओं के लिए हैं; इस प्रकार, डिफ़ॉल्ट मूल्यों को छोड़ दें।
    नोट: उन्नत मापदंडों को जीएनपीएस प्रलेखन में पढ़ा जा सकता है () पर पाया जाता है।

Figure 5
चित्रा 5: आणविक नेटवर्क विश्लेषण (उन्नत विकल्प) करने के लिए जीएनपीएस का उपयोग करना। मिन जोड़ी कॉस सीधे समूहों के आकार को प्रभावित करेगा, क्योंकि उच्च मूल्यों के परिणामस्वरूप दूर से संबंधित यौगिकों के संयोजन में बारीकी से संबंधित यौगिकों और कम मूल्यों का संयोजन होगा। बहुत कम मूल्यों का उपयोग करने से बचना चाहिए। न्यूनतम मिलान टुकड़ा आयन नेटवर्क में जुड़े होने के लिए दो विखंडन स्पेक्ट्रा के बीच साझा टुकड़ों की संख्या का प्रतिनिधित्व करते हैं। साथ में, दोनों पैरामीटर नेटवर्क प्रारूप का मार्गदर्शन करते हैं; निचले मूल्य अधिक दूर से संबंधित यौगिकों और इसके विपरीत क्लस्टर होंगे । उचित मूल्यों का उपयोग करने से यौगिक व्याख्या में काफी मदद मिलेगी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

  1. काम होने पर अलर्ट प्राप्त करने के लिए ई-मेल पता चुनें, और काम सबमिट करें।

7. जीएनपीएस परिणामों का विश्लेषण

  1. जीएनपीएस में लॉग इन करें। नौकरी का चयन करें और काम खोलने के लिए किया गया प्रकाशित नौकरी और gt; । एक वेबपेज चित्र 6में सचित्र के रूप में खुल जाएगा । आणविक नेटवर्किंग से प्राप्त सभी परिणाम प्रदर्शित किए जाएंगे।
  2. सभी नेटवर्क क्लस्टर (रेड बॉक्स, चित्र6)देखने के लिए देखें स्पेक्ट्रल परिवार (ब्राउज़र नेटवर्क विज़ुअलाइजर में) का चयन करें।

Figure 6
चित्रा 6: आणविक नेटवर्क परिणामों की कल्पना करने के लिए जीएनपीएस का उपयोग करना। सभी संबंधित यौगिक समूहों को स्पेक्ट्रल परिवारों (रेड बॉक्स) को ध्यान में रखते हुए देखा जा सकता है। केवल लाइब्रेरी हिट की कल्पना करने के लिए, "सभी लाइब्रेरी हिट देखें" (ब्लू बॉक्स) का चयन किया जाना चाहिए। आणविक नेटवर्क परिणामों के बेहतर चित्रमय प्रतिनिधित्व के लिए, "डायरेक्ट साइटोस्केप पूर्वावलोकन" (पीला बॉक्स) डाउनलोड किया जाना चाहिए, और साइटोस्केप के नवीनतम संस्करण का उपयोग किया जाना चाहिए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

  1. सभी जनित आणविक नेटवर्किंग समूहों के साथ एक सूची प्रदर्शित की जाएगी। यदि निष्कर्षों को उत्पन्न करने के लिए पुस्तकालय खोज का चयन किया गया था, तो अनंतिम अणुओं की पहचान एलीडी में प्रदर्शित की जाएगी। उन्हें कल्पना करने के लिए शो का चयन करें।
    नोट: डेटा विश्लेषण अन्य परिणामों (यानी, जीनोम खनन, जैविक परख, पुस्तकालय वास्तविक अणुओं, आदि) के लिए संचालित किया जा सकता है।
  2. आणविक नेटवर्क क्लस्टर का विश्लेषण करने के लिए, विजुअलाइज नेटवर्कका चयन करें।
    नोट: प्रत्येक क्लस्टर क्रमशः नोड्स (सर्कल) और किनारों से बना होता है, जो क्रमशः अणुओं और आणविक समानता का प्रतिनिधित्व करता है। डिनकलकिए गए अणुओं को ऑनलाइन ब्राउज़र नेटवर्क विज़ुअलाइजर में नीले नोड के रूप में हाइलाइट किया जाएगा ।
  3. नोड लेबल बॉक्स में, माता-पिता द्रव्यमान (रेड बॉक्स, चित्रा 7)का चयन करें।
  4. एज लेबल बॉक्स में, क्रमशः नोड्स (येलो बॉक्स, चित्रा 7)के बीच नोड समानता या बड़े पैमाने पर अंतर का निरीक्षण करने के लिए कोसिन या डेल्टाएमजेड का चयन करें।
  5. मल्टीग्रुप विश्लेषण के मामले में, हर समूह (ब्लू बॉक्स, फिगर 7)में प्रत्येक नोड दिखाई देने वाली आवृत्ति का निरीक्षण करने के लिए नोड रंग बॉक्स में ड्रा पाई पर क्लिक करें।
    नोट: अन्य विकल्प संभव हैं, लेकिन ऊपर सुझाए गए लोग क्लस्टर नोड्स को एनोटेट करने और उनकी संरचनाओं को उजागर करने के लिए इष्टतम हैं।

Figure 7
चित्रा 7: आणविक क्लस्टर परिणामों की कल्पना करने के लिए जीएनपीएस का उपयोग करना। बेहतर डेटा विज़ुअलाइज़ेशन के लिए आणविक समूहखोलने के बाद, निम्नलिखित को चुना जाना चाहिए: नोड लेबल (लाल बॉक्स) के रूप में "माता-पिता द्रव्यमान" ; एज लेबल (पीला बॉक्स) के रूप में "डेल्टाएमजेड" ; और नोड रंग (ब्लू बॉक्स) के रूप में "पाई ड्रा" । आणविक क्लस्टर के माध्यम से नेविगेट करें और सभी नोड्स को एनोटेट करने का प्रयास करें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

  1. सभी लाइब्रेरी हिट देखने के लिए, सभी लाइब्रेरी हिट (ब्लू बॉक्स, चित्रा 7)देखें चुनें।
    नोट: इसके अलावा, MNW "प्रत्यक्ष साइटोस्केप पूर्वावलोकन/डाउनलोड" (पीला बॉक्स, चित्रा 7)में डाउनलोड किया जा सकता है, और फ़ाइल को साइटोस्केप प्लेटफॉर्म (ग्राफिकल संरचना में अधिक विकल्पों के लिए और अधिक विकल्पों के लिए और अधिक एलटी;https://cytoscape.org/>) में खोला जा सकता है ।
  2. संबंधित यौगिकों के विरूपित यौगिकों और संरचना व्याख्या की मैन्युअल पुष्टि की आवश्यकता है। विखंडन स्पेक्ट्रा को सीधे जीएनपीएस प्लेटफॉर्म में या मूल कच्ची फाइलों में खोलें।

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Representative Results

प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक जीनोम खनन, विषमलोगोस अभिव्यक्ति के संयोजन का उपयोग कर उदाहरण दिया गया था, और एमएस निर्देशित/कोड दृष्टिकोण नए विशेष valinomycin अनुरूप अणुओं का उपयोग करने के लिए । लक्ष्य के लिए जीनोम-टू-अणु कार्यप्रवाह, वैलिनोमाइसिन (वीएलएम), चित्रा 8में दर्शाया गया है। स्ट्रेप्टोमाइसेस एसपी सीबीएमएआई 2042 ड्राफ्ट जीनोम का विश्लेषण सिलिको में किया गया था, और वीएलएम जीन क्लस्टर को तब पहचाना गया और एक विषमलोगोस होस्ट को स्थानांतरित कर दिया गया। हेटेरोलोगस और जंगली प्रकार के उपभेदों की खेती उचित किण्वन स्थितियों का उपयोग करके त्रिमूर्ति में की जाती थी, जो एथिल एसीटेट के साथ विभाजित होती थी, और कच्चे तेल निकालने के लिए केंद्रित होती थी। उत्पाद से, एमएस/एमएस डेटा आणविक नेटवर्किंग के लिए एक मिलकर एमएस मेटाबोलाइट प्रोफ़ाइल उत्पन्न करने के लिए अधिग्रहीत किया गया था । चित्रा 9 स्ट्रेप्टोमाइसेस एसपी सीबीएमएआई 2042 क्रूड एक्सट्रैक्ट से एमएस/एमएस डेटा से प्राप्त संकुल आयनों का प्रतिनिधित्व करता है, जिसमें विशेषता विखंडन पैटर्न और इसी एमएस समानताएं एक आणविक परिवार की संरचनात्मक विशेषताओं को साझा करने की घटना का सुझाव देती हैं2। ज्ञात बायोसिंथेटिक तर्क और बायोइन्फॉर्मेटिक्स अंतर्दृष्टि के बाद, और पैटर्न आधारित एमएस/एमएस स्पेक्ट्रा द्वारा समर्थित, मूल रूप से रिपोर्ट किए गए चार साइक्लोडिप्सिपेप्टाइड्स की संरचना स्पष्ट थी, और उनके मूल वीएलएम असेंबली32के लिए जिम्मेदार एक ही बायोसिंथेटिक जीन समूहों के साथ सहसंबद्ध थे।

आणविक नेटवर्किंग डेटा () में संसाधित किया गया था और एक बड़े पैमाने पर भंडार (MSV000083709) में जमा किया गया था । जवाब ी के लिए, दो रणनीतियों को पहले वर्णित यौगिकों के साथ नेटवर्क आबाद करने के लिए चुना गया: 1) Deप्रतिकृति () और 2) एक पेप्टाइड प्राकृतिक उत्पाद पहचान उपकरण जिसे वरक्वेस्ट नामक (हमारे पिछले प्रकाशन में पाया गया है, अधिक जानकारी32प्रदान करता है।

Figure 8
चित्रा 8: सिलिको जीनोम अनुक्रम विश्लेषण में से एमएस डेटा अधिग्रहण के लिए वर्कफ्लो। (क) स्ट्रेप्टोमाइसेस एसपी सीबीएमएआई 2042 जीनोम से एक मसौदा इलुमिना मिसेक अनुक्रमण द्वारा प्राप्त किया जाता है। (ख)वैलिनोमाइसिन बीजीसी पहचान और एनोटेशन । (ग)पूरे जीन क्लस्टर को एक उपयुक्त मेजबान में स्थानांतरित करने के बाद, तनाव की खेती की जाती है । संस्कृति से एथिल एसीटेट निकालने का विश्लेषण एलसी द्वारा उत्पादित माध्यमिक मेटाबोलाइट्स का प्रोफाइल प्राप्त करने के लिए किया जाता है। क्रोमेटोग्राम से पता चलता है कि एक हेटेरोलोगस होस्ट में वीएलएम बीजीसी अभिव्यक्ति द्वारा वैलिनोमाइसिन, मोंटानास्टेटिन और पांच एनालॉग्स का उत्पादन किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 9
चित्रा 9: आणविक नेटवर्किंग परिणाम । (A) स्ट्रेप्टोमाइसेस एसपी सीबीएमएआई 2042 एक्सट्रैक्ट से मॉलिक्यूलर नेटवर्किंग। कैल्िनोमाइसिन के अनुरूप आणविक नेटवर्किंग आयन, स्ट्रेप्टोमाइसेस एसपी सीबीएमएआई 2042 जीनोम में एनोटेट किए गए इसी बीजीसी के साथ एक पहले से ही ज्ञात यौगिक, सबसे पहले वीएलएम बीजीसी के लिए वर्णित एनालॉग से संबंधित आयनों से संबंधित आयनों से संकुल हैं। (ख)वैलिनोमाइसिन और संबंधित एनालॉग के लिए एमएस स्पेक्ट्रा और रासायनिक संरचनाएं दिखाई जाती हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल का सबसे मजबूत लाभ नए अणुओं, विशेष रूप से संरचनात्मक एनालॉग2की संरचनाओं को स्पष्ट करने के लिए एमएस डेटा के साथ मेटाबोलिक प्रोफाइल और पुल जीनोमिक जानकारी को तेजी से डिक्रिनेट करने की क्षमता है। जीनोमिक जानकारी के आधार पर, विभिन्न प्राकृतिक उत्पादों कीमोटाइप की जांच की जा सकती है, जैसे पॉलीकेटाइड्स (पीके), नॉनरिबोसोमल पेप्टाइड्स (एनआरपी), और ग्लाइकोसिटेड प्राकृतिक उत्पाद (जीएनपी), साथ ही गुप्त बीजीएसी। मेटापोलोमिक स्क्रीनिंग प्रयोगशाला की स्थितियों के तहत एक विशिष्ट तनाव द्वारा उत्पादित सक्रिय बीजीसी प्रोफाइल और रासायनिक विविधता के सबूत पैदा करती है। इस प्रकार, एक बीजीसी को आणविक नेटवर्किंग द्वारा खोजी गई समानताओं द्वारा सुगम पहले से ही ज्ञात बीजीसी से संबंधित एक नए यौगिक या अज्ञात एनालॉग के प्रत्यक्ष उत्पादन के लिए क्लोन किया जा सकता है। इसलिए, यह प्रक्रिया प्राकृतिक स्रोतों द्वारा उत्पादित मूल्यवान यौगिकों को अलग करने में मदद करती है और भविष्य के अलगाव के कदमों के लिए एक गाइड के रूप में उपयोग किया जा सकता है, जो प्राकृतिक उत्पाद पाइपलाइनों में आम हैं।

एमएस निर्देशित जीनोम खनन सबसे पहले पेप्टिडोगनोमिक्स41 और ग्लाइकोजेनोमिक्स42के क्षेत्रों में वर्णित किया गया था। पेप्टाइड प्राकृतिक उत्पाद रासायनिक विविधता की सीमा का अनुमान लगाने के लिए, डोरेस्टीन और सहयोगियों ने व्यक्त प्राकृतिक उत्पादों (कीमोटाइप) और उनके जीन समूहों (जीनोटाइप) के बीच संबंध की कल्पना करने के लिए एमएस और जीनोमिक्स का उपयोग करके एक स्वचालित विधि विकसित की। पेप्टाइड विशेष मेटाबोलाइट्स का उपयोग करते समय एमएस-गाइडेड जीनोम खनन की अवधारणा का वर्णन किया गया था। यहां, एक जीएम दृष्टिकोण और मिलकर एमएस का उपयोग कर माइक्रोबियल ग्लाइकोसिलेटेड प्राकृतिक उत्पादों (जीएनपी) की पहचान के लिए एक विधि को चीनी पैरों के निशान के बाद उनके इसी बायोसिंथेटिक जीनोटाइप के साथ जीएनपी कीमोटाइप (माइक्रोबियल मेटाबोलोम्स से) को तेजी से जोड़ने के लिए उपकरण के रूप में लागू किया गया था।

पेप्टिडोग्नोमिक्स की अवधारणा को स्ट्रेप्टोमाइसेस रोसोस्पोरसमें स्टेनोथेरिकिन जीन समूहों को प्रकट करने के लिए लागू किया गया है, जो जीएनपीएस की व्यापक उपयोगिता को एक मंच43के रूप में प्रदान करता है । पैटर्न आधारित जीनोम खनन और आणविक नेटवर्किंग को अंततः नए यौगिकों, ज्ञात यौगिकों, नए एनालॉग का पता लगाने और 35 सेलिनिसपोरा उपभेदों की संरचना व्याख्या के रूप में सुविधाजनक बनाने के लिए जीएनपीएस प्लेटफॉर्म26 के साथ जोड़ा गया था। इसके कारण रिटिमिसिन ए का अलगाव और लक्षण वर्णन हुआ, जो एक क्विनोमाइसिन-प्रकार के डिप्सिपेप्टाइड44था। जीएनपीएस की शुरुआत के बाद, एकीकृत मेटापोलोमिक्स और जीनोम खनन दृष्टिकोण आणविक नेटवर्क को बायोसिंथेटिक क्षमताओं,45,,46,47,,48,49,50से जोड़ने के लिए सबसे बहुमुखी अवसर बन गए हैं।,

यह प्रोटोकॉल सामग्री के निम्न स्तर का उपभोग करते समय कुछ कदमों में ज्ञात और अज्ञात रासायनिक अनुरूप यौगिकों के उत्पादन की जांच करने के लिए जीनोमिक और मेटापोलोमिक विश्लेषणों का उपयोग करने की व्यवहार्यता को पुष्ट करता है। यहां प्रस्तुत मॉडल आणविक नेटवर्किंग derespondcation के माध्यम से कच्चे अर्क से valinomycin एनालॉग पहचान से संबंधित है । एनालॉग की संरचना एमएस/एमएस विखंडन द्वारा कम की जाती है और क्लोन वीएलएम बीजीएस के बायोसिंथेटिक तर्क का अनुसरण करती है ।

खनन माध्यमिक मेटाबोलाइट बायोसिंथेटिक जीन क्लस्टर51 और मेटाबोलाइट व्याख्या के लिए विभिन्न सॉफ्टवेयर उपलब्ध हैं, लेकिन लगातार अपडेट के कारण ओपन सोर्स विकल्पों के फायदे हैं, और वे वैज्ञानिक समुदाय के लिए खुले हैं। इस अर्थ में, एंटीस्मैश और जीएनपीएस प्लेटफॉर्म सबसे लोकप्रिय विकल्प हैं।

इस सामान्य प्रक्रिया का पता लगाया प्राकृतिक स्रोत के आधार पर अन्य निष्कर्षण पद्धतियों के लिए संशोधित किया जा सकता है। निष्कर्षण की एक से अधिक विधि को मेटाबोलाइट गुणों (यानी ध्रुवता, हाइड्रोफोबीसिटी, मिसेल बनाने की क्षमता) के अनुसार भी जोड़ा जा सकता है, और यहां तक कि समान गुण, विभिन्न सॉल्वैंट्स या राल में वृद्धि के परिणाम प्राप्त कर सकते हैं। आमतौर पर, तरल मध्यम खेती से अर्क तैयार किए जाते हैं, लेकिन समृद्ध अर्क को अलग करने और ब्याज के किसी भी जैविक नमूने को स्क्रीन करने के लिए निष्कर्षण विधियों की अधिकता उपलब्ध होती है।

एमएस डेटा प्राप्त करते समय, डेटा निर्भर अधिग्रहण (डीडीए) विश्लेषण का उपयोग किया जाना चाहिए। यह मुद्दा महत्वपूर्ण है जब एक ही इंजेक्शन में बड़ी संख्या में यौगिकों का मूल्यांकन किया जा रहा है । डीडीए का प्रदर्शन करते समय प्रत्येक अग्रदूत आयन के एमएस/एमएस स्पेक्ट्रा की अधिकतम संख्या और विभिन्न अग्रदूत आयन की अधिकतम संख्या की भरपाई की जानी चाहिए । तेजी से स्कैन दर उपकरणों का उपयोग करते समय, इसे उच्च स्कैन दरों (~ 6-10 एमएस/एमएस स्कैन प्रति चक्र) के साथ प्राप्त किया जा सकता है। हालांकि, कम स्कैन दर उपकरणों में, एमएन प्रदर्शन केवल बेहतर क्रोमेटोग्राफिक रिज़ॉल्यूशन के साथ बढ़ाया जा सकता है। आणविक नेटवर्किंग को आबाद करने के लिए सबसे व्यापक डेटा प्राप्त किया जाना चाहिए। एमएस डेटा अधिग्रहण के लिए, निश्चित टकराव ऊर्जा संभव है, लेकिन रैंप ऊर्जा बेहतर परिणाम देने के लिए उपयुक्त हैं। कोई इष्टतम स्थितियां नहीं हैं जो पूरी तरह से सभी नमूनों के लिए काम करेंगी। पर्याप्त एमएस विश्लेषण प्राप्त करना निम्नलिखित चरणों के लिए महत्वपूर्ण है। अब से, आणविक नेटवर्क समूहों को प्रक्रिया के अनुसार उत्पन्न और डिबाराया जाना चाहिए।

एक लगातार समस्या निवारण त्रुटि जनता के लिए तीव्रता याद आ रही है । आम तौर पर, यह विश्लेषण के दौरान उच्च टकराव ऊर्जा शुरू करने से हल किया जा सकता है । कभी-कभी, स्पेक्ट्रा और जीएनपीएस लाइब्रेरी के बीच कोई सहसंबंध नहीं देखा जाता है, जो बहुत असामान्य है। इस मामले में, सुनिश्चित करें कि फ़ोल्डर प्रीविज़ुअलाइजेशन एमएस सॉफ्टवेयर में ठीक से खुलता है क्योंकि रूपांतरण चरण के दौरान कभी-कभी (एमजेडएक्सएमएल फ़ाइलों) के दौरान त्रुटियां बनाई जा सकती हैं।

जीनोम खनन के बारे में, जीन क्लस्टर एनोटेशन प्लेटफार्मों से सबसे सटीक उत्पादन उच्च गुणवत्ता वाले पूरे जीनोम अनुक्रमण दोनों, एकल तनाव, या संस्कृति स्वतंत्र खनन के लिए प्रदान किया जाएगा । उच्च गुणवत्ता वाले अनुक्रमण से बायोसिंथेटिक रास्तों के वास्तविककरण के लिए उच्च गुणवत्ता वाली बायोइन्फॉर्मेटिक अंतर्दृष्टि उत्पन्न होगी। इसके विपरीत, हालांकि बीजीसी भविष्यवाणी बायोइन्फॉर्मेटिक्स सॉफ्टवेयर तेजी से विकसित हो रहा है, जीन फ़ंक्शन और ख्यात उत्पादों की सटीक भविष्यवाणियां अभी भी मुश्किल हैं, खासकर जब उपन्यास बायोसिंथेटिक रास्ते और विशेषताओं की जांच करना जो सिलिको में भविष्यवाणी नहीं की जा सकती हैं। इसके अलावा, कुछ बायोसिंथेटिक मशीनरी को हड़ताली रूप से संरक्षित किया जाता है, जबकि एंज़िमोलॉजी जो हाइब्रिड सिस्टम, ट्रांस-एटमॉड्यूलर पीके और एनआरपीएसएस में शामिल है, कोकॉली नियम के अपवाद के रूप में पहचाना जाता है। इस अर्थ में, बायोइन्फॉर्मेटिक आउटपुट सॉफ्टवेयर में विषमजीवस अभिव्यक्ति और शोधन अप्रत्याशित एंजाइम कार्यों और असामान्य जैव रसायन52,,53,54को स्पष्ट करने में मदद कर सकते हैं।, सार्वजनिक डेटाबेस के संवर्धन से उपन्यास विशेष मेटाबोलाइट्स की अधिक सटीक भविष्यवाणियां और खोज होगी, क्योंकि WGS के लिए लागत जीनोम खनन के लिए बाधा का प्रतिनिधित्व नहीं करती है।

अंत में, एकीकृत मेतापोलोमिक और जीनोम खनन दृष्टिकोण के सबसे मजबूत फायदे जीनोमिक, ट्रांसक्रिप्टोमिक को जोड़ने वाले स्वचालित और उच्च थ्रूपुट विश्लेषण के माध्यम से जीनोटाइप और कीमोटाइप वास्तविकप्रदर्शन करने की उनकी व्यवहार्यता से संबंधित हैं, और जीन को अणुओं से कुशलतापूर्वक जोड़ने के लिए मेटापोलोमिक डेटा।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस अध्ययन के लिए वित्तीय सहायता साओ पाउलो रिसर्च फाउंडेशन द्वारा प्रदान की गई थी - FAPESP (2019/10564-5, 2014/12727-5 और 2014/50249-8 से L.G.O; 2013/12598-8 और 2015/01013-4 से आरएस; और 2019/08853-9 से C.F.F.A. । B.S.P., C.F.F.A., और L.G.O. ने राष्ट्रीय वैज्ञानिक और प्रौद्योगिकीय विकास परिषद से फैलोशिप प्राप्त की-CNPq (205729/2018-5, 162191/2015-4, और 313492/2017-4) । L.G.O. विज्ञान में महिलाओं के लिए कार्यक्रम द्वारा प्रदान की अनुदान सहायता के लिए भी आभारी है (२००८, ब्राजील संस्करण) । सभी लेखकों CAPES स्वीकार करते है (उच्च शिक्षा कर्मियों के सुधार के लिए समन्वय) ब्राजील में स्नातकोत्तर कार्यक्रमों के बाद समर्थन के लिए ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetonitrile Tedia AA1120-048 HPLC grade
Agar Oxoid LP0011 NA
Apramycin Sigma Aldrich A2024 NA
Carbenicillin Sigma Aldrich C9231 NA
Centrifuge Eppendorf NA 5804
Chloramphenicol Sigma Aldrich C3175 NA
Column C18 Agilent Technologies NA ZORBAX RRHD Extend-C18, 80Å, 2.1 x 50 mm, 1.8 µm, 1200 bar pressure limit P/N 757700-902
Kanamycin Sigma Aldrich K1377 NA
Manitol P.A.- A.C.S. Synth NA NA
Microcentrifuge Eppendorf NA 5418
Nalidixic acid Sigma Aldrich N4382 NA
Phusion Flash High-Fidelity PCR Master Mix ThermoFisher Scientific F548S NA
Q-TOF mass spectrometer Agilent technologies NA 6550 iFunnel Q-TOF LC/MS
Sacarose P.A.- A.C.S. Synth NA NA
Shaker/Incubator Marconi MA420 NA
Sodium Chloride Synth NA P. A. - ACS
Soy extract NA NA NA
Sucrose Synth NA P. A. - ACS
Thermal Cycles Eppendorf NA Mastercycler Nexus Gradient
Thiostrepton Sigma Aldrich T8902 NA
Tryptone Oxoid LP0042 NA
Tryptone Soy Broth Oxoid CM0129 NA
UPLC Agilent Technologies NA 1290 Infinity LC System
Yeast extract Oxoid LP0021 NA

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References

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